Abstract
Nas últimas décadas, novos métodos para o estadiamento do tumor, reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma variedade de cânceres têm surgido em conjunto com a tomografia por emissão de positrões state-of-the-art com 18 F-fluorodeoxyglucose ([18 F ] -FDG PET). 13 C espectroscópica imagiologia de ressonância magnética (13 CMRSI) é um método de imagem minimamente invasivo que permite o controlo do metabolismo in vivo e em tempo real. Tal como acontece com qualquer outro método com base em 13 C ressonância magnética nuclear (RMN), que enfrenta o desafio de baixa polarização térmica e uma subsequente baixa relação de sinal-para-ruído devido ao relativamente baixo rácio giromagnético de 13 C e a sua baixa abundância natural em amostras biológicas. Ao superar estas limitações, a polarização nuclear dinâmica (DNP) com a dissolução da amostra subsequente recentemente habilitado comumente usados sistemas de imagem por ressonância magnética (MRI) RMN e medir, Estudo, e chave vias metabólicas em vários sistemas biológicos. Uma molécula particularmente interessantes e promissoras utilizado em 13 CMRSI é [1- 13 C] piruvato, que, nos últimos dez anos, tem sido amplamente utilizada para in vitro, pré-clínicos, e, mais recentemente, estudos clínicos para investigar o metabolismo da energia celular em câncer e outras doenças. Neste artigo, vamos delinear a técnica de dissolução DNP usando um pré-clínico hiperpolarizadora DNP 3.35 T e demonstrar seu uso em estudos in vitro. Um protocolo semelhante para a hiperpolarização pode ser aplicado para a maior parte, em estudos in vivo, bem. Para isso, utilizou-se lactato desidrogenase (LDH) e a reacção catalisada metabólica de [1- 13 C] piruvato em lactato [1- 13 C] em uma linha de células de carcinoma da próstata, PC3, in vitro, utilizando 13 CMRSI.
Introduction
Presentemente, o método clínica mais amplamente utilizada para estadiamento do tumor, Reestadiamento, a monitorização da resposta ao tratamento e detecção de recorrência de uma ampla variedade de cancros é [18F] -FDG PET. 1 No entanto, recentemente, várias abordagens novas e alternativas têm surgido. Um desses métodos é de 13 CMRSI. Esta técnica envolve a introdução da molécula de C-13 em uma amostra biológica, seguido por MRI minimamente invasivo para avaliar o metabolismo in vitro ou in vivo em tempo real. No entanto, o maior desafio de 13 CMRSI, em comparação com os outros métodos, tais como [18F] -FDG PET ou tomografia computadorizada, é a sua baixa razão sinal-ruído.
O sinal de NMR é directamente proporcional ao nível de polarização, um rácio da diferença população spin ½ núcleos em dois estados de energia à população total (Figura 1A). A polarização é um produto do thrazão E giromagnético (γ) dos núcleos e a intensidade do campo magnético aplicado sobre a temperatura. Um típico de polarização 1H núcleos é na ordem de 0,001% para 0,005% a 3 T, o que dá uma proporção relativamente baixa de sinal-para-ruído. Hoje MRI state-of-the-art tem sido um método de imagem sucesso apenas devido à grande abundância de 1 H em amostras biológicas ea relação gyromagnetic alta de 1 H (y 1H = 42,576 MHz / T). No entanto, observando outros núcleos, tais como o carbono, é mais exigente. A única, de isótopos de carbono magneticamente ativo estável, 13 C, torna-se apenas 1,1% de todos os átomos de carbono. Além disso, o rácio giromagnético de 13 C (13C γ = 10,705 MHz / T) é quatro vezes menor do que a de um H, conduzindo a uma eficiência de detecção mais baixo. Em resumo, a baixa abundância de 13 C e 13 C γ baixo conduzir a medições 13 C térmicos para atingir 0,0176% da sensibilidade de um 1Medição H-RMN in vivo.
Polarização Nuclear dinâmica
Um método para ultrapassar a sensibilidade relativamente fraca de 13 medições C é DNP. Foi originalmente descrita para os metais em 1953 por Albert W. Overhauser. No seu artigo, ele afirma: "Verificou-se que, se a ressonância de spin electrónico dos electrões de condução é saturada, os núcleos irão ser polarizadas no mesmo grau que seria se a sua proporção giromagnética fosse o do spin do electrão." 2 Mais tarde Naquele ano, Carver e Slichter confirmada experimentalmente a hipótese de Overhauser 3. Em 1958, Abragam e Proctor descreveu este efeito para os elétrons em líquidos e nomeou-o "efeito sólido". A temperaturas inferiores a 4 K,-spin do electrão polarização atinge cerca de 100% e é mais do que três ordens de magnitude maior do que a polarização-spin nuclear (Figura 1B) 4. Tsua ocorre porque o rácio giromagnético do electrão (γ e = 28024,944 MHz / T) é três ordens de grandeza maior do que os rácios gyromagnetic nucleares. As interacções fracas entre electrões e núcleos, tais como o efeito de Overhauser, o efeito sólido, o efeito transversal, e o efeito de mistura térmica, permitir a transferência de polarização de electrões gira para spins nucleares utilizando a irradiação de microondas com uma frequência perto do electrão correspondente ressonância paramagnética (EPR) 5,6 frequência. teoria DNP tem sido desenvolvido para envolver mais elétrons e mistura térmica. No entanto, até à data, nenhuma descrição teórica quantitativa unificado de DNP foi publicado 7,8.
