Summary
Bu çalışma serbestçe hareket eden bir fare içinde uyanık sistometri gerçekleştirmek için cerrahi prosedürleri ve deneysel teknikleri tanımlamaktadır. Buna ek olarak, optimizasyonunu ve standardizasyonunu destekleyen deneysel kanıtlar sağlar.
Abstract
Uyanık dolum sistometrisi, serbest hareket eden farelerde mesane fonksiyonunu değerlendirmek için uzun süre kullanılmıştır, ancak kullanılan spesifik metotlar laboratuvarlar arasında değişiklik göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, intravezikal bir tüp yerleştirmek için kullanılan mikrocerrahi prosedürünü ve uyanık, serbestçe hareket eden bir fare içine mesane basıncının kaydedilmesi için deneysel tekniği tanımlamaktır. Buna ek olarak, deneysel veriler, ameliyatın yanı sıra tüpün tipi ve boyutu, alt idrar yolları fonksiyonlarını ve kayıt hassasiyetini nasıl etkilediğini göstermek için sunulmuştur. Boru çapının basınç kaydı üzerindeki etkisi hem polietilen hem de poliüretan boru içlerinde farklı iç çaplarla değerlendirildi. Daha sonra, her iki materyalden en iyi performans gösteren tüp cerrahi olarak erkek C57BL / 6 farelerin idrar torbasının kubbesine yerleştirildi. Ameliyattan 2, 3, 5 ve 7 gün sonra, sağlıklı, bozulmamış hayvanlarda ve hayvanlarda, on iki saatlik bir gece boyunca mikozlanma sıklığı kaydedildi. Hasatta mesanelerŞişme bulguları brüt gözlem ile değerlendirildi ve daha sonra patolojik analiz için işlendi. Mesane şişmesinin büyük ölçüde mesane fonksiyonlarını önemli ölçüde bozduğu davranışsal işeme verileri ile korele olan 2. ve 3. günlerde gözlenmiştir. 5. günde, mesane histolojisi ve işeme frekansı normalize edildi. Çalışmalarımız tarafından sağlanan literatür ve kanıtlara dayanarak, uyanık bir faredeki intravezikal basınç ve boşluk hacmini in vivo olarak kaydetmek için aşağıdaki adımları öneriyoruz: 1) Ameliyatı bir ameliyat mikroskobu ve mikrocerrahi aletler kullanarak gerçekleştirin, 2) Polietilen-10 kullanın Hareket eserlerinin en aza indirgenmesi için hortumlar ve 3) Mesane şişmesi giderildiğinde ameliyat sonrası 5. günde sistometri uygulayın.
Introduction
Dolum sistometrisi (YB), mesane dolumunun yavaş olması sırasında basıncın kaydedilmesi için idrar kesesine kateter yerleştirilmesini içeren bir tanı yöntemidir. İlk olarak alt idrar yolları fonksiyonlarını değerlendirmek için klinik bir tanı yöntemi olarak 1927'de tanıtılan, yaygın olarak kullanılmaya devam edilmiştir. 1 Araştırma uygulamalarında FC, sağlıklı ve hasta hayvan modellerinde mesane fonksiyonunu test etmek ve farmakolojik ajanların etkilerini incelemek için kullanılabilir. Kemirgen hayvan modelleri alt üriner sistem fonksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. 2 Bu memeliler grubunda, FC ilk kez sıçanlarda kullanılmak üzere geliştirildi. 3 Burada, tüpü idrar torbasına yerleştirme ve FC'yi gerçekleştirme metodolojisi, birçok araştırmacı tarafından kabul edilebilir tekrarlanabilirlik seviyesinde tanımlanmış ve kullanılmıştır. Transgenik ve nakavt edilen suşların varlığı fareleri sayısız araştırma alanı için değerli bir türe dönüştürür,Alt idrar yolları disfonksiyonu da dahil olmak üzere. Fare sistometrisinin gerçekleştirilmesi için kullanılan metodoloji, laboratuvarlar arasında gözle görülebilir şekilde değişmekte ve sonuçların karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır. 5
Ekz vivo modellerle karşılaştırıldığında, FC düşük idrar yolu anatomisini korur ve mikrovasküler siklüsün depolanması ve boşaltma aşamaları sırasında mesane ve çıkışı arasında eşgüdümlü işlevin değerlendirilmesini sağlar. Önceki araştırmalar, yaygın olarak kullanılan sayısız anestezik maddenin kasılmasını baskıladığını göstermektedir. İdrar kesesi düz kası büzülmesini (üretan, a-kloraloz, ketamin ve ksilazin) koruyan, hayvanın mikroplaşmasına izin veren ajanlar, fonksiyonel mesane kapasitesini hala önemli ölçüde azaltacak ve nörotransmisyonu bastıracak ajanlar. 6 , 7 , 8 , 9 Teknik olarak daha zorlu olmasına rağmen, FC awAmatör hayvan ameliyatı refleksinin fonksiyonel bütünlüğünü korur.
