Introduction
소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다.
제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다.
대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) 20 정량적 분석을 제공한다.
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Protocol
이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다.
1. 동물 준비
- 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드.
- 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다.
- 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취.
지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비
- 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로 사용합니다.
- 원한다면 준비 형광 리피드 유사체 (들) 난황 사료에 첨가한다.
- 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다.
주 : 지질 아날로그 에탄올에 현탁하는 경우는, 클로로포름보다 N 2하에 빠르게 건조되므로 지질 아날로그 다량 사용한다. 지질 아날로그 에탄올에 현탁 경우 단계 2.2.4에서 리포솜 피드에 추가하기 전에 건조시키고, 재현 탁 될 수 없지만, 전체 에탄올 농도는 0을 초과하지 않아야한다.리포좀 피드의 1 % 에탄올 잠재적으로 혼란 생리 학적 효과를 방지 할 수 있습니다. - 형광 지방산 유사체의 경우 : EM 20 mL의 5 % 난황 에멀젼의 총 부피를 준비한다. 그 라이브 공 초점 이미지 및 음식 섭취 분석 또는 1 μg의 / ㎖ 6.4 μM 4,4- 디 플루오로 -4- 보라 -3a, 4a- 디아 자 - S - 인다 센의 최종 농도 (BODIPY C 16)와 5 ml의 분취 량을 준비 입체 영상에 대한 BODIPY C (12). 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 형광 지질 아날로그 원하는 금액을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조.
- 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 5 μL의 100 % 에탄올에 재현 탁을 95 μL의 EM을 추가하고, 잘 혼합한다.
참고 : 혼합물이 균질 나타납니다; 컬러 지질 튜브의 측면에 유지되거나 액체가 덩어리 진 나타나면 지질 완전히 용해 에탄올 등을 필요로하지 않았다. 이리저리 튜브를 보호얼음 m 빛과 상점. - 형광 콜레스테롤 아날로그의 경우 : 라이브 영상 연구를위한 5 ml의 0.5 % 달걀 노른자 에멀젼 2.4 μg의 / ㎖ 콜레스테롤의 최종 농도를 준비합니다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 콜레스테롤의 정량을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조.
- 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 정제 H 2 O. RT에서 1 %의 지방산이없는 BSA 85 μL와 혼합하여 RT 100 % 에탄올 15 μL에 재현 탁 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 저장합니다.
- 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다.
- 계란 노른자 리포좀 피드를 준비합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 EM에 달걀 노른자의 해동 나누어지는을 추가합니다. 1-2 분 동안 희석 된 난황 혼합물을 와동; 혼합물이 균질 한 에멀젼으로 나타납니다.
- 새로운, 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 단백질 대기업을 제거하고 수집하는 좋은 메쉬 스트레이너를 통해 혼합물을 붓고.
- 펄스 SONICA리포좀을 만들 RT에서 :; 한 네 번째 인치 테이퍼 마이크로 팁과 (6 W 출력 강도 각 세트 사이에 5 ~ 10 초 일시 중지 5 회 (5 × 1 초, 1 초 오프)) 계란 혼합물을 테. 초음파기 전원 설정 종속 기기이며, 따라서 각각의 악기와 마이크로 팁에 대한 최적화를 필요로한다.
주 : 계속 사용할 때까지 동질성을 유지하기 위해 RT에서 리포좀 혼합물을 흔들어.
- 원하는 경우, 달걀 노른자 리포좀에 형광 지질 아날로그를 추가합니다. 즉시 초음파 처리 한 후, 리포솜에 통합 30 초 동안 고속으로 리포솜 혼합물 소용돌이로 제조 된 지질 피펫. 호일에 튜브를 배치하여 빛의 혼합물을 보호하고 실온에서 락을 계속합니다.
3. 수유 패러다임
- 먹이의 애벌레를 준비합니다.
- 공급을 방해 할 수 명백한 형태 학적 결함에 대한 공급, 화면 애벌레를 시작하기 전에. 60mm X 15mm 페트리 접시 또는 6 또는 12도 괞 찮아로 전송 애벌레TES, EM 최소로 감소시키고, 제조 된 리포좀 용액 5 ㎖로 교체한다.
- 필요한 경우, EM 5 ML의 EM 및 / 또는 5 ml의 5 % 달걀 흰색에 unfed 제어 유충을 전송하고 병렬로 처리합니다.
