Summary
En let og smidig bouillon microdilution metode til screening svampedræbende stoffer og ekstrakter.
Abstract
Svampeinfektioner i de sidste årtier er blevet en vigtig medicinsk tilstand, men antallet af tilgængelige svampemidler er begrænset. I dette scenario er søgningen efter nye svampemidler nødvendige. Protokollen rapporteret her beskriver en metode til skærmen peptider for deres svampedræbende egenskaber. Det er baseret på bouillon microdilution modtagelighed test fra de kliniske og laboratorium standarder Institute (der) M27-A3 retningslinjer med ændringer der passer til forskning af antimikrobielle peptider som potentielle nye svampemidler. Denne protokol beskriver en funktionel analyse for at vurdere aktiviteten af svampedræbende stoffer og let kan ændres så de passer til en bestemt klasse af molekyler under undersøgelsen. Da assays udføres i 96-brønd plader ved hjælp af små mængder, kan en omfattende screening fuldføres i en kort tid, især hvis udført i en indstilling for automatisering. Denne fremgangsmåde viser, hvordan en standardiseret og justerbar klinisk protokol kan hjælpe bænk-arbejde udøvelse af nye molekyler til at forbedre behandling af svampesygdomme.
Introduction
Svampeinfektioner er blevet en vigtig medicinsk bekymring i de seneste årtier, har betydeligt øget hovedsagelig skyldes en stigning i antallet af immunkompromitterede personer som dem, der undergår kræftbehandling og dem, der lever med HIV/AIDS eller transplanteres organer1,2. Men en meget begrænset vifte af tilgængelige svampemidler og det stigende antal rapporter om svampe modstand mod dem bidrage til de store problemer vedrørende therapeutics af systemisk mycoses3.
En potentiel kilde til nye svampedræbende stoffer er antimikrobielle peptider (AMP'er), lille kationiske peptider produceret af mange organismer som en del af deres medfødte immun reaktion på infektion4. Ikke desto mindre er screeningsmetode til at teste disse forbindelser mod svampe patogener ikke standardiseret. Forskellige procedurer har anvendt til at vurdere de svampedræbende aktivitet af ampere, nogle gange for den samme model mikroorganisme5,6,7. Disse forskelle og manglen på detaljer i nogle protokoller komplicere sammenligninger mellem forbindelser og hæmmer reproducerbarhed.
En måde at standardisere afprøvning af nye lægemiddelkandidater er at følge retningslinjer bruges til at definere svampedræbende modtagelighed i klinisk indstillinger, som kliniske og laboratorium standarder Institute (der) M27-A3 retningslinjer. Men disse svampedræbende følsomhed test er for restriktiv, og tager ikke hensyn variation i stofskiftet på tværs af arter, som de kun blev etableret for et par udvalgte agenter. For eksempel, tager de ikke hensyn ikke-gæring Gær metaboliske behov.
Denne protokol giver mulighed for vurdering af aktivitet af potentielle svampedræbende stoffer, og er implementeret her for søgning efter svampedræbende peptider. Det er baseret på bouillon microdilution modtagelighed test fra retningslinjerne der M27-A3 med ændringer, optimerer screeningen af nye forbindelser8,9. Disse ændringer giver mulighed for brug af små mængder af sammensatte, variationer i temperatur eller indledende inokulum og forskellige medier for optimal pre-test vækst, samtidig med at standardisere resultater med brug af reference svampemidler som kontrol. Denne metode med brug af flere godt kultur plader, gør det muligt at hurtigt og pålideligt skærmen et stort antal forbindelser.
På grund af dens iboende fleksibilitet, kan denne protokol bruges med forskellige kemiske klasser af forbindelser og mod andre mikroorganismer, med nogle tilpasninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. løsninger og medier
- Forbered 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, fosfatbufferet saltopløsning (PBS), Sabouraud dextrose bouillon og Sabouraud dextrose agar ifølge tabel 1.
2. svampe inokulum vækstbetingelser
- Gemme alle svampe stammer som frosne bestande i 35% glycerol ved-80 ° C, indtil det skal bruges.
- Udfør følgende trin før hvert forsøg.