Figura 1: compreensão dinâmica Polarização Nuclear e Hiperpolarização. A) Uma comparação esquemática da população de spinno estado de equilíbrio polarização térmica e o estado hiperpolarizado. B) A polarização é dependente da temperatura. A polarização de um electrão (e -) atinge 100% abaixo de 1.4 K. O DNP permite a transferência da polarização do electrónico para os núcleos de 13 C, o que aumenta a sua polarização até 10 vezes de 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para introduzir DNP em estudos de sistemas biológicos utilizando 13 C RMN, subsequente dissolução rápida amostra tinha de ser desenvolvido. 50 anos após a hipótese de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. resolveu a questão tecnicamente difícil de levar a amostra congelada hyperpolarized no estado líquido com perda mínima hiperpolarização 6. Dissolução DNP abriu um novo campo de pesquisa chamado 13 CMRSI, fornecendo um novo método para investigar e caracterizar vários estados de doença 9,10. como portadores estáveis de um elétron não emparelhado, a tritil tris radical (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) -metil sal de sódio (OX063) ou (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) oxilo (TEMPO) é normalmente utilizado. Estes são misturados com a molécula desejada marcada com 13 C e exposto a irradiação de microondas com uma frequência perto da frequência de EPR correspondente. Usando esta técnica, a polarização dos núcleos de 13 C pode ser aumentada até 37% 11. Isto resulta num aumento de polarização 10 vezes de 5 em comparação com a polarização equilíbrio térmico 11,12. No entanto, logo que a irradiação de microondas é parado e / ou o C-13 molécula é transferida para o estado líquido, a polarização decai com o tempo de relaxamento longitudinal (T1) do núcleo 13 C, que foi polarizada. Assim, oinvenção de técnicas de rápida dissolução ou qualquer técnica subsequente redução do tempo antes da medição experimental (isto é, injecção) é crucial para aplicações biológicas 13.
Há três requisitos principais que a molécula candidato precisa cumprir para bem sucedidos 13 estudos CMRSI. Em primeiro lugar, o núcleo 13 C de interesse tem de ter um tempo suficientemente longo T 1 (> 10 s). A escolha da etiqueta C-13 é crucial. Os melhores núcleos candidatos são carbonos sem contacto directo com 1 H-núcleos através de uma ligação. Também tem de ser rapidamente metabolizado dentro de 2 - 3 vezes 1 T, resultando em um produto metabólico a jusante com um desvio químico muito diferente da substância original. A mistura da amostra deve também formar um vidro amorfo quando em estado sólido de modo a que a distribuição espacial diminui a distância entre o electrão e 13 C, permitindo que o transfer de polarização. Se a molécula candidata não formar vidro amorfo, naturalmente, que deve ser altamente solúvel em um agente de envidraçamento, tal como o glicerol ou o sulfóxido de dimetilo 14. Estes requisitos resultar num número relativamente pequeno de moléculas candidatas. No entanto, mesmo depois da descoberta bem sucedida de uma molécula adequada, o desenvolvimento de um protocolo de trabalho para a hiperpolarização pode ser tecnicamente exigente 9,14,15.
Nos últimos anos, vários substratos foram com sucesso polarizada, tal como [1- 13 C] piruvato 12,16 - 36, [2- 13 C] piruvato 37, [1- 13 C] etil piruvato 38, [1- 13 C ] lactato 39, [1- 13 C] fumarato 40 - 43, 13 C-bicarbonato 36,44,45, [1- 13 C] acetato de sódio 43,46 - 49, 13 C-ureia 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutami15,52,53 NE, [1- 13 C] glutamato 53,54, [1- 13 C] 2-oxoglutarato 55, [1- 13 C] alanina, e outros 14,56. Um substrato particularmente interessante e utilizada para hiperpolarização é [1- 13 C] piruvato. É amplamente utilizada em estudos pré-clínicos para investigar a energia do metabolismo celular em várias doenças 14,17,22. [1- 13 C] piruvato preenche todos os requisitos para hiperpolarização bem sucedida, incluindo um transporte relativamente longo T 1 e rápida através da membrana celular antes posteriormente ser metabolizado. Estudos pré-clínicos com piruvato [1- 13 C] estão actualmente a ser traduzido para a clínica 57.
Metabolismo do piruvato
É bem conhecido que existe uma relação directa entre as mutações no DNA e alterações nas suas vias metabólicas de células cancerosas. Já na década de 1920, Otto Warburg Discovrado que há um aumento do metabolismo de glucose e produção de lactato em tumores em comparação com tecidos saudáveis 58-60. Subsequentemente, várias alternâncias em outras vias metabólicas, tais como a via de pentoses fosfato, o ciclo de ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa e da síntese de nucleótidos e lípidos, têm sido descritas.
O piruvato é o produto final da glicólise. No tumor, ele sofre da glicólise anaeróbia catalisada pela LDH 61 e reage com a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleótido coenzima (NADH), o que resulta em lactato e a forma oxidada da coenzima (NAD +). Alternativamente, o piruvato é submetido a uma reacção de transaminação com o glutamato para formar alanina, catalisada por transaminase alanina (ALT). Ambas as reacções são prontamente reversível. Piruvato também sofre descarboxilação catalisada pela desidrogenase de piruvato (PDH) para dióxido de carbono e acetil-CoA, representing uma reacção irreversível neste passo. Alternâncias nestas taxas de reacção pode ser ligada ao metabolismo do tumor 17,21,22,25,62. As vias metabólicas estão resumidos na Figura 2.
Figura 2: Diagrama das principais reacção metabólica do piruvato. / Conversão de lactato piruvato é catalisada pela LDH, e conversão de piruvato / alanina é catalisada por ALT. O piruvato é irreversivelmente convertida a acetil-CoA e de CO 2 por PDH, e CO 2 está num equilíbrio dependente do pH com bicarbonato de 80. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A detecção de hiperpolarizado [1- 13 C] piruvato e seus metabolitos foi previamente demonstrada no rato, elearte 37,63 - 65, 66 fígado, músculo, rim e 62,67. Um estudo demonstrou diferenças significativas na relação lactato-to-alanina entre o fígado normal e em jejum de rato 66 e demonstraram um [1- 13 C] nível de lactato altamente elevada e hyperpolarized no cancro do fígado 68,69. Há evidências de que o grau do tumor pode ser identificada num adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho (TRAMP) usando hiperpolarizado piruvato [1- 13 C] 22, com os níveis de lactato hiperpolarizados que mostram uma elevada correlação com o grau histológico dos tumores excisados. A alanina a partir do piruvato catalisada por ALT foi também sugerida como um marcador útil no rato carcinoma hepatocelular 23.