Alt üriner sistem fonksiyonu post-operatif mesane duvarında şişme, ağrı ve rahatsızlıktan kaynaklanan stres ve çevresel etkiler gibi birçok faktörden etkilenir. Tüp implantasyonunda doku hasarını en aza indirgeyen bir cerrahi teknik kullanılarak ve tüp hareketini azaltan kayıt yöntemleri ile aynı anda hayvanın serbest dolaşımına izin verilmesi, doğru ve tekrarlanabilir kayıtlar elde etmek için gereklidir.
Eğer yeterince gerçekleştirilirse, in vivo Serbest hareket eden hayvanlardaki FC, fizyolojik mesane fonksiyonunu güvenilir bir şekilde yansıtan veriler sağlayabilir. Serbest hareket eden hayvanlarda 10 FC aşağıdaki parametreler hakkında bilgi sağlayabilir; Bazal veya baseline basınç: İki meme arasındaki minimum basınç. Ara geçiş basıncı: İki meme arasındaki ortalama basınç. Eşik basıncı: İntravezikal basınç immİyileşmeden önce iyice. Maksimum basınç: Bir miksiyon devri sırasında maksimum mesane basıncı. Spontan aktivite (veya ortalama intermiktürasyon titreşim basıncı): Müdahale basıncı eksi bazal basınç. Boşaltma kasılmaları: Dolum aşamasında intravezikal basıncın artması, sıvının serbest bırakılmasına bağlı değildir. Mesane uyumluluğu: Mesane kapasitesi, eşik basıncının eksi bazal basınca bölünmesiyle bölünür. Mikstürasyon frekansı: Birim zamanındaki mikrodalga sayısı. Ara geçiş aralığı: İki maksimum işeme basıncı arasındaki süre. Mesane kapasitesi: Verilen hacim, miksiyon sayısına bölünür. Bu parametrelerin ve standart terminolojinin ayrıntılı bir açıklaması daha önce yayınlanmıştır. 11
FC sürekli veya tek devirli intravezikal infüzyon yöntemi kullanılarak yapılabilir. Sürekli sistometri, birden fazla mikstürasyon siklusunun kaydedilmesine ve temsili verilerin seçilmesine izin verirTekrarlanabilirlik üzerine. Mesane kapasitesinin ölçülmesindeki doğruluğu, bilinmeyen artık hacim nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, serbest ambulasyon yapan farelerde küçük boşluklu hacimlerin (gerilme ve cinsiyet 30 ila 184 μL arasında değişen oranlarda) toplanması zor. Boşalmış hacmi kaydetmek için bu yöntemi kullanmak, anestezi uygulanmış bir preparatla karşılaştırıldığında daha az doğrudur, ancak anestezinin mesane fonksiyonundaki baskılayıcı etkilerini önlemesi açısından daha üstüntür. Mesane kapasitesini değerlendirmek için tek devirli sistometri kullanılmalıdır. Bu yöntemde, mesane, infüzyon öncesinde aspirasyon yoluyla boşaltılır ve kapasite, infüzyon oranının zamanla maksimum basınca çarpımı olarak hesaplanır.
