Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren der Fisch Sperma Bewertung mit computerunterstützten Spermiogramm und Kühlgeräten. Die Software bietet eine schnelle, genaue und Quantitative Analyse von Fisch Spermienqualität basierend auf Motilität der Spermien, die ein nützliches Werkzeug in der Aquakultur Reproduktionserfolg zu verbessern sein kann.
Abstract
Für die Qualitätsbewertung der Gameten gibt es innovative, schnelle und quantitative Techniken, die nützliche Hinweise für die Aquakultur liefern können. EDV-Systeme für Spermiogramm wurden entwickelt, um mehrere Parameter zu messen und eines der am häufigsten gemessenen ist die Beweglichkeit der Spermien.
Zunächst wurde dieser Computertechnologie für Säugetierarten, entwickelt, obwohl es auch für Fisch-Sperma-Analyse verwendet werden kann. Fische haben Besonderheiten, die Spermien Bewertung wie eine kurze Motilität Zeit nach der Aktivierung und in einigen Fällen Anpassung an niedrigere Temperaturen beeinflussen können. So ist es notwendig, sowohl Hardware als auch Software-Komponenten, Motilität Analyse effizienter für Fisch Spermiogramm machen zu ändern. Für Säugetier-Samenzellen wird die Heizplatte verwendet, um optimale Temperaturen von Spermien zu erhalten. Für einige Fischarten ist es jedoch vorteilhaft, eine niedrigere Temperatur zu verwenden, um die Dauer der Motilität, zu verlängern, da das Sperma weniger als 2 min. lang aktiv bleiben. Kühlgeräte sind daher notwendig, über die Zeit der Analyse, einschließlich auf dem optischen Mikroskop Proben bei konstanter Temperatur im Kühlschrank zu lagern. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Fisch Samenzellenmotilität mit Software für Spermiogramm und neuen Kühlgeräten um die Ergebnisse zu optimieren.
Introduction
Die Wirksamkeit der Wiedergabe hängt von der Qualität der beiden Gameten (Eizellen und Spermien)1,2. Dies ist der wichtigste Faktor, der zur erfolgreichen Befruchtung, soll die Entwicklung von lebensfähige Nachkommen3,4beiträgt. Die günstige Bewertung der Gameten Qualität ist das beste Werkzeug für die Definition der Fruchtbarkeit Potenzial einer Probe.
Mischen von Sperma von mehreren Männern, ist eine gängige Praxis bei der Herstellung von vielen aquatischen Nutztierarten4. Jedoch die Spermien Variabilität zwischen Männern zu Spermien Wettbewerb führen kann und folglich nicht alle Männer tragen ebenso zu den gen-Pool-5. In diesem Sinne ist die korrekte Beurteilung der einzelnen Ejakulat/Spermien Features, z. B. Motilität, grundlegend für diskriminierend über einzelne männliche Fruchtbarkeit potenzielle informieren. Direkter Beobachtung der Beweglichkeit der Spermien kann ungenaue und subjektiven Daten produzieren, wie es erfordert Zeit und Erfahrung, führt zu einem Mangel an Konsistenz und Unvereinbarkeit der Ergebnisse6,7. Allerdings gibt es viele innovative, schnelle und quantitative Techniken, die eine zuverlässige Spermien Qualität Analyse2,4bieten können.
