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Biochemistry

Polysome में profile Leishmania, मानव कोशिकाओं और माउस वृषण

Published: April 8, 2018 doi: 10.3791/57600
Automatic Translation
2, 1, 1, 2,3, 1,3, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

Summary

polysome रूपरेखा तकनीक का समग्र लक्ष्य प्रोटीन संश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत mRNAs या transcriptome mRNAs के शोधों की गतिविधि का विश्लेषण है । विधि प्रोटीन संश्लेषण विनियमन, अनुवाद सक्रियण और स्वास्थ्य और कई मानव रोगों में दमन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है ।

Abstract

सही समय पर उचित प्रोटीन अभिव्यक्ति और सही मात्रा में सामांय कोशिका समारोह और एक तेजी से बदलते वातावरण में अस्तित्व का आधार है । काफी समय से transcriptional स्तर पर शोध से जीन एक्सप्रेशन स्टडीज हावी रहीं । हालांकि, mRNAs के स्थिर राज्य स्तर प्रोटीन उत्पादन के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी नहीं है, और mRNAs के अनुवाद बहुत शर्तों के आधार पर बदलता है । कुछ जीवों में, परजीवी Leishmaniaकी तरह, प्रोटीन अभिव्यक्ति ज्यादातर शोधों के स्तर पर विनियमित है । हाल के अध्ययनों में यह दर्शाया गया है कि प्रोटीन अनुवाद dysregulation कैंसर, चयापचय, neurodegenerative और अन्य मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है । Polysome profiling प्रोटीन अनुवाद विनियमन अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । यह व्यक्तिगत mRNAs की शोधों की स्थिति को मापने या एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर अनुवाद की जांच करने के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक के आधार polysomes, ribosomes, उनकी उपइकाई और एक lysate ढाल के माध्यम से एक cytoplasmic सुक्रोज के केंद्रापसारक के दौरान मुक्त mRNAs की जुदाई है । यहां, हम तीन अलग मॉडल-परजीवी Leishmania प्रमुख, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं और पशुओं के ऊतकों पर इस्तेमाल एक सार्वभौमिक polysome profiling प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । Leishmania कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से निलंबन और संस्कृति मानव कोशिकाओं अनुयाई monolayer में बढ़ने में वृद्धि, जबकि माउस वृषण एक पशु ऊतक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रकार, तकनीक इन स्रोतों के सभी के लिए अनुकूलित है । polysomal अंशों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल RT-qPCR द्वारा व्यक्तिगत mRNA स्तर का पता लगाना भी शामिल है, पश्चिमी दाग और RNAs द्वारा राइबोसोमल ट्रो के विश्लेषण द्वारा प्रोटीन. विधि transcriptome स्तर पर ribosome के साथ गहरी आरएनए-seq और ribosome-जुड़े प्रोटीन के विश्लेषण द्वारा अंशों के जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एक के साथ mRNAs एसोसिएशन