Summary
שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.
Abstract
זיהומים פטרייתיים הפכו מצב רפואי חשוב בעשרות השנים האחרונות, אך מספר תרופות נגד פטריות זמין הוא מוגבל. בתרחיש זה, החיפוש אחר תרופות נגד פטריות חדשות הכרחי. פרוטוקול דיווח על פרטי שיטה פפטידים מסך עבור מאפייניהם נגד פטריות. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם שינויים שיתאימו למחקר של פפטידים מיקרוביאלית כמו תבחיני חדשים פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר assay פונקציונלי כדי להעריך את הפעילות של תרכובות נגד פטריות, ניתן לשנות בקלות כדי להתאים כל סוג מסוים של מולקולות תחת חקירה. מאז מבחני מבוצעות ב- 96-ובכן צלחות באמצעות אמצעי אחסון קטן, הקרנה בקנה מידה גדול וניתן להשלים את כמות קצרה של זמן, במיוחד אם יבוצע באווירה אוטומציה. הליך זה מדגים איך פרוטוקול קליני מתוקנן, הניתנים לשינוי יכול לעזור המרדף ספסל-עבודה של מולקולות חדשות כדי לשפר את הטיפול של מחלות פטרייתיות.
Introduction
זיהומים פטרייתיים הפכו הדאגה הרפואית חשובה במהלך העשורים האחרונים, נתקל גדל במידה ניכרת בעיקר בשל עלייה במספר של יחידים immunocompromised כגון אלה עוברת טיפול בסרטן, אלה החיים עם HIV/איידס או מושתלים איברים1,2. עם זאת, מערך מוגבל מאוד של תרופות נגד פטריות זמין, הגדלת מספר דיווחים על ההתנגדות פטרייתי להם לתרום הבעיות העיקריות לגבי הרפוי של mycoses מערכתית3.
מקור פוטנציאלי של תרכובות חדשות פטריות הם פפטידים מיקרוביאלית (אמפר), קטן פפטידים cationic המיוצר על ידי אורגניזמים רבים כחלק שלהם תגובה חיסונית מולדת זיהום4. למרות זאת, שיטת ההקרנה כדי לבדוק את המשחות נגד פתוגנים ופטריות אינה אחידה. הליכים שונים שימשו כדי להעריך את הפעילות פטרת של אמפר, לפעמים על אותו מודל מיקרואורגניזם5,6,7. הבדלים אלה וחוסר פרט פרוטוקולים מסוימים לסבך השוואות בין הפארמצבטית תרכובות ואת הסלים.
דרך אחת כדי לתקנן את הבדיקות למועמדים סמים חדשים היא לעקוב אחר הנחיות המשמש להגדרת הרגישות פטריות בהגדרות קליני, כגון קלינית והנחיות M27 מכון תקנים מעבדה (CLSI)-A3. עם זאת, בדיקות רגישות פטריות אלה מגבילות מדי, לא עשה שיקול וריאציה בחילוף החומרים על פני מינים, כפי שהם הוקמו רק עבור כמה סוכנים בחר. לדוגמה, הם לא לוקחים בחשבון את צרכי חילוף החומרים שאינם התססת שמרים.
פרוטוקול זה מאפשר את ההערכה של פעילות של תרכובות פטריות פוטנציאליים והוא מיושם כאן לחיפוש פטריות פפטידים. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות CLSI M27-A3 עם שינויים לייעל את ההקרנה של תרכובות חדשות8,9. שינויים אלה מאפשרים השימוש כמויות קטנות של המתחם, וריאציות של טמפרטורה או inoculum הראשונית, מדיה שונים לצמיחה pre-test אופטימלית, תוך המתקנות את התוצאות עם השימוש של הפניה תבחיני כפקדים. שיטה זו, עם השימוש של תרבות רב טוב צלחות, מאפשר למסך במהירות ובאמינות מספר רב של תרכובות.
עקב הגמישות שלה, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מחלקות שונות הכימי של תרכובות ונגד מיקרואורגניזמים אחרים, עם כמה עיבודים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פתרונות ומדיה
- הכנת 2 X רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), מרק דקסטרוז Sabouraud ו- Sabouraud אגר דקסטרוז לפי טבלה 1.
2. תנאי הגידול Inoculum פטרייתי
- לאחסן כל זני פטריות קפואות מניות ב- 35% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס, עד שהוא נדרש.
