Summary
Un método microdilución en caldo fácil y adaptable para la detección de compuestos antifúngicos y extractos.
Abstract
Infecciones por hongos se han convertido en una condición médica importante en las últimas décadas, pero el número de fármacos antifúngicos disponibles es limitado. En este escenario, la búsqueda de nuevos fármacos antifúngicos es necesaria. El protocolo reportado aquí detalla un método para péptidos de pantalla por sus propiedades antifúngicas. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con modificaciones para adaptarse a la investigación de péptidos antimicrobianos como potenciales nuevos antifúngicos. Este protocolo describe un análisis funcional para evaluar la actividad de compuestos antimicóticos y puede modificarse fácilmente para adaptarse a cualquier clase particular de moléculas bajo investigación. Puesto que los ensayos se realizan en placas de 96 pozos utilizando pequeños volúmenes, una proyección a gran escala puede completarse en un corto período de tiempo, especialmente si lleva a cabo en un entorno de automatización. Este procedimiento muestra cómo un protocolo clínico estandarizado y ajustable puede ayudar a la búsqueda Banco de trabajo de nuevas moléculas para mejorar la terapia de enfermedades causadas por hongos.
Introduction
Infecciones por hongos se han convertido en una preocupación médica importante en las últimas décadas, habiendo aumentado considerablemente debido principalmente a un aumento en el número de individuos inmunocomprometidos como los sometidos a tratamiento contra el cáncer y las personas que viven con VIH/SIDA o trasplantados de órganos1,2. Sin embargo, una gama muy limitada de los fármacos antimicóticos disponibles y el número creciente de informes sobre resistencia a los hongos les contribuyen a los grandes problemas con respecto a la terapéutica de micosis sistémicas3.
Una fuente potencial de nuevos compuestos antimicóticos son péptidos antimicrobianos (AMPs), pequeños péptidos catiónicos producidos por muchos organismos como parte de la respuesta inmune innata a infecciones4. Sin embargo, no está estandarizado el método de cribado para probar estos compuestos contra hongos patógenos. Se han utilizado diversos procedimientos para evaluar la actividad antifúngica de amperios, a veces para el mismo modelo microorganismo5,6,7. Estas diferencias y la falta de detalle en algunos de los protocolos complican las comparaciones entre reproducibilidad compuestos y cestas.
Una manera de estandarizar las pruebas de nuevos fármacos candidatos debe seguir directrices utilizadas para definir susceptibilidad antifúngica en contextos clínicos, como la clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3. Sin embargo, estas pruebas de sensibilidad a los antifúngicos son demasiado restrictivas y no tienen en variaciones de consideración en el metabolismo entre especies, ya que sólo se establecieron algunos agentes selectos. Por ejemplo, no toman en cuenta las necesidades metabólicas de las levaduras no fermentadores.
Este protocolo permite la evaluación de la actividad de potenciales compuestos antihongos y se implementa aquí para la búsqueda de péptidos antifúngicos. Se basa en la prueba de sensibilidad de microdilución de caldo de las directrices del CLSI M27-A3 con modificaciones que optimizan la proyección de nuevos compuestos de8,9. Estos cambios permiten el uso de pequeñas cantidades de compuesto, las variaciones de temperatura o inóculo inicial y distintos medios para un crecimiento óptimo previo a la prueba, mientras que la estandarización de los resultados con el uso de antifúngicos de referencia como controles. Este método, con la utilización de placas de varios pocillos cultura, permite la rápida y confiable de la pantalla un gran número de compuestos.
Debido a su flexibilidad inherente, este protocolo puede utilizarse con diferentes clases químicas de los compuestos y contra otros microorganismos, con pocas adaptaciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. las soluciones y los medios de comunicación
- Preparar 2 medio de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), tamponada fosfato salino (PBS), caldo de dextrosa de Sabouraud y agar dextrosa de Sabouraud según tabla 1.
2. condiciones de crecimiento del inóculo hongos
- Guarde todas las cepas de hongos como acción congelada en 35% de glicerol a-80 ° C, hasta que se necesite.
- Realice los pasos siguientes antes de cada experimento.