Medindo o fluxo metabólico piruvato-lactato foi usado para monitorização isquemia 63,65,70 e como uma resposta ao tratamento com drogas citotóxicas quimioterapia 17,40, segmentados <sup> 24,25,41, 26 ou radioterapia em modelos animais. Também tem sido utilizado para a detecção do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) inibidor da resposta LY294002 em glioblastoma e o cancro da mama modelos de ratos 25. Alterações no metabolismo do piruvato em tumores cerebrais 26 e o cancro da próstata 24,71 também foram observadas após o tratamento.
próstata Carcinoma
Carcinoma da próstata é o cancro predominante em homens idosos e o segundo câncer líder envolvidos na morte de homens em todo o mundo 72. Até o momento, não há métodos confiáveis e não-invasivos estão disponíveis para o diagnóstico precoce e caracterização de câncer de próstata 73,74, enfatizando a necessidade urgente de técnicas de imagem metabólica novos para permitir a detecção rigorosa e estadiamento dos pacientes. Carcinoma da próstata foi usado como um modelo para demonstrar as possibilidades da DNP dissolução combinados com 13 CMRSI no pacienteS 57. Este trabalho foi continuado em um primeiro ensaio clínico utilizando [1- 13 C] piruvato e 13 CMRSI para a imagem do câncer de próstata, e tem apenas recentemente foi concluída (NCT01229618).
A motivação por trás deste trabalho foi ilustrar em mais detalhe e para um público mais amplo a aplicação do método CMRSI 13 em um cenário pré-clínico com células. Medir o metabolismo catalisado-LDH de [1- 13 C] piruvato para [1- 13 C] lactato in vitro na linha de células de carcinoma da próstata PC3, demonstramos a eventual aplicação do DNP dissolução em estudos in vitro e abordar os passos cruciais e desafios durante os experimentos.
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Protocol
1. Amostra Preparação da Solução
- Adicionar gadoterate meglumina (GADM, 0,5 mol / L) de concentrado [1- 13 C] ácido pirúvico para dar uma concentração final de 1-mmol / L GADM. Adicionar tritilo radical tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-il) - sal de sódio de metilo (OX063) a esta mistura para dar uma concentração final de 15 mmol / L. Vórtice até à dissolução completa.
NOTA: Esta preparação de soluções de é projetado para uso com um 3.35-T hiperpolarizadora pré DNP. Quando um hiperpolarizadora clínica 7-T é utilizada, a meglumina gadoterate não é necessário porque, em um campo magnético mais elevado, as suas vantagens são insignificantes. A adição de um agente de contraste à base de gadolínio aumenta a polarização em estado sólido também possível, e a taxa de polarização. No entanto, no estado líquido, o agente de contraste reduz o tempo de relaxamento T1.
2. Crescer a cultura celular
NOTA: Cada linha de células requer um protocolo de preparação particular para a propagação de células. Consulte os requisitos com o fornecedor de linha celular.
3. Preparação das células para o experimento
- Remover o meio das células e lavar as células com ~ 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicionar 5 ml de tripsina ao balão e devolver os frascos de cultura celular na incubadora durante 3 a 5 min.
- Adicionar ~ 5 mL de meio F-12K para desactivar a tripsina.
- Contar as células usando um contador de células automático. Misturar 10 ul da solução de células com 10 uL da solução de coloração. Misturar bem com a pipeta e transferir 10 ul da mistura em the câmara de um "vidro contando".
- Remover e contar as células no frasco (s). Transferir os volumes adequados contendo o número desejado de células (por exemplo, 5 x 10 6 a 10 8) em frascos de plástico.
- Centrifugar as células a 1200 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
- Re-suspender as células no meio F-12K contendo 10% de FCS até um volume total de 800 uL e transferi-los para um copo de reacção (2 mL). Coloque o copo de reacção para um frasco de plástico cheio de água morna.
4. A dissolução do agente Preparação
NOTA: O agente de dissolução é um líquido que é utilizado para dissolver a amostra hiperpolarizado. Em aplicações biológicas, a dissolução é usualmente realizada com H2O ou com base em óxido de deutério (D 2 O) tampões baseados, tal como PBS ou Tris (hidroximetil) aminometano (Tris), contendo 1 g / l de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA).
- Preparação de 20 mmol de tampão / L de PBS
- Para a preparação de 100 ml do agente de dissolução, dissolve-se 36 mg de fosfato monossódico (NaH 2 PO 4), 247 mg de fosfato de dissódio (Na 2 HPO 4), e 10 mg de EDTA numa solução de hidróxido de / L de sódio 20 mmol ( NaOH) em D 2 O. Mix corretamente até dissolução completa.
NOTA: EDTA (1 g / L) é adicionado ao tampão para eliminar possíveis iões ferromagnéticas, que pode estragar a hiperpolarização. O NaOH é utilizado para neutralizar o ácido pirúvico em uma proporção de 1: 1 mol até atingir um pH de 7,4.
- Para a preparação de 100 ml do agente de dissolução, dissolve-se 36 mg de fosfato monossódico (NaH 2 PO 4), 247 mg de fosfato de dissódio (Na 2 HPO 4), e 10 mg de EDTA numa solução de hidróxido de / L de sódio 20 mmol ( NaOH) em D 2 O. Mix corretamente até dissolução completa.