की परीक्षा द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है. विधि आसानी से अंय जैविक मॉडलों के लिए समायोजित किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का नियमन transcriptional, posttranscriptional और posttranslational तंत्र द्वारा नियंत्रित होता है. गहरी आरएनए अनुक्रमण में अग्रिम एक अभूतपूर्व स्तर पर एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर स्थिर राज्य mRNA के स्तर के अध्ययन की अनुमति देते हैं । हालांकि, हाल के निष्कर्षों से पता चला है कि स्थिर राज्य mRNA स्तर हमेशा प्रोटीन उत्पादन1,2के साथ सहसंबंधी नहीं है । एक व्यक्ति की प्रतिलिपि के भाग्य बहुत जटिल है और आंतरिक/बाहरी उत्तेजनाओं, तनाव, आदिजैसे कई कारकों पर निर्भर करता है । प्रोटीन संश्लेषण के दौरान जीन अभिव्यक्ति का विनियमन बदलती परिस्थितियों में एक तेजी से प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति नियंत्रण की एक और परत प्रदान करता है । Polysome (या "polyribosome") रूपरेखा, जुदाई और सक्रिय रूप से अनुवाद ribosomes के दृश्य, एक शक्तिशाली करने के लिए प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन अध्ययन विधि है । हालांकि, इसके पहले प्रयोगात्मक आवेदन 1960 के दशक में3दिखाई दिया, polysome profiling वर्तमान में प्रोटीन अनुवाद अध्ययन में सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों में से एक है4। एकल mRNAs एक polysome के गठन के लिए अग्रणी एक से अधिक ribosome द्वारा अनुवाद किया जा सकता है । टेप cycloheximide के साथ ribosomes पर स्टाल लगाया जा सकता है5 और polysomes के विभिंन नंबरों युक्त mRNAs polysome ढाल सुक्रोज द्वारा ultracentrifugation अंश की प्रक्रिया में अलग किया जा सकता है6,7 , 8 , 9. आरएनए polysomal अंशों का विश्लेषण तो जीनोम पर व्यक्तिगत mRNAs के शोधों राज्यों में परिवर्तन की व्यापक पैमाने पर और विभिन्न शारीरिक स्थितियों के दौरान माप की अनुमति देता है4,7, 10. विधि भी mRNA अनुवादता11के नियंत्रण में 5 ' UTR और 3 ' UTR अनुक्रम की भूमिकाओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, शोधों दमन में miRNAs की भूमिका की जांच करें12, ribosome में उजागर दोष13 , और मानव रोगों14,15के साथ ribosome-जुड़े प्रोटीन की भूमिका को समझते हैं । पिछले दशक के दौरान, अनुवाद के दौरान जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए एक बढ़ती हुई भूमिका उभरी है जो मानव रोगों में इसके महत्व को दर्शाती है । कैंसर, चयापचय और neurodegenerative रोगों में अनुवाद नियंत्रण के लिए सबूत भारी है15,16,17,18। उदाहरण के लिए, eIF4E के dysregulation-निर्भर शोधों नियंत्रण आत्मकेंद्रित संबंधित घाटे के लिए योगदान देता है15 और FMRP autism से जुड़े mRNAs पर ribosomes के स्टालिंग में शामिल है14। इस प्रकार, polysomal profiling एक बहुत ही महत्वपूर्ण उपकरण के लिए कई मानव रोगों में अनुवाद विनियमन में दोषों का अध्ययन है ।