- בצע את השלבים הבאים לפני ניסוי.
- עבור זנים של קנדידה אלביקנס :
- הפשרת בקבוקון מניות ולהעביר 200 µL מ"ל Sabouraud מרק דקסטרוז צינור פוליפרופילן סטרילי 50 מ עם מכסה, תרבות בין לילה ב 30 ° C עם עצבנות (200 סל ד). זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר של התרבות.
- עבור זנים קריפטוקוקוס neoformans :
- לגרד את פני השטח הקפואים של הבקבוקון מניות. צלחת את התאים על פלטות אגר דקסטרוז Sabouraud ואת תקופת דגירה של 48 h ב- 30 ° C. לאחר הצמיחה גלוי של מושבות המבודד, לשמור את הצלחות במקרר (4 ° C) אטום עם סרט פרפין עד 15 ימים.
- לאסוף את מושבה מבודד בגודל בינוני מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי או לולאה לחסן סטרילי, לחסן 10 מ ל מרק דקסטרוז Sabouraud צינור חרוטי סטרילי 50 מ. תקופת דגירה של 24 h ב- 30 ° C תחת עצבנות (200 סל ד).
- אם תחרוג הדגירה 24 שעות ביממה. זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר. . זה תמיד טוב לתקנן את שלב הצמיחה של התאים לפני כל בדיקה, מאחר וזה גורם חשוב המשפיעים על עמידות מיקרוביאלית.
הערה: פטריות הן גדלו ב 30 ° C עבור הפצת מהירה בניסויים שלנו, אך ניתן לשנות את הטמפרטורה כדי לשקף את המטרות של המחקר, טיפול רפואי לדוגמה (37 מעלות צלזיוס). והכי חשוב, הפעם הדגירה הראשונית צריכה להיות הוקמה מראש עבור כל בידוד פטרייתי ומתוחזק לאורך כל הבדיקות כדי להבטיח הפארמצבטית.
- עבור זנים של קנדידה אלביקנס :
- לאחר צמיחה פטרייתי, לאסוף את התאים על ידי צריך שתוציאו הצינורות חרוט ב g x 1,200 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל ל- PBS.
- Resuspend את התאים ואת צנטריפוגה שוב ב- g x 1,200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על כביסה PBS ו צנטריפוגה עוד פעמיים. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend את התאים ב 5 מ ל (לפי גודל גלולה) 2 X RPMI-1640 בינוני.
- להכין 1 מ"ל של בטחונות או 1:1,000 לדילול צינור microcentrifuge (בהתאם עכירות של התליה תא).
- Aliquot 10 µL של דילול זה, למקם אותו בתוך תא hemocytometer ולספור את המספר הכולל של תאים ברבעים פינה ארבעה מתחת למיקרוסקופ. לחשב את הריכוז באמצעות הנוסחה: (סה כ מס ' תא/4) x דילול פקטור x 104 (קאמרית דילול קבוע).
- שקול הכדאיות של 100% אם ספירות הכדאיות ותנאי גידול יש היה בקורלציה באופן שיטתי עבור בידוד נחקר.
הערה: תקינה ובקרת איכות של ספירת הכדאיות יכול להיעשות על ידי חזרה-ציפוי בהתאם הוועדה האירופית על שיטת בדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) מינימום מעכבות ריכוז (MIC) פטריות שמרים10 . - אם המתאם צמיחה/הכדאיות לא נוצרה במשך בידוד שנבחנה, למדוד את הכדאיות פטרייתי על ידי ספירת תאים חיים ב hemocytometer בעזרת צבעי זה צבע סלקטיבי תאים מתים, כגון phloxine B11, trypan blue 12, או יאנוס ירוק13. השתמש התאים פטרייתי עבור פרוטוקול זה רק אם הכדאיות של האוכלוסייה בשלב זה הוא 90% ומעלה.
הערה: צבעי המלח/חיה לא יפעלו היטב עם הפטריה של בחירה. בבקשה לבדוק אותם לפני השימוש. לדוגמה, לצבוע trypan blue לא עובד טוב עם neoformans ג.
- שקול הכדאיות של 100% אם ספירות הכדאיות ותנאי גידול יש היה בקורלציה באופן שיטתי עבור בידוד נחקר.