- 부드럽게 형광 지질 유사체가있는 경우 빛으로부터 보호하기 위해 계속하는 동안 음식 섭취를 장려하기 위해 공급 전반에 걸쳐 배양 로커의 유충 (30 rpm에서 29 ~ 31 °의 C를) 바위. 애벌레 필요가 빛에 노출 될 경우, 착색 유리 인큐베이터 덮개 노출을 최소화 할 수 있습니다.
- 공급 기간의 끝에서, EM 3 회 자유롭게 수영 유충을 헹군다.
참고 : 애벌레 피드 동안 어느 시점에서 리포좀을 소비 시작할 수 있습니다. 이 유충이 동시에 공급하기 시작하는 것이 중요한 경우, 음식 섭취에 대한 화면 급전 1 시간 후 (3.4 참조) 공급을 완료 난황 에멀젼 공급을 개시 한 경우에만 애벌레를 반환한다. - 소수로 음식 섭취량이 시점에서 유충 화면 EA 않을 수도t (일반적 ~ 0~5%). 그들이 공급 한 경우 결정하기 위해 얼음에 금속 블록에 마취 또는 약간 냉각 된 유충의 장을 검사 : 리포좀을 섭취 한 유충은 어두운 소장 (그림 1)을해야합니다.
- 바로 음식 섭취에 대한 이미지 또는 공정 애벌레. 또는, 장소 신선한 EM의 유충 및 28 ° C에서 부화 대사 처리가 발생 할 수 있습니다.
라이브 영상에 대한 유충을 설치 (4)
- 장착 미디어를 준비합니다.
- 3 % 메틸 셀룰로오스의 경우 : -20 ° C에서 년 동안 근처 끓는 EM, 소용돌이, 4 ° C에서 2~3일 완전히 용해 될 때까지 실온에서 바위, 저장 25 ml의 0.75 g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 4 ° C에서 동결 융해의 반복주기는 공기 방울을 제거합니다. 애벌레를 설치하는 동안 얼음에 3 % 메틸 셀룰로오스를 저장합니다.
- 1.2 % 낮은 마운트 아가로 오스의 경우 : 0.3 g 추가 25 ㎖ EM에 아가로 오스 낮은 용융 및 2 ML의 t에 종기, 나누어지는로 가져 와서 용해ubes, 그리고 열 블록에 26 ~ 28 ℃로 유지한다. 미사용 분취 량을 RT에서 저장 또는 -20 ° C 및 사용시에 다시 비등 될 수있다. 아가로 오스는 유충에 노출하거나 가열을 통해-수 있습니다 전에 처리 할 수있을만큼 멋진 있는지 확인합니다.
- 낮은 배율, 중간 처리량 라이브 영상의 경우, 얼음에 금속 블록에 조직에 유리 슬라이드를 배치하고 슬라이드가 식을 때까지 기다립니다. 에 붙어 낚시 줄 포커를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스에 유충을 전송, 슬라이드에 (얼음에 4 ° C로 유지 된) 3 % 메틸 셀룰로오스의 충분한 양을 적용 (0.41 mm 직경의 낚시 줄 유리 모세관의 끝)이 메틸 셀룰로오스 희석되지 않는다 (따라서 과잉 EM 드레인) 및 원하는대로 유충 위치로 약속하다를 생성한다.
- 단기 (<20 분)의 경우, 수직 오일 에멀젼의 목적으로 고배율 라이브 영상은, 방법 희박로 커버 슬립과 애벌레를 탑재합니다.
- 에 시아 노 아크릴 레이트 기반의 접착제 (순간 접착제)를 사용하여유리 슬라이드의 일단에 AA 22mm X 30mm의 coverslip에 연결합니다. 커버 슬립에 인접한 슬라이드에 3 % 메틸 셀룰로오스의 세선을 넣어 전체 보어 파스퇴르 피펫으로 슬라이드에 유충을 전송 포커를 사용한다. 는 메틸 셀룰로오스를 희석되지 않도록 초과 EM을 제거합니다.
- 포커를 사용하여 부드럽게 커버 슬립 옆에 그들의 머리와 함께 (오른쪽 이미지에 담낭을 측면이 위로 간 더 많은 이미지 왼쪽) 자신의 양쪽에있는 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 놓습니다.