- Para las cepas de Candida albicans :
- Descongelar un vial común y transfiera 200 μl a 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en tubo estéril 50 mL polipropileno con tapa y cultura durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm). Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación de la cultura.
- Para las cepas de Cryptococcus neoformans :
- Raspar la superficie congelada de un frasco de stock. Las células en placas de Sabouraud dextrosa agar de la placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Tras el visible crecimiento de colonias aisladas, mantener las placas en el refrigerador (4 ° C) sellado con la película de parafina hasta 15 días.
- Recoger una colonia aislada de tamaño mediano de la placa con un palillo estéril o asa de inoculación estéril e inocular 10 mL de caldo de dextrosa de Sabouraud en un tubo cónico estéril 50 mL. Incuban durante aproximadamente 24 h a 30 ° C en agitación (200 rpm).
- No exceda la 24 h de incubación. Recuerde incline el tubo y deje la tapa ligeramente abierta para mejor aireación. Siempre es bueno estandarizar la fase de crecimiento de las células antes de cada prueba, ya que este es un factor importante que afecta la resistencia a los antimicrobianos.
Nota: Ambos hongos fueron cultivadas a 30 ° C para la rápida propagación en nuestros experimentos, pero la temperatura puede cambiarse para reflejar los objetivos del estudio, por ejemplo tratamiento (37 ° C). Lo más importante, este tiempo de incubación inicial debe ser establecido previamente para cada hongo aislado y mantenido a lo largo de todas las pruebas para asegurar la reproducibilidad.
- Para las cepas de Candida albicans :
- Después de crecimiento fúngico, recogen las células por centrifugación los tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS.
- Resuspender las células y centrifugar nuevamente a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Repita el lavado PBS y centrifugación dos veces más. Después del tercer lavado, resuspender las células en 5 mL (según el tamaño de la pelotilla) de Medio RPMI-1640 X 2.
- Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 o 1:1,000 en un tubo de microcentrífuga (dependiendo de la turbidez de la suspensión de células).
- Alícuota de 10 μl de esta dilución, colocar en una cámara del hemocitómetro y contar el número total de células en los cuadrantes de cuatro esquinas en el microscopio. Calcular la concentración de la fórmula: (número de celular/4 en total) x dilución factor x 104 (constante de disolución de la cámara).
- Considerar una viabilidad del 100% si las condiciones de crecimiento y cuentas de viabilidad se han correlacionado sistemáticamente para la cepa en estudio.
Nota: La normalización y control de calidad de viabilidad cuenta pueden hacerse por la parte posterior-galjanoplastia de acuerdo a la Comisión Europea de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) antimicóticos concentración inhibitoria mínima (MIC) método para levaduras10 . - Si no ha sido establecida la correlación de crecimiento/viabilidad de la cepa en estudio, medir la viabilidad de hongos por recuento de células vivas en un hemocitómetro con ayuda de tintes que color selectivamente las células muertas, como la Floxina B11, trypan azul 12, o Janus verde13. Utilice las células micóticas de este protocolo sólo si la viabilidad de la población en este momento es 90% o superior.
Nota: Muerto/vivo tintes no funcionen bien con el hongo de la opción. Por favor prueba antes del uso. Por ejemplo, el colorante azul de trypan no funciona bien con C. neoformans.
- Considerar una viabilidad del 100% si las condiciones de crecimiento y cuentas de viabilidad se han correlacionado sistemáticamente para la cepa en estudio.
- Después de eso, preparar las suspensiones celulares en Medio RPMI-1640 X 2 (2 X ajustar inóculo en Medio RPMI-1640). Para placas de 96 pocillos considerar un volumen de 5 mL para cada placa.
- Para todas las cepas de C. albicans , preparar una suspensión stock de 4 x 103 células/mL. Esta concentración es de 2 X de la concentración final de células en cada pozo (2 x 103 células/mL).
- Para las cepas de C. neoformans , preparar un cultivo de células 2 x 104 células/mL. Esta concentración es dos veces la concentración final de células en cada pozo (1 x 104 células/mL).
- Para otros hongos, prueba con un antimicótico conocido que la concentración será ideal para el estudio particular en relación con el tiempo de incubación. Considerar con tiempo de duplicación y el metabolismo del hongo.