- לאחר מכן, להכין את המתלים תא 2 X RPMI-1640 בינוני (2 X יותאמו inoculum בינוני RPMI-1640). עבור לוחות 96-ובכן לשקול אמצעי אחסון של 5 מ"ל על כל צלחת.
- עבור כל אלביקנס ג זנים, להכין השעיה תא מניות של 4 x 103 תאים למ"ל. זה הריכוז הוא 2 X של ריכוז התא האחרון מכל קידוח (2 x 103 תאים/mL).
- עבור זנים neoformans ג , להכין מלאי תרבות של תאים 2 x 104 תאים/מ ל.... זה הריכוז הוא פעמיים התא האחרון ריכוז כל היטב (1 x 104 תאים/mL).
- עבור פטריות אחרות, מבחן עם ידוע פטריות באיזה ריכוז יהיה אידיאלי לחקר מסוים ביחס זמן הדגירה. להתחשב בזמן חילוף החומרים ושכפול של הפטריה.
3. פפטידים (סוכן לא ידוע)
- לאחסן את פפטידים lyophilized ב-20 ° C, לפזר אותם במים יונים לפני ניסוי. הפעם אחסון מרבי פעם מומס במים יהיה תלוי אופי כל פפטיד.
- להכין את aliquots של פעמיים את הריכוז הגבוה ביותר הסופי במקצועות וזמינותו (2 X). באופן אידיאלי, להכין מספר קטן של aliquots עם מספיק פפטיד לשימוש פעם אחת להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה.
הערה: הבחירה של ריכוז צריך להיות מבוסס על ספרות והמאפיינים של פפטיד. מומלץ להתחיל את דילולים סדרתי עם-100 מיקרומטר של פפטיד, ואז להקטין או להגדיל את טווח ריכוז זה בהתאם לתוצאות שהושג.
4. התייחסות תבחיני (פקדי חיובי)
- עבור אלה מדולל במים: להכין פתרון X 2 של הריכוז הגבוה ביותר של הניתוח (ראה סעיף 5: פטריות Assay עבור הצעדים דילול).
- עבור זנים אלביקנס ג , להכין פתרון של µg/mL 128 של פלוקונאזול או 128 µg/mL של קספופונגין. ריכוז צלחת לשניהם יהיה 64 µg/mL.
- עבור זנים neoformans ג , להכין פתרון של µg/mL 32 של המפוטריצין (פתרון מסיסים במים). ריכוז צלחת יהיה 16 µg/mL.
הערה: בדרך כלל המפוטריצין הוא מדולל ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), מאז זה נגד פטריות הוא מסיסות במים. עם זאת, ישנם תכשירים המפוטריצין מסיסים במים זמינים מסחרית.
- עבור תבחיני מעורבבת עם הממס האורגני: להכין 100 X פתרון מניות ב דימתיל סולפוקסיד ולאחר מכן למהול אותו עד 10 X מים לשימוש.
הערה: לפיכך, בבאר, הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד לא יעלה 1%. באר שבו הפטרייה יצמח בתקשורת המכיל 1% דימתיל סולפוקסיד כפקד נדרש לאור העובדה כמה פטריות לא סובלים גם בריכוז זה של הממס. זכרו דימתיל סולפוקסיד פוטוסנסיטיבית, אז כיסוי לצלחת עם נייר כסף או להניחה בחדר חשוך למשך כל תקופת הדגירה.
5. פטריות Assay
הערה: במבחנה מבחני פטריות מבוצעות בהתבסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם מספר שינויים.
- להכין לדילול טורי כפולה כל פפטיד ושליטה פטריות ב 96-ובכן פוליסטירן microplates לאמצעי הסופי של 50 µL.
- בעזרת פיפטה להוסיף 100 µL של פטריות/פפטיד בריכוז 2 X הגבוה הרצוי הריכוז הסופי בעמודות שורה בתוך 1-3, א
- בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של מים סטריליים לתוך הבארות אחרים, בשורות ב' עד ה'
- הסר µL 50 הבארות עם הריכוז הגבוה ביותר (row A), העברה הבא טוב של ריכוז הבא (שורה B), homogenize.
- חזור על השלבים שלעיל עד הבאר עם הריכוז הנמוך ביותר ולמחוק 50 µL של זה הרבה (שורה H). להשאיר עמודות 11 ו- 12 (שורות A, B, C) עם המים היחידים עבור הפקד ריק או שליטה שלילי/צמיחה.
