Summary
Une méthode de microdilution bouillon simple et adaptable pour le dépistage des substances antifongiques et extraits.
Abstract
Les infections fongiques sont devenues une condition médicale importante dans les dernières décennies, mais le nombre de médicaments antifongiques disponibles est limité. Dans ce scénario, la recherche de nouveaux médicaments antifongiques est nécessaire. Le protocole rapporté ici en détail une méthode aux peptides de l’écran pour leurs propriétés antifongiques. Il repose sur le test de sensibilité de microdilution bouillon des lignes directrices du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3, avec des modifications pour répondre à la recherche de peptides antimicrobiens comme de potentiels nouveaux antifongiques. Ce protocole décrit une analyse fonctionnelle afin d’évaluer l’activité des composés antifongiques et peut être facilement modifié pour convenir à une quelconque classe de molécules incriminés. Comme les tests sont effectués en plaques 96 puits à l’aide de petits volumes, un dépistage à grande échelle peut être complété en un court laps de temps, surtout si réalisée dans un cadre de l’automatisation. Cette procédure illustre comment un protocole clinique standardisé et réglable peut aider à la poursuite de banc-travaux de nouvelles molécules pour améliorer le traitement des maladies cryptogamiques.
Introduction
Les infections fongiques sont devenus une préoccupation médicale importante ces dernières décennies, ayant considérablement augmenté principalement en raison d’une augmentation du nombre des individus immunodéprimés tels que ceux qui subissent le traitement du cancer et ceux qui vivent avec le VIH/sida ou transplanter des organes1,2. Cependant, un éventail très limité de médicaments antifongiques disponibles et le nombre croissant de rapports sur la résistance fongique à eux contribuent aux problèmes majeurs concernant la thérapeutique des mycoses systémiques3.
Une source potentielle de nouveaux composés antifongiques sont des peptides antimicrobiens (ampères), petits peptides cationiques produites par nombreux organismes dans le cadre de leur réponse immunitaire innée à l’infection4. Néanmoins, la méthode de dépistage pour tester ces composés contre les pathogènes fongiques n’est pas standardisée. Procédures différentes ont été utilisées pour évaluer l’activité antifongique des amplis, parfois pour le même modèle micro-organisme5,6,7. Ces différences et le manque de précision dans certains protocoles compliquent les comparaisons entre reproductibilité de composés et de paniers.
Normaliser les tests de nouveaux candidats-médicaments consiste à suivre les lignes directrices permettant de définir la sensibilité aux antifongique en milieu clinique, tels que la clinique et Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Toutefois, ces tests de sensibilité antifongiques sont trop restrictives et ne prennent pas en variation de la contrepartie dans le métabolisme de toutes les espèces, telles qu’elles ont été établies uniquement pour quelques agents sélectionnés. Par exemple, ils ne tiennent pas compte des besoins métaboliques des levures fermentant le non.
Ce protocole permet l’évaluation de l’activité des éventuels composés antifongiques et est mis en place ici pour la recherche de peptides antifongiques. Il repose sur le test de sensibilité de microdilution bouillon des lignes directrices du CLSI M27-A3, avec les adaptations qui permettent d’optimiser le dépistage des nouveaux composés8,9. Ces modifications permettent l’utilisation de faibles quantités de composés, les variations de température ou initiale d’inoculum et différents médias pour une croissance optimale pré-test, tout en standardisant les résultats avec l’utilisation d’antifongiques de référence sous forme de contrôles. Cette méthode, avec l’utilisation de plaques multipuits culture, rend possible un grand nombre de composés de l’écran rapidement et sûrement.
En raison de sa souplesse inhérente, ce protocole peut être utilisé avec différentes classes chimiques des composés et contre d’autres micro-organismes, avec quelques adaptations.
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Protocol
1. les solutions et les médias
- Préparer 2 milieu de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), en solution saline tamponnée au phosphate (PBS), bouillon de Sabouraud dextrose et la Sabouraud dextrose agar conformément au tableau 1.
2. champignons Inoculum des Conditions de croissance
- Stocker toutes les souches fongiques comme stocks congelés en glycérol de 35 % à-80 ° C, jusqu'à ce que nécessaire.
- Effectuez les opérations suivantes avant de chaque expérience.