- For Candida albicans stammer:
- Tø en stock hætteglas og overføre 200 µL til 10 mL af Sabouraud dextrose bouillon i en steril 50 mL polypropylen rør med en hætte og kultur natten over ved 30 ° C med agitation (200 rpm). Husk at bøje i røret og forlade fælles landbrugspolitik lidt åben for bedre beluftning af kultur.
- For Cryptococcus neoformans stammer:
- Skrab den frosne overflade med en bestand hætteglas. Plade celler på Sabouraud dextrose agar plader og inkuberes i 48 timer ved 30 ° C. Efter synlig vækst af isolerede kolonier, holde pladerne i køleskab (4 ° C) forseglet med paraffin film i op til 15 dage.
- Indsamle en mellemstore isoleret koloni fra pladen ved hjælp af en steril tandstikker eller sterile vaccinere loop og podes 10 mL af Sabouraud dextrose bouillon i en steril 50 mL konisk slange. Inkuber i cirka 24 timer ved 30 ° C under agitation (200 rpm).
- Ikke overstige 24 h inkubation. Husk at bøje i røret og lade fælles landbrugspolitik lidt åben for bedre udluftning. Det er altid godt at standardisere vækststadium af celler før hver test, da dette er en vigtig faktor, der påvirker antimikrobiel resistens.
Bemærk: Begge svampe blev dyrket ved 30 ° C til hurtige formering i vores eksperimenter, men temperaturen kan ændres for at afspejle målene for undersøgelsen, for eksempel kliniske behandling (37 ° C). Vigtigst, denne første inkubationstiden etableret på forhånd for hver svampe isolat og vedligeholdes i hele alle prøver at sikre reproducerbarhed.
- For Candida albicans stammer:
- Efter svampevækst, indsamle cellerne ved centrifugering af koniske rør på 1.200 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes og der tilsættes 10 mL PBS.
- Resuspend celler og centrifugeres igen ved 1.200 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Gentag PBS vask og centrifugering to gange mere. Efter den tredje vask, resuspend celler i 5 mL (ifølge pellet størrelse) 2 X RPMI-1640 medium.
- Forberede 1 mL af en 1: 100 eller 1:1,000 i et microcentrifuge rør (afhængigt af turbiditet i cellesuspension).
- Alikvot 10 µL af denne fortynding, placere den i en hemocytometer kammer og tæller antallet af celler i de fire hjørne kvadranter under mikroskop. Beregne koncentrationen af formlen: (alt celle nummer/4) x fortynding faktor x 104 (kammer fortynding konstant).
- Overveje en 100% levedygtighed, hvis levedygtighed tæller og vækst betingelser har været systematisk korreleret til isolatet undersøges.
Bemærk: Standardisering og kvalitetskontrol af levedygtighed tæller kan gøres ved back-plating i henhold til den Europæiske Komité for antimikrobiel følsomhed test (EUCAST) svampedræbende Minimum hæmmende koncentration (MIC) metode for gær10 . - Hvis vækst/levedygtighed korrelation ikke er blevet etableret for isolat under undersøgelsen, måle svampe levedygtighed ved optælling af levende celler i en hemocytometer ved hjælp af farvestoffer, som selektivt farve døde celler, såsom phloxine B11, trypan blå 12, eller Janus grøn13. Bruge svampe cellerne for denne protokol, kun hvis levedygtighed af befolkningen på dette punkt er 90% eller derover.
Bemærk: Død/levende farvestoffer kan ikke fungerer godt med svamp af valg. Venligst test dem før brug. For eksempel, fungerer trypan blå farvestof ikke godt med C. neoformans.
- Overveje en 100% levedygtighed, hvis levedygtighed tæller og vækst betingelser har været systematisk korreleret til isolatet undersøges.
- Efter dette, forberede celle suspensioner i 2 X RPMI-1640 medium (2 X justeret inokulum i RPMI-1640 medium). 96-brønd plader overveje et volumen på 5 mL for hver plade.
- For alle stammer, C. albicans , udarbejde et lager cellesuspension af 4 x 103 celler/mL. Denne koncentration er 2 X i den sidste celle koncentration i hver brønd (2 x 103 celler/mL).
- C. neoformans stammer, forberede en stamkultur celler 2 x 104 celler/ml. Denne koncentration er to gange den sidste celle koncentrationen i hver brønd (1 x 104 celler/mL).