- 부드럽게 두 번째 커버 슬립의 코너에서 스팟 순간 접착제는 애벌레를 브리징, 장착 된 커버 슬립에 커버 슬립 및 슬라이드의 다른 한쪽 끝을 배치합니다. 이 단계 동안이나 그 유충이 손상되지 않은 상태로 유지하면서 이미지 있도록 목적으로 과잉 압력을 적용하지 않도록 조심해서.
- 장기의 경우, 수직 침지 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스에 애벌레를 탑재합니다. 아가로 오스 다음 전송 1.2 % 낮은 용융의 작은 나누어지는에 유충을 추가배양 접시에 아가로 오스의 작은 볼륨에서 애벌레.
- 빨리 아가로 오스 응고 전에 포커와 애벌레를 놓습니다. 아가로 오스는 2 ~ 3 분 동안 건조 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 EM 완벽 아가로 오스를 포함 할 수 있습니다.
- 장기의 경우, 역 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스의 유리 바닥 접시에 애벌레를 탑재합니다.
- 얼음에 금속 블록 쿨. 과도한 냉각 및 유충의 동결을 방지하기 위해 조직에 의해 분리 된 금속 블록에 접시를 놓습니다. 접시에 애벌레를 전송하고 티슈로 위킹하여 EM을 제거합니다.
- 유충의 상단에 28 ° C 낮은 용융 아가로 오스 (1.2 %)의 하락을 놓고 즉시 포커 (아래 최상의 이미지에 왼쪽 간, 아래로 담낭 이미지 오른쪽)에 위치. 추위 블록에서 요리를 제거 2 ~ 3 분 동안 건조 할 수 있도록하고, 아가 로스를 커버하는 신선한 EM의 충분한 볼륨을 추가 (~ 2-5 ㎖).
5. 식품 섭취시험
- 6.4 μM BODIPY C 16 함유 난황 리포솜 공급의 마지막에, 플라스틱이 1.5 ㎖의 튜브 10 세정 유충 최소 EM 풀을 제거하고 동결 스냅. 샘플을 몇 달 동안 빛으로부터 보호 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
참고 : 가능하면 여러 복제를 수집합니다. (사용되는 동일한 클러치에서 이상적으로 유충) 배경 지질 형광에 대한 정상화를이 단계에서 unfed 애벌레를 수집하는 것이 중요하다. - 수정 후 Bligh-다이어 지질 추출 3,21을 수행합니다.
- 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다).
참고 : 클로로포름은 위험합니다; 이후의 모든 지질 전을 수행화학 후드에서 실온에서 견인 단계. - (: 메탄올 클로로포름) 2 : 사용 균질화 버퍼의 각 100 μL, 1의 375 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 ~ 60 초, 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 당 클로로포름, 소용돌이 30 초 125 μl를 추가, 10 분을 품어.
- 200 mM 트리스 산도의 125 μl를 추가 7.5 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 (빛으로부터 보호 2,000 X g, 5 분, RT) 소용돌이 30 초, 원심 분리기 당. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 상부상은 수성이다 유생 파편의 인터페이스 및 하부 유기상 (지질을 포함)은 이들 두 개의 단계로 구분된다.
- 깨끗한 유리 피펫 하단 유기상을 수집하고 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮긴다.
주 : 계면의 성상 및 유생 파편을 피하기 위해주의; 오염이 발생하는 경우, 원심 분리 단계 및 배열 회수 반복한다. 상단, 수성 상을 폐기; 그것을 제거하고이를 폐기하는 것이 도움이 될 수 있습니다유기상을 수집하기 전에 단계. 샘플 1 개월까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다. - 빛으로부터 보호하면서 진공 유기상 (0.12 기압)을 건조. 이 지질 용해도가 감소하므로 액체가 증발 후 샘플을 건조 계속하지 마십시오. 2의 지질을 재현 탁 : 얼음에 저장 : 1 (메탄올 클로로포름). 클로로포름의 최적 량 : 메탄올 용액을 사용하는 측정 방법에 따라, 낮은 시작하고 필요에 따라 희석을 계속합니다. 일반적인 지침은 10 풀링 유충 10 μl를 사용하는 것입니다.
- 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다).