- להוסיף 50 µL של 2 X מנוכי עונתיות inoculum בינוני RPMI-1640 מכל קידוח (עמודים 1-3 בתוספת טור 11 (פקד שלילי/צמיחה)); הריכוז הסופי עבור אלביקנס ג יהיה עונה 2 פרק 103 תאים למ"ל, וריכוז הסופי זנים neoformans ג יהיה 104 תאים למ"ל.
- להכין פקדים ריק (מים µL 50 + 50 µL 2 X RPMI-1640 בינונית ללא תאים) שליטה שלילי/צמיחה (מים µL 50 + 50 µL מותאמות inoculum 2 X RPMI-1640 בינוני בלי פטריות) ואת העומס המשקולת טוב כפי שתואר לעיל.
- חזור על ההליך בכל מתחם להיבדק והפקד פטריות שבחרת (עמודות 4-10).
הערה: טורי דילולים יכול להיעשות אנכית כפי להלן הניסוי, או אופקית בצלחת (קרי, אם המספר של דילולים של התמצית נתונה התרכובת/שצריך להיבדק הוא שמונה ומעלה).- אם הפניה תרכובות, סמים, או כל מרכיביו אותםלאור, לבצע את הבדיקה באור מופחתת, לכסות את הלוחות בנייר כסף או למקם בחדר חשוך במהלך incubations.
- שקול את ההמלצות הבאות אופציונלי.
- חותם את הצלחת עם צלחת כיסוי ברור המתיר חילוף הגזים, כמו זה מסייע להפחית את אידוי.
- מקם את הצלחת בחדר לחים; זה גם יעזור להפחית את אידוי.
- דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה או 48 שעות עבור כל זני אלביקנס ג , ועבור 48 שעות עם סל"ד 200 רועד עבור neoformans ג. עוצמת הקול הסופי נמוך (100 µL) מבטיח כששינוי לא תתרחש.
הערה: אין הבדל משמעותי נצפתה בין קריאות MIC ב 24 שעות ל- 48 שעות עבור זנים אלביקנס ג . למרות זאת, קריאות ב 48 שעות הם קל הרבה יותר לדמיין. - שימו לב כל בארות, בסיוע מיקרוסקופ אופטי הפוכה, לפני תקופת הדגירה ואחרי כדי לוודא שינויים מורפולוגיה גם כדי לבדוק סימני זיהום.
הערה: קריאות יכול להיות נעשה באופן חזותי, צולם בסוף הניסוי. לפני כל קריאה, homogenize מעט את הצלחת. ניתן גם לבצע את הקריאות על ידי מדידת OD שלה ב 600 nm, אם התא מתגבש או filamentation הם לא נצפו. - לבצע את הניסויים לפחות שלוש פעמים על תאריכים נפרדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המיקרופון מוגדר הריכוז הנמוך ביותר במתחם מיקרוביאלית כי לחלוטין מעכב צמיחה פטרייתי גלוי בסוף תקופת הדגירה. מאחר המטרה של פרוטוקול זה יש שיטה מהירה תבחיני פוטנציאליים מסך, כל טוב עם הדומה הבארות ריק ברור מדיה נחשבת תוצאה חיובית, ואילו בכל טוב עם עכירות מקביל הבארות שליטה שלילי/צמיחה נחשב שלילי. עם זאת, אם יש אינטרס לדעת אם כח נתון הוא fungistatic או אנטי-פטרייתית, המדיה מן הבארות חיובי יכול גם להיות מצופה על גבי אגר דקסטרוז Sabouraud או נבדק על ידי עוד מבחן הכדאיות.
נתון כי מנגנון הפעולה של רומן מורכב אינו ידוע, לכן חיוני כדי לוודא פטרת הפניה נופל בתוך הטווח הצפוי עבור פטרייתי לבודד (הסימון קווים מנחים הרשמי, טבלאות או נתונים בספרות) לפני שבדקת מיקרופון נבדק עבור המתחם (במקרה זה, המגבר; איור 1 , איור 2) כדי לאשר כי תנאים אידיאליים. אם זה לא נופל בטווח מכובד, זה יהיה צורך להפעיל מחדש את הניסוי, מאז זה יהיה בלתי אפשרי לקבוע אם השינויים שנצפו הן אך ורק בשל המתחם שנבדקו. באותה מידה חשוב להתבונן כל בארות תחת מיקרוסקופ אופטי לפני ואחרי תקופת הדגירה כדי לבדוק שינויים מורפולוגיה וזיהום.