5. temperatura variável Insert (VTI) Cooldown
- Na janela principal do programa polarizador DNP-RMN, clique em "Recarga".
NOTA: Este liga a bomba de vácuo e evacua o VTI para aproximadamente 5,0 mbar. Subsequentemente, a válvula de agulha entre o reservatório e VTI hélio líquido totalmente aberta, permitindo que o hélio líquido a fluir para o VTI. A taxa de fluxo é regulated pela válvula de agulha para manter a quantidade óptima de hélio líquido na VTI até atingir a temperatura de ebulição do hélio. Em seguida, o VTI é evacuado a vácuo quase completa, e a temperatura atinge cerca de 1,4 K. A VTI é preenchido com hélio líquido-se a 65%. Neste ponto, o aparelho está pronto para a inserção da amostra.
6. Preparação de amostras e Inserção
- Usando uma micropipeta, adicione ~ 8 mL de 13 solução de amostra C-marcado em um copo de plástico.
- Fixe o copo de plástico à haste de inserção e iniciar o processo de inserção de amostra pressionando "Inserir amostra" na janela principal do programa. Selecione "amostra Normal" e clique em "Continue".
NOTA: Durante este processo, a primeira válvula de agulha fecha para interromperem o fluxo de hélio líquido em VTI, e a pressão no VTI, em seguida, aumenta. O suporte de amostras dentro do VTI é levantada a partir do hélio líquido, a válvula de entradana parte superior da VTI é aberta, e um fluxo de hélio gasoso é introduzido a partir da válvula de admissão para evitar a contaminação pela humidade do ar exterior. - Quando solicitado, empurre a vareta de inserção com o copo de plástico anexado para dentro do VTI. Certifique-se de atingir o suporte de amostra na parte inferior da VTI. Caso contrário, o hélio gasoso pode empurrar a amostra para fora do VTI.
- Separar e remover a haste de inserção.
- Terminar o procedimento, clicando em "Next" na janela de diálogo. O procedimento de inserção amostra não deve demorar mais do que 10 s.
NOTA: A válvula de entrada fecha então, o fluxo de hélio gasoso é interrompido, o suporte de amostra com o copo de amostra é submersa em hélio líquido, e a válvula de agulha é aberta para permitir que o hélio líquido a fluir para o VTI. Após 5-10 minutos, o VTI é arrefecida abaixo de 1,4 K, permitindo que todos os electrões livres a ser polarizada. - Confirmar que o copo de plástico com a amostra foi introduzida correctamente no VTI, verificando tchapéu não está ligado à vareta de inserção ou empurrado para fora da VTI por gás hélio. Em seguida, clique em "Concluir".
7. Microondas varredura (opcional)
NOTA: A remoção de microondas permite a determinação da frequência de microondas ideal para maximizar a taxa de hiperpolarização dos núcleos 13 C no composto alvo.
- Para medir a varredura microondas, iniciar o programa RINMR, digite "HYPERSENSENMR," e clique em "Selecionar Config" e "Do Microsweep."
- Para iniciar o processo, selecione a guia "calibrar" na janela principal do programa.
- Clique em "Generate" e escolha o início eo fim de frequência (por exemplo, 94,100 GHz-94,200 GHz), o tamanho do passo de frequência (por exemplo, 20 MHz), a alimentação (100 mW), eo tempo (60 s). Clique em "Continuar", "Ativar" e "Iniciar".
NOTA: Com essas configurações, o hiperpolarizadora primeira polariza a amostradurante 60 s utilizando uma freqüência de microondas de 94.100 GHz e uma potência de 100 mW. Em seguida, aplica-se um pulso de 90 ° de rádio-frequência (RF) e adquire o sinal de 13 C hyperpolarized usando o espectrômetro de built-in. Estes passos são repetidos para cada passo na gama de frequências especificada. Para hiperpolarização posterior, escolha a freqüência de microondas com a amplitude do sinal máximo medido.
8. Polarização
- Para medir a polarização build-up, iniciar o programa RINMR, digite "HYPERSENSENMR," e clique em "Selecionar Config" e "Build-up sólido."
- Na janela principal do programa polarizador DNP-RMN, clique em "polarização" para iniciar o processo de hiperpolarização.
- Escolha a frequência ideal de microondas (obtido durante a varredura microondas) eo poder (por exemplo, 100 mW) para a amostra e clique em "Avançar".
- Enable "Polarização monitoramento build-up" e clique em "Finish".
- Polarizar a amostra> 95% (~ 60 min para [1- 13 C] piruvato).
Nota: Durante a polarização, as microondas são guiados para o VTI e para a amostra, fazendo com que a 13 C gira para alinhar com as rotações de electrões desemparelhados hiperpolarizados. Para medir a acumulação de hiperpolarização, pulsos de RF com um ângulo de aleta (FA) de 5 ° são aplicados periodicamente (por exemplo, a cada 300 s), e o sinal resultante é representada como uma curva de acumulação de polarização.
9. Dissolução
- Quando a polarização atinge> 95%, dará início ao processo de dissolução, clicando em "Dissolução" na janela principal do programa polarizador DNP-RMN.
- Escolha o processo de dissolução a partir do menu drop-down e clique em "Avançar".
NOTA: O polarizador permite uma para definir o processo de dissolução desejado, escolhendo o momento do gás perseguição. - Carregar ~ 5 ml do agente de dissolução através da válvula de topo para um recipiente aquecido em tEle faz parte dissolução do polarizador. Calcular o volume exacto do agente de dissolução necessário, utilizando a equação seguinte:
em que V é o volume DA desejada de agente de dissolução, M Pa, m OX063, e m Gade são as massas da piruvato, OX063 e meglumina gadoterate, respectivamente, adicionou-se à solução da amostra. - Coloque a vara de dissolução na posição activa acima da válvula de entrada.