Küçük kemirgenlerde sistometri yapma tekniği yayınlanmış olmasına rağmen, bir sıçanda gerçekleştirilen ameliyatı tarif etmiş ve fare sistometrisinin üretan anestezi altında yapılması önerilmiştir. 10 Bu iletişimin amacı tHem idrar torbasının kubbe içine intravezikal bir tüp yerleştirmek için kullanılan mikrocerrahi teknikler hem de sürekli mesane doldurma ve idiyesizlik sırasında uyanık bir şekilde hareket eden farede in vivo alt idrar yolları fonksiyonunu kaydetmek için kullanılan deney düzeneğini tanımlar. Buna ek olarak, tüpün uzunluğu, çapı ve malzemesinin yanı sıra vivo FC'yi gerçekleştirmek için kullanılan metodolojinin kaydı nasıl etkilediğini belirlemek için deneyler gerçekleştirildi. Bu deneysel protokol daha önce yayınlanmış teknikleri özetler ve deneysel sonuçlara dayanan bir takım değişiklikler önermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar, kurumsal kurallara göre Vermont Üniversitesi Hayvan Bakım Tesisinde barındırıldı. Tüm hayvan deneyleri, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzuna uygun olarak yürütülmüştür.
1. İntravezikal Boru İmplantasyonu
- Cerrahi işlem için hortum ve aletlerin hazırlanması
- Kateterin implantasyona sokulması için 7 cm'lik bir PE10 tüpünü kesin.
- PE10 tüpünün bir ucunda, ucun açık ateşe doğru yavaş yavaş ilerleyerek bir parlama oluşturun.
NOT: Ateş geliştikçe tüpü çabucak çekin. - PE10 tüpünün dışındaki alevli ucundan 4.5, 5 ve 5.5 cm'lik bir tutkal tabancasındaki düşük ısı ayarını kullanarak üç damla çok amaçlı sıcak tutkal uygulayın. Bunlar, tüpün hayvan sırtında sabitlenmesine yardımcı olacaktır. ( Şekil 1 )
- Boruyu% 70 oranında ıslatarak sterilize edin.Etanol ile yıkayın ve daha sonra steril% 0.9 NaCl ile yıkayın. Sisteme hava kabarcığı girmesini önlemek için tüp dolu halde bırakılmalıdır.
- PE10 kateteri ucunu, 30 gauge iğneyi göbeğe ayırarak, proksimal ucun yanına manuel olarak manipüle ederek 30 gauge fiş oluşturun. Sonuna bir damla sıcak tutkal uygulayın. Contanın su geçirmez olduğundan emin olun. ( Şekil 2 )
- Aşağıdaki iki mikro cerrahi aleti kullanın: İki çift Dumont # 7 eğri mikroforceps, iki çift Dumont # 5 kavisli mikroforceps, 21 G iğne, ultra ince düz hemostat, mikro makas, küçük diseksiyon makası ve mikro iğne tutucu.
- Prosedürü başlatmadan önce tüm aletleri sterilize edin.
- Hayvanın hazırlanması
- Hayvanı anestezi ettikten sonra önce karnın alt yarısını tıraş edin, sonra hayvanı eğilip tıraş edin ve üst sırttaki alanı% 70 alkolle temizleyip betadinle temizleyin. Kurumayı önlemek için gözlere veteriner merhemi uygulayın. Ardından, scapulae'ler arasında 1,5 cm'lik bir cilt insizyonu yapmak için steril örtülerle kaplı bir ısıtma yastığı (37 ° C) üzerinde hayvan sırtını yerleştirmek için düz, künt bir makas çifti ve Dumont # 7 eğri mikro-forseps çifti kullanın.
- Sonunda karnı alkol ve betadin ile temizleyin.
- Ameliyat prosedürü
NOT: 3.15X ila 20X aralığında büyütme ile tüm cerrahi işlemleri mikroskop altında gerçekleştirin. Hayvanı steril örtüye yerleştirdikten sonra steril eldiven koyun. Tüm ameliyat boyunca steril prosedürleri kullanmaya devam edin.- Hayvan bir indüksiyon kutusu yerleştirin ve bir oksijen taşıyıcı (1 L / dakika) ile% 2 inhale izofluran kullanarak anestezi. Hayvan kafasını bir burun konisine yerleştirerek ve oksijen taşıyıcılı (% 1 L / dakika)% 2 inhale izofluran kullanarak prosedür boyunca anestezi uygulayın. Negatif aldıktan sonra ameliyatı başlatınToe-pinch testinden ative yanıt.
- Deriden 1.5 cm daha düşük, orta hatlı karın kesi yapmak için düz kör makas ve çift Dumont # 7 eğri mikro-forseps kullanın. Ardından, kubbeyi ve idrar torbasının üst yarısını ortaya çıkarmak için linea alba ve kas boyunca fascia aracılığıyla uygun bir kesi oluşturun. Bir çift Dumont # 7 kavisli mikro-forseps kullanarak her doku katmanına yukarı çekiş uygulayarak mesaneye zarar vermekten kaçının. Sıcak fizyolojik tuzlu su damlaları ekleyerek kurutmadan karın iç organını tutun.