Computergestützte Spermiogramm wurde entwickelt, um genaue Daten über Spermien Qualität8bieten. Diese Technologie umfasst die Entwicklung von Software verbunden mit einem Phase-Kontrast-Mikroskop, mit dem die Beurteilung der Beweglichkeit der Spermien können. Ein limitierender Faktor der Motilität Parameter ist jedoch die Frame-Rate der Videokamera. Einzelne Bahnen auf Spermien basieren Spermien Kopf Zentroid Position in aufeinanderfolgenden Rahmen von Videoaufnahmen, die mit den flagellar Bewegung Muster3,9,10, korreliert ist 11. die wichtigsten kinetischen Parameter gemessen sind die lineare Geschwindigkeit (VSL), krummlinigen Geschwindigkeit (VCL) und durchschnittliche Bahngeschwindigkeit (VAP). VSL ist der Abstand zwischen den Start- und Endpunkt durch die Spermien geteilt durch Zeit genommen. VCL ist die reale Geschwindigkeit entlang der präzise Flugbahn genommen durch die Spermien. VAP ist die Geschwindigkeit auf eine abgeleitete geglätteten Weg der Flugbahn. Diese Parameter ermöglichen zusätzlichen kinetische Informationen, einschließlich Linearität (LIN), Geradheit (STR), wackeln (WOB) und schlagen Messungen wie Amplitude der seitlichen Kopfbewegung (ALH) und Beat-Kreuz Frequenz (BCF)4,10.
Die Sperma-Analyse-System wurde ursprünglich für Säugetierarten verwendet, und eine der Voraussetzungen für das System ist bei der Körpertemperatur des Spenders (etwa 37 ° C) betrieben. Diese Software könnte auch für Fischarten verwendet werden; Obwohl es einige Anpassungen, die Fehler der Spermien Analyseergebnisse zu reduzieren muss. Bei einigen Fischarten wie Salmoniden und Aal8,12tritt Befruchtung bei niedriger Temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Kühlgeräte sollten so entwickelt werden, um unangenehme Arbeitsbedingungen zu vermeiden. Darüber hinaus Fisch Spermien sind in der Samenflüssigkeit unbewegten und erfordern einen osmotischen Schock, Motilität zu aktivieren. Für Süßwasserarten sollte das Aktivator Medium hypotone Osmolalität haben, während das Medium für Meerestiere hypertonen sein sollte. Allerdings könnte für einige Arten als Salmoniden, die Ionenkonzentration auch wichtig3,4,9sein. Nach der Aktivierung ist Fisch Sperma gekennzeichnet durch einen raschen Rückgang der Motilität (weniger als 2 min.)13,14 und hoher Geschwindigkeit, wird entscheidend für die optimale Bildrate zu zuverlässigen Daten15bestimmen.
Die Ziele dieser Studie sind design und Kühlanlagen für Fisch Spermaproben anwenden. Dieses Protokoll definiert zudem die optimale Frameraten für die Einrichtung von Standardprotokollen je nach Tierart zu bestimmen. Die Verwendung dieses Protokolls öffnet neue Türen im Zusammenhang mit Fisch bahnbrechenden Bewertung, mit der europäische Aal als Modell.
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Protocol
Verfahren mit tierische Probanden wurden genehmigt (2015/VSC/Erbse/00064) durch die allgemeine Ausrichtung der landwirtschaftlichen Produktion und Vieh an der Universitat Politècnica de València.
1. sammeln Sie Sperma aus reifen europäischen Aale in Gefangenschaft
Hinweis: Verwendung europäischer Aal Männchen im Becken mit Meerwasser und ein Kreislaufsystem bei konstanter Temperatur (20 ° C) beibehalten. Behandlung mit Hormonen durch wöchentliche intraperitoneale Injektion (humanes Choriongonadotropin (hCG); 1,5 IU pro g Fisch Körpergewicht). Akklimatisieren Sie allmählich mit 3 Tage in Süßwasser Fische gefolgt von Ersatz mit Meerwasser (1/3 des gesamten Wassers im Tank) alle 2 Tage bis zum Erreichen einer Salinität von 37,0 g/mL.
- Betäuben Sie Aal 24 h nach der Hormon-Injektion, Proben mit bessere Qualität der Spermien zu erhalten.
- Im Vorfeld die Narkose bereiten: 100 mL 70 % igem Ethanol 300 mg Benzocain hinzufügen. Gut mischen und bei 4 ° c Lagern
- Verdünnen Sie Benzocain in einem flexiblen Eimer mit 5 L System Wasser um eine Endkonzentration von 60 mg/L und richtig mischen.
- Übertragen Sie den Fisch in den Eimer mit Wasser und Benzocain. Warten Sie einige Minuten, bis die Fische beruhigen.
