Summary
Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.
Abstract
Le infezioni fungine sono diventati un'importante condizione medica negli ultimi decenni, ma il numero di farmaci antifungini disponibili è limitato. In questo scenario, è necessaria la ricerca di nuovi farmaci antifungini. Il protocollo qui riportato i dettagli di un metodo a peptidi di schermo per le loro proprietà antifungine. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dagli orientamenti Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con modifiche per soddisfare la ricerca di peptidi antimicrobici come potenziale nuovi anti-fungine. Questo protocollo descrive un'analisi funzionale per valutare l'attività dei composti Antifungini e può essere facilmente modificato per soddisfare una particolare classe di molecole in esame. Poiché le analisi vengono eseguite in piastre da 96 pozzetti utilizzando piccoli volumi, uno screening su larga scala può essere completato in un breve lasso di tempo, soprattutto se effettuate in un contesto di automazione. Questa procedura illustra come un protocollo clinico standardizzato e regolabile può aiutare il banco di lavoro perseguimento di nuove molecole per migliorare la terapia di malattie fungine.
Introduction
Le infezioni fungine sono diventati un'importante preoccupazione medica negli ultimi decenni, avendo aumentato considerevolmente principalmente a causa di un aumento del numero di individui immunocompromessi, come quelli sottoposti a trattamento del cancro e coloro che vivono con l'HIV/AIDS o trapiantati organi1,2. Tuttavia, una gamma molto limitata di farmaci antifungini disponibili e il numero aumentante dei rapporti sulla resistenza fungina a loro contribuiscono ai grandi problemi per quanto riguarda la terapeutica di micosi sistemiche3.
Una potenziale fonte di nuovi composti antifungini sono peptidi antimicrobici (amp), piccoli peptidi cationici prodotte da molti organismi come parte della loro risposta immunitaria innata a infezione4. Tuttavia, il metodo di screening per testare questi composti contro i patogeni fungini non è standardizzato. Le procedure differenti sono state usate per valutare l'attività antifungina di ampere, a volte per il modello stesso microrganismo5,6,7. Queste differenze e la mancanza di dettaglio in alcuni protocolli complicare i confronti tra composti e ostacola riproducibilità.
Un modo per standardizzare la sperimentazione di nuovi farmaci candidati è quello di seguire le linee guida utilizzate per definire antifungosa di predisposizione nelle regolazioni cliniche, quali la clinica e linee guida Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Tuttavia, questi test di sensibilità antifungini sono troppo restrittivi e non prendono in variazione di considerazione nel metabolismo tra le specie, come essi sono stati stabiliti soltanto per alcuni agenti selezionare. Ad esempio, non prendono in considerazione le esigenze metaboliche dei lieviti non fermentanti.
Questo protocollo permette la valutazione dell'attività dei potenziali composti antifungine e viene implementato qui per la ricerca di peptidi antimicotici. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dalle linee guida CLSI M27-A3 con modifiche che ottimizzano lo screening di nuovi composti8,9. Queste modifiche consentono l'uso di piccole quantità di composto, variazioni di temperatura o inoculo iniziale e media diversi per la crescita ottimale di pre-test, standardizzando i risultati con l'uso di antimicotici di riferimento come controlli. Questo metodo, con l'uso di piastre multi-pozzetto cultura, rende possibile rapidamente e in modo affidabile a schermo un gran numero di composti.
Grazie alla sua flessibilità intrinseca, questo protocollo può essere usato con differenti classi chimiche dei composti e contro altri microrganismi, con alcuni adattamenti.
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Protocol
1. soluzioni e Media
- Preparare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medie, tamponato fosfato salino (PBS), brodo di Sabouraud destrosio e Sabouraud agar destrosio come da tabella 1.
2. condizioni di crescita fungine inoculo
- Memorizzare tutti i ceppi fungini come gli stock congelati in 35% glicerolo a-80 ° C, fino a quando necessario.
- Attenersi alla seguente procedura prima di ogni esperimento.
- Per i ceppi di Candida albicans :
- Scongelare una fiala di magazzino e trasferire 200 µ l a 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in un tubo in polipropilene sterile 50 mL con tappo e coltura durante la notte a 30 ° C con agitazione (200 giri). Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione della cultura.