- Boynunun ağzındaki kesiğe erişmek için hayvanı yana çevirin. İnsizyona rağmen dar bir hemostatı subkütan yönde itin. Deri altı kanalı arkadan başlamalı ve yana doğru ilerlemelidir.
- Aletin ucu göğüs kafesinin alt kısmına eriştiğinde, ucu orta hatta ve karın içine doğru çevirin (karın duvarındaki kasları deldiğinde hafif bir pop olacaktır). İğne, kas tabakası altındaki karın kesisine maruz kalana kadar hemostatı ilerletmeye devam edin. ( Şekil 3 )
- Hortumun "alevsiz" ucunu hemostatla tutun ve borunun ucunu boynun arka kısmındaki kesiğin içinden çekerek yavaşça aleti geri çekin. Hortumun alevlenen ucunu, mesanenin kubbesinin hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
- 6-0 monofilament sütürden (absorbe edilemeyen) gevşek bir bağ oluşturun ve mesane kubbesinin üzerine yerleştirin. Bu kravat tüpün mesaneye sabitlenmesi için daha sonra kullanılacaktır.
- Karın ve mesanenin arkasında küçük bir tüysüz doku yerleştirin ve stabilize etmeye ve yükseltmeye yardımcı olun.
- PE10 kateterinin alevli ucunu mesaneye sokmaya hazırlayın.
- Hakim olmayan elinde mesanenin kubbesini Dumont # 7 eğri mikroforce ile tutun ve kateter mesaneye yerleşene kadar tutun.
- 21 metrelik bir iğne kullanın tO kubbenin tepesinde bir sistotomi yapın. Kateterin delikten kolaylıkla geçebildiğinden emin olmak için nazikçe sistotomiyi kapalı kavitili # 5 kavisli mikroflepses çifti ile muayene edin.
- Mesane kubbesini egemen olmayan elinde tutmaya devam ederken, PE10 kateterinin alevlenen ucunu mesaneye yerleştirin (parlamayı, mesane boynuna aşağı itin, böylece emniyete alınmaz).
- 6-0 monofilament sütürü, mesanenin kubbesi etrafına bağlayın ve hortumun önüne yerleştirilen bağ ile bağlayın. Mesane kapasitesini yapay olarak azaltmaktan kaçınmak için dikiş makinesini mümkün olduğunca yukarı doğru bağladığınızdan emin olun. ( Şekil 4 )
- Alternatif olarak, kateteri aşağıdaki gibi bir çanta dize dikişi kullanarak sabitleyin. 6-0 monofilament kullanarak mesanenin kubbesinde gevşek bir çanta dikiş dikişi yapın. Sistotomi yapmak ve kateteri takmak için 1.3.8.1 - 1.3.8.3 adımlarını takip edin. Torbayı, cüzdan dikiş dikişini bağlayarak sabitleyin. ( Şekil 5 )
- Tüpün distal ucuna 30-gauge iğne ile 0.5 mL'lik bir insülin şırınga takarak mesanedeki tüpün açıklığını ve mühürünü test edin. Üretra deliğinde bir damla görünene kadar mesaneyi 0.1-0.2 mL% 0.9 NaCl ile yavaşça doldurun, daha sonra mesaneyi aspirasyonla boşaltın. Mesanenin doldurulup boşaltılması önemlidir.
- Kubbe sızıntısı olmazsa, mesaneyi bir çift kavisli mikro-forseps ile tutun ve ateş parmakları mesane kubbesinin içine yaslanana kadar hortumu hafifçe çekin.
- Kapanmadan önce küçük doku rulolarını çıkarın ve mesanenin normal konumunda olduğundan emin olun.
- Karın duvarını iki kat halinde (kas ve deri) 6-0 koşu sütürüyle kapatın. Rektus abdominis kasının anterior abdominal fasya kenarlarını dikenleyerek (rektus kılıfının ön duvarı) yaklaşık olarak bulunması tercih edilir.
- Hayvanlardaki tüpleri emniyet altına almak için, nazikçe roHayvanı karnına yatırın. Metal ankrajın subkütan kısmını interkapüler kesi içine sokun. ( Şekil 12 ) Tüpü sabitlemek için bir 6-0 dikiş kullanın ve dikey bir şilte dikişiyle onları çevreleyerek tutturun.