- 채널 화 TLC 판에 균등 간격으로 전체 샘플 볼륨을 파악하고 정기적으로 생체 분자 영상 (예를 들어, 형광 플레이트 리더)에 사용되는 레이저 스캐너와 함께 접시를 검사합니다. 510-665 nm 내지 500-650 nm의 최대 발광의 여기 최대 값을 가진 물질의 목록에 포함 된 형광 리피드 유사체를 들어, 520 nm의 발광 회수를 가진 488 nm의 레이저를 사용하여.
- 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화.
참고 : 자연스럽게 쌍, unfed 애벌레 샘플의 형광을 뺀 배경 지질 형광을 발생에 대한 올바른.
- 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화.
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Representative Results
29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘.
그림 1 :. 식품 섭취를 위해 애벌레를 선별 야생 타입 6-DPF 유충은 2 시간 동안 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 또는 unfed 컨트롤을 얻기 위해 EM에서 병렬로 처리 하였다. 입체경에 10 배에서 몇 군데 때 계란 노른자를 섭취 한 먹이 애벌레 어두운 장을하면서 Unfed 유충은 분명 창자가 있습니다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 지질 유사체로 공급하면 전신 전송 및식이 지질의 세포 내 축적의 시각화를 허용합니다. 8 시간이 희박한에 대한 방법 및 수직 목적으로 이미징 된 커버 슬립 (그림 장착을위한 형광 신호는 6.4 μM 형광 C (16) 아날로그와 애벌레 공급 5 % 달걀 노른자의 소화 기관 (대장, 간, 췌장)에 걸쳐 존재 2) 3.
그림 2 :. 6 DPF 유충의 형광 지질 유사체 시각화식이 지질 전송 대표 합성 이미지 (오른쪽 직면 헤드) 8 시간 동안 C 16 6.4 μM BODIPY FL과 EM 5 % 달걀 노른자를 공급. 애벌레는 의지-에있어서, 상기 커버 슬립에 의해 3 % 메틸 셀룰로오스에 장착하고 수직 63X로 이미지화 하였다 아르곤 레이저와 단일 광자 공 초점 현미경에 기름 침지 목표. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 간, L; 장, I; 췌장, P, 담낭, GB; 데브 바이오 3의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그들이 차등 복잡한 지질 (즉, 중성 지방, 콜레스테롤 에스터, 인지질)로 대사되기 때문에 다양한 지질 유사체 세포 구조의 독특한 세트를 시각화 할 수 있습니다. 다음 4 - 8 시간은, 피드 형광 C (16)와 C (12) 유사체 지질 방울, 형광등 FL의 C 5 라벨 지질 방울, 간 및 췌장 덕트, 세포막, 동맥 네트워크 및 형광 C 2 아날로그 간 및 췌장 덕트 및 세포 레이블 레이블 멤브레인 (그림 3) 3.
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그림 3 :. 다른 형광 지질 유사체 라벨 고유 세포 기관은 유충의 대표적인 합성 이미지는 4-8 시간 (6 DPF)에 대한 C 16, C 12, C 5, C 2 6.4 μM BODIPY FL과 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 . C (16) 아날로그 장 세포의 지질 방울 (LD)에서 관찰되어, 장 루멘에서 enterocyte의 LD 및 장 루멘, 및 C 2 아날로그 C 12 및 C 5 유사체. 애벌레는 의지-에있어서, 상기 커버 슬립에 의해 3 % 메틸 셀룰로오스에 장착하고, 아르곤 레이저와 단일 광자 공 초점 현미경에 수직 63X 기름 침지 목적으로 몇 군데 있었다. 스케일 바는 20 미크론을 나타냅니다. 약 Discov 오늘 지 모델 (22)의 허가 재판."_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
애벌레 음식 섭취 분석 방법은 유전자 돌연변이, 유전자 과발현 형질 전환을 조사하기 위해 개발 된, 및 / 또는 외래 치료 유생 음식물 섭취에 영향을 미친다. 유충 소비 음식의 양을 나타 내기 위해 형광 지질 아날로그 타서 지질이 풍부한 음식을 공급된다. Unfed 유충 형광 지질 아날로그 검출 할 수있는 감도를 향상 유충에있는 배경 형광의 양에 대해 정규화 병렬로 수집된다. 이 분석은 아포 지단백 A-IVb.1 (apoA-IVb.1) 음식 섭취를 감소의 과발현을 표시하는 데 사용되었다. 이전 unfed의 Tg (HSP70 : apoA-IVb.1 : mCherry) 유충은 7 DPF에서 4 시간 동안 6.4 μM 형광 C (16) 아날로그와 10 % 달걀 노른자를 공급 (그림 4) (20) 야생 형 유충보다 약 30 % 적은 지질을 소비했다.