- Per i ceppi di Cryptococcus neoformans :
- Raschiare la superficie ghiacciata di un flaconcino stock. Piastra le cellule su piastre di agar Sabouraud destrosio e incubare per 48 h a 30 ° C. Dopo visibile crescita di colonie isolate, tenere le piastre in frigorifero (4 ° C) sigillato con la pellicola di paraffina per fino a 15 giorni.
- Raccogliere una colonia isolata di medie dimensioni dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile o sterile ansa da inoculo e inoculare 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in una provetta conica sterile 50 mL. Incubare per circa 24 h a 30 ° C sotto agitazione (200 giri).
- Non superare le 24 ore di incubazione. Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione. È sempre buona standardizzare la fase di crescita delle cellule prima di ogni prova, poiché questo è un fattore importante che interessa la resistenza antimicrobica.
Nota: Entrambi funghi sono stati coltivati a 30 ° C per propagazione rapida nei nostri esperimenti, ma la temperatura può essere modificata per riflettere gli obiettivi dello studio, il trattamento ad esempio clinico (37 ° C). La cosa più importante, questo tempo di incubazione iniziale dovrebbe essere stabilito in anticipo per ogni isolato fungina e mantenuto durante tutti i test per garantire la riproducibilità.
- Per i ceppi di Candida albicans :
- Dopo la crescita di funghi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione le provette coniche a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e aggiungere 10 mL di PBS.
- Risospendere le cellule e centrifugare nuovamente a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Ripetere il lavaggio con PBS e centrifugazione di altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 5 mL (secondo il formato della pallina) di 2 X RPMI-1640 medi.
- Preparare 1 mL di una diluizione 1: 100 o 1:1,000 in un tubo del microcentrifuge (a seconda la torbidità della sospensione delle cellule).
- Aliquotare 10 µ l di questa diluizione, metterlo in una camera di un emocitometro e contare il numero totale delle cellule nei quadranti quattro angolo sotto il microscopio. Calcolare la concentrazione dalla formula: (totale cella numero/4) x diluizione fattore x 104 (costante di diluizione di camera).
- Considera una redditività del 100% se le condizioni di conteggi e crescita di redditività sono stati sistematicamente correlate per l'isolato oggetto di studio.
Nota: La standardizzazione e il controllo di qualità dei conteggi di redditività può essere fatto da retro-placcatura in accordo con il Comitato europeo sul metodo di concentrazione inibitoria minima (MIC) antimicotico test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) per lieviti10 . - Se la correlazione di crescita/redditività non è stata stabilita per l'isolato sotto studio, misurare la redditività fungina contando le cellule vive in un emocitometro con l'ausilio di coloranti che colorano in modo selettivo le cellule morte, come Floxina B11, trypan blu 12, o Janus Green13. Utilizzare le cellule fungine per questo protocollo solo se la vitalità della popolazione a questo punto è 90% o superiore.
Nota: Morti/vivi coloranti potrebbero non funzionare bene con il fungo di scelta. Si prega di testarli prima dell'uso. Ad esempio, il colorante trypan blu non funziona bene con c. neoformans.
- Considera una redditività del 100% se le condizioni di conteggi e crescita di redditività sono stati sistematicamente correlate per l'isolato oggetto di studio.
- Dopo di che, preparare le sospensioni delle cellule in 2 X RPMI-1640 medi (2 X regolata inoculo nel medium RPMI-1640). Per piastre da 96 pozzetti considera un volume di 5 mL per ogni piatto.
- Per tutti i ceppi di c. albicans , preparare una sospensione di cellule stock di 4 x 103 cellule/mL. Questa concentrazione è di 2 volte della concentrazione finale delle cellule in ogni pozzetto (2 x 103 cellule/mL).
- Per i ceppi di c. neoformans , preparare una cultura stock di cellule 2 x 104 cellule/mL. Questa concentrazione è due volte la concentrazione di cella finale in ogni pozzetto (1 x 104 cellule/mL).
- Per altri funghi, prova con un antimicotico noto che la concentrazione sarà ideale per studio particolare per quanto riguarda il tempo di incubazione. Prendere tempo metabolismo e duplicazione del fungo in considerazione.
3. peptidi (agente sconosciuto)
- Memorizzare i peptidi liofilizzati a-20 ° C e scioglierle in acqua deionizzata prima di ogni esperimento. Il tempo massimo di conservazione una volta dissolto in acqua dipenderà la natura di ciascun peptide.