- Tüpün dışarı çıkmasını önlemek için cildin üstünde ve altında bir tutkal baloncuğu kalmasını sağlayın. Tüp cildin yaklaşık 2 cm üzerinde kesilir.
- İdrarın dışarı sızmasını önlemek için, 30 gauge fişini (adım 1.1.5) tüpün sonuna hafifçe yerleştirin.
- Hidrasyon için 0.5 mL% 0.9 NaCl subkutanöz enjekte edin. Ameliyattan hemen sonra ameliyat sonrası analjezi uygulayın ve 48 saat boyunca koruyun.
- Hayvanı bir kızılötesi lamba altında bulunan kafese geri koyun. Hayvan kafesin etrafında rahatça dolaşana kadar sürekli gözlem altında tutun.
- Hayvanı günlük olarak izleyin ve kayıttan önce 5 gün boyunca iyileşmesine izin verin.
2. Uyanık KistOmetri Kayıt
- Kayıt programının hazırlanması, basınç transdüseri ve infüzyon pompası.
- Hayvana anestezi vermeden önce, infüzyon pompasını, basınç transdüserini ve PE50 tüpünü kullanarak 22 G'lik döndürmeyi birbirine bağlayın. ( Şekil 6 )
- Sistem basıncını ayarlamak ve kayıt için hazırlanmak için bir bilgisayarda kayıt programını açın (bir örnek için malzeme tablosuna bakın). Kalibrasyon ve kayıt sırasında aynı ayarları kullandığınızdan emin olun.
- 10 - 15 mL oda sıcaklığında% 0.9 NaCl içeren 20 mL'lik bir şırınga doldurun ve infüzyon pompasına yükleyin. Pompayı, 0,6 mL / saat'lik bir hızla infüze edecek şekilde programlayın.
- Basınç dönüştürücüyü hayvan mesanesi ya da kayıt kafesinin alt kısmı ile aynı yükseklikte sabitleyin.
- 22-mastar maki- neyi basınç transdüserinin sonuna takın (PE50 - hortum - basınç transdüseri döndürmek için)
NOT: Döndürme, tüpün bükülmesini veya kıvrılmasını önlemek için kullanılırHayvan hareket ediyor. - Şırınga pompasını sistemde% 0.9 NaCl'yi boşaltmak için ileri alın. Kalibre etmeden önce tüm hava kabarcıklarını kaldırdığınızdan emin olun.
- Kayıt programı çalışıyorken basıncı kalibre etmek için bir cetvel kullanın (cm / H 2 O). PE50 bağlantısının ucunu 0 ile 30 cm arasında yavaşça hareket ettirin. Gerekirse sıfır ayarlayın.
NOT: 0-cm işareti, kayıt kafesi ve basınç transdüseri tabanı ile aynı yükseklikte olmalıdır.
- Kayıt kafesinin merkezine 22-mastar çevirme askısını durdurun. Kafes tabanı, idrarın, kafesin altına yerleştirilmiş denge toplama cihazına düşmesine izin verdiğinden emin olun. Farenin yüksekliğini ayarlayın, böylece fare, boruyu zorlamadan veya gererek kafesin etrafında özgürce hareket edebilir. ( Şekil 7 )
- İşiniz bittiğinde, sistemin ve harici PE50 tüplerinin% 0.9 NaCl ile dolu olduğundan emin olun ve tüm hava kabarcığı çıkarın.
- HazırlıkHayvanın kayıt için aranması
- Hayvanı% 2 inhale izofluran ile anestezi altına alınız ve karnının üzerine koyunuz. 30-gauge fişini çıkartın ve PE10 tüpünü (mesane kateteri) PE50 bağlantısının ucuna kaydırın. Su geçirmez bir mühür oluşturmak için sıcak tutkal kullanınız.
- Anestezi kapatın ve hayvanı, idrarın doğrudan analitik bir terazinin üzerine yerleştirilen bir toplama cihazına düşmesine izin verecek şekilde paralel tel zemin ile kayıt kasasına yerleştirin. ( Şekil 7 )
- Hayvan kafesteyken kayıt işlemine başlayın, ancak içeri sokmaya başlamayın. Anesteziden tamamen kurtarılana kadar hayvanı izleyin. Mesane basıncı stabilize olduktan sonra 0,6 mL / saat'lik bir oranda% 0.9 NaCl verilir.