- Deaktivieren Sie den Genitalbereich mit Wasser und trocknen Sie mit saugfähigem Papier zur Vermeidung von Kontaminationen von Spermaproben von Kot, Urin oder Meerwasser.
- Üben Sie sanften Druck im Bauchbereich und sammeln Sie die Spermaproben in 15 mL Kunststoffrohre mit der Vakuumpumpe. Spermavolumen bis zu 6-7 mL, abhängig von der männlichen.
- Halten Sie Spermaproben bei 4 ° C für mindestens 1 h bis Motilität Analyse durchgeführt wird.
(2) im Kühlschrank lagern Sie und verdünnen Sie die Spermaproben
- Verdünnungsmittel Lösung im Voraus zubereiten.
Hinweis: Die Spermaproben sollten in der Extender-Lösung speziell für jede Art verdünnt werden.- Aal Spermaproben (P1 Medium)-Aktivator Medium vorbereiten. 0,42 g Natriumbicarbonat, 1,828 g Natriumchlorid, 0,127 g Magnesiumchlorid, 0,56 g Kaliumchlorid und 0,037 g Calciumchlorid, 250 mL destilliertem Wasser zugeben. Mischung gut aufzulösen. Shop bei 4 ° C.
- Setzen Sie den Kühler bei 4 ° C Proben bei einer konstanten Temperatur zu halten. Warten Sie, bis die Temperatur stabilisiert.
- Verdünnen Sie die Spermaproben mit Verdünnungsmittel Lösung für jede Art bestimmten.
Hinweis: Das Verdünnungsverhältnis ist bestimmte Arten und muss definiert werden, um das Protokoll zu standardisieren. Erstens schätzen Sie samenzellenkonzentration basierend auf die Konzentration, die in der Pre-Analyse der Motilität mit Software, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben. Mit dieser Analyse ist es auch möglich, die besten Spermaproben ausgehend vom prozentualen Anteil der Motilität zu wählen. Danach kann der Forscher starten, Daten für das Experiment mit der besten Proben mit der richtigen Konzentration zu sammeln.- Verdünnen Sie Aal Spermaproben P1 mittelfristig mit einem Verhältnis von 01:50. Fügen Sie um 500 µL verdünnt Aal Sperma vorzubereiten, 50 µL der Probe frisches Sperma und 450 µL P1. Mischen Sie gut.
(3) die Spermien-Motilität-Parameter auswerten
-
Aufbau der Motilität-Modul der Software
- Bühne frei bei 4 ° C kühler und warten, bis es stabilisiert.
- Öffnen Sie die Software und wählen Sie Motilität Modul. Erstellen Sie Benutzernamen und Passwort, falls erforderlich.
- Wählen Sie Eigenschaften und wählen Sie die gewünschten Parameter vor dem Start das Spermiogramm.
- Klicken Sie auf Arten | Fisch.
- Wählen Sie die Frames pro Sekunde und Anzahl der Bilder, die besten technischen Voraussetzungen für jede Art. Legen Sie beide Optionen mit 120 Bildern pro Sekunde.
- Negativer Kontrast zu wählen. Es ist zwingend erforderlich für die genaue Rekonstruktion der Spermien Trajektorien16.
- Wählen Sie die entsprechende Kammer zählen und Maßstab der Videokamera. Kalibrieren Sie die Video-Kamera für die Vergrößerung Objektiv in das Experiment verwendet. Festlegen Sie SpermTrack10 als Zählkammer und 10 X-Skalierung.
Hinweis: In der Regel eine Tiefe von 10 µm in der Zählkammer und eine vergrößerungslinse von 10 X sind die empfohlenen Bedingungen da sie bieten eine bessere Fokussierung von alle Spermien und die höchste Anzahl an Zellen zu erfassen. Es wird jedoch empfohlen, eine frühere Studie über die optimalen Bedingungen für die Motilität Analyse der einzelnen Arten zu machen. - Passen Sie die Partikel Bereich und Konnektivität für jede Spezies. Stellen Sie minimale Partikel Bereich bei 2 µm2 und Konnektivität bei 7 µm.