- Preparare le aliquote di due volte la più alta concentrazione finale nel test (2 X). Idealmente, preparare un piccolo numero di aliquote con abbastanza peptide per utilizzare una sola volta evitare cicli di gelo-disgelo.
Nota: La scelta della concentrazione dovrebbe essere basata sulla letteratura e sulle proprietà del peptide. Si consiglia di iniziare le diluizioni seriali con circa 100 µM del peptide e quindi diminuire o aumentare la gamma di concentrazione a seconda dei risultati ottenuti.
4. riferimento antimicotici (controlli positivi)
- Per quelli diluiti in acqua: preparare una soluzione di 2 X di più alta concentrazione di analisi (vedere sezione 5: saggio di antimicotico per i passaggi di diluizione).
- Per i ceppi di c. albicans , preparare una soluzione di 128 µ g/mL di fluconazolo o 128 µ g/mL di caspofungin. La concentrazione di piastra per entrambi sarà 64 µ g/mL.
- Per i ceppi di c. neoformans , preparare una soluzione di 32 µ g/mL di amfotericina B (soluzione solubile in acqua). La concentrazione di piastra sarà 16 µ g/mL.
Nota: Normalmente la amfotericina B è diluita in dimetilsolfossido (DMSO), poiché questo Antifungini è scarsamente solubile in acqua. Tuttavia, ci sono preparazioni solubili in acqua amfotericina B disponibile in commercio.
- Per gli antimicotici diluiti in un solvente organico: preparare una soluzione di riserva in DMSO a 100x, quindi diluirlo a 10 volte di acqua per uso.
Nota: Così, nel pozzo, la concentrazione finale di DMSO non supererà 1%. Un pozzo dove il fungo crescerà in media che contengono 1% DMSO come controllo è obbligatorio, dato che alcuni funghi non tollerano bene questa concentrazione del solvente. Ricordate che DMSO è fotosensibile, quindi coprire la piastra con un foglio o posizionarlo in una camera oscura per tutta la durata del periodo d'incubazione.
5. antifungino Assay
Nota: In vitro Antifungini saggi vengono eseguite in base al test di suscettibilità di microdilution brodo da linee guida di Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con alcune modifiche.
- Preparare una diluizione seriale di duplice di ciascun peptide e antimicotico in piastre microtiter da 96 pozzetti polistirolo ad un volume finale di 50 µ l di controllo.
- Utilizzando una pipetta aggiungere 100 µ l di antimicotico/peptide nella concentrazione X 2 dei più alti desiderata concentrazione finale nelle colonne 1-3, in fila A.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di acqua sterile negli altri pozzetti, nelle righe B-H.
- Rimuovere 50 µ l di pozzi con la più alta concentrazione (riga A), trasferire a altro bene della concentrazione prossima (riga B) e omogeneizzare.
- Ripetere i passaggi precedenti fino al pozzo con la più bassa concentrazione e scartare 50 µ l di questo pozzo (fila H). Lasciare le colonne 11 e 12 (righe A, B, C) con solo acqua per controllo vuoto o controllo negativo/crescita.
- Aggiungere 50 µ l di 2x regolato inoculo nel medium RPMI-1640 ad ogni pozzetto (colonne 1-3 più colonna 11 (controllo negativo/crescita)); la concentrazione finale per c. albicans sarà 2 x 103 cellule/mL e la concentrazione finale di ceppi di c. neoformans sarà 104 cellule/mL.
- Preparare i controlli vuoti (50 µ l acqua + 50 µ l 2 medium RPMI-1640 X senza cellule) controllo negativo/crescita (50 µ l acqua + 50 µ l regolata inoculo 2 X RPMI-1640 medium senza antimicotico) e carico nella piastra ben come descritto sopra.
- Ripetere la procedura per ogni composto da testare e selezionato controllo antimicotico (colonne 4-10).
Nota: Le diluizioni seriali possono essere fatto verticalmente come l'esperimento qui sotto, o orizzontalmente nella piastra (cioè, se il numero di diluizioni del composto/estratto dato che deve essere testato è otto o più).- Se i composti, fare riferimento a farmaci, o ad uno qualsiasi dei suoi componenti sono fotosensibili, eseguire l'analisi in luce ridotta, coprire le piastre con un foglio o posto in una camera oscura durante le incubazioni.
- Considerare le seguenti raccomandazioni opzionale.
- Sigillare la piastra con un coperchio trasparente che consente lo scambio di gas, come questo aiuta a ridurre l'evaporazione.