NOTA: Isso permite que o instrumento para conectar sua instrumentação dissolução do copo de amostra no VTI. - Clique em "Finish" para iniciar o processo de dissolução.
NOTA: O agente de dissolução é pressurizado a 3 bar com gás hélio e é subsequentemente aquecida até 200 ° C, provocando um aumento da pressão. Quando a pressão atinge 10 bar, a válvula de agulha fecha para interromperem o fluxo de hélio líquido na VTI. O suporte de amostras levanta a taçado hélio líquido. A vara de dissolução é reduzido para o VTI e ligado ao copo de amostra. O agente de dissolução condicionado é empurrado pela pressão, que resulta a partir do vaso de aquecimento contendo o tampão de dissolução e de gás hélio, através da dissolução da vara para a taça, causando uma rápida dissolução da amostra. A solução, então, flui para fora para o balão de recolha através de tubos de plástico. A vara de dissolução com a taça ligada é então levantada a partir do VTI. - Mover a alavanca de dissolução com a taça ligado à posição "limpeza" e conclua o processo clicando em "Finish".
Detecção 10. do C hyperpolarized Signal 13
- 13 C metabólica espectroscopia de ressonância magnética in vitro
- Misturar 200 mL de o / L dissolvido amostra hiperpolarizado 20 mmol a partir do balão de recolha com 800 uL da solução de células.
NOTA: A concentração final resultantede [1- 13 C] piruvato é 4 mmol / L. - Misture bem a suspensão utilizando uma micropipeta e a transferência de ~ 600 mL para um tubo de RMN de 5 mm.
- Inserir o tubo de RMN de 5 mm para o espectrómetro de RMN de 1-T. Na janela principal do software, clique em "Executar" para iniciar a medição, aplicando série de cem 10 ° pulsos de RF a cada 3 s.
NOTA: medir o tempo entre a mistura inicial da amostra hiperpolarizado com as células e o início da aquisição espectroscópica. Certifique-se de que o procedimento de mistura não exceda 30 s para minimizar a perda de polarização.
- Misturar 200 mL de o / L dissolvido amostra hiperpolarizado 20 mmol a partir do balão de recolha com 800 uL da solução de células.
- 13 C ressonância magnética metabólica
- Para construir um recipiente para os experimentos in vitro, usando o espectrômetro de ressonância magnética, dê uma seringa de 5 ml e conectá-lo a um cateter (d = 1,2 mm) que é longo o suficiente para alcançar a partir iso-centro do espectrômetro para a área acessível do espectrômetro.
- Encha o recipiente in vitro com thsolução de e células com a concentração desejada para a experiência (por exemplo, 10 8) ou com uma solução enzimática.
- Coloque um recipiente in vitro no isocentro do magneto MRI. Coloque uma bobina receptora de rádio frequência 13 C-sintonizado no recipiente. Coloque um fantasma de calibração concentrada 13 marcado com C (por exemplo, 10 mol / L 13 C-ureia) nas proximidades.
- Insira o "container in vitro" próximo iso-centro do scanner de RMN a.
- Execute sequência de localização de 3 plano padrão do scanner e ajustar a posição do recipiente in vitro para iso-centro, conforme necessário.
- Executar uma sequência pesada em T2 1 H "anatômica" cobrindo o in vitro recipiente de localização. Utilize as seguintes definições: spin echo 2D com orientação axial, tempo de repetição (TR) = 2.000 ms, tempo de eco (TE) = 20 ms, fatia de espessura = 1 mm, de campo de visão que cobre o recipiente in vitro, e16 ecos por excitação. Certifique-se de que calços campo é feito em protões durante este passo.
- Nas imagens anatômicas, selecione 5 fatias contíguas centradas na região de interesse. Prescrever uma aquisição de calibração espectroscópica 13 C cobrindo as fatias anatômicas selecionados. Utilize as seguintes definições: sequência de calibração 2D Block-Siegert com orientação axial 12 x 12 centric codificado, TR = 1.000 ms, espessura de corte = 5 mm, campo de visão combinando imagens anatômicas, número de scans (NS) = 64, largura de banda = 5,000 Hz, e FA = 90 °.
- Selecione a sequência de calibração espectroscópica 13 C (para mais informações, consulte Schulte et al. 2011) 75 da biblioteca sequência de impulsos. Baixar a sequência de pulso para o scanner do computador clicando em "Download". Clique em "Spectra Prescan" para executar o pré-digitalização espectroscópica. Na trama espectro de magnitude, ajustar o pico do fantasma de calibração 13 C ao center da frequência scanner. Definir os ganhos do receptor ao máximo. Clique em "Iniciar" para executar a sequência de calibração espectroscópica 13 C. Observe o ganho de transmissão relatado e frequência centric.
- Definir uma aquisição de 13 C imaging deslocamento químico (CSI), que abrange as fatias anatômicas selecionados. Utilize as seguintes definições: 2D eco-planar espectroscópica imagiologia (EPSI) com orientação axial 12 x 12 centric codificado, TR = 400 ms, espessura de corte = 5 mm, campo de visão correspondentes imagens anatômicas, NS = 300, e largura de banda = 5.000 Hz .
NOTA: As amostras Epsi uma única linha no k-space repetidamente após uma excitação RF para adquirir tanto a informação espacial e espectral simultaneamente. Para mais informações sobre as técnicas de aquisição, ver o artigo de Durst et al. 2015 76. - Baixar a sequência C CSI 13 e executar a pré-digitalização espectroscópica. Ajustar a frequência do scanner e transmitir o ganho como especificado pela sequência de calibraçãosaída.