NOT: Herhangi bir değişiklik yapılırken kayıt programında not alın. Enfüzyon başladığında, durduğunda veya düzensizliklerin ortaya çıktığı zaman bir kayıt olması önemlidir. - Sistemi sızdırmazlık açısından kontrol edin ve hayvanın kolay erişime sahip olduğundan emin olunYiyecek ve suya.
- Üç tekrarlanabilir miksiyon döngüsü elde edilinceye kadar sessiz bir odada kayıt işlemine devam edin.
NOT: Hayvan, kayıt boyunca tamamen rahatsız edilmemelidir. Tercihen, davranış gözlemlemek için uzaktan video izleme kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüp oklüzyonu esnasında sistem içerisindeki basınç artışı ve düşüşü tutarlılığında tüp malzemesi ve çapları arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Mesane duvarında şişme posttravezikal tüp implantasyonu hem polietilen (PE) hem de poliüretan (PU) materyalleri için önemlidir. 2. günde, ciddi submukozal şişme gelişti. Mesanenin yarı kesitini işgal etti, bu da lümenin tıkanmasına neden oldu. 5. günde, ödemin tamamen çözülmesi, submukozal bölgeleri muskularis'i kısmen işgal eden inflamatuar hücrelerle infiltre bıraktı. 7. günde inflamatuvar infiltrasyon önemli ölçüde azaldı ve mesane duvarının histolojisi normale döndü ( Şekil 8 ). 2. günde ve 3. günde gözlemlenen en büyük doku şişmesi, mesane fonksiyonunu önemli derecede bozulmuş olan davranışsal işeme verileri ile korele olmuştur ( Şekil 9 ). Boşaltma frekansı po tarafından normalize edildi Ameliyat günü 5.
Uyanık, serbestçe hareket eden farede (minimal hareket artifaktlarıyla) intravezikal basınç, 10-15 cm H2O temel hattı basıncı ile karakterize edilir; bu, dolum döngüsü boyunca değişmeden kalabilir veya kademeli olarak 10 cm H2O'dan fazla artmayabilir , Ardından ani, pulsatil basınç artışı ve daha sonra işeme sırasında damla ( Şekil 10 ve 11 ).
Şekil 1: İdrar Mesanesine İmplantasyon için PE10 Boru. ( A ) Alevli uçtan 4.5, 5 ve 5.5 cm sıcak tutkal damlaları olan 7 cm PE10 tüp. ( B ve C ) Tüpün alevlenen ucu (mesane tüpünü sabitlemek için kullanılan) gösteren ayrıntılı bir resim.Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: PE10 Mesane Borunun Dış Kısmı İçin Tak. Tapa 30 G'lik bir iğne ve sıcak tutkaldan yapılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Mesane Boru Yolları. Tüpün karın yoluyla boyun ağzına doğru subkütan yolu ile yerleşimini gösteren şematik çizgi çizimi. Daha büyük görüntülemek için lütfen tıklayınız.Bu şeklin versiyonu.
Şekil 4: Bir Lose Monofilament Sütür Kullanarak Tüpü Takma ve Güvenli Kılmak İçin Mesane / Boru Karşılaştırması ve Adımları. Ameliyat esnasında çekilen fotoğraflar: ( A ) PE50 ve PE10'u bir fare mesane ile karşılaştıran resim. ( B ) Mesaneyi çevreleyen küçük bir 6-0 monofilament dikiş ipliği. Bir çift 5 mikroforce mesane kubbesini tutarken, 21 G iğne kistotomi yapmak için kullanılır. ( C ) Mesanenin kubbesini serbest bırakmadan, zıt eldeki bir çift # 5 mikrofüze, PE10 kateteri yerleştirmeden önce deliği problar. ( D ) mesanenin kubbesinde 6-0 monofilament sütür ile sabitlenmiş PE10 kateteri. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için.