- Posizionare la piastra in una camera umida; aiuterà anche a ridurre l'evaporazione.
- Incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore o 48 ore per tutti i ceppi di c. albicans e per 48 h con 200 giri/min agitazione per c. neoformans. Il volume finale inferiore (100 µ l) garantisce che nessuna ricaduta si verifica.
Nota: Nessuna differenza significativa è stata osservata fra MIC letture a h 24 e 48 ore per i ceppi di c. albicans . Ciò nonostante, letture a 48 h sono più facili da visualizzare. - Osservare tutti i pozzetti, con l'aiuto di un microscopio ottico invertito, prima del periodo di incubazione e dopo per verificare i cambiamenti nella morfologia anche per verificare eventuali segni di contaminazione.
Nota: Le letture possono essere fare visivamente e fotografate alla fine dell'esperimento. Prima di ogni lettura, omogeneizzare leggermente la piastra. Le letture possono essere eseguite anche misurando la sua OD a 600 nm, se cella ciuffi e filamentazione non vengano rispettate. - Eseguire gli esperimenti almeno tre volte in date separate.
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Representative Results
Il MIC è definito come la più bassa concentrazione di composta antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo d'incubazione. Poiché l'obiettivo del presente protocollo è quello di avere un metodo veloce per potenziali antimicotici schermo, qualsiasi bene con Chiara media simili ai pozzetti del bianco è considerato un risultato positivo, considerando che qualsiasi bene con torbidità analoga per i pozzetti di controllo negativo/crescita è considerati negativi. Tuttavia, se vi sia un interesse a sapere se un determinato AMP è fungistatico o fungicida, i media dai pozzetti positivi possono anche piastrati su Sabouraud Dextrose Agar o controllati da un altro test di vitalità.
Dato che il meccanismo di azione di un composto del romanzo è sconosciuto, pertanto è essenziale per verificare se l'antimicotico di riferimento sono compresi nell'intervallo previsto per isolare il fungine (linee guida ufficiali di controllo, tabelle o dati in letteratura) prima di controllare il testata MIC per il composto (in questo caso, un AMP; Figura 1 e Figura 2) per confermare che le condizioni sono ideali. Se non rientra nell'intervallo rispettato, sarà necessario rieseguire l'esperimento, dato che sarà Impossibile determinare se eventuali cambiamenti osservati sono dovuti unicamente al composto testato. È altrettanto fondamentale per osservare tutti i pozzetti sotto un microscopio ottico prima e dopo il periodo di incubazione per controllare i cambiamenti nella morfologia e contaminazione.
Figura 1. Valutazione di attività antifungina per tre peptidi contro Cryptococcus neoformansusando l'analisi di microdilution del brodo. Fungo concentrazione è a 1 x 104 cellule/mL. Sono stati testati tre peptidi (AMP1, colonne 1 e 3; AMP2, colonne 5 e 7; AMP3, colonne 8-10) con concentrazioni che variano da 100 µM (riga A) a 0,78 µM (fila H). Vuoto e controllo della crescita sono nelle colonne 11 e 12, rispettivamente. L'immagine è stata acquisita con una fotocamera digitale dopo 48 h di incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Valutazione di attività antifungina per tre peptidi contro Candida albicans usando l'analisi di microdilution del brodo. Fungo concentrazione è a 2 x 103 cellule/mL. Sono stati testati tre peptidi (AMP1, colonne 1 e 3; AMP2, colonne 4 e 6; AMP3, colonne da 7 a 9) con concentrazioni che variano da 100 µM (riga A) a 0,78 µM (fila H). Vuoto e controllo della crescita sono stati inclusi nell'analisi, ma non appaiono nella foto. L'immagine è stata acquisita con una fotocamera digitale dopo 48 h di incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Come osservato nella Figura 1 e Figura 2, 48h è abbastanza tempo per distinguere visivamente pozzetti positivi e negativi per entrambi c. neoformans e c. albicans. È interessante nota che i risultati di c. neoformans sono stati ottenuti 24h precedenti nell'ambito degli orientamenti CSLI senza le modifiche. Per ogni triplice copia, il pozzo di positivo e negativo e pertanto il microfono per ogni composto, sono facilmente distinguibili. Questo consente per la rapida determinazione della MIC per molteplici composti anche quanto alla scelta dei quali molecole ulteriori indagini di merito. Nel frattempo, nella figura 3 è un esempio di un risultato scadente, probabilmente da pipettaggio improprio durante la fase di diluizione. Questo può essere osservato nella colonna 5, riga C, dove la differenza nella crescita di c. neoformans è presente attraverso repliche (colonne 5-7).