איור 1. הערכה של פעילות נגד פטריות עבור פפטידים 3 נגד קריפטוקוקוס neoformansבאמצעות ציר microdilution וזמינותו. ריכוז פטריה היא עונה 1 פרק 104 תאים/מ ל.... נבדקו שלושה פפטידים (AMP1, עמודות 1 עד 3; AMP2, עמודים 5-7; AMP3, עמודים 8-10) עם ריכוזים ועד 100 מיקרומטר (row A) 0.78 מיקרומטר (שורה H). צמיחה ובקרה ריק נמצאים בעמודות 11 ו- 12, בהתאמה. התמונה נרכשה באמצעות מצלמה דיגיטלית לאחר 48 שעות של דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. הערכה של פעילות נגד פטריות עבור פפטידים 3 נגד קנדידה אלביקנס באמצעות ציר microdilution וזמינותו. הריכוז פטריה נמצא ב- 2 x 103 תאים/מ ל.... נבדקו שלושה פפטידים (AMP1, עמודות 1 עד 3; AMP2, עמודים 4-6; AMP3, עמודים 7-9) עם ריכוזים ועד 100 מיקרומטר (row A) 0.78 מיקרומטר (שורה H). צמיחה ובקרה ריק נכללו בתוך וזמינותו, אך אינם מופיעים בתמונה. התמונה נרכשה באמצעות מצלמה דיגיטלית לאחר 48 שעות של דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כפי שנצפתה איור 1 , איור 2, 48 שעות זה מספיק זמן כדי להבחין בארות חיוביים ושליליים באופן חזותי עבור neoformans ג והן אלביקנס ג. ראוי לציין כי התקבלו התוצאות עבור neoformans ג 24 שעות מוקדם יותר תחת ההנחיות CSLI בלי השינויים. על כל דולר, הבאר חיוביים ושליליים, ולכן את המיקרופון עבור כל המתחם, ניכרים בקלות. דבר זה מאפשר נחישות מיקרופון מהיר עבור מספר תרכובות כמו גם לגבי בחירת מולקולות אילו חקירה נוספת יתרון. בינתיים, איור 3 היא דוגמה תוצאה עניים, הנראה pipetting לא תקין במהלך השלב דילול. זה יכול להיות שנצפו בעמודה 5, שורה ג, איפה ההבדל בצמיחה neoformans ג קיים מעבר משכפל (עמודות 5-7).
איור 3. דוגמה של שגיאה במחלקה הטכנית משכפל ב וזמינותו דילול טורי. התמונה מציגה לדילול טורי אמפר ועד 100 מיקרומטר (row A) 0.78 מיקרומטר (שורה H). הבדלים neoformans ג הצמיחה נמצאים בין משכפל בעמודות שורה 5-7, C, קרוב לוודאי עקב שגיאת pipetting במהלך ההכנה דילול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
לגבי הפרשנות של הלוחות, באיור 1 יש assay פטריות עבור שלושה מגברים שונים נגד neoformans ג, ממוקם ב 1-3 עבור AMP1, עמודים 5-7 עבור AMP2, ועמודות 8-10 עבור AMP3 עם ריכוזים שונים, מ ממוצע 100 M (row A) 0.78 מיקרומטר (שורה H). הפקד שלילי/צמיחה הונח בעמודה 11, שורות A ל- C, כאשר הפקד ריק הונח בעמודה 12, שורות א-ג עבור AMP1 (עמודים 1-3, שורות A-C) ו AMP2 (עמודים 5-7, שורות A-D), הערה על ריכוז גבוה יותר שהמדיה שקוף ושם הוא אין התפתחות גלוי. לעומת זאת, בריכוזים נמוכים הבארות הם אטומים (עמודים 1-3, שורות D-H ועמודות שורות 5-7, E-H). לכן, שורה ג נחשב להכיל את המיקרופון עבור AMP1, ואילו המיקרופון עבור AMP2 הוא בשורה D, זאת אומרת, 25 מיקרומטר, 12.5 מיקרומטר, בהתאמה. AMP3 יהיה חייב להיות הערכה מחדש, כמו הפטרייה גדלה בריכוזים כל נבדק. ליטיגציית עבור AMP3 יש צורך לקבוע את הגורם, אשר יכול להיות כי המדיום מבחן מפריעה לפעילות נגד פטריות של הזיהום מורכבים, חיידקים, או התנגדות גבוהה יותר של הפטריה לסוכן נבדק. לאפשרות האחרונה, יהיה צורך להגדיל את טווח הריכוז נבדק. כפי שנצפו, הבארות לא-עיכוב ובקרה הן הומוגניות, כך הם גם יכול להיות מוערך על ידי מדידה OD-600 ננומטר.