3. péptidos (agente desconocido)
- Almacenar los péptidos liofilizados a-20 ° C y disolver en agua desionizada antes de cada experimento. El tiempo máximo de almacenamiento una vez disuelto en el agua dependerá de la naturaleza de cada péptido.
- Preparar alícuotas de dos veces la máxima concentración final en el ensayo (2 X). Lo ideal es preparar un pequeño número de alícuotas con suficiente péptido para un uso evitar la congelación y descongelación.
Nota: La opción de concentración debe basarse en la literatura y las propiedades del péptido. Se recomienda iniciar las diluciones seriadas con aproximadamente 100 μm del péptido y disminuir o aumentar este rango de concentración dependiendo de los resultados obtenidos.
4. referencia antifúngicos (controles positivos)
- Para los diluidos en agua: preparar una solución de X 2 de la concentración más alta del análisis (ver sección 5: ensayo de antimicóticos para los pasos de dilución).
- Para las cepas de C. albicans , preparar una solución de 128 μg/mL de fluconazol o 128 μg/mL de la caspofungina. La concentración de placa para ambos será de 64 μg/mL.
- Para las cepas de C. neoformans , preparar una solución de 32 μg/mL de anfotericina B (solución soluble en agua). La concentración de placa será de 16 μg/mL.
Nota: Normalmente la anfotericina B se diluye en dimetil sulfóxido (DMSO), ya que este fungicida es mal soluble en agua. Sin embargo, existen preparaciones de anfotericina B soluble en agua disponible en el mercado.
- Para antifúngicos diluidos en un solvente orgánico: preparar 100 X solución de DMSO, luego diluir hasta 10 X en agua para su uso.
Nota: Por lo tanto, en el pozo, la concentración final de DMSO no superará el 1%. Un pozo donde el hongo crece en medios que contienen 1% DMSO como control es necesario ya que algunos hongos lo toleran bien esta concentración del disolvente. Recuerde que el DMSO es fotosensible, así que cubra la placa con papel de aluminio o colocarlo en una cámara oscura para la duración de la incubación.
5. ensayo antimicótico
Nota: In vitro antifúngicos ensayos se realizan en base a la prueba de sensibilidad de microdilución caldo de guías clínicas y el Instituto de normas de laboratorio (CLSI) M27-A3 con algunas modificaciones.
- Preparar una dilución seriada de la dobles de cada péptido y antihongos en microplacas de poliestireno de 96 pocillos a un volumen final de 50 μl de control.
- Añadir con una pipeta 100 μl del péptido y antimicótico en la concentración de X 2 de la más alta deseada concentración final en las columnas 1-3, en fila A.
- Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de agua estéril en los pozos, en filas B a H.
- Quitar 50 μl de los pozos con la concentración más alta (columna A), transferencia a la siguiente también de la concentración próxima (fila B) y homogeneizar.
- Repita los pasos anteriores hasta el pozo con la concentración más baja y descartar 50 μl de este pozo (columna H). Dejar columnas 11 y 12 (filas A, B, C) con sólo agua para control de crecimiento negativo o control en blanco.
- Añadir 50 μl de la 2 X inóculo ajustado en Medio RPMI-1640 a cada pozo (columnas 1-3 más columna 11 (control de crecimiento negativo)); la concentración final para C. albicans será 2 x 103 células/mL y la concentración final para las cepas de C. neoformans 104 células/mL.
- Preparar controles en blanco (50 μl de agua + 50 μl de 2 X RPMI-1640 medio sin células) y control de crecimiento negativo (50 μl de agua + 50 μl ajustar inóculo 2 X RPMI-1640 medio sin antifúngico) y carga en la placa bien y como se describe arriba.
- Repita el procedimiento para cada compuesto ser probados y el control elegido antihongos (columnas 4-10).
Nota: Las diluciones seriadas pueden hacerse verticalmente como el experimento de abajo, u horizontal en la placa (es decir, si el número de diluciones de determinado compuesto/extracto que debe probarse es ocho o más).- Si los compuestos de referencia medicamentos, o cualquiera de sus componentes son fotosensibles, realizar el análisis de luz reducida, cubrir las placas con papel de aluminio o colocar en una cámara oscura durante las incubaciones.
- Considere las siguientes recomendaciones opcionales.