- Pour les souches de Candida albicans :
- Décongeler un flacon de stock et transférer 200 µL à 10 mL de bouillon de Sabouraud dextrose dans un tube en polypropylène stérile de 50 mL avec un bouchon et de la culture du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation (200 tr/min). N’oubliez pas d’incliner le tube et laisser le bouchon légèrement ouverte pour une meilleure aération de la culture.
- Pour les souches de Cryptococcus neoformans :
- Gratter la surface gelée d’un flacon de stock. Plaque des cellules sur des plaques de Gélose Sabouraud dextrose et incuber pendant 48 h à 30 ° C. Après croissance visible de colonies isolées, garder les assiettes dans le réfrigérateur (4 ° C) operculée avec film de paraffine pendant 15 jours.
- Recueillir une colonie isolée moyennes de la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile ou une boucle inoculation stérile et ensemencer 10 mL de bouillon de Sabouraud dextrose dans un tube conique stérile de 50 mL. Incuber pendant environ 24 heures à 30 ° C sous agitation (200 tr/min).
- Ne pas dépasser le 24 h d’incubation. N’oubliez pas d’incliner le tube et laisser le bouchon légèrement ouverte pour une meilleure aération. Il est toujours bon de normaliser le stade de croissance des cellules avant chaque essai, puisqu’il s’agit d’un facteur important affectant la résistance aux antimicrobien.
Remarque : Les deux champignons ont été cultivées à 30 ° C pour une propagation rapide dans nos expériences, mais la température peut être modifiée pour refléter les objectifs de l’étude, le traitement par exemple clinique (37 ° C). Surtout, ce temps d’incubation initiale doit être établi au préalable pour chaque isolat fongique et maintenu pendant tous les essais afin d’assurer la reproductibilité.
- Pour les souches de Candida albicans :
- Après la croissance fongique, recueillir les cellules par centrifugation des tubes coniques à 1 200 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et ajouter 10 mL de PBS.
- Remettre en suspension les cellules et centrifuger à nouveau à 1 200 g pendant 5 min à température ambiante.
- Répéter le lavage PBS et centrifugation de deux fois plus. Après le troisième lavage, remettre en suspension les cellules de 5 mL (selon la taille de granule) de 2 X RPMI-1640 moyenne.
- Préparer 1 mL d’une dilution au 1/100 ou 1 : 1 000 dans un tube de microcentrifuge (en fonction de la turbidité de la suspension cellulaire).
- Aliquote de 10 µL de cette dilution, placez-le dans une chambre hémocytomètre et compter le nombre total de cellules dans les quadrants de quatre coin sous le microscope. Calculer la concentration par la formule suivante : (total cellule numéro/4) x dilution facteur x 104 (constante de dilution de chambre).
- Envisager une viabilité de 100 % si les conditions dénombrements et croissance de viabilité ont été systématiquement corrélées pour l’isolat à l’étude.
NOTE : La normalisation et le contrôle de la qualité des comtes de viabilité peuvent être faits par l’arrière-électrodéposition en accord avec le Comité européen sur la méthode de Concentration inhibitrice Minimum (CMI) antifongique Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) pour levures10 . - Si la corrélation de croissance/viabilité n’a pas été établie pour l’isolat à l’étude, mesurer la viabilité fongique par comptage des cellules vivantes dans un hémocytomètre avec l’aide de colorants cette couleur sélectivement les cellules mortes, comme le phloxine B11, le bleu de trypan 12, ou Janus vert13. Utiliser les cellules fongiques pour ce protocole seulement si la viabilité de la population à ce stade est de 90 % ou plus.
NOTE : Colorants morts/vivants ne fonctionnent pas bien avec le champignon de choix. S’il vous plaît de les tester avant de l’utiliser. Par exemple, le colorant bleu trypan ne fonctionne pas bien avec c. neoformans.
- Envisager une viabilité de 100 % si les conditions dénombrements et croissance de viabilité ont été systématiquement corrélées pour l’isolat à l’étude.
- Après cela, préparer les suspensions de cellules dans un milieu RPMI-1640 de X 2 (2 X ajusté inoculum dans un milieu RPMI-1640). Pour les plaques à 96 puits envisager un volume de 5 mL pour chaque plaque.
- Pour toutes les souches de c. albicans , préparer une suspension de cellules stock de 4 x 103 cellules/mL. Cette concentration est 2 X de la concentration de la dernière cellule dans chaque puits (2 x 103 cellules/mL).
- Pour les souches de c. neoformans , préparer une culture de réserve de cellules 2 x 104 cellules/mL. Cette concentration est deux fois la concentration de la dernière cellule dans chaque puits (1 x 104 cellules/mL).