Figura 3. Esempio di un errore tecnico viene replicato in un test di diluizione seriale. L'immagine mostra una diluizione seriale di amplificatori che vanno da 100 µM (riga A) a 0,78 µM (fila H). Differenze nella crescita di c. neoformans sono presenti tra repliche nelle colonne 5-7, riga C, molto probabilmente a causa di pipettaggio errore durante la preparazione della diluizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per quanto riguarda l'interpretazione delle piastre, nella Figura 1 c'è un saggio di antimicotico per tre diversi amplificatori contro c. neoformans, situato alle colonne 1-3 per AMP1, colonne 5-7 per AMP2 e colonne 8-10 per AMP3 con concentrazioni variabili da 100 µ M (riga A) a 0,78 µM (fila H). Il controllo negativo/crescita è stato collocato nella colonna 11, righe da A C, mentre il controllo vuoto è stato inserito nella colonna 12, A righe e C. Per AMP1 (colonne 1-3, f. A-C) e AMP2 (colonne 5-7, f. A-D), nota che a una maggiore concentrazione media è traslucido e non c'è crescita visibile. Al contrario, alle concentrazioni più basse i pozzetti sono opachi (colonne 1-3, righe D-H e colonne righe 5-7, E-H). Di conseguenza, riga C è considerato per contenere il MIC per AMP1, mentre il microfono per AMP2 è in fila D, vale a dire, 25 µM e 12,5 µM, rispettivamente. AMP3 dovranno essere rivalutate, come il fungo è cresciuto in tutte le concentrazioni testate. Il riesame per AMP3 è necessario determinare la causa, che potrebbe essere che il mezzo di prova sta interferendo con l'attività antifungina della contaminazione microbica, composta, o una maggiore resistenza del fungo all'agente testato. Per l'ultima possibilità, sarà necessario aumentare l'intervallo di concentrazioni testata. Come osservato, i pozzi no-inibizione e controllo sono omogenei, così si potrebbe anche essere valutate tramite la misura di OD a 600 nm.
Per quanto riguarda la Figura 2, tre peptidi distinti sono stati testati contro c. albicans. I microfoni per AMP1 (colonne 1-3), AMP2 (colonne 4-6) e AMP3 (colonne 7-9) erano 50 µM, 6 µM e 25 µM, rispettivamente. Albicans del c., a causa di filamentazione nella temperatura di incubazione, può essere osservato in ciuffi nei pozzetti no-inibizione e controllo, che lo rende difficile da usare misura OD per la lettura.
A volte, nessuna crescita è osservata nei pozzetti. Ciò può essere dovuto una contaminazione di tossina in media (nel qual caso i controlli di crescita non mostrano anche nessuna crescita) o una maggiore suscettibilità all'agente (nel qual caso, i controlli di crescita mostrano crescita). Di conseguenza, per quest'ultimo caso, una diminuzione nella gamma di concentrazione potrebbe essere necessaria.
| Medio | Preparazione | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medi – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (completato con L-Glutammina e rosso fenolo; senza bicarbonato) | |
| 330 mM 3-(N- morfolino) propano acido solfonico (MOPS) | ||
| Regolare a pH 7.0 con NaOH | ||
| Sterilizzare mediante filtrazione (filtro di 0,22 µM) | ||
| Tampone fosfato salino (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2.7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Sterilizzare in autoclave a 121° C per 15 minuti. | ||
| Brodo di Sabouraud destrosio | 15 g di polvere in 500 mL di acqua distillata. | |
| Regolare il pH 7.0 con NaOH | ||
| Sterilizzare in autoclave a 121° C per 15 minuti. | ||
| Sabouraud Dextrose Agar | 32,5 g di polvere in 500 mL di acqua distillata. | |
| Regolare il pH 7.0 con NaOH | ||
| Sterilizzare in autoclave a 121° C per 15 minuti. | ||
Tabella 1. Preparazione media e reagente.