- Depois de a solução hiperpolarizado é depositado no balão de recolha, elabora ~ 3 mL para uma seringa e em seguida injectá-la no cateter ligado ao recipiente in vitro. Iniciar a aquisição. Após a aquisição for concluída, salve o arquivo de dados brutos para a reconstrução subsequente.
Reconstrução 11. Dados
- Aplicar um dos dois modelos cinéticos descritos para analisar os dados adquiridos.
- No primeiro método para descrever a cinética de LDH, valor cinética (K), comparar a soma do sinal de lactato (M LAC) para o sinal de todas as moléculas hiperpolarizados (M x) 21,77.
- No outro método, medir o lactato e piruvato de sinais ao longo do tempo e se encaixam estes a um modelo de cinética 17,25,71. Para resolver a taxa de câmbio metabólica, k PA → LAC, e de eficáciataxa de decaimento do sinal de lactato, r LAC, use as seguintes equações diferenciais lineares usando o modelo de câmbio diferencial de dois locais, produzindo para o lactato:
- No primeiro método para descrever a cinética de LDH, valor cinética (K), comparar a soma do sinal de lactato (M LAC) para o sinal de todas as moléculas hiperpolarizados (M x) 21,77.
Nota: O sinal de lactato taxa de decaimento r LAC eficaz é dependente do tempo de relaxamento longitudinal de lactato (t 1, a ALC), a taxa de troca metabólica oposto de lactato para piruvato K ALC → PA, a FA aplicada e TR, e a intensidade do sinal de piruvato (M Pa) e lactato (M ALC), tendo em conta a redução irreversível depois de cada sinal de excitação sucessiva: 
Portanto, r LAC resulta em um único termo, inseparável da decadência notável. Uma vez que é possível corrigir para tele virar ângulo e o tempo de repetição, e mesmo que não haja um fluxo ALC → PA, assume-se que a taxa de câmbio de lactato para piruvato (k ALC → PA) não precisam de ser incluídos no cálculo, com base nos resultados de Harrison et al. 2012 78. Seus resultados mostram que o k LAC → PA não desempenha um papel tão crucial como é de se supor. Este modo permite que o T 1 tempo de relaxamento de lactato a ser quantificado. Este modelo é independente de administração piruvato para a medição, o que, no caso em experiências in vitro, não é crucial e pode ser negligenciada. É, no entanto, desempenham um papel importante para nas medições in vivo 79.
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Representative Results
Os resultados do "varrimento microondas" são ilustrados na Figura 3. Ele mostra que a frequência de microondas ideal para a [1- 13 C] é a amostra de piruvato 94,156 GHz para o hiperpolarizadora 3,35-T local. Todos hiperpolarização seguinte experiência (n = 14) foram realizados utilizando esta frequência de microondas, com uma potência de 100 mW. A irradiação de microondas foi aplicada durante 60 a 80 minutos, levando a uma hiperpolarização de estado sólido superior a 90%. Os resultados são apresentados na Figura 4. O piruvato hiperpolarizado [13 C] foi misturada com 5 x 10 6 (n = 2), 10 7 (n = 2), 2 x 10 7 (n = 1), 3 x 10 7 (n = 2), 4 × 10 7 (n = 1), 6 x 10 7 (n = 2), 8 × 10 7 (n = 2), e 10 8 (n = 1) a linha celular de cancro da próstata PC3.
Os dados resultantes encontram-se resumidos na Figura 5 Figura 6. Dados adquiridos com resolução espectral e temporal são mostrados na Figura 5A-D e Figura 6A-D, com apenas uma resolução temporal para cada molécula observado (Figura 5E-H e Figura 6E-H), e apenas com uma resolução espectral (figura 5I -L e Figura 5I-G). Temos observado três principais sinais hiperpolarizados representando [1- 13 C] piruvato, [1- 13 C] piruvato hidrato, e [1- 13 C] lactato, com deslocamentos químicos em 173 ppm, 181 ppm e 185 ppm, aproximadamente relativa para o ácido propanóico trimetilsililo (TMSP) a pH 7,4 e temperatura de 20 ° C. As razões de sinal entre os três metabolitos encontram-se resumidos na Tabela 1. Os dados mostram uma clara correlação entre o sinal de lactato e o número de células presentes na amostra (Figura 7). Entretanto, os resultadosa partir das experiências com menos de 2 x 10 7 células exibem desvio significativa, provavelmente devido a uma baixa relação de sinal-para-ruído. Portanto, sugerimos o uso de mais células do que este para novas experiências. Quando o sinal de lactato relativa (valor cinética) é normalizado ao número de células (Figura 8), que demonstra claramente a absorção e metabolismo semelhante ao longo de todas as células. No entanto, há uma tendência de diminuição da produção de lactato por célula com um número crescente de células. Cremos que uma das causas da actividade metabólica celular reduzida é uma concentração muito elevada de células num volume muito pequeno, o que resulta no aumento da viscosidade da amostra. Os resultados do modelo de troca diferencial de dois locais encontram-se resumidos na Tabela 2 e mostrado na Figura 9. Os dados seguem uma tendência semelhante à do modelo anterior: o aumento k PA → LAC com um número crescente de células. No entanto, este modelo resultars em um aumento abrupto da cinética com o número de células. Quando a taxa de conversão metabólica K PA → LAC é normalizada para o número de células, pode-se ver novamente uma tendência clara de diminuição K PA → ALC com um número crescente de células (Figura 10).