- Selle la placa con una plancha de cubierta transparente que permite el intercambio de gases, como esta ayuda a reduce la evaporación.
- Colocar la placa en una cámara húmeda; también ayudará a reducir la evaporación.
- Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h o 48 h para todas las cepas de C. albicans y durante 48 h con 200 rpm por C. neoformans. El menor volumen final (100 μL) asegura que no hay derrame ocurre.
Nota: Ninguna diferencia significativa se observó entre MIC lecturas a las 24 h y 48 h para las cepas de C. albicans . Sin embargo, las lecturas a las 48 h son más fáciles de visualizar. - Observar todos los pozos, con la ayuda de un microscopio óptico invertido, antes de la incubación y después de verificar cambios en la morfología, así como para verificar si hay signos de contaminación.
Nota: Lecturas pueden hacerse visualmente y fotografiadas en el final del experimento. Antes de cada lectura, homogeneizar un poco la placa. Las lecturas también se pueden realizar mediante la medición de su OD a 600 nm, si la célula produce o filamentación no se observan. - Realizar los experimentos al menos tres veces en diferentes fechas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La CMI se define como la menor concentración compuesta antimicrobiana que inhibe totalmente visible crecimiento del hongo al final de la incubación. Puesto que el objetivo de este protocolo es tener un método rápido de antifúngicos potencial pantalla, cualquier pozo con claros medios similares a los pocillos del blanco se considera un resultado positivo, considerando que cualquier pozo con turbiedad análogo a los pocillos de control de crecimiento negativo es considera negativo. Sin embargo, si hay interés en conocer si un determinado amplificador es fungistática o fungicida, los medios de comunicación de los pozos positivos pueden también ser plateado en Sabouraud dextrosa Agar o comprobado por otra prueba de la viabilidad.
Dado que el mecanismo de acción de una novela compuesta es desconocido, por lo tanto, es esencial para comprobar si el antifúngico de referencia cae dentro del rango esperado para el fungicida aislar (cheque las pautas oficiales, tablas o datos en la literatura) antes de verificar la prueba MIC para el compuesto (en este caso, un amplificador; Figura 1 y figura 2) para confirmar que las condiciones son ideales. Si no caen en el rango respetado, será necesario volver a ejecutar el experimento, ya que será imposible determinar si los cambios observados son debidos exclusivamente al compuesto probado. Es igualmente crucial para observar todos los pozos debajo de un microscopio óptico antes y después de la incubación para detectar cambios en la morfología y la contaminación.
Figura 1. Evaluación de actividad antifúngica de tres péptidos contra Cryptococcus neoformansusando el ensayo de microdilución de caldo. Concentración del hongo es 1 x 104 células/ml. Se ensayaron tres péptidos (AMP1, columnas 1 a 3; AMP2, columnas 5 a 7; AMP3, columnas de 8 a 10) con concentraciones que van de 100 μm (columna A) a 0,78 μm (columna H). En blanco y control de crecimiento están en las columnas 11 y 12, respectivamente. La imagen fue adquirida con una cámara digital después de 48 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Evaluación de actividad antifúngica de tres péptidos contra Candida albicans utilizando el ensayo de microdilución de caldo. Concentración de hongo es 2 x 103 células/ml. Se ensayaron tres péptidos (AMP1, columnas 1 a 3; AMP2, columnas 4 y 6; AMP3, columnas 7 a 9) con concentraciones que van de 100 μm (columna A) a 0,78 μm (columna H). Se incluyeron en el ensayo en blanco y control de crecimiento, pero no aparecen en la foto. La imagen fue adquirida con una cámara digital después de 48 h de incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como se observa en la figura 1 y figura 2, 48 horas es tiempo suficiente distinguir visualmente los pozos positivos y negativos para C. neoformans y C. albicans. Es de destacar que se obtuvieron los resultados para C. neoformans 24 h antes que bajo los lineamientos CSLI sin las modificaciones. Para cada triplicado, bien positivo y negativo y por lo tanto el micro para cada compuesto, son fácilmente discernibles. Esto permite la rápida determinación de MIC para varios compuestos, así como para elegir qué moléculas investigación más mérito. Mientras tanto, la figura 3 es un ejemplo un pobre resultado, probablemente de pipeteo incorrecto durante el paso de dilución. Esto puede observarse en la columna 5, fila C, donde está presente una diferencia en el crecimiento de C. neoformans en repeticiones (columnas 5-7).