באשר איור 2, נבדקו שלושה ייחודי פפטידים נגד ג אלביקנס. סנדלי החבלנים עבור AMP1 (עמודים 1-3), AMP2 (עמודות 4-6), ו- AMP3 (עמודות 7-9) היו 50 מיקרומטר, מיקרומטר 6 ו 25 מיקרומטר, בהתאמה. ג אלביקנס, בשל filamentation בטמפרטורת דגירה, ניתן לצפות בכל מיני הבארות לא-עיכוב ושליטה, ומקשה לשימוש יתר המידה עבור קריאה.
לפעמים, אין התפתחות הוא ציין הבארות. זה עשוי להיות בשל זיהום הרעלן התקשורת (ובמקרה צמיחה הפקדים גם להראות אין צמיחה) או רגישות גבוהים לסוכן (בכל מקרה, הפקדים צמיחה מראים צמיחה). בהתאם לכך, עבור המקרה האחרון, ירידה בטווח ריכוז ייתכן שיהיה צורך.
| בינוני | הכנה | |
| 2 בינוני 1640 X רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) – 500 מ ל | 10.4 גרם RPMI-1640 (בתוספת עם L-גלוטמין ו פנול אדום; ללא ביקרבונט) | |
| 330 מ מ 3-(N- מורפולינו) פרופן sulfonic חומצה (מגבים, מכשירי) | ||
| התאם ל pH 7.0 עם NaOH | ||
| לחטא על-ידי סינון (0.22 מסנן מיקרומטר) | ||
| פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) | 137 מ מ NaCl | |
| 2.7 מ"מ אשלגן כלורי | ||
| 10 מ מ נה2HPO4 | ||
| 2PO 2 מ מ ח'4 | ||
| אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. | ||
| Sabouraud דקסטרוז מרק | 15 גרם של האבקה ב 500 מ ל מים מזוקקים. | |
| להתאים את ה-pH 7.0 עם NaOH | ||
| אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. | ||
| Sabouraud דקסטרוז אגר | 32.5 גר' האבקה ב 500 מ ל מים מזוקקים. | |
| להתאים את ה-pH 7.0 עם NaOH | ||
| אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. | ||
טבלה 1. הכנה ריאגנט ומדיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקות Microdilution יכול לנתח את הפעילות נגד פטריות פוטנציאלי של מטרה מורכבים באמצעות כמויות קטנות של המתחם, באותו זמן לבחון אותה בטווח ריכוזים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מומלץ כשלב ראשון סינון עבור פוטנציאל תרכובות חדשות נגד פטריות. פרוטוקול המובאת כאן מבוססת על פרוטוקול M27-A3, תוכנן בתחילה כדי לסייע בבחירה של טיפול נגד פטריות במרפאות, וניתן להתאים מגוון של תרכובות חדשות נגד פטריות. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול להתמקד התכונות physicochemical של התמצית או מורכבים. לדוגמה, מועמד פוטנציאלי ב וזמינותו שקרית להופעתו לא יעיל כי מתחם בתקשורת עלול לחסום ביחסיו עם התא פטרייתי, כגון השפעת RPMI על Histatin 514. במקרה זה, אמצעי חלופי עבור מתי RPMI הכיסוי אינו מאגר בסיס חנקן שמרים (YNB) עם pH 7 מגבים15.
הפרוטוקול מאפשר גם שינויים טרום הצמיחה תנאים, ריכוז inoculum, בטמפרטורת דגירה, עבור רכיבים רגישים לאור, כל עוד התוצאות פטריות התייחסות הן בטווח הנחיות. פטרת הפניה צריך להתבסס על הטיפול הנוכחי עבור המין פטרייתי שנבדקו. בנוסף, אם יש הפניה מתחם זה דומים באופיים התרופה פוטנציאליים – לדוגמה, פפטיד מיקרוביאלית ידוע עם פטריות פעילות נגד המודל פטרייתי שנבדקו – זה אמור לשמש כפקד התייחסות נוספת.