Hinweis: Für Fisch hängt der Minimalwert der Partikel Gebiet erstreckt sich zwischen 2 bis 5 µm und Konnektivität die Geschwindigkeit der Spermien und die Frame-Rate. - Speichern Sie das Setup.
- Wählen Sie erfassen.
-
Europäischer Aal Spermien mit Software zu analysieren
- Bereiten Sie die Aktivator-Lösung (künstliches Meerwasser) indem Sie 25 mL destilliertem Wasser mit 2 % BSA 0,946 g kommerziellen Salz hinzufügen.
- 500 mL Aktivator-Lösung (künstliches Meerwasser) und in den Kühler.
Hinweis: im Allgemeinen ist Fisch Sperma von einem osmotischen Schock-Ereignis aktiviert obwohl für einige Arten der Ionenkonzentration auch wichtig sein könnte. Für Süßwasserarten sollte das Aktivator Medium hypotone Osmolalität haben, während das Medium für Meerestiere hypertonen sein sollte. - Setzen Sie Zählkammer unter der kühlenden Bühne und warten Sie, bis die Temperatur um 4 ° c stabilisiert
- Mischen Sie die Aktivator und verdünnten Sperma Spermien aktivieren und starten Sie die Motilität Videoaufnahme zwischen 5-10 s nach der Aktivierung.
- Nehmen Sie 4 µL Aktivator-Lösung und Platz in der Zählkammer.
- Homogenisieren Sie schonend verdünnten Sperma durch Schütteln der Microcentrifuge 3 Mal um Schäden in den Samenzellen Zellen zu vermeiden.
- Nehmen Sie 0,5 µL verdünnter Sperma, mischen mit dem Aktivator und setzen Sie die Abdeckung in der Zählkammer schnell.
Hinweis: Dieser Schritt dauert nicht mehr als 5 s, um die Analyse so schnell wie möglich zu starten. - Konzentrieren Sie sich auf die Samenzellen Zellen und finden Sie den besten visuellen Bereich, die durch eine geringe Anzahl von Spermien (150 bis 200 Zellen) zu abhören zwischen Zellen (ergänzende Abbildung 1A) definiert wird. Wählen Sie Video aufnehmen , um die Spermien-Spuren zu erhalten, die je nach Geschwindigkeit voneinander getrennt sind.
- Wählen Sie erfassen , 3 bis 7 Felder der optimale Abstand sind zu erhalten eine geringere Variabilität in den Ergebnissen, und wie zuvor Verfahren zu erwirken. Videos aufnehmen bis 120 s nach Aktivierung zur Vermeidung von Kondensation auf dem Cover von der Zählkammer.
- Wählen Sie Exit , einen Überblick über alle Felder zu haben.
4. Motilität Daten zu erhalten
- Wählen Sie Felder aus | Partielle | Speichern Sie und wählen Sie einen Dateinamen ein. Klicken Sie auf Speichern.
Hinweis: Die Tabelle bietet Mittelwerte der partiellen Daten, Diagramme und Bilder der Spermien Tracks. - Wählen Sie allgemeine Daten | Dateiname | Speichern.
Hinweis: Die Daten geben kinetische Werte für einzelne Spermien aus allen Bereichen.
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Representative Results
Analyse der Zeit-Effekt auf die Beweglichkeit der Spermien
Im Falle der europäische Aal, der Prozentsatz der statischen Spermien erhöht von 15 s bis 120 s nach Aktivierung (von 24,4 % auf 40,7 %) und der Anteil der mobilen progressive Spermien verringert (von 36,9 % auf 20,9 %) (Abbildung 1A und 1 b). Basierend auf Geschwindigkeit, Samenzellen Zellen zeigten eine Abnahme der Geschwindigkeit im Laufe der Zeit (Abbildung 1 und 1 D) verringert. Der Anteil der Spermien mit eilgeschwindigkeit sank etwa 23 % (von 49,4 % auf 26,6 %) und der Anteil der Spermien mit mittlerer Geschwindigkeit stiegen um rund 7 %.