- Pour les autres champignons, tester avec un antifongique connu dont la concentration sera idéale pour l’étude en particulier en ce qui concerne le temps d’incubation. Compte tenu de temps le métabolisme et la duplication du champignon.
3. peptides (Agent inconnu)
- Stocker les peptides lyophilisés à-20 ° C et les dissoudre dans l’eau désionisée avant chaque expérience. La durée de conservation maximale une fois dissoute dans l’eau dépendra de la nature de chaque peptide.
- Préparer des aliquots de deux fois la plus forte concentration finale analysés avec le test (2 X). Idéalement, préparer un petit nombre de parties aliquotes avec assez de peptide pour un usage de temps afin d’éviter les cycles de gel-dégel.
Remarque : Le choix de la concentration devrait reposer sur la littérature et les propriétés du peptide. Il est recommandé de commencer la série de dilutions avec environ 100 µM du peptide et ensuite augmenter ou diminuer cette gamme de concentration en fonction des résultats obtenus.
4. reference antifongiques (témoins positifs)
- Pour ceux dilué dans l’eau : préparer une solution de X 2 de la plus forte concentration de l’analyse (voir Section 5 : dosage antifongique pour les étapes de dilution).
- Pour les souches de c. albicans , préparer une solution de 128 µg/mL de fluconazole ou 128 µg/mL de la caspofungine. La concentration de la plaque pour les deux soit 64 µg/mL.
- Pour les souches de c. neoformans , préparer une solution de 32 µg/mL d’amphotéricine B (solution soluble dans l’eau). La concentration de la plaque soit 16 µg/mL.
Remarque : Normalement amphotéricine B est dilué dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), étant donné que l’anti-fungiques est peu soluble dans l’eau. Cependant, il y a les préparations solubles dans l’eau amphotéricine B disponibles dans le commerce.
- Pour antifongiques dilués dans un solvant organique : Préparez un 100 X solution dans du DMSO, puis diluer à 10 X dans l’eau pendant l’utilisation.
Remarque : Ainsi, dans le puits, la concentration finale de DMSO ne dépassera pas 1 %. Il faut un puits où le champignon se développera dans des milieux contenant 1 % DMSO comme contrôle compte tenu du fait que certains champignons ne tolèrent pas bien cette concentration du solvant. N’oubliez pas que le DMSO est photosensible, donc couvrir la plaque avec une feuille ou placez-le dans une chambre noire pour la durée de la période d’incubation.
5. antifongique Assay
NOTE : In vitro antifongique analyses basé sur le test de sensibilité de microdilution bouillon de directives Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 avec quelques modifications.
- Préparer une dilution en série double de chaque peptide et antifongique en Microplaque 96 puits en polystyrène pour un volume final de 50 µL de contrôle.
- À l’aide d’une pipette ajouter 100 µL de l’antifongique/peptide dans la concentration X 2 de la plus haute désiré concentration finale dans les colonnes 1 à 3, en ligne A.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL d’eau stérile dans les autres puits, dans les rangées B à H.
- Enlever 50 µL des puits ayant la plus forte concentration (ligne A), transfert à l’autre bien de la prochaine concentration (ligne B) et homogénéiser.
- Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que le bien avec la concentration la plus faible et jeter 50 µL de ce puits (colonne H). Laissez les colonnes 11 et 12 (lignes A, B, C) avec de l’eau seule pour contrôle à blanc ou contrôle négatif/croissance.
- Ajouter 50 µL de la 2 X inoculum ajusté dans un milieu RPMI-1640 dans chaque cupule (colonnes 1-3 plus colonne 11 (contrôle négatif/croissance)) ; la concentration finale de c. albicans sera 2 x 103 cellules/mL et la concentration finale pour les souches de c. neoformans sera 104 cellules/mL.
- Préparer les contrôles vides (50 µL d’eau + 50 µL 2 X RPMI-1640 moyen sans cellules) et contrôle négatif/croissance (50 µL d’eau + 50 µL ajusté inoculum 2 X RPMI-1640 moyennes sans antifongique) et la charge dans la plaque bien comme décrit ci-dessus.
- Répétez la procédure pour chaque composé à tester et le contrôle choisi antifongique (colonnes 4-10).