그림 4 :. 대표 음식 섭취의 분석 야생 타입 (WT)과의 Tg (HSP70 : apoA-IVb.1 : mCherry) (Tg)가 유충이 공급 된 10 % 닭고기 달걀 노른자 4 시간 (연준) 또는 6.4 μM BODIPY FL C16와 EM (Unfed)에서 병렬로 처리 하였다. (A) 유생 (N = 10)을 모으고, 지질을 추출하고, 추출물을 TLC 플레이트에서 목격 하였다. (B) 총 형광 정량 하였다는 감산에 의해 unfed 형제의 배경 형광을위한 표준화 된 임의의 형광 단위 (AFU), 표현 및 WT를 기준으로 표시. WT에 비해 같이 ApoA-IVb.1가 적은 형광 표지 된 지질 유사체를 섭취 과다 발현의 Tg 유충은 (학생의 t 검정, P <0.001 쌍, N = 9, 실험 당 20 유충). 박스는 25 ~ 75 번째 백분위 수를 나타내며, 평균이 표시된다. 수염은 10 ~ 90 번째 백분위 수를 표시합니다. 재판지 모델 메크 (20)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수행합니다. 낮은 공급 속도 미만 6 음식 섭취 (즉, 턱 또는 소장 기형, 제대로 수영을 할 수없는)을 방해 발달 돌연변이 내생 노른자 에너지 공급, 건강에 해로운 고기, 생선 남아와 DPF 물고기를 관찰 할 수있다. 자신의 내생 노른자 저장이 소진되고 노른자 고갈이 소화 시스템을보다 효율적으로 시각화 할 수 있습니다 때까지 애벌레 외래 음식을 필요로하지 않기 때문에 파버 연구소는 일반적으로 6~7일 게시물 수정 (DPF)에 공급하는 연구를 수행한다. 급송RT에서도 크게 먹는 애벌레의 수를 줄일 수 있습니다. 음식 섭취량과 결과를 혼동 할 수 있습니다 후속 실험에서 unfed 유충의 의도하지 않은 포함을위한 화면 유충에 실패. 또한, 최대 형광, 따라서 분석의 감도를 유지하기 위해 가능하면 빛 형광 리피드 유사체 및 동족체가 공급 모든 유충 샘플을 보호하는 것이 중요하다. 음식물 섭취 측정 할 경우 결국, 식사가 배출되기 시작하기 때문에 공급 체이스 (포스트 피드 대사 기간), 4 시간의 합계를 초과하는 것을 허용하지 않는다. 현재, 식사와 관련된 형광 지질 유사체가 배설되는 속도를 알 수 있지만, 형광은 최소 2 일 후 피드 (JPO와 SAF 게시되지 않은 데이터)의 애벌레 몸 전체 지속 할 수 있습니다.
수정하고 관심있는 실험 질문에 대답 프로토콜의 문제를 해결하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 지질이 풍부한 공급 물 t 다양한 기간 동안 수행 될 수있다IME 4 시간 지질 다량으로 소장을 채울하면서 1 시간이 작은 식사를 제공한다. 그러나, 이상 6 시간 이상 애벌레를 공급하는 노른자로 권장되지 않으며 EM 결과를 혼동 할 수 멸균 조건 및 계란 노른자 / 화이트 에멀젼의 세균 증식에 (즉, 증가 염증, 변경 장내 미생물 프로필을) 준비되지 않습니다. 애벌레는 빠르게 재가 후 다시 공급하기 시작 간단한 냉각 또는 마취에 의해 고정화 공급 애벌레의 급성 효과를 조사하기 위해 수유 후 즉시 검사 할 수 있지만, 냉각 마취에 구토가 발생할 수 있습니다 애벌레와 같은 고정의 바람직한 방법 (SAF 게시되지 않은 관찰)입니다. 대안 적으로, 추적 기간은 연구 전에식이 지질 대사 전송을 허용하도록 이송 후에 수행 될 수있다. 피드는 일반적으로 5 ㎖ 리포좀 용액에서 수행되지만, 피드 성공적으로 1 내지 20 ㎖ 부피의 범위에서 수행되었다. 다양한 농도계란 노른자의의는 애벌레 피드에 사용할 수 있습니다; 파버 연구소는 정기적으로 5 % 달걀 노른자 (1 ml의 계란 노른자 19 ML의 EM에 추가), 0.5 % 달걀 노른자, 10 % 달걀 노른자와 실험을 수행한다.