Die Wirkung der Frame-Rate und Zählkammer
Verschiedene Arten erfordern unterschiedliche Frame-Raten für ein optimales Ergebnis. Russischer Stör erfordert 150 Frames pro Sekunde (fps; Abbildung 2A); der Karpfen erfordert 100 fps (Abb. 2 b); und für die Äsche 200 fps war nicht genug, um optimale kinetische Ergebnisse (Abbildung 2). Diese Ergebnisse waren nicht abhängig von der Tiefe des Zählens Kammer getestet (Abbildung 2A-2 C).
Sperma Subpopulationen Struktur
Die Identifizierung von Spermien Subpopulation basiert auf statistischen Analyse. Der erste Schritt ist die Bestimmung der wichtigsten Komponenten (Hauptkomponentenanalyse; PCA) aus den vollständigen Satz von Daten der Motilität. Dann werden die clustering Verfahren mit den Spermien-abgeleitete Indizes erhalten, nachdem die PCA ausgeführt.
Für diese Studie verwendet wir Atlantischen Lachs Spermien, die vier verschiedenen Subpopulationen, benannt zeigte: nichtlineare langsam (niedrige LIN, STR und VCL), schnelle nichtlineare (untere STR, hohe VCL), schnell linear (hohe LIN, STR und VCL) und am schnellsten linear (höchste LIN, STR und VCL). Die Verteilung von diesen Subpopulationen variiert entlang Generationen von Wildtieren zu landwirtschaftlich genutzt (Abbildung 3).
Abbildung 1 : Effekt der Zeit Post-Aktivierung auf die Progressivität und Motilität des Europäischen Aals Sperma. A und B) Prozentsatz der Progressivität bei 15 bis 120 s bzw.; und C und D) der Prozentsatz der Motilität basierend auf Geschwindigkeit im Laufe der Zeit (15 bis 120 s nach Aktivierung, beziehungsweise). Die Progressivität gliederte sich in drei Gruppen: progressive bewegliche Zellen (weiß; VCL bedeuten ± SD Wert: 114,5 18,2 und 101,4 ± ± 34,5 µm/s für 15 bis 120 s, beziehungsweise), keine progressive bewegliche Zellen (grau; VCL bedeuten ± SD Wert: 84.8 ± 17,4 µm/s für 15 s und 84,6 ± 16,5 µm/s für 120 s), und statische Samenzellen (schwarz). Die Geschwindigkeit der Spermien wurde in 4 Gruppen unterteilt: schnelle (VCL bedeuten ± SD Wert: 119.3 ± 13,7 µm/s für 15 s und 118,9 ± 13,3 µm/s für 120 s; weiß), mittlere (VCL bedeuten ± SD Wert: 79,7 ± 15,5 µm/s für 15 s und 79.6 ± 15,5 µm/s für 120 s; hellgrau) , langsam (VCL bedeuten ± SD Wert: 32,9 ± 6,5 µm/s für 15 s und 32,6 ± 6,6 µm/s für 120 s; dunkelgrau) und statische (schwarz). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Die Wirkung der die Frame-Rate und der Zählkammer in drei Süßwasser-Fischarten: (A) russischen Stör (B) der Karpfen und (C) Äsche. Spermiogramm wurde auf 50, 100, 150 und 200 Bilder pro Sekunde, mit zwei kommerzielle zählen Kammern mit verschiedenen Tiefen (10 bis 20 µm). Der schwarze Kreis stellt die besten Frame-Rate für jede Art. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Sperma Subpopulationen Struktur von drei Generationen des Atlantischen Lachses: Wilde Männchen (F0) und die ersten beiden Generationen produziert in Gefangenschaft (F1 und F2). Nach Cluster-Analyse wurden vier Subpopulationen beobachtet: nichtlineare Spermien langsam (niedrige LIN, STR und VCL; Cluster 1; schwarz), schnelle nichtlineare Spermien (untere STR, hohe VCL Cluster 2; dunkelgrau), schnelle lineare Spermien (hohe LIN, STR und VCL; cluster-3; Fortgeschrittene grau) und am schnellsten lineare Spermien (höchste LIN, STR und VCL; Cluster 4; hellgrau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1. Verschiedene visuelle Bereiche aus der Motilität Analyse des Europäischen Aals Spermien definiert als beste (A) und (B) am schlechtesten Zellkonzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Für verschiedene Arten, darunter