Remarque : Les dilutions en série peuvent s’effectuer verticalement comme l’expérience ci-dessous, ou horizontalement dans la plaque (c'est-à-dire, si le nombre de dilutions de l’extrait/composé donné qui doit être testé est de huit ou plus).- Si les composés, référence médicaments, ou un de ses composants sont photosensibles, effectuer le test en lumière réduite, recouvrir les plaques avec du papier ou placer dans une chambre noire au cours d’incubations.
- Examiner les recommandations facultatives ci-après.
- Sceller la plaque avec un couvercle transparent qui permet les échanges gazeux, comme cette aide à réduire l’évaporation.
- Placer la plaque dans une chambre humide ; Il contribuera également à réduire l’évaporation.
- Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h ou 48 h pour toutes les souches de c. albicans et pendant 48 h avec 200 tr/min, secouant pour c. neoformans. Le volume final inférieur (100 µL) veille à ce qu’aucun débordement se produit.
Remarque : Aucune différence significative n’a été observée entre les lectures de MIC après 24 h et 48 h pour les souches de c. albicans . Néanmoins, les lectures à 48 h sont plus faciles à visualiser. - Observer tous les puits, avec l’aide d’un microscope optique inversé, avant la période d’incubation et après pour vérifier les changements dans la morphologie ainsi pour contrôler les signes de contamination.
Remarque : Les lectures peuvent être faits visuellement et photographiés à la fin de l’expérience. Avant chaque lecture, homogénéiser légèrement la plaque. Le lit peut également être effectué en mesurant son OD à 600 nm, si la cellule des touffes ou filamentation ne sont pas respectées. - Réaliser les expériences au moins trois fois à des dates distinctes.
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Representative Results
Le MIC est définie comme la plus faible concentration de composés antimicrobiens qui inhibe complètement la croissance fongique visible à la fin de la période d’incubation. Étant donné que l’objectif de ce protocole est une méthode rapide pour les potentiels antifongiques écran, un puits avec claire médias similaires à blancs est considéré comme un résultat positif, alors qu’un puits une turbidité analogue dans les puits de contrôle négatif/croissance est considéré comme négatif. Toutefois, s’il y a un intérêt à savoir si un ampli donné est fongistatique ou fongicide, les médias provenant des puits positifs peuvent également être ensemencés sur la gélose de Sabouraud Dextrose ou vérifiés par un autre test de viabilité.
Étant donné qu’on ne connaît pas le mécanisme d’action d’un roman composé, il est donc essentiel de vérifier si l’antifongique de référence tombe dans l’intervalle prévu pour isoler le fongique (cocher lignes directrices officielles, tables ou données dans la littérature) avant de vérifier la MIC testé pour le composé (dans ce cas, un ampli ; Figure 1 et Figure 2) pour confirmer que les conditions sont idéales. Si elle ne tombe pas dans la gamme respectée, il sera nécessaire de relancer l’expérience puisqu’il sera impossible de déterminer si les changements observés sont imputables uniquement à la substance testée. Il est tout aussi crucial d’observer tous les puits au microscope optique avant et après la période d’incubation pour vérifier les changements dans la morphologie et de la contamination.
La figure 1. Évaluation de l’activité antifongique pour trois peptides contre Cryptococcus neoformansutilisant le test de microdilution bouillon. Concentration de champignon est à 1 x 104 cellules/mL. Trois peptides ont été testés (AMP1, colonnes 1 à 3 ; AMP2, colonnes de 5 à 7 ; AMP3, colonnes 8 à 10) avec des concentrations allant de 100 µM (ligne A) à 0,78 µM (colonne H). Blank et contrôle de la croissance sont dans les colonnes 11 et 12, respectivement. L’image a été acquise avec un appareil photo numérique après 48 h d’incubation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Évaluation de l’activité antifongique pour trois peptides contre Candida albicans en utilisant le test de microdilution bouillon. Concentration de champignon est à 2 x 103 cellules/mL. Trois peptides ont été testés (AMP1, colonnes 1 à 3 ; AMP2, colonnes 4 à 6 ; AMP3, colonnes de 7 à 9) avec des concentrations allant de 100 µM (ligne A) à 0,78 µM (colonne H). Blank et contrôle de la croissance ont été inclus dans l’essai, mais n’apparaissent pas dans la photo. L’image a été acquise avec un appareil photo numérique après 48 h d’incubation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Comme indiqué dans la Figure 1 et Figure 2, 48 h est assez de temps pour distinguer visuellement les puits positifs et négatifs pour c. albicanset c. neoformans . Il est à noter que les résultats pour c. neoformans ont été obtenus 24 h plus tôt conformément aux directives CSLI sans les modifications. Pour chaque trois exemplaires, le puits positif et négatif et donc le MIC pour chaque composé, sont facilement discernables. Cela permet pour la détermination rapide de MIC pour plusieurs composés ainsi que pour choisir quelles molécules une enquête plus approfondie du mérite. Pendant ce temps, la Figure 3 est un exemple un mauvais résultat, probablement de pipetage incorrecte lors de l’étape de dilution. Cela peut être observée dans la colonne 5, ligne C, où une différence dans la croissance de c. neoformans est présente dans l’ensemble de répétitions (colonnes, 5-7).