고려되어야 형광 지질 유사체의 잠재적 인 제한이 있습니다. 형광 리피드 유사체를 선택할 때 그 결과를 해석 할 때 형광 부분이 지질의 화학 구조에 어떻게 지질 생리 처리되고 여기서 고려하는 것이 중요하다. 예를 들면, 트리글리 세라이드 전에 흡수 장 루멘, 무료 콜레스테롤 및 지방산으로 유리 지방산 및 글리세롤 및 콜레스테롤 에스테르로 세분화된다. 형광 중성 지방 또는 콜레스테롤 에스터 아날로그은 다이어트에 제공되는 경우, 따라서, 신체에서 관찰 된 형광은 형광 부분이 아닌 본래 중성 또는 콜레스테롤 에스테르에 부착 된 지방산, 무료 콜레스테롤, 또는 글리세롤을 추적한다. 다른 fluorescent 지질 유사체는 고유의 세포 구조를 레이블,이 사실은 선택 3시에 고려되어야한다. 또한 노트 원시 지방산의 대사에 비해 BODIPY 잔기의 첨가는 지방산 쇄 길이 (SAF 미발표 데이타)에게 ~ 2-3 개의 탄소를 첨가 대략 동일하다.
여기에 설명 된 기술 분야에 기재된 분석법 이전에 비해 상당한 진보를 나타낸다. 유충에 전원이 공급 된이 닭 계란 노른자 사료의 개발에 앞서,이 원고는 상세한 연구는 하드 계란은 4,23 노른자. 여기에 설명 된 기술은 난황 인한 급속한 산화하기 어려운 해당 분말 난황은 매우 짧은 반감기 비등 전에 사용할 분쇄 할 필요가 없다는 장점을 제공한다. 액체 계란 노른자도 용이 효과적인식이 배달 형광 리피드 유사체 동의 리포좀을 제조 할 수있다. 또한, 방사성 표지 지질 inves의로 사용할 수 있습니다식이 지질 대사를 tigate과 음식 섭취를 측정하지만, 형광 지질 유사체는 방사능과 관련된 안전 위험을 제시하지 않습니다. 연구팀은 방사성 표지 된 지질을 사용하려면 그러나 경우 파버 연구소는 방사성 표지 지질에 통합 될 수 있는지 확인하기 위해 연구를 수행하고, 성공적으로 공급, 19 리포좀있다. 여기에 설명 된 형광 리피드 유사체는 내인성 및 방사성 표지 된 지질 대사에 매우 유사한 표시를 선택하기 때문에, 그리고 저 고전력 촬상 충분히 밝은이었다 하였다.
유충 형광 리피드 유사체를 공급하는 이러한 기법의 개발을 선행하는 다른 방법은 생체 내에서식이 지질 수송과 축적을 가시화 할 수 없었다. 형광 리피드 유사체의 직접적인 시각화 혈청 지질 등 생리학 간접적 인 측정을 이용하여 위에 이점을 제공 할 수있다. 애벌레 제브라 피쉬의 음식 섭취의 정확한 측정은 긴 역이었다현장에서 문제를 찾아내는. 애벌레는 먹이를 할 수 있도록, N -methylpyridinium 요오드 (4- 디-10-ASP), 그리고 형광을 측정 - 유일한 대안은 형광 친 유성 추적 4- (4- (didecylamino) 스티 릴)로 레이블을, 문화 paramecia이었다 플레이트 리더 (24)와 복부 영역. 마지막으로, 이들 기술은 모두 중간 처리량 스크린 (식이 지질 처리 즉, 순방향 유전자 스크린)뿐만 아니라 초점 고배율 촬상 연구에 적용 할 수 있다는 장점이있다 (즉, 유전 가설 구동 연구 역방향). 미래에, 이들 기술은 표현형에 적용 할 수 있고, 제브라 대사 및 GI 질환의 다양한 모델을 화면.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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