- For andre svampe, test med et kendt svampedræbende hvilken koncentration vil være ideel til den særlige undersøgelse i forbindelse med inkubationstiden. Tage stofskifte og dobbeltarbejde tidspunktet for svampen.
3. peptider (ukendt Agent)
- Gemme de frysetørrede peptider ved-20 ° C, og opløses i deioniseret vand før hvert forsøg. Den maksimale opbevaringstid engang opløst i vand vil afhænge af arten af hver peptid.
- Forberede delprøver af to gange den højeste endelige koncentration testet i analysen (2 X). Ideelt, klargør et lille antal delprøver med nok peptid til engangsbrug at undgå fryse-tø cykler.
Bemærk: Valget af koncentration bør være baseret på litteratur og egenskaberne for peptid. Det anbefales at starte de serielle fortyndinger med ca. 100 µM af peptid, og derefter mindske eller øge denne koncentration rækkevidde afhængigt af de opnåede resultater.
4. reference svampemidler (positiv kontrol)
- For dem, fortyndet i vand: Forbered en 2 X løsning på den højeste koncentration af analysen (Se afsnit 5: svampedræbende Assay for fortynding trin).
- For C. albicans stammer, der fremstilles en opløsning af 128 g/mL af fluconazol eller 128 g/mL af caspofungin. Plade koncentration for begge vil være 64 µg/mL.
- C. neoformans stammer, forberede en opløsning af 32 µg/mL af amphotericin B (vandopløselige løsning). Plade koncentration vil være 16 µg/mL.
Bemærk: Normalt amphotericin B er fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO), da denne anti-svampe er tungtopløselige i vand. Der er dog vandopløselige amphotericin B præparater kommercielt tilgængelige.
- For svampemidler fortyndet i et organisk opløsningsmiddel: forberede en 100 X stamopløsning i DMSO, så fortynd det til 10 X i vand til brug.
Bemærk: Således i brønden, den endelige koncentration af DMSO vil ikke overstige 1%. En brønd, hvor svampen vil vokse i medier indeholdende 1% DMSO som kontrol er nødvendig, da nogle svampe ikke tolererer godt denne koncentration af opløsningsmidlet. Husk at DMSO er lysfølsomme, så dække pladen med folie eller placere den i et mørkt kammer for varigheden af inkubationstiden.
5. svampedræbende Assay
Bemærk: In vitro svampedræbende assays udføres baseret på bouillon microdilution modtagelighed test fra klinisk og laboratorie standarder Institute (der) M27-A3 retningslinjer med nogle ændringer.
- Forberede en dobbelt seriel fortynding af hver peptid og styre svampemidler i 96-brønd polystyren mikroplader til en endelige mængden af 50 µL.
- Ved hjælp af en pipette tilføje 100 µL af svampemidler/peptid i 2 X koncentrationen af den højeste ønskede slutkoncentration i kolonnerne 1-3, i rækken A.
- Ved hjælp af en multikanalpipette, tilføje 50 µL sterilt vand ind i de andre brønde i række B til H.
- Fjerne 50 µL af wells med den højeste koncentration (linje A), overføre til næste godt af den næste koncentration (række B) og homogeniseres.
- Gentag ovenstående trin indtil godt med den laveste koncentration og kassér 50 µL af denne brønd (række H). Forlade kolonner 11 og 12 (rækkerne A, B, C) med kun vand til enten blindkontroller eller negativ/vækst kontrol.
- Tilsæt 50 µL af 2 X justerede inokulum i RPMI-1640 medium til hver brønd (kolonner 1-3 plus kolonne 11 (negativ/vækst control)); den endelige koncentration for C. albicans vil være 2 x 103 celler/mL, og den endelige koncentration for C. neoformans stammer vil være 104 celler/mL.
- Forberede Tom kontrol (50 µL vand + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium uden celler) og negativ/vækst kontrol (50 µL vand + 50 µL justeret inokulum 2 X RPMI-1640 medium uden svampemidler), og belastning i godt pladen som beskrevet ovenfor.
- Gentag proceduren for hver sammensat at blive testet og den valgte svampedræbende kontrol (kolonne 4-10).
Bemærk: De serielle fortyndinger kan gøres lodret som eksperiment nedenfor, eller vandret i pladen (dvs. hvis antallet af fortyndinger af det givne sammensatte/ekstrakt, der skal testes, er otte eller flere).- Hvis henviser til forbindelser, narkotika, eller nogen af dets komponenter er lysfølsomme, udføre analysen i nedsat lys, dække plader med folie eller sted i et mørkt kammer under inkubationer.