ניתן לשנות מצבים טרום הצמיחה כדי שיתאימו הפטריות ומחקר הצרכים. כמו הפרוטוקול, neoformans ג , ג אלביקנס גדלו ב 30 ° C עבור הפצת טוב יותר. ובכל זאת, את החום יכול להשתנות בהתאם חילוף החומרים פטריות: לדוגמה, Paracoccidioides ברזילאית דורשת צמיחה ב 37 ° C כדי לשמור על צורתו שמרים, עקב קצב איטי שכפול שלה, צריך להיות גדל במשך 5-7 ימים. לכן, חיוני להבין את מאפייני פטריה לבדיקת תרופה חדשה פוטנציאליים. יתר על כן, הגיל, בשלב של צמיחה של תאי המשמש צריך להיות מוגדר בהתאם לצורך כל מחקר, והכי חשוב, זמן הדגירה הראשונית צריכה להיות הוקמה מראש ומתוחזק לאורך כל הבדיקות כדי להבטיח הפארמצבטית .
באותה מידה, אם התרכובת/התמצית, פטריות הפניה או diluent הוא רגיש לאור, צעדים יש להוסיף כדי למנוע והשפלות שלו, כגון עבודה עם אור מופחתת, המכסים את הצלחות עם נייר כסף או הצבת הלוחות בחדר חשוך במהלך הדגירה פעמים.
יתר על כן, אפקט קצה של אידוי יכול להיות פחתה עם התוספת של מים בבארות ריק, לא באמצעות הבארות החיצוני ו ממלאים אותם עם מים, או על-ידי הצבת הלוח בחדר לחים.
אחת המגבלות העיקריות כאשר משתמשים בשיטה זו הוא את המיקוד שלה על פעילות המעכבת של תרכובת שנבדקו, לעומת הבחנה בין אפקטים אנטי-פטרייתית או fungistatic. עם זאת, כפי המטרה היא מהירה הקרנת פוטנציאל חדש נגד פטריות, חזותי הערכה ראשונית מיקרופון עם חיובית ברורה (' נקי/ללא-עכירות' וולס), תוצאה שלילית ('עכירות' וולס), מסייע לזהות תרכובות עניין ללמוד בהמשך, ולכן הפחתת העלות הכוללת של הקרנה של תרכובות חדשות.
מאז מנגנון הפעולה של תרכובות חדשות אלה אינו ידוע, באותו פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע של המתחם היכולת לעכב או להרוג תאים פטרייתי על-ידי הוספת כמה צעדים נוספים, כגון ציפוי הבארות חיובי או באמצעות צבעי חי/מת. ניתן להוסיף שינויים קלים אחרים לשימוש בפרוטוקול עבור assay טיטור לוח שחמט כדי לזהות תופעות סינרגטי של המתחם עם תרופות אחרות.
למרות הקריאה של וזמינותו מבוצעת בדרך כלל על ידי ניתוח ויזואלי של צמיחה פטרייתי בתנאים שונים, לעומת הגידול בתוך הבאר ללא סוכן פטריות (פקד שלילי/צמיחה), זה יכול להיעשות גם על ידי מדידת OD שלה ב 600 ננומטר. עם זאת, המדד OD אמנם מדויק עבור פתרונות הומוגנית, כמה פטריות לגדול במקבצים ובכך לשבור את מידת הדיוק של שיטת – לדוגמה, קנדידה spp. כתוצאה של filamentation במהלך תקופת הדגירה.
מצד שני, אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול המתואר כאן, לעומת הקווים המנחים CLSI M27-A3, הוא שנדרש לתוך חשבון לערבב של המדיה עבור שאינם ההתססה פטריות, כמו neoformans ג. בנוסף, ההנחיות CLSI משתמש רק inoculum הראשוני קטן, וכך מצריכים ממושכות של דגירה צמיחה פטרייתי, הגדרת המיקרופון. מספר מחקרים הראו כי ראשי התיבות inoculums גבוה יותר, ומנענע את הצלחת במהלך הדגירה לשפר את בדיקות רגישות פטריות ללא השפעות משמעותיות על מיקרופון נחישות16,17. פרוטוקול שלנו יכול לקבוע בדיוק את המיקרופון עבור תרכובות חדשות נגד neoformans ג בתקופת הדגירה מקוצר, בתוך 48 שעות, לעומת 72 h שהוצעה על ידי הנחיות CLSI.