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Discussion
Test di microdilution può analizzare le potenziali attività antifungina di un target composto utilizzando piccole quantità del composto e allo stesso tempo testarlo in un intervallo di concentrazioni. Di conseguenza, questo protocollo è consigliato come un primo passo nello screening per potenziali nuovi composti antifungini. Il protocollo qui presentato è basato sul protocollo M27-A3, inizialmente progettato per aiutare nella selezione della terapia antifungosa in cliniche e può essere adattato ad una varietà di nuovi composti antifungini. Nel complesso, questo protocollo può concentrarsi sulle caratteristiche fisico-chimiche dell'estratto o composti. Ad esempio, un candidato potenziale nell'analisi venga erroneamente inefficace perché un composto nei mezzi di comunicazione può bloccare la sua interazione con la cellula fungina, come l'effetto di RPMI su istatina 514. In questo caso, il mezzo alternativo per quando il RPMI interferisce, è lievito azoto Base (YNB) buffer con MOPS pH 715.
Il protocollo permette anche modifiche nella pre-crescita condizioni, la concentrazione di inoculo, la temperatura di incubazione e per componenti sensibili alla luce, come i risultati di antimicotico di riferimento sono all'interno della gamma di linee guida. L'antimicotico di riferimento dovrebbe essere basata sulla terapia attuale per la testata specie fungina. Inoltre, se c'è un riferimento composto che è simile in natura al potenziale farmaco – ad esempio, un peptide antimicrobico conosciuto con attività antifungina contro fungo modello testato – dovrebbe essere usato come un controllo di riferimento aggiuntivo.
Condizioni di pre-crescita possono essere modificate per soddisfare i funghi ed esigenze di ricerca. Come il protocollo, c. neoformans e albicans del c. sono stati coltivati a 30 ° C per migliore propagazione. Tuttavia, questa temperatura può essere variata a seconda del metabolismo di funghi: ad esempio, Paracoccidioides brasiliensis richiede crescita a 37 ° C per mantenere la sua forma di lievito e grazie al suo tasso di duplicazione lento, ha bisogno di essere coltivata per 5-7 giorni. Pertanto, è essenziale per comprendere le caratteristiche del fungo per testare un potenziale nuovo farmaco. Inoltre, l'età e la fase di crescita delle cellule utilizzate devono essere definiti secondo lo scopo di ogni studio e, soprattutto, il tempo di incubazione iniziale dovrebbe essere stabilito in anticipo e mantenuto durante tutti i test per garantire la riproducibilità .
Allo stesso modo, se il composto/estrarre, l'antimicotico di riferimento o diluente è sensibile alla luce, passaggi devono essere aggiunto per impedire la degradazione, ad esempio lavorando con luce ridotta, che coprono le piastre con un foglio o posizionando le piastre in una camera oscura durante tempi di incubazione.
Inoltre, l'effetto di bordo ed evaporazione possono essere diminuiti con l'aggiunta di acqua nei pozzi vuoti, non utilizzando i pozzetti esterni e riempiendole con acqua, o inserendo la piastra in una camera umida.
Una delle principali limitazioni quando si utilizza questo metodo è la sua attenzione per l'attività inibitoria di un composto testato, al contrario di distinguere tra effetti antiparassitari o micostatico. Tuttavia, come l'obiettivo è uno screening veloce del potenziale nuovo antimicotico, l'iniziale valutazione visiva MIC con un chiaro positivo (' clear/non-torbidità' pozzi) e un risultato negativo (pozzi 'torbidità'), consente di identificare composti di interesse per lo studio ulteriormente e di conseguenza riducendo il costo complessivo di screening di nuovi composti.
Poiché il meccanismo di azione di questi nuovi composti è sconosciuto, questo stesso protocollo può essere utilizzato per determinare la capacità di composto di inibire o uccidere le cellule fungine aggiungendo alcuni passaggi aggiuntivi, come i pozzetti positivi di placcatura o utilizzando coloranti live/dead. Altre modifiche minori possono essere aggiunti per utilizzare il protocollo per l'analisi di una titolazione di scacchiera per identificare eventuali effetti sinergici del composto con altri farmaci.
Anche se la lettura del dosaggio viene in genere eseguita dall'analisi visiva della crescita fungina in condizioni diverse rispetto alla crescita nel pozzo con nessun agente antimicotico (controllo negativo/crescita), anche può essere fatto misurando la sua OD a 600 nm. Tuttavia, anche se la misurazione OD è accurata per soluzioni omogenee, alcuni funghi crescono in ciuffi rompendo così la precisione del metodo – ad es., Candida spp. come risultato di filamentazione durante il periodo di incubazione.