- Overvej følgende valgfri anbefalinger.
- Forsegle pladen med en klar dækplade, som tillader, at luftskiftet, da dette hjælper med at reducere fordampning.
- Pladen anbringes i et fugtigt kammer; det vil også medvirke til at reducere fordampning.
- Inkuber plader ved 37 ° C i 24 timer eller 48 timer for alle stammer, der C. albicans og for 48 h med 200 rpm ryster for C. neoformans. Den lavere endelige rumfang (100 µL) sikrer, at ingen spillover opstår.
Bemærk: Ingen signifikant forskel blev observeret mellem MIC aflæsninger på 24 h og 48 h for C. albicans stammer. Ikke desto mindre er aflæsninger på 48 h nemmere at visualisere. - Overhold alle brønde, med bistand fra en inverteret optisk mikroskop, før inkubationstiden og efter at kontrollere ændringer i morfologi samt at kontrollere for tegn på kontaminering.
Bemærk: Behandlinger kan gøres visuelt og fotograferet i slutningen af forsøget. Før hver læsning, homogeniseres lidt pladen. Læser kan også udføres ved at måle dens OD på 600 nm, hvis cellen klumper eller filamentation ikke overholdes. - Udføre eksperimenter på mindst tre gange på forskellige datoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MIC er defineret som den laveste antimikrobiel sammensatte koncentration, der fuldstændig hæmmer synlige svampevækst i slutningen af inkubationstiden. Da formålet med denne protokol er at have en hurtig metode til skærmen potentielle svampemidler, anses nogen godt med klare medier svarer til Tom brøndene et positivt resultat, enhver godt med turbiditet analog med negativ/vækst-kontrolhullerne er betragtes som negative. Men hvis der er en interesse i at vide, om en given AMP er fungistatisk eller svampedræbende, medier fra de positive brønde kan også belagt på Sabouraud Dextrose Agar eller kontrolleres af en anden levedygtighed test.
Om en roman sammensatte virkningsmekanisme er ukendt, det er derfor vigtigt at kontrollere, hvis reference svampedræbende falder inden for det forventede interval for de svampe isolere (check officielle retningslinjer, tabeller eller data i litteratur) før du kontrollerer den testede mikrofon til sammensat (i dette tilfælde, en AMP; Figur 1 og figur 2) til at bekræfte, at betingelserne er ideel. Hvis det ikke falder i den respekterede vifte, vil det være nødvendigt at rerun eksperimentet, da det vil være umuligt at afgøre, om de observerede ændringer er udelukkende på grund af den testede sammensatte. Det er ligeledes afgørende at observere alle brønde under et optisk mikroskop, før og efter inkubationstid at tjekke for ændringer i morfologi og forurening.
Figur 1. Evaluering af svampedræbende aktivitet for tre peptider mod Cryptococcus neoformansbruger bouillon microdilution assay. Svamp koncentration er på 1 x 104 celler/mL. Tre peptider blev testet (AMP1, kolonner 1 til 3; AMP2, kolonner 5 til 7; AMP3, kolonne 8 til 10) med koncentrationer spænder fra 100 µM (linje A) til 0,78 µM (række H). Vækst kontrol og blank er i kolonne 11 og 12, henholdsvis. Billedet blev erhvervet med et digitalt kamera efter 48 h inkubation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Evaluering af svampedræbende aktivitet for tre peptider mod Candida albicans bruger bouillon microdilution assay. Svamp koncentration er på 2 x 103 celler/mL. Tre peptider blev testet (AMP1, kolonner 1 til 3; AMP2, kolonner 4 til 6; AMP3, kolonner 7-9) med koncentrationer spænder fra 100 µM (linje A) til 0,78 µM (række H). Vækst kontrol og Tom indgik i analysen, men vises ikke i fotoet. Billedet blev erhvervet med et digitalt kamera efter 48 h inkubation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som anført i figur 1 og figur 2, er 48 h tid nok til at skelne mellem positive og negative brønde visuelt for både C. neoformans og C. albicans. Det er bemærkelsesværdigt, at resultaterne for C. neoformans blev indhentet 24 timer tidligere end under retningslinjerne CSLI uden ændringer. For hver tre eksemplarer, de positive og negative godt, og derfor MIC for hvert stof, der nemt mærkbar. Dette giver mulighed for hurtig MIC bestemmelse for flere forbindelser såvel som for at vælge hvilke molekyler merit yderligere undersøgelse. I mellemtiden, figur 3 er et eksempel et dårligt resultat, sandsynligvis fra forkert pipettering under trinnet fortynding. Dette kan ses i kolonne 5, række C, hvor en forskel i C. neoformans vækst er til stede på tværs af flergangsbestemmelser (kolonner 5-7).