Fisch ist die Sperma-Analyse-Software in diesem Protokoll verwendeten von Forschern weltweit eingesetzt. Fische haben jedoch einige Besonderheiten, die die Spermien Bewertung beeinflussen können. Fisch-Spermien zeigte high-Speed im Moment der Aktivierung, die schnell sinkt und führt zu einer kurzen Zeit der Motilität nach der Aktivierung. Außerdem die Temperatur der Reproduktion ist Spezies-abhängig, und in einigen Fällen könnte um 4 ° C2,4,8,12. So ist es notwendig, einige Anpassungen zur Verbesserung der Effizienz eines EDV-Systems für Fisch Spermiogramm vorzunehmen. Das Grundprinzip des Parameters Motilität ist die Erfassung und Analyse von aufeinander folgenden Bildern von bewegliche Spermien. Die meisten Systeme verwenden standard Frame-Raten (16, 25, 30, 50 oder 60 fps) aufgrund von Einschränkungen der Hardware und Software17,18,19,20,21,22. Einige Studien zeigten jedoch, dass eine höhere Bildrate Geschwindigkeit Parameter, wie z. B. VCL, STR erhöht, BCF15,23,24. Dies ist besonders wichtig, wenn es notwendig zu bewerten Überaktivierung der Spermien und die maximale Geschwindigkeit der Spermien11,17,18,19, zu finden 25. in Bezug auf die Temperatur der Analyse eine Kühlplatte für das optische Mikroskop und eine neue Technologie, um Proben bei konstanter Temperatur im Kühlschrank könnte auch die Analyse im Laufe der Zeit verbessern. Das vorliegende Werk bietet einen Ansatz um zwei der wichtigsten Probleme im Zusammenhang mit der Fisch-Sperma-Motilität Analyse und Temperatur Sensibilität zu lösen. Trotz der Ergebnisse konzentriert sich auf einige Süßwasserarten könnte diese Methode für Meerestiere, verwendet werden, obwohl die Aktivierung Medium für jede Art angepasst werden sollte.
Auf dem Markt gibt es eine Reihe von Produkten oder sogar verschiedene Versionen des gleichen Produkts. Auch wenn die Systeme das gleiche Prinzip haben können, hat jeder unterschiedliche Details, was die Unvereinbarkeit der Ergebnisse26,27,28. Außerdem könnte die Bewertung der Spermienqualität Fisch noch methodische und technische Einschränkungen haben. Die Sperma-Aktivierung-Technik und der Analyse nach der Aktivierung sind zwei wesentliche Faktoren, die Spermien Qualität Bewertung29,30betreffen. Die Zeit zwischen der Aktivierung der Spermaproben und die Stabilisierung des Bildes bei Videoaufnahmen sollte ca. 5 s seit den ersten Sekunden (Zeitintervall von 5-20 s) bietet die nützlichsten Daten2,4. Die Zeit der Spermiogramm kann aufgrund Kondensationsprobleme auf dem Objektträger beschränkt werden. Fisch-Spermien bleiben jedoch für weniger als zwei Minuten2mit einer energischen Bewegung aktiv. Auf technischer Ebene ist es notwendig zu wissen, die "optimale" Frame-Rate um Detailinformationen zu erhalten, die eine genaue Rekonstruktion der Spermien Trajektorien15gibt. Im unteren Frame-Raten sind die Details der Bahn verloren, besonders für schnelle und nichtlineare Spermien, während auf höhere Bildraten, die Informationen redundante15,31 werden. Für einige Fischarten, die Bildrate (bis zu 250 fps) könnte nicht ausreichen, um die maximale Geschwindigkeit der Spermien für einige Fischarten wie Äschen und Lachse zu finden. Diese Variante ist bestimmte Arten und muss für jede Art des Protokolls zu standardisieren und zuverlässige Ergebnisse15,23,24definiert werden. Die Tiefe der Zählkammer begrenzen die Bewegung des großen Geissel der Fisch und die Spermien nicht erreichen konnte, Höchstgeschwindigkeit11,32,33. Außerdem kann die Software haben einige Einschränkungen bei der Erkennung von echten Spermien bei eine Kreuzung von Zellen.