Figure 3. Exemple d’une erreur technique réplique lors d’un test de dilution sérielle. L’image montre une dilution en série des amplis allant de 100 µM (ligne A) à 0,78 µM (colonne H). Différences dans la croissance de c. neoformans sont présents entre les répétitions dans les colonnes 5-7, ligne C, probablement en raison de l’erreur de pipettage lors de la préparation de la dilution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
En ce qui concerne l’interprétation des plaques, à la Figure 1 il y a un dosage antifongique pour trois amplis différents contre c. neoformans, situé à colonnes 1 à 3 pour AMP1, AMP2 colonnes 5-7 et 8-10 pour AMP3 avec des concentrations variant de 100 µ M (ligne A) à 0,78 µM (colonne H). Le contrôle négatif et la croissance a été placé dans la colonne 11, lignes A à C, tandis que le témoin a été placé dans la colonne 12, lignes A et C. Pour AMP1 (colonnes 1 à 3, les lignes A-C) et AMP2 (colonnes 5-7, lignes A-D), remarque qu’à une concentration plus élevée, le support est translucide et il n’y est pas visible de la croissance. En revanche, à des concentrations plus faibles, les puits sont opaques (lignes colonnes 1-3, D-H et colonnes lignes 5-7, E-H). Ligne C est donc pour contenir le MIC pour AMP1, tandis que le micro pour AMP2 est dans la rangée D, c'est-à-dire, 25 µM et 12,5 µM, respectivement. AMP3 devront être réévaluées, comme le champignon a augmenté dans toutes les concentrations testées. Le réexamen pour AMP3 est nécessaire pour déterminer la cause, qui pourrait être que le milieu d’épreuve interfère avec l’activité antifongique de la contamination microbienne composée, ou une plus grande résistance du champignon à l’agent mis à l’essai. La dernière possibilité, il sera nécessaire d’augmenter la gamme de concentrations testée. Tel qu’observé, les puits non-inhibition et le contrôle sont homogènes, donc ils pourraient également être évaluées par mesure d’OD à 600 nm.
Quant à la Figure 2, trois peptides distincts ont été testés contre c. albicans. Les micros pour AMP1 (colonnes 1 à 3), AMP2 (colonnes 4 à 6) et AMP3 (colonnes 7-9) étaient de 50 µM, 6 µM et 25 µM, respectivement. C. albicans, en raison de la filamentation dans la température d’incubation, peut être observée en touffes dans les puits non-inhibition et du contrôle, rendant difficile l’utilisation mesure OD pour la lecture.
Parfois, aucune croissance n’est observée dans les puits. Cela peut être dû à une contamination de la toxine dans les médias (auquel cas les contrôles de croissance ne montrent également aucune croissance) ou une susceptibilité accrue à l’agent (dans ce cas, les contrôles de croissance montrent la croissance). En conséquence, pour ce dernier cas, une diminution de la plage de concentration peut être nécessaire.
| Médium | Préparation | |
| 2 médiums de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (complété avec la L-glutamine et de rouge de phénol ; sans bicarbonate) | |
| 330 mM 3-(N- morpholino) propane sulfonique (MOPS) | ||
| Réduire/agrandir à pH 7,0 avec NaOH | ||
| Stériliser par filtration (filtre de 0,22 µM) | ||
| En solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoclave à 121° C pendant 15 minutes. | ||
| Bouillon de Sabouraud dextrose | 15 g de la poudre dans 500 mL d’eau distillée. | |
| Ajuster le pH 7,0 avec NaOH | ||
| Autoclave à 121° C pendant 15 minutes. | ||
| Sabouraud Dextrose Agar | 32,5 g de la poudre dans 500 mL d’eau distillée. | |
| Ajuster le pH 7,0 avec NaOH | ||
| Autoclave à 121° C pendant 15 minutes. | ||
Le tableau 1. Préparation de supports et réactif.