Figur 3. Eksempel på en fejl i tekniske replikater i en seriel fortynding assay. Billedet viser en seriel fortynding af ampere spænder fra 100 µM (linje A) til 0,78 µM (række H). Forskelle i C. neoformans vækst er til stede mellem replikater i kolonne 5-7, række C, sandsynligvis på grund af pipettering fejl under fortynding forberedelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Med hensyn til fortolkningen af pladerne i figur 1 er der et svampedræbende assay for tre forskellige ampere mod C. neoformans, placeret på kolonner 1-3 til AMP1, kolonner 5-7 for AMP2 og kolonne 8-10 for AMP3 med koncentrationer varierende fra 100 μ M (linje A) til 0,78 µM (række H). Kontrolelementet negativ/vækst blev placeret i kolonne 11, rækker A til C, mens blindprøvekontrollen var placeret i kolonne 12, rækker A til C. For AMP1 (kolonne 1-3, rækker A-C) og AMP2 (kolonner 5-7, rækker A-D), er Bemærk, at ved en højere koncentration i medierne er gennemsigtig, og der ingen synlig vækst. Derimod ved lavere koncentrationer brøndene er uigennemsigtigt (kolonne 1-3, rækker D-H og kolonner 5-7, rækker E-H). Derfor er række C anses for at indeholde MIC for AMP1, mens MIC for AMP2 er i række D, det vil sige 25 µM og 12,5 µM, henholdsvis. AMP3 bliver nødt til at blive genevalueret, da svampen voksede i alle koncentrationer testet. Reeksamen for AMP3 er nødvendige for at fastslå årsagen, som kunne være at testsubstratet forstyrrer de svampedræbende aktivitet af den sammensatte, mikrobiel forurening, eller en højere modstand af svampen til agenten testet. For den sidste mulighed, vil det være nødvendigt at øge det koncentrationsområde, testet. Som bemærket, no-hæmning og kontrol brønde er homogen, så de kunne også blive vurderet af OD måling på 600 nm.
Med hensyn til figur 2, blev tre forskellige peptider testet mod C. albicans. Mikrofoner for AMP1 (kolonner 1-3), AMP2 (kolonner 4-6), og AMP3 (kolonner 7-9) var 50 µM, 6 µM og 25 µM, henholdsvis. C. albicans, kan på grund af filamentation i inkubation temperatur, observeres i klumper i ingen-hæmning og kontrol brøndene, hvilket gør det vanskeligt at bruge OD måling for læsning.
Nogle gange, er ingen vækst observeret i brøndene. Dette kan skyldes et giftstof forurening i medierne (i hvilket tilfælde vækst kontrol også viser ingen vækst) eller en højere følsomhed over for agenten (i hvilket tilfælde vækst kontrol viser vækst). I overensstemmelse hermed, for sidstnævnte tilfælde et fald i koncentrationsområde kan være nødvendige.