A Figura 11 demonstra a possibilidade da adição de localização espacial para a experiência. Ela mostra um espectro injectados com 80 mmol / L hiperpolarizado [1- 13 C] piruvato ao lado de um 10 mol / L 13 C-ureia fantasma. A técnica permite a obtenção de um espectro com resolução temporal e especial (Figura 11A) ou do decaimento do sinal dos sinais de metabólitos escolhidos no tempo (Figura 11B). Os espectros no domínio do tempo também pode ser somados para receber uma melhor relação (Figura 11C) de sinal-para-ruído. A resolução especial permite a escolha do desejado frequência região of o espectro de 13 C, pertencentes a determinados metabolitos, tais como [1- 13 C] piruvato (Figura 11D), [1- 13 C] piruvato hidrato (Figura 11E), ou de referência 13 C-ureia (Figura 11F). Pode ser co-registadas uma imagem de um H, com. A sequência de impulsos utilizado (EPSI) permite a aquisição de uma imagem de toda a fatia a cada 4.9 s. Em resumo, esta técnica pode fornecer dados com uma resolução espacial, temporal e espectral por qualquer metabolito.
Figura 3: Resultados de uma varredura microondas com [1- 13 C] piruvato no local 3.35-T hiperpolarizadora. O resultado das medições de determinar a frequência óptima de microondas para maximizar a taxa de hiperpolarização de 13 núcleos C no composto alvo de piruvato [1- 13 C]. O varrimento de microondas tem a forma de uma absorção EPRespectro. A forma e separação dos picos são baseadas no radical utilizado (neste caso, tritilo radical), e a maior influência têm um efeito sólido e mistura térmica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Solid Buildup estado de polarização de um [1- 13 C] piruvato Sample. Uma média de n = 13 a polarização em estado sólido buildups com o erro representadas pelo desvio padrão medido a cada 300 s até 4500 s. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados da espectroscopia de RMN de C 13 para o número de células (5 x 10 6 e 3 x 10 7 células). Os dados adquiridos plotados com resolução espectral e temporal (AD), plotados com resolução temporal apenas para [1- 13 C] piruvato, [1- 13 C] piruvato hidrato, e [1- 13 C] lactato (EH), e plotados apenas com resolução espectral, soma de todos os passos de tempo (IL). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Os resultados da espectroscopia de RMN de 13 C para o número de células (4 x 10 7 a 1 x 10 8 células). Os dados adquiridos plotados com resolução espectral e temporal (
Figura 7: Resultados da Ratio metabolito simples Kinetic Modeling. Os dados representam a razão entre a [1- 13 C] sinal de lactato para a soma de [1- 13 C] piruvato, [1- 13 C] hidrato de piruvato, e [1- 13 C] lactato versus o número de células no experimentos. O erro representam o desvio padrão. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Resultados do Índice de Metabolito simples Kinetic Modeling normalizada ao número de células. Os dados representam a razão entre a [1- 13 C] sinal de lactato para a soma de [1- 13 C] piruvato, [1- 13 C] piruvato hidrato, e [1- 13 C] lactato normalizada para o número de células versus o número de células nas experiências. O erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: resultados das duas local Modelo Diferencial Exchange. A repr dados esent a taxa de troca metabólica (k PA → ALC) versus o número de células nas experiências. O erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: resultados das duas local Modelo Diferencial Troca normalizados para o número de células. Os dados representam a taxa de troca metabólica (k PA → ALC) normalizados para o número de células versus o número de células nas experiências. O erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Resultado da ressonância magnética do hyperpolarized [1- 13 C] Probe piruvato. A) O espectro adquirido ao longo de toda a fatia e todos os passos de tempo. B) A decadência do piruvato [1- 13 C] e [1- 13 C] sinal de hidrato piruvato ao longo do tempo. O terceiro sinal, é a referência de localização 10 H 13 C-ureia. C) O espectro adquirido a partir de toda a resolução espacial e temporal. D) A imagem 1H cobertas com a imagem 13 C do sinal piruvato [1- 13 C] somado em todos os intervalos de tempo. E) A imagem 1H cobertas com a imagem 13 C do sinal piruvato hidrato [1- 13 C] somado em todos os intervalos de tempo. F) A imagem 1 H sobreposto com o <sup> 13 image C do sinal C-ureia 13 somado em todos os intervalos de tempo (de referência). O sinal C-13 em CE é normalizado para o valor máximo do sinal do metabolito específico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número do celular | ||||||||
| 5 x 10 6 (n = 2) | 10 7 (n = 2) | 2 × 10 7 (n = 1) | 3 x 10 7 (n = 2) | 4 × 10 7 (n = 1) | 6 x 10 7 (n = 2) | 8 × 10 7 (n = 2) | 10 8 (n = 1) | |
| [1- 13 C] piruvato | 92,9 ± 1,4 | 91,7 ± 1,0 | 86,7 | 77,5 ± 2,7 | 76 | 69,7 ± 0,5 | 65,9 ± 3,7 | 42,9 |
| [1- 13 C] hidrato piruvato | 6,8 ± 1,2 | 6,7 ± 1,6 | 9.5 | 10,1 ± 1,8 | 8,9 | 7,7 ± 1,5 | 10,4 ± 0,2 | 13,4 |
| [1- 13 C] lactato | 0,3 ± 0,3 | 1,6 ± 0,6 | 3.8 | 12,4 ± 4,5 | 15.1 | 22,5 ± 1,1 | 23,7 ± 3,5 | 43,7 |
Tabela 1: A proporção relativa de hyperpolarized metabolitos com respeito ao diferente número de células.
Mesa 2:Os resultados das duas local modelo de intercâmbio Diferencial.