Şekil 5: Bir Purse String Suture, Tüpü Mesanede Sabitlemek İçin Alternatif Bir Yöntem Olarak Kullanılabilir. ( A ) Mesanenin kubbesinde çanta dize sütür. ( B ) PE10 tüpleri cüzdanın ortasından geçirilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Deneysel Kurulum. İnfüzyon pompasında% 0.9 NaCl içeren şırınga, basınç dönüştürücü ve intravezikal kateterle seri bağlanmıştır. Sağ alt taraftaki bilgisayar ekranı üç tekrarlanabilir mict gösterirDönüş çevrimleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Deneysel Kayıt Ayarı. ( A ) 22 G dönebilen bir kayıt kafesi ve denge üzerine asılmıştır. ( B ) İnfüzyon tüpünün dış kısmının tüm uzunluğunu 22 G'lik bir döner ve bir PE50 bağ ile gösteren fotoğraf. ( C ) PE50 tüpünü örten bir yay kılıfı olan 22 G'lik bir döner. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: Yeniden Histolojik Değerlendirmeİdrar Mesane Duvarının İmplante PE10 Tüpüne cevabı. Ameliyattan 2, 3, 5 ve 7. günler önce hematoksilin ve eozin (H & E) ile boyanan mesane kesitleri. Mesane duvarında şişme ameliyat sonrası 5. gününde düzeldi . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız .
Şekil 9: Voiding Spot Assay'ı kullanarak fonksiyonel mesane değerlendirmesi. UV tonu ile incelenen filtre kağıdındaki idrar lekeleri, 0. günde (tüp implantından önce), 2, 3, 4, 5 ve 7. post-intravezikal tüp implantasyonunda temsil eden mikstürasyon modelini belgelemektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 10: Sistometrogram. Uyanık, serbestçe dolaşan bir farede intravezikal mesane basıncının temsilcisi. 3 tekrarlanabilir miksiyon döngüsü gösteren iz. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 11: Mikstürasyon Aşaması. Basınçtaki ilk artış, tepe basıncı ve taban çizgiye hızlı basınç düşüşü sırasında yüksek frekans salınımlarıyla birlikte mikstürasyon fazını gösteren iz. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 12: Bağın Bağlanması. ( A ) PE10 kateteri hayvana sabitlemek ve tüpün mesane üzerine çarpmasını önlemek için kullanılan çapa. Disk, yay kılıfına tutturulmuştur. ( B ) Harici PE50 tüpüne bağlı dahili PE10 kateteri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 13: Döner Çapa. Çapanın subkutan kısmı, ( 1 ) kumaştan yapılmış bir disk ve ( 2 ) metal bir halkadan oluşur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İntravezikal hortumun optimum materyali ve boyutu
Basınçlı kayıtlarda boru çapının etki tayini için, farklı mikroakışkan tüpleri test ettik; PE50 (0,58 mm ID), poliüretan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) ve PE10 (0,28 mm ID). Her tüp için basınç, tüpü 0 ila 30 cm arasında dikey olarak hızlı bir şekilde hareket ettirirken 1 mL / saat hızla infüzyon pompası ile kaydedildi. Başlangıçtaki in vivo deneyler, PE50 tüpünü kullanmayı denedi, ancak fare mesanesine kıyasla hortumun boyutu nedeniyle başarısızdı ( Şekil 4A ). Bu, bir faredeki uyanık sistometri için PE50 tüpünün kullanılması, verilerin yorumlanmasını zorlaştıran eserler yarattığını öne süren Smith ve Kuchel'in bulgularını desteklerken, başkalarının PE50 tüplerini hem uyanık hem de serbestçe kullandıklarını not etmek önemlidir , Uyanık kısıtlanmış ve anestezi uygulanmış fare sistometrisi. 9 ,Sup10 = "xref"> PE50 ile karşılaştırıldığında, PE10 daha esnektir; bu sayede fare hareket ettikçe borunun mesaneye uyguladığı gerginlik miktarını azaltır ve hareket eserlerinin azaltılması sağlanır. PE10'un kesitinin mümkün olduğunca kısa olması (≤ 7cm) önemlidir. Daha uzun PE10 tüpleri basınç okumasının nemlendirileceği olasılığını artırır. Enflamatuar reaksiyonu azaltmak için intravezikal implantasyon için PU gibi daha yumuşak, daha biyolojik olarak inert bir materyal kullanmak teorik bir avantaja sahip olmakla birlikte, post-operatif mesane şişmesinde anlamlı bir farklılığa neden olmamıştır. Ayrıca, daha yumuşak PU tüplerini kullanan denemeler, bükülme ve tıkanma ile ilişkilendirildi.