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Discussion
Tests de microdilution peuvent analyser l’activité antifongique potentielle d’un composé à l’aide de petites quantités de ce composé de la cible et en même temps le tester dans une gamme de concentrations. En conséquence, le présent protocole est recommandé dans un premier temps dans le dépistage de potentiels nouveaux composés antifongiques. Le protocole présenté ici est basé sur le protocole M27-A3, initialement conçu pour aider dans le choix du traitement antifongique dans les cliniques et peut s’adapter à une variété de nouveaux composés antifongiques. Dans l’ensemble, ce protocole peut se concentrer sur les caractéristiques physico-chimiques de l’extrait ou composé. Par exemple, un candidat potentiel à l’essai peut apparaître faussement inefficace, parce qu’un composé dans les médias peut bloquer son interaction avec les cellules fongiques, comme l’effet de RPMI sur histatine 514. Dans ce cas, un moyen alternatif pour quand le RPMI interfère, est un tampon levure azote Base (YNB) avec MOPS pH 715.
Le protocole permet également des modifications dans les conditions préalables de la croissance, la concentration de l’inoculum, température d’incubation et pour les composants sensibles à la lumière, tant que les résultats de reference antifongiques sont dans la plage de lignes directrices. L’antifongique de référence devrait reposer sur le traitement actuel pour les espèces fongiques testés. En outre, s’il y a une référence composé qui est similaire à la drogue potentielle – par exemple, un peptide antimicrobien connu ayant une activité antifongique contre le modèle testé fongique – il doit servir à un contrôle de référence supplémentaire.
Conditions préalables de la croissance peuvent être modifiées pour adapter les champignons et les besoins en recherche. Comme dans le protocole, c. neoformans et c. albicans ont été cultivées à 30 ° C pour une meilleure propagation. Néanmoins, cette température peut être modifiée selon le métabolisme des champignons : par exemple, Paracoccidioides brasiliensis exige une croissance à 37 ° C pour maintenir sa forme de levure et à cause de son taux de reproduction lent, doit être cultivé pendant 5 à 7 jours. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les caractéristiques de champignon pour tester un nouveau médicament. Par ailleurs, l’âge et le stade de croissance de cellules utilisées doivent être définis selon le but de chaque étude et, surtout, le temps d’incubation initial doit être établi au préalable et maintenu tout au long de tous les tests pour assurer la reproductibilité .
Même, si le composé/extrait, l’antifongique de référence ou diluant est sensible à la lumière, étape devrait être ajoutée pour éviter sa dégradation, comme travailler avec lumière réduite, couvrant les plaques avec du papier ou placer les plaques dans une chambre noire au cours de temps d’incubation.
En outre, l’effet de bord et l’évaporation peuvent être diminuées avec l’ajout d’eau dans les puits vides, de ne pas utiliser les puits extérieurs et en les remplissant avec de l’eau, ou en plaçant la plaque dans une chambre humide.
Une des principales limitations lors de l’utilisation de cette méthode est de mettre l’accent sur l’activité inhibitrice d’une substance testée, plutôt que de faire la distinction entre les effets fongicides ou fongistatiques. Néanmoins, l’objectif étant une projection rapide de la nouvelle potentiel antifongique, la première évaluation visuelle de MIC avec un positif clair (« clear/non-turbidité » puits) et un résultat négatif (puits de « turbidité »), permettent d’identifier les composés d’intérêt pour l’étude plus loin et par conséquent réduisant le coût global du dépistage des nouveaux composés.
Puisqu’on ne connaît pas le mécanisme d’action de ces nouveaux composés, ce même protocole peut être utilisé pour déterminer la capacité du composé pour inhiber ou tuer des cellules fongiques en ajoutant quelques étapes supplémentaires, tels que les puits positifs de placage ou utilisant des teintures de vivre/morts. Autres modifications mineures peuvent être ajoutées pour utiliser le protocole pour un dosage de titrage damier pour identifier tout effet synergique du composé avec d’autres médicaments.
Bien que la lecture de l’essai est généralement effectuée par analyse visuelle de la croissance fongique dans des conditions différentes par rapport à la croissance dans le puits sans agent antifongique (contrôle négatif/croissance), il peut également être fait en mesurant son OD à 600 nm. Cependant, malgré la mesure de l’OD est exacte des solutions homogènes, certains champignons poussent en touffes, brisant ainsi la précision de la méthode – par exemple, les espèces de Candida comme résultat de filamentation au cours de la période d’incubation.