Figura 3. Ejemplo de un error en la técnica se replica en un ensayo de dilución serial. La imagen muestra una dilución seriada de amplificadores que van desde 100 μm (columna A) 0,78 μm (columna H). Diferencias en el crecimiento de C. neoformans están presentes entre repeticiones en las columnas 5-7, fila C, probablemente debido a un error de pipeteo durante la preparación de la dilución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En cuanto a la interpretación de las placas, en la figura 1 es un ensayo antihongos para tres diferentes amperios contra C. neoformans, ubicados en columnas 1-3 para AMP1, columnas 5-7 para AMP2 y columnas 8-10 para AMP3 con concentraciones que varían de 100 μ M (columna A) 0,78 μm (columna H). El control de crecimiento negativo fue colocado en la columna 11, filas de A C, mientras que el control en blanco fue colocado en la columna 12, filas de A C. Para AMP1 (columnas 1-3, filas A-C) y AMP2 (columnas 5-7, de las filas A-d), nota que una mayor concentración de los medios de comunicación son translúcido y allí no es ningún crecimiento visible. En cambio, en concentraciones menores de los pozos son opacos (columnas 1-3, filas columnas y D H filas 5-7, E-H). Por lo tanto, es considerado como fila C contienen el MIC para AMP1, mientras que el micrófono para AMP2 es en fila D, es decir, 25 μm y 12,5 μm, respectivamente. AMP3 tendrá que volver a evaluarse, a medida que el hongo crecía en todas las concentraciones probadas. La reexaminación para AMP3 es necesaria determinar la causa, que podría ser que el medio de ensayo está interfiriendo con la actividad antifúngica de la contaminación microbiana, compuesta, o una mayor resistencia del hongo al agente de prueba. La última posibilidad, será necesario aumentar el intervalo de concentraciones probado. Como se observa, las no inhibición y control de pozos son homogéneos, por lo que también podría evaluar por medición de OD a 600 nm.
En cuanto a la figura 2, se analizaron tres péptidos diferentes contra C. albicans. Los micrófonos para AMP1 (columnas 1-3), AMP2 (columnas 4-6) y AMP3 (columnas 7-9) fueron 6 μm y 50 μm y 25 μm, respectivamente. C. albicans, debido a filamentación en la temperatura de incubación, puede observarse en grupos en los pozos no inhibición y control, lo que hace difícil usar la medición de OD por la lectura.
A veces, no se observa crecimiento en los pozos. Esto puede ser debido a una contaminación de la toxina en los medios de comunicación (en cuyo caso los controles de crecimiento también no demostración ningún crecimiento) o una mayor susceptibilidad al agente (en cuyo caso, los controles de crecimiento muestran crecimiento). En consecuencia, para este último caso, puede ser necesaria una disminución en el rango de concentración.
| Medio | Preparación | |
| 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (complementado con rojo de fenol y L-glutamina, sin bicarbonato) | |
| 330 mM 3-(N- morfolino) propano el ácido sulfónico (MOPS) | ||
| Ajustar a pH 7.0 con NaOH | ||
| Esterilizar por filtración (filtro de 0.22 μm) | ||
| Tamponada fosfato salino (PBS) | 137 mM NaCl | |
| 2,7 mM KCl | ||
| m 10 Na2HPO4 | ||
| 2 mM KH2PO4 | ||
| Autoclave a 121° C durante 15 minutos. | ||
| Caldo de dextrosa de Sabouraud | 15 g de polvo en 500 mL de agua destilada. | |
| Ajustar a pH 7,0 con NaOH | ||
| Autoclave a 121° C durante 15 minutos. | ||
| Agar dextrosa de Sabouraud | 32,5 g del polvo en 500 mL de agua destilada. | |
| Ajustar a pH 7,0 con NaOH | ||
| Autoclave a 121° C durante 15 minutos. | ||
Tabla 1. Preparación de medios y reactivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pruebas de microdilución pueden analizar la potencial actividad antifúngica de un objetivo compuesto usando pequeñas cantidades del compuesto y al mismo tiempo la prueba en una gama de concentraciones. Por consiguiente, este protocolo se recomienda como primer paso en la detección de posibles nuevos compuestos antifúngicos. El protocolo presentado aquí se basa en el protocolo M27-A3, inicialmente diseñado para ayudar en la selección de la terapia antifúngica en clínicas y puede ser adaptado a una variedad de nuevos compuestos antifúngicos. En general, este protocolo puede centrarse en las características físico-químicas del extracto o compuesto. Por ejemplo, un posible candidato en el ensayo falso puede aparecer ineficaz debido a un compuesto en los medios de comunicación puede bloquear su interacción con la célula fúngica, tales como el efecto de RPMI Histatin 514. En este caso, un medio alternativo para cuando interfiere el RPMI, es levadura nitrógeno Base (YNB) tampón MOPS pH 715.