יתרון נוסף הוא כי הפרוטוקול שלנו משתמשת נפח סופי 100 µL במקום 200 µL מומלצת על ידי הנחיות CLSI, ובכך להקטין את הכמות של המתחם החדש נבדק נדרש וזמינותו פטריות. עם זאת, אידוי של בארות חיצוני עשוי להיות דאגה, אבל פתרונות כבר המתואר בסעיף זה כדי להקטין התאדות יכול לשמש מבלי להתפשר על התוצאות וזמינותו.
בנוסף, על ידי ביצוע דילולים את ישירות בצלחת, ובכך לעקוף את ההנחיות דילול CLSI לשימוש microcentrifuge צינורות, פיפטות רב-ערוצי יכול לשמש. הרכבה פרוטוקול זו לזו ההנחיות CLSI מסובך פחות, גם משתמש בחומרים פחות.
שלב קריטי הקשורים התא פטרייתי הכנה הוא השימוש של תאים שהם טריים ככל האפשר. חשוב גם לבצע את כל מבחני עם התאים בשלב הצמיחה אותו, שכן ישנם מספר דיווחים בספרות על הבדלי רגישות פטריות כאשר התרבות גילאי18,19. בחירה זהירה של זנים התייחסות גם חיוני. זן רגיש או לעיתים רחוקות מבודד לייצר תמונה ברורה של הפוטנציאל נגד פטריות. באותה מידה, היא מסייעת להימנע culturing תת השלבים הבאים כדי להוסיף משתנים רבים וזמינותו. לדוגמה, עבור זני קנדידה (אשר יגדל יותר מהר), אנו מעדיפים לעקוף את הצעד צלחת אגר בכך את inoculum ישירות לתוך כלי התקשורת נוזלי.
זכור התכונות physicochemical של התמצית או תרכובת להיבדק חשוב שיש לקחת בחשבון. לדוגמה, אם תמצית או תרכובת צריך להיות מומס ממיסים מלבד מים, עליך לוודא שיש פקד צמיחה פטרייתי המתאים הכוללת ריכוז הממס זהה עם הפטריה לבד. הדבר נועד להבטיח כי כל עיכוב גדילה נצפתה ואינו הממס במקום המתחם נבדק או לחלץ. במקרה זה, אולי עדיף את ההמלצות CLSI-M27A3 עבור תרופות נגד פטריות דימתיל סולפוקסיד מדולל, כגון המסת לסם ריכוז לפחות 100 פעמים גבוה יותר מאשר הריכוז הגבוה ביותר שנבדקו כדי להקטין את אחוז הממס ב צלחת.
לגבי יציבות, מומלץ לשמור על aliquots קטן של תמציות שנותחה או תרכובות. על-ידי אחסון את אמצעי האחסון הדרושים עבור יחיד assay בבית הטמפרטורה המתאימה, מניפולציה מוגזמת של aliquot, אם תמציות או תרכובות מאוחסנים קפוא, ניתן להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה.
לבסוף, היא אחד הצעדים הבסיסיים ביותר הדיוק של דילול טורי microplate, בהתחשב בכך שום שגיאה pipetting להיות מופצות לאורך דילולים רצופים. מעתה ואילך, דיוק פיפטה וטכניקות pipetting נכונה הם הכרחיים כדי להבטיח הפארמצבטית אז, זה הכרחי כדי להשתמש מכויל פיפטות ותמיד הסימון אם אמצעי האחסון נוספו והוסרו מכל קידוח היא הנכונה. ודא כי שאריות או שריד של התרופה לא נותר בקצה פיפטה. אם המתחם נוטה לדבוק הטיפ, אולי עדיף להחליף טיפים בין דילולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים שכמיות-ברזיל, CNPq-ברזיל, FAP/DF עבור תמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה ד ר הוגו קוסטה פאיס עבור תיקון כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
- Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
- Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).
- Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
- Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
- CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
- Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844 (2016).
- The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
- Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
- Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
- Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
- Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
- Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
- Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
- Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
- Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
- Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).