En revanche, l’un des principaux avantages du protocole décrit ici, en comparaison avec les lignes directrices CLSI M27-A3, est qu’elle prend en aération compte des médias pour les champignons non fermentant, comme c. neoformans. Aussi, les lignes directrices CLSI utilise uniquement une petite initiale d’inoculum, ce qui exige de longues périodes d’incubation pour la croissance fongique et définition MIC. Certaines études ont démontré que les inocule initiales supérieures et secouant la plaque durant l’incubation améliorent les tests de sensibilité aux antifongiques sans effets significatifs sur les MIC détermination16,17. Notre protocole peut déterminer précisément le MIC pour les nouveaux composés contre c. neoformans dans une incubation raccourcie, à moins de 48 h, comparée à 72 h, suggérée par les lignes directrices CLSI.
Un autre avantage est que notre protocole utilise un volume final de 100 µL au lieu de 200 µL recommandées par les directives CLSI, réduisant ainsi le montant de la nouvelle molécule testée requis pour l’essai antifongique. Cependant, évaporation de puits externes peut être un sujet de préoccupation, mais les solutions déjà décrites dans cette section pour réduire l’évaporation peuvent être utilisées sans compromettre les résultats de titrage.
En outre, en réalisant les dilutions directement dans la plaque et en contournant ainsi les directives de dilution CLSI pour utiliser des tubes de microcentrifuge, pipettes multicanaux peuvent être utilisés. Ce protocole est moins compliquée que celle dans les lignes directrices CLSI et utilise également moins de matières.
Une étape cruciale, associée à la préparation de la cellule fongique est l’utilisation de cellules qui sont aussi frais que possible. Il est également crucial d’effectuer tous les tests avec les cellules à la même phase de croissance, puisqu’il y a plusieurs rapports dans la littérature sur les différences de sensibilité aux antifongique lorsque la culture ages18,19. Une sélection rigoureuse des souches de référence est également essentielle. Une espèce très sensible ou rarement isolée ne peut pas produire une image claire du potentiel antifongique. De même, il est utile d’éviter toute mesure sous culture quant à ne pas ajouter beaucoup de variables à l’essai. Par exemple, pour les souches de Candida (qui poussent plus vite), nous préférons contourner l’étape de plat d’agar en rendant l’inoculum directement dans les milieux liquides.
N’oubliez pas que les caractéristiques physico-chimiques de l’extrait ou le composé à tester sont importants à considérer. Par exemple, si l’extrait ou le composé doit être dissous dans des solvants autres que l’eau, doit s’assurer d’avoir un contrôle approprié de la croissance fongique, qui comprend la même concentration de solvant avec le champignon seul. C’est pour garantir que toute inhibition de la croissance observée n’est pas à cause du solvant au lieu de la substance testée ou extraire. Dans ce cas, il serait préférable de suivre les recommandations CLSI-M27A3 pour DMSO dilué des médicaments antifongiques, comme dissolvant de la drogue dans une concentration au moins 100 fois supérieure à la concentration la plus élevée testée afin de réduire le pourcentage de solvant dans le plaque.
Au sujet de la stabilité, il est recommandé de garder les petites parties aliquotes des extraits analysés ou composés. En stockant le volume nécessaire pour un seul dosage à la bonne température, manipulation excessive de l’aliquote et, si les extraits ou les composés sont conservés congelés, les cycles gel-dégel peuvent être évités.
Enfin, une des étapes plus fondamentales est l’exactitude de la microplaque de dilution en série, étant donné que toute erreur de pipettage sera propagée le long des dilutions consécutives. Désormais, pipette de précision et les techniques de pipetage appropriées sont primordiaux pour assurer la reproductibilité. Ainsi, il est impératif d’utilisation calibrée pipettes et toujours vérifier si le volume ajoutés et supprimés de chaque puits est correct. Assurez-vous que les résidus ou vestige de la drogue ne reste pas dans l’embout de la pipette. Si le composé a tendance à s’en tenir à la pointe, il serait préférable passer de conseils entre les dilutions.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions CAPES-Brésil, Brésil CNPq, FAP/DF pour un soutien financier. Nous sommes reconnaissants à m. Hugo Costa Paes pour réviser le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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