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Discussion
13 CMRSI com sondas hiperpolarizados é um método promissor para monitorizar em tempo real o metabolismo in vitro e in vivo. Um aspecto muito importante quando se emprega este processo experimental é a padronização adequada, especialmente em relação experimentos in vitro. Em primeiro lugar, a preparação da amostra tem de ser feito de forma adequada e consistente para conseguir a mesma concentração de material hiperpolarizado em cada experiência. Isto requer uma pesagem precisa de tanto a amostra a ser hiperpolarizado e o tampão. Se a concentração não é correcta, o pH final da solução não é preciso, que pode ter uma influência sobre o t 1 e respostas das células. É também crucial para lidar com as células tão uniforme quanto possível. As células devem ser sempre preparadas de tal maneira que existe um mínimo de atraso entre a colheita de células e a experiência subsequente, a fim de minimizar o período de tempo, as células são mantidas a um nível muito elevado concentration e de baixo volume. Variação no protocolo de preparação de células, tais como a diferentes tempos de preparação ou temperaturas, pode resultar em variações substanciais nos dados obtidos. A mistura da amostra com as células também devem ser normalizados. É importante para medir o tempo entre as adições do traçador à suspensão de células e o início da medição, porque esta pode variar; durante a análise de dados, isto deve ser considerado.
A escolha correta da análise de dados e modelagem cinética é crucial na interpretação dos dados adquiridos. O modelo simples é adequado para uma reacção de um modo linear com uma taxa de dois metabolitos troca constante. Como descrito na introdução, piruvato sofre várias reacções enzimáticas e, mais importante, que também sofre uma reacção de permuta reversível não-enzimática com hidrato de piruvato. Esta reacção desempenhado um papel crucial nas experiências, e o seu efeito é bem demonstrado iN, a experiência com 8 × 10 7 células. Embora a Tabela 1 indica que a concentração relativa de piruvato hidrato é semelhante a outras experiências, quando intimamente investigados na Figura 6D, que mostra um sinal de piruvato hidrato muito mais elevada no início da experiência comparada com os outros ensaios. No entanto, quando a resolução temporal é resumida, esta informação importante está perdido e provoca um erro na reconstrução dos dados. Por outro lado, o modelo de troca diferencial de dois locais é uma descrição mais robusto e preciso da cinética porque inclui a resolução temporal no cálculo. Deste modo, ele inclui a troca não-enzimática com hidrato de piruvato, mesmo que rapidamente troca com piruvato durante a medição.
Existem várias estratégias de imagem para escolher entre a observar o sinal hiperpolarizado ou para controlar o metabolismo de uma molécula hiperpolarizado em preclinicaL e estudos clínicos. Durst et al. demonstrou as vantagens e desvantagens de diferentes pulso sequnces 76. A sequência de decaimento de indução de imagem deslocamento químico livre (FIDCSI) é relativamente robusto, mas tem uso limitado para multi-slice e imagem temporariamente resolvido. Eco-planar imagens espectroscópicas (EPSI) é robusto para questões de gradiente e fora de ressonância efeitos, mas, ele está propenso a artefatos de reconstrução. A decomposição iterativo de água e gordura com eco assimétrica e de mínimos quadrados de estimativa (IDEAL) 81, espiral de imagem deslocamento químico (ISPCSI), sequência de impulsos 35, e imagiologia deslocamento químico em espiral (SPCSI) tem alta eficiência de codificação, mas são sensíveis a B 0 inhomogeneity. A escolha da sequência irá depender das características do scanner, a questão biológica, e o sistema a ser investigado.
Há muitas exigências que precisam ser cumpridas para hiperpolarização bem sucedido. No entanto, taqui estão também várias limitações que a 13 técnica CMRSI hyperpolarized é hoje enfrentam. A principal limitação é inalterável e o tempo de relaxação T 1 do núcleo 13 C na molécula, o que define a quantidade de sinal detectável disponível no momento de medição específico. O sinal é reduzido por cada excitação de RF que provoca uma perda do sinal de hiperpolarização repetidamente durante a aquisição de dados. Outra limitação é o período de tempo relativamente longo que é requerido para hiperpolarizar uma molécula. Isto normalmente leva de 30 a 90 min.
Em comparação com outras técnicas de imagiologia, tais como molécula de [18F] -FDG PET, hiperpolarizado 13 CMRSI não requer tumores com aumento de vias metabólicas glicolíticas e, por conseguinte, o aumento de consumo de glucose. A técnica mostra um fluxo metabólico real, em tempo real. Por outro lado, [18F] -FDG PET não dá informação direta sobremetabolismo, mas apenas informações indiretas sobre a acumulação na área metabolicamente ativo. Isto pode causar um resultado falso negativo, onde o tumor parece ser metabolicamente inactiva, mas é, na verdade, utilizando diferentes vias metabólicas, tais como glutaminolysis, como fonte de carbono para a proliferação.
Em conclusão, a dissolução de DNP podem ser usados em uma variedade de aplicações para estudar uma lista ilimitada de doenças (tais como diabetes) 82, 15,36,45 medir o pH, ou monitorizar as alterações metabólicas em vários tipos de cancro. Estas medições podem ser realizados em diferentes níveis, a partir de experiências com células in vitro, por meio de estudos pré-clínicos utilizando modelos animais (tais como ratinhos, ratos, coelhos, porcos e cães), com recentes estudos clínicos humanos 57. As aplicações clínicas futuras irá apresentar uma ferramenta de diagnóstico muito poderoso e não-invasiva, que não só pode detectar e localizar a doença, mas também permitir a observação do tratamentoresposta em tempo real 83.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer | |
| GE/Agilent MR901 | GE Healthcare/Agilent Technologies | 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent | |
| Spinsolve Carbon | Magritek | 1 T NMR spectrometer with permanent magnet | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 7789-20-0 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monbasic | Sigma Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Disodium edetate | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | |
| Pyruvic acid - 13C1 | Cambridge Isotopes Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Dotarem (0.5 mmol/L) | Guerbet | gadoterate meglumine | |
| tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) | GE Healthcare | trityl radical used as a sourse of free electron | |
| PC3 cell line | ATCC | CRL1435 | |
| F-12K medium | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | SCRR-30-2020 | |
| Trypsine-EDTA Solution, 1x | ATCC | 30-2101 | |
| Sample plastic cup | Oxford Instruments | ||
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013-MSDS |
References
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