Klassische Bewertung der Spermienqualität ist eine subjektive Analyse basierend auf der Schätzung der Konzentration und der Prozentsatz der Motilität, die Variabilität der Ergebnisse produzieren kann. Allerdings bietet ein EDV-System schnelle, präzise und quantitative Messungen der Motilität Parameter. Diese objektive Analyse gibt eine große Menge an Daten und reduziert die Variabilität der Ergebnisse34,35,36,37. Die Reaktion der Spermien-Motilität Verhalten hängt von der Temperatur der Analyse und variiert zwischen den Arten38,39,40. Optimaler Temperatur der Spermien Analyse könnten Spermien Geschwindigkeit und Dauer der Motilität analog zu den natürlichen Bedingungen der Reproduktion38,40. Sperma-Analyse-Software mit Kühleinrichtungen verbessert daher die Bewertung der Spermienqualität Fisch.
Die Ergebnisse der Qualitätsanalyse Sperma konnte das Wissen über Fische Sperma Eigenschaften und Qualität basierend auf Sperma Subpopulationen, die möglicherweise die Zukunft der Spermien Bewertung in allen Tierarten41,42verbessern. Auf praktischer Ebene, diese Technik könnte ein Indikator für qualitativ hochwertige Züchter und hilft erhalten Sie weitere Informationen über Sperma Auswahlverfahren, bahnbrechenden Dosen Berechnung für künstliche Besamung, Sperma Wettbewerb basierend auf Geschwindigkeit und Progressivität und potenzielle Fruchtbarkeit. Dieses Wissen kann auf verschiedenen Forschungsgebieten, einschließlich Aquakultur und Erhaltung Programme, die das Interesse an Fisch Spermien Speicherung und Kryokonservierung in den letzten Jahrzehnten2,13stimuliert angewendet werden. Toxikologische Wirkungen sind auch immer besonderes Interesse aufgrund von Umweltproblemen sowie Studien die Entwicklung von phylogenetical Studien basierend auf Spermien-Motilität Merkmale43,44.
Diese Arbeit hat gezeigt, wie die Optimierung der eine automatische Software für Fish-Spermien-Motilität-Analyse die Ergebnisse verbessert. Standardisierung des Protokolls muss berücksichtigt werden, die Temperatur der Analyse und die Frame-Rate, die je nach Art unterschiedlich sein könnte. Die Analyse der Fisch Spermienqualität hat jedoch zwei wichtige Schritte, dass die Forscher achten sollte. Spermiengewinnung ist der erste wichtige Schritt, die die Probe aufgrund von Verunreinigungen durch Kot, Urin und Wasser zerstören kann (Meerwasser oder Süßwasser). Der andere kritische Punkt ist verbunden mit der Sperma-Aktivierung und dem Beginn der video-Aufnahmen. Dieser Schritt sollte so bald wie möglich erfolgen, um Daten zu sammeln, wenn die Spermien energische Bewegung haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wird finanziell unterstützt von der COST-Vereinigung (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE und der Europäischen Union Programm Horizont 2020 Forschung und Innovation unter Marie Sklodowska-Curie Projekt IMPRESS (GA Nr. 642893). Wir möchten das Wissenschaftlerteam des PROiSER, speziell für den Schüler Alberto Vendrell Bernabéu, für seine aktive Mitarbeit in der Videoaufzeichnung dieses Projektes danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
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