D'altra parte, uno dei principali vantaggi del protocollo descritto qui, rispetto alle linee guida CLSI M27-A3, è che ci vuole in aerazione conto dei mezzi di comunicazione per i funghi non fermentanti, come c. neoformans. Inoltre, le linee guida CLSI utilizza solo un piccolo inoculo iniziale, così che richiedono lunghi periodi di incubazione per la crescita fungina e definizione di MIC. Alcuni studi hanno dimostrato che più alto Inoculanti da iniziali e scuotendo la piastra durante l'incubazione migliorare i test di suscettibilità antifungina senza effetti significativi su MIC determinazione16,17. Il nostro protocollo può determinare con precisione il microfono per nuovi composti contro c. neoformans in un periodo di incubazione abbreviata, all'interno di 48 h, rispetto al 72 h suggerito dalle linee guida CLSI.
Un altro vantaggio è che il nostro protocollo utilizza un volume finale di 100 µ l anziché 200 µ l raccomandati dalle linee guida CLSI, riducendo così la quantità del composto nuova testata richiesto per il dosaggio di antimicotico. Tuttavia, evaporazione di pozzi esterni può essere una preoccupazione, ma soluzioni già descritte in questa sezione per ridurre l'evaporazione possono essere utilizzati senza compromettere i risultati del saggio.
Inoltre, eseguendo le diluizioni direttamente nel piatto, e quindi ignorare gli orientamenti di diluizione CLSI per utilizzare microcentrifuga, pipette multicanale possono essere utilizzati. Questa Assemblea di protocollo è meno complicata di quello nelle linee guida CLSI e utilizza anche meno materiali.
Un passaggio fondamentale legato alla preparazione delle cellule fungine è l'uso di cellule che sono più fresco possibile. È anche fondamentale per eseguire tutti i test con le cellule nella fase di crescita stessa, poiché ci sono parecchi rapporti nella letteratura circa le differenze nella suscettibilità antifungina quando la cultura di età compresa tra18,19. Un'attenta selezione di ceppi di riferimento è anche essenziale. Una specie molto sensibile o raramente isolata non può produrre un'immagine chiara delle potenzialità antifungine. Per lo stesso motivo, è utile evitare passaggi sub-coltura, non aggiungere molte variabili per il dosaggio. Ad esempio, per i ceppi di Candida (che crescono più velocemente), preferiamo ignorare il passaggio di piastra di agar facendo l'inoculo direttamente nei mezzi liquidi.
Ricordate che le caratteristiche fisico-chimiche dell'estratto o composti da testare sono importanti da considerare. Ad esempio, se l'estratto o il composti deve essere disciolto in solventi diversi dall'acqua, deve assicurarsi di avere un controllo appropriato crescita fungina che include la stessa concentrazione di solvente con il fungo da solo. Questo è per garantire che qualsiasi inibizione di crescita osservata non è dovuto il solvente anziché il composto testato o estrarre. In questo caso, potrebbe essere meglio a seguire le raccomandazioni del CLSI-M27A3 per droghe antifungose DMSO diluito, come sciogliere il farmaco in una concentrazione almeno 100 volte superiore la più alta concentrazione testata per ridurre la percentuale di solvente nella piastra.
Per quanto riguarda stabilità, si consiglia di mantenere piccole aliquote del estratti analizzati o composti. Archiviando il volume necessario per un singolo test alla temperatura appropriata, eccessiva manipolazione dell'aliquota e, se gli estratti o composti sono conservati congelati, cicli di gelo-disgelo possono essere evitati.
Infine, uno dei passaggi più fondamentali è la precisione della micropiastra diluizione seriale, dato che qualsiasi errore di pipettaggio verrà propagata lungo le diluizioni consecutive. D'ora in poi, pipetta di precisione e tecniche di pipettaggio corretto sono di fondamentale importanza per garantire la riproducibilità. Quindi, è imperativo per uso calibrato pipette e sempre verificare se il volume aggiunto e rimosso da ogni pozzetto è corretta. Assicurarsi che residui o vestigio dalla droga non rimanga nella punta della pipetta. Se il composto tende ad attaccarsi alla punta, sarebbe meglio passare suggerimenti tra le diluizioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo CAPES-Brasile, CNPq-Brasile, FAP/DF per il sostegno finanziario. Siamo grati al Dr. Hugo Costa Paes di revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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