El protocolo también permite modificaciones en las condiciones de crecimiento de la concentración de inóculo, temperatura de incubación y para componentes sensibles a la luz, como los resultados de antimicóticos de referencia están dentro del rango de directrices. El antifúngico de referencia debe basarse en la terapia actual para la especie fúngica probada. Además, si hay una referencia compuesto es similar en naturaleza a la droga potencial – por ejemplo, un péptido antimicrobiano conocido con actividad antifúngica contra el modelo probado hongos – debe ser utilizado como un control de referencia adicional.
Condiciones de pre-crecimiento pueden ser modificadas para adaptarse a los hongos y las necesidades de investigación. Como en el protocolo, C. neoformans y C. albicans fueron cultivadas a 30 ° C para la mejor propagación. Sin embargo, esta temperatura puede modificarse dependiendo del metabolismo de hongos: por ejemplo, Paracoccidioides brasiliensis requiere crecimiento a 37 ° C para mantener su forma de levadura y debido a su tasa de duplicación lento, necesita cultivarse durante 5-7 días. Por lo tanto, es esencial entender las características del hongo para probar un nuevo medicamento potencial. Además, la edad y etapa de crecimiento de las células utilizadas deben definirse según el objetivo de cada estudio y, lo más importante, el tiempo de incubación inicial debe ser establecido previamente y mantenido a lo largo de todas las pruebas para asegurar la reproducibilidad .
Igualmente, si el compuesto, extracto, antifúngico de referencia o diluyente es sensible a la luz, pasos deben añadirse para evitar su degradación, como trabajar con luz reducida, cubriendo las placas con papel de aluminio o colocar las placas en una cámara oscura durante tiempos de incubación.
Por otra parte, el efecto de borde y la evaporación se pueden disminuir con la adición de agua en los pozos vacíos, por no utilizar los pozos externos y llenándolos con agua, o mediante la colocación de la placa en una cámara húmeda.
Una de las principales limitaciones al uso de este método es su enfoque en la actividad inhibitoria de un compuesto probado, en lugar de distinguir entre efectos fungicidos o fungistáticos. Sin embargo, como el objetivo es una proyección rápida de los potenciales nuevos antihongos, la evaluación visual inicial MIC con un claro positivo (' clear/no-turbidez' pozos) y un resultado negativo (pozos 'turbidez'), ayuda a identificar compuestos de interés para el estudio de Además y por lo tanto reducir los costos de la investigación de nuevos compuestos.
Puesto que el mecanismo de acción de estos nuevos compuestos es desconocido, este mismo protocolo puede utilizarse para determinar la capacidad del compuesto para inhibir o matar células fúngicas mediante la adición de pasos adicionales, como los pozos positivos de la galjanoplastia o usar colorantes en vivo/muerto. Pueden agregarse otras modificaciones menores a utilizar el protocolo para un ensayo de valoración de tablero de ajedrez para identificar cualquier efecto sinérgico del compuesto con otros medicamentos.
Aunque la lectura de la prueba se realiza generalmente por análisis visual del crecimiento fúngico en condiciones diferentes en comparación con el crecimiento en el pozo con ningún agente antihongos (control de crecimiento negativo), también puede hacerse mediante la medición de su OD a 600 nm. Sin embargo, aunque la medición de OD es precisa de soluciones homogéneas, algunos hongos crecen en matas rompiendo así la precisión del método, p. ej., Candida spp., como resultado de filamentación durante el período de incubación.