Cerrahinin mesane duvarında kontraktilite ve şişme üzerine etkileri
Şimdiye kadar, mesane fonksiyonu ve mesane duvarında şişme, intravezikal bir tüp implant sonrası veriler sıçanlar için mevcuttu. Önceki sIşeme sonrası hacim daha düşüktü ve işeme sonrası sıklığı postoperatif 1-3 günlerde daha yüksekti.15 Ayrıca bir sıçanın mesane fonksiyonundaki değişikliklerin mesanenin şiddetli şişmesi ile ilişkili olduğu ve ödemin 3'ten sonra azalmaya başladığı gösterildi günler. PE10 hortum implantasyonundan kaynaklanan erkek, C57BL / 6 farelerinin, mesane duvarındaki şişme ve tamir zaman çizelgesindeki değişimin daha iyi anlaşılabilmesi için, 12 saatlik davranışsal boşluk sıklığı, filtre kağıdı kayıt yöntemi kullanılarak değerlendirildi . Son kayıttan sonra, fare anestezi altına alındı ve mesane kabaca değerlendirildi, hasat edildi, sabitlendi ve histolojik olarak değerlendirildi. Ameliyat sonrası 1. gün ve 2. gün, işeme sıklığı azaldı ve lekelenme arttı ve ardından 3. günde işeme oranında artış oldu. 5. günde normalize edilen boşaltma davranışı. Hasat ve ardından H & E boyamada mesane değerlendirmeleri arasında en büyük miktarPost-operatif 2 ve 3. günlerde subro- korelyal şişme, mesane tüp implantının ardından 5. ve 7. günlerde kontrol mesanelerine benzemektedir.
Klinik ürodinamik çalışmalara benzer şekilde, laboratuvarların çoğunluğu oda sıcaklığında% 0.9 NaCl kullanmıştır. 11 Önceki çalışmalardaki infüzyon hızı, 10 μL / dk'dan 100 uL / dk'ya kadar önemli derecede değişir. 17 , 18 Farklı infüzyon oranlarının bir farede mesane fonksiyonu üzerindeki etkilerini karşılaştıran bir çalışma henüz yapılmadı, daha büyük hayvan çalışmalarında elde edilen veriler daha yavaş dolum oranlarının kullanılmasını önerdi. Fare mesanesinin hacminin az olması nedeniyle, peristaltik pompalar uygun değildir ve sürekli bir mekanizma infüzyon pompası gereklidir.
En doğru ve kullanışlı FC kayıtları, sınırlı eserler ile basınç değişikliklerinin iyi bir şekilde geçirgenliğini dengeler. Elde edilen sonuçlarDoğrudan PE50'ye bağlı olan PE10 tüpünün kısa bir bölümü, fare mesane içindeki basıncın doğru bir ölçümünü sağlamıştır. Hayvan hareketinin neden olduğu basınç dalgalanmaları, tüpün boynun kenarına çıktığı noktada cilde sabitlenmesiyle sınırlanabilir ( Şekil 12 ve 13 ). Bu, yapışkan kabarcığı ve subkutan olarak yerleştirilen metal kumaş kaplı bir plakadan ve tübü örten metal yaya tutturulan harici parçadan oluşan özel bir çapa kullanılarak başarılabilir. Tüpün mesane üzerinde çekilmesini önlemeye yönelik ek yöntemler arasında PE10 tüpünün iç kısmı için tüpün gevşekliğini sağlayan eğri bir subkutan parça oluşturulması ve bükülmeyi ve kıvrılmayı önleyen bir döner ve bağ kullanılmasını içerir. Bu çalışmaların sağladığı literatür ve kanıtlara dayanarak, in vivo için en tekrarlanabilir ve fizyolojik olarak doğru yöntemi sağlamak için aşağıdaki adımlar önerilmektedirBir fare içindeki intravezikal basıncın kaydedilmesi. Kateterin idrar torbasının kubbesine yerleştirilmesi için bir ameliyat mikroskopu ve mikrocerrahi alet kullanın. Ameliyat ve kayıt arasında 5 gün kurtarma periyoduna izin verin. Hayvanı, aynı kafeste kayıt işleminin yapıldığı yerde gerçekleştirin ve yiyecek ve suya ücretsiz erişin. Deneyi, en azından insanın temas etmeden sessiz bir ortamda gerçekleştirin, ideal olarak hayvanın davranışını gözlemek için uzaktan video izleme kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