| Medium | Forberedelse | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (suppleret med L-glutamin og phenol rød; uden bikarbonat) | |
| 330 mM 3-(N- morpholino) propan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (MOPS) | ||
| Juster til pH 7,0 med NaOH | ||
| Sterilisere ved filtrering (0,22 µM filter) | ||
| Fosfatbufferet saltopløsning (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| 10 mM Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoklavering ved 121° C i 15 minutter. | ||
| Sabouraud dextrose bouillon | 15 g pulver i 500 mL destilleret vand. | |
| Justeres til pH 7,0 med NaOH | ||
| Autoklavering ved 121° C i 15 minutter. | ||
| Sabouraud Dextrose Agar | 32,5 g pulver i 500 mL destilleret vand. | |
| Justeres til pH 7,0 med NaOH | ||
| Autoklavering ved 121° C i 15 minutter. | ||
Tabel 1. Medier og reagens forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdilution tests kan analysere den potentielle svampedræbende aktivitet af et sammensat ved hjælp af små mængder af sammensat mål og samtidig prøve det i en række koncentrationer. Derfor kan denne protokol anbefales som et første skridt i forbindelse med screening for potentielle nye svampedræbende stoffer. Protokollen præsenteres her er baseret på M27-A3-protokollen, oprindeligt designet til at støtte i udvælgelsen af svampedræbende terapi i klinikker, og kan tilpasses til en lang række nye svampedræbende stoffer. Samlet set kan denne protokol fokusere på de fysisk-kemiske egenskaber af ekstraktet eller sammensatte. For eksempel kan en potentiel kandidat i analysen fejlagtigt vises ineffektive, fordi en sammensat i medierne kan blokere dens interaktion med svampe cellen, såsom effekten af RPMI på Histatin 514. I dette tilfælde er en alternativ medium for Hvornår RPMI griber, gær Nitrogen Base (YNB) buffer med MOPPER pH 715.
Protokollen giver også ændringer i pre vækstbetingelser, inokulum koncentration, inkubation temperatur og for lysfølsomme komponenter, så længe de reference svampedræbende resultater inden for de retningslinjer. Reference svampedræbende bør baseres på den aktuelle behandling for de testede svampe arter. Desuden, hvis der er en reference sammensatte det er samme karakter som den potentielle stof – fx, en kendt antimikrobielle peptid med svampedræbende aktivitet mod de testede svampe model-det bør anvendes som en supplerende Henvisningsobjektet.
Før vækstbetingelser kan ændres til at passe svampene og forskning behov. Som i protokollen blev, C. neoformans og C. albicans dyrket ved 30 ° C til bedre formering. Ikke desto mindre, denne temperatur kan ændres alt efter svampe stofskifte: for eksempel, Paracoccidioides brasiliensis kræver vækst ved 37 ° C til at opretholde sin gær form, og på grund af dens langsomme dobbeltarbejde sats, skal være dyrket i 5-7 dage. Derfor er det vigtigt at forstå svamp karakteristika for at teste en potentielle nye narkotika. Desuden, alder og fase af vækst af celler anvendes bør defineres ifølge Formålet med hver undersøgelse og, vigtigst, den første inkubationstiden bør fastsættes på forhånd og vedligeholdes i hele alle prøver at sikre reproducerbarhed .
Ligeledes, hvis sammensatte/ekstrakt, reference svampehæmmende eller fortyndingsmiddel er følsomme over for lys, trin bør tilføjes for at forhindre dets nedbrydning, som arbejder med reduceret lys, der dækker plader med folie eller placere pladerne i et mørkt kammer under inkuberingstider.
Derudover kan kant virkning og fordampning mindskes med tilsætning af vand i tomme wells, ikke bruger de yderste brønde og fylde dem med vand, eller ved at placere pladen i et fugtigt kammer.
En af de vigtigste begrænsninger ved brug af denne metode er dets fokus på de hæmmende aktivitet af en testet sammensatte, i modsætning til at skelne mellem svampedræbende eller fungistatisk effekter. Alligevel, da målet er en hurtig screening af den potentielle nye svampemidler, den første visuelle vurdering MIC med et klart positivt (klar/ikke-turbiditet' wells) og negative ('turbiditet' wells) følge, hjælper med at identificere forbindelser af interesse at studere yderligere, og derfor reducere de samlede omkostninger ved screening for nye forbindelser.
Da virkningsmekanisme af disse nye forbindelser er ukendt, kan denne samme protokol bruges til at bestemme den sammensatte evne til at hæmme eller dræbe svampe celler ved at tilføje et par ekstra skridt, såsom plating de positive brønde eller ved hjælp af live/døde farvestoffer. Andre mindre ændringer kan føjes til protokollen for et skakternet titrering assay for at identificere eventuelle synergivirkninger i sammensat med andre lægemidler.
Selvom analysens læsning udføres typisk af visuel analyse af svampevækst under forskellige betingelser i forhold til væksten i brønden med ingen svampedræbende middel (negativ/vækst control), kan det også gøres ved at måle dens OD på 600 nm. Men selv om OD måling er nøjagtig for homogen løsninger, nogle svampe vokser i klumper således bryde praecision – e.g., Candida spp. som følge af filamentation under inkubationstiden.