Por otra parte, una de las principales ventajas del protocolo descrito aquí, en comparación con las directrices del CLSI M27-A3, es que tarda en aireación de cuenta de los medios para hongos no fermentadores, como neoformans de la C.. Además, las directrices CLSI solamente utiliza un pequeño inóculo inicial, por lo que requiere largos períodos de incubación para el crecimiento fúngico y la definición de MIC. Algunos estudios han demostrado que el mayor inóculo iniciales y sacudir la placa durante la incubación mejoran las pruebas de susceptibilidad antifúngica sin efectos significativos en la determinación de MIC16,17. Nuestro protocolo puede determinar precisamente el MIC de nuevos compuestos contra C. neoformans en un período de incubación corto, dentro de las 48 h, en comparación con 72 h sugerido por las directrices CLSI.
Otra ventaja es que nuestro protocolo utiliza un volumen final de 100 μL en lugar de 200 μL recomendados por las directrices CLSI, reduciendo así la cantidad del compuesto nuevo prueba necesaria para el análisis de antimicótico. Evaporación de los pozos externos puede ser una preocupación, pero ya descritas en esta sección para reducir la evaporación de soluciones se pueden utilizar sin comprometer los resultados del ensayo.
Además, al realizar las diluciones directamente en la placa y obviando las directrices de dilución CLSI para utilizar tubos de microcentrífuga, pueden usarse pipetas multicanales. Este conjunto de protocolo es menos complicado que en las directrices CLSI y también utiliza menos materiales.
Un paso crítico relacionados con la preparación de la célula fúngica es el uso de las células que son tan frescas como sea posible. También es crucial para llevar a cabo todos los ensayos con las células en la misma fase de crecimiento, ya que hay varios informes en la literatura sobre las diferencias en la sensibilidad antifúngica, cuando la cultura entre18,19años. También es esencial una cuidadosa selección de las cepas de referencia. Una especie muy sensible o raramente aislada no puede producir una imagen clara del potencial antifúngico. Por la misma razón, es útil evitar el cultivo pasos como no añadir muchas variables para el análisis. Por ejemplo, para cepas de Candida (que crecen más rápido), preferimos omitir el paso de la placa de agar haciendo el inóculo directamente en el medio líquido.
Recuerde que las características físico-químicas del extracto o compuesto a probar son importantes a considerar. Por ejemplo, si el extracto o compuesto deben ser disueltos en solventes distintos del agua, debe asegurarse de tener un control del crecimiento fúngico adecuado que incluye la misma concentración de disolvente con el hongo solo. Esto es para garantizar que cualquier inhibición del crecimiento observada no es por el disolvente en vez del compuesto probado o extracto. En este caso, sería mejor seguir las recomendaciones de CLSI M27A3 para DMSO diluido fármacos antimicóticos, tales como disolver la droga en una concentración de al menos 100 veces superior a la concentración más alta probada para reducir el porcentaje de solvente en el placa.
En cuanto a estabilidad, es aconsejable mantener pequeñas alícuotas de los extractos analizados o compuestos. Al almacenar el volumen necesario para un solo ensayo a la temperatura adecuada, la excesiva manipulación de la alícuota y, si los extractos o compuestos se almacenan congelados, puede evitarse la congelación y descongelación.
Finalmente, uno de los pasos más fundamentales es la exactitud de la dilución serial de microplacas, dado que cualquier error de pipeteo se propagará a lo largo de las diluciones consecutivas. En adelante, pipeta de precisión y técnicas de pipeteo adecuadas son fundamentales para asegurar la reproducibilidad. Por lo tanto, es imperativo para pipetas uso calibrado y siempre Compruebe si el volumen añadido y removido de cada bien es correcto. Asegúrese de que el residuo o vestigio de la droga no permanece en la punta de la pipeta. Si el compuesto tiende a pegarse a la punta, podría ser mejor cambiar consejos entre las diluciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a CAPES-Brasil, CNPq-Brasil, FAP/DF para apoyo financiero. Agradecemos al Dr. Hugo Costa Paes para revisar el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