På den anden side et af de store fordele ved den protokol, der er beskrevet her, i forhold til retningslinjerne der M27-A3 er, at den tager hensyn beluftning af medierne for ikke-gærende svampe, ligesom C. neoformans. Også, der retningslinjer kun bruger en lille indledende inokulum, hvilket kræver længere perioder af inkubation for svampevækst og MIC definition. Nogle undersøgelser har vist, at højere initialerne inoculums og ryster pladen under inkubation forbedre svampedræbende modtagelighed prøver uden betydelige virkninger på MIC bestemmelse16,17. Vores protokol kan præcist bestemme MIC for nye forbindelser mod C. neoformans i en forkortet inkubationstid inden for 48 timer, i forhold til 72 h foreslået af der retningslinjer.
En anden fordel er, at vores protokol bruger en 100 µL endelige mængden i stedet for 200 µL anbefales af der retningslinjer, hvilket reducerer mængden af det afprøvede nye sammensatte kræves for svampedræbende analysen. Fordampning af eksterne brønde kan være en bekymring, men løsninger allerede beskrevet i dette afsnit for at reducere fordampning kan bruges uden at kompromittere assay resultater.
Derudover ved at udføre Fortyndingerne direkte i pladen, og dermed omgå der fortynding retningslinjerne for at bruge microcentrifuge rør, kan multikanals pipetter bruges. Denne protokol forsamling er mindre kompliceret end den, i retningslinjerne for der, og også bruger færre materialer.
Et kritisk trin relateret til svampe celle forberedelse er brugen af celler, der er så frisk som muligt. Det er også afgørende at udføre alle assays med celler på den samme vækstfase, da der er flere rapporter i litteraturen om forskelle i svampedræbende modtagelighed, når kulturen aldre18,19. En omhyggelig udvælgelse af reference stammer er også væsentlige. En meget følsom eller sjældent isoleret arter kan ikke producere et klart billede af de svampedræbende potentiale. Af samme grund, er det nyttigt at undgå sub dyrkningsbaserede trin, ikke tilføje mange variabler til analysen. For eksempel, for Candida stammer (som vokse hurtigere), vi foretrækker at omgå agar plade skridt ved at gøre inokulat direkte ind i den flydende medier.
Husk, at de fysisk-kemiske egenskaber af ekstraktet eller sammensatte skal testes er vigtigt at overveje. For eksempel hvis ekstrakt eller sammensatte behov at være opløst i opløsningsmidler end vand, skal sikre en passende svampevækst kontrol indeholder, den samme opløsningsmiddel fusion med svamp alene. Dette er for at sikre, at enhver væksthæmning, observeret ikke er på grund af opløsningsmiddel i stedet for den testede sammensatte eller uddrag. I dette tilfælde, det ville være bedre at følge de der-M27A3 anbefalinger til DMSO fortyndet svampedræbende medicin, såsom opløse stof i en koncentration på mindst 100 gange højere end den højeste testkoncentration at reducere andelen af opløsningsmidler i de plade.
Med hensyn til stabilitet anbefales det at holde små prøver analyseret ekstrakter eller forbindelser. Ved at gemme den nødvendige mængde for et enkelt assay ved den hensigtsmæssige temperatur, overdreven manipulation af alikvot, og hvis ekstrakter eller forbindelser gemmes frosset, fryse-tø cykler kan undgås.
Endelig, et af de mest grundlæggende skridt er nøjagtigheden af mikrotiterplade seriel fortynding, eftersom enhver pipettering fejl vil blive formeret ad de på hinanden følgende fortyndinger. Fremover, er pipette præcision og ordentlig pipettering teknik afgørende at sikre reproducerbarhed. Så er det bydende nødvendigt at bruge kalibreret pipetter og altid check hvis lydstyrken tilføjet og fjernet fra hver brønd er korrekte. Sørg for, at restkoncentrationer eller levn fra stoffet ikke forbliver pipette tip. Hvis stoffet har tendens til at holde sig til spidsen, kan det være bedre at skifte tips mellem Fortyndingerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker KAPPER-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF for finansiel støtte. Vi er taknemmelige for Dr. Hugo Costa Paes for revision af håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