विभिन्न शारीरिक स्थितियों के अंतर्गत polysomal अंशों का प्रोटीन विश्लेषण अनुवाद के दौरान ribosomes से जुड़े कारकों के कार्य को विच्छेदित करते हैं । polysome profiling तकनीक खमीर, स्तनधारी कोशिकाओं, पौधों, और प्रोटोजोआ10,19,20,21सहित कई प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोजोआ की तरह परजीवी Trypanosoma और Leishmania प्रदर्शन सीमित जीन अभिव्यक्ति की transcriptional नियंत्रण । उनके जीनोम polycistronic जीन क्लस्टर कि कमी प्रमोटर विनियमित प्रतिलेखन22में आयोजित कर रहे हैं । इसके बजाय, विकास जीन अभिव्यक्ति मुख्य रूप से trypanosomatid प्रजातियों में प्रोटीन अनुवाद और mRNA स्थिरता के स्तर पर नियंत्रित किया जाता है23,24। इसलिए, transcriptional विनियमन के अभाव में शोधों के नियंत्रण की समझ इन जीवों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । Polysomal profile Leishmania25,26,27,28में जीन की अभिव्यक्ति के posttranscriptional विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।

वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) और पूर्ण transcriptome द्वारा अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, साथ ही प्रोटियोमिक् प्रौद्योगिकियों द्वारा व्यक्तिगत mRNAs स्तर का पता लगाने में हाल ही में प्रगति, संकल्प और एक नए स्तर के लिए polysomal profiling के लाभ लाता है । इन विधियों का उपयोग एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर कोशिकाओं की शोधों की स्थिति पर नजर रखने के लिए proteomic विश्लेषण के साथ संयुक्त गहरी आरएनए अनुक्रमण द्वारा व्यक्तिगत polysomal भिन्नताओं के विश्लेषण द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है । यह विभिंन शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत अनुवाद विनियमन नए आणविक खिलाड़ियों की पहचान की अनुमति देता है । यहां, हम तीन विभिंन मॉडलों पर इस्तेमाल एक सार्वभौमिक polysome profiling प्रोटोकॉल वर्तमान: परजीवी Leishmania प्रमुख, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं, और पशुओं के ऊतकों । हम विभिंन जीवों से सेल lysates की तैयारी पर सलाह पेश करते हैं, ढाल शर्तों का अनुकूलन, RNase अवरोधकों के विकल्प और आरटी के आवेदन-qPCR, पश्चिमी दाग और आरएनए ट्रो इस अध्ययन में polysome भागों का विश्लेषण करने के लिए ।

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Protocol

सभी पशु उपचार और अध्ययन में प्राप्त ऊतकों की हैंडलिंग के अनुसार राष्ट्रीय संस्थानों के साथ टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के मुताबिक प्रदर्शन किया गया स्वास्थ्य पशु कल्याण दिशानिर्देश, प्रोटोकॉल संख्या ९६००५ । कृपया हड्डीवाला पशुओं का बलिदान करें और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार ऊतकों को तैयार करें । यदि ऐसी समिति की कमी है, तो कृपया राष्ट्रीय स्वास्थ्य पशु कल्याण के दिशा निर्देशों का उल्लेख करें । वयस्क (> 60 दिन पुराना) C57BL/6 चूहों का इस्तेमाल किया गया । सभी जानवरों और ऊतकों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र में स्वास्थ्य पशु कल्याण के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ प्राप्त किए गए थे । इच्छामृत्यु के लिए, एक एकल माउस एक छोटे से कक्ष में रखा गया था, और हवा के बारे में 30% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ धीरे से विस्थापित किया गया था anesthetize और पशु के संकट को कम । श्वास की समाप्ति के बाद, हम गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन का इस्तेमाल करने के ऊतकों को फसल से पहले पशु की मौत की पुष्टि ।

चेतावनी: जीवित Leishmania और संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं के साथ सभी काम बीएसएल में सुरक्षा कैबिनेट में किया गया था-2 प्रमाणित प्रयोगशाला ।

1. Leishmania प्रमुख , सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं, और माउस के ऊतकों से Cytoplasmic Lysates की तैयारी

नोट: विभिन्न स्रोत सामग्रियों से lysate तैयारियों में कई अंतर होते हैं. सुक्रोज ग्रैडिएंट तैयारी और polysomal भिन्नीकरण सहित अन्य चरण समान हैं और नमूना स्रोत पर निर्भर नहीं है ।

  1. Leishmania प्रमुख cytoplasmic lysate तयारी
    1. Inoculate Leishmania प्रमुख (FV1 तनाव) कोशिकाओं 1x M199 मध्यम29 में से 30 मिलीलीटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन/streptomycin मिश्रण (100 इकाइयों और 100 μg/एमएल के अनुरूप) 1x10 के घनत्व पर5 कोशिकाओं/ .
      नोट: सभी Leishmania प्रमुख कोशिकाओं को शामिल कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए ।
    2. मशीन में कोशिकाओं को रखें और उन्हें 27 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती है जब तक लघुगणक चरण (मध्य लॉग 5x106 कोशिकाओं/एमएल) से मेल खाती है । इसके बढ़ने में आमतौर पर दो दिन का समय लगता है ।
    3. अनुवादित mRNAs पर ribosomes को गिरफ्तार करने के लिए 100 μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए Leishmania प्रमुख संस्कृति में cycloheximide जोड़ें । 27 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन में वापस कोशिकाओं प्लेस ।
    4. cycloheximide उपचार के बाद पूरा हो गया है, एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और उंहें 1,800 x g और 4 ° c 8 मिनट के लिए पर स्पिन । supernatant त्यागें ।
    5. Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के 30 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । 8 मिनट के लिए 1,800 x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक ।
    6. supernatant को त्यागें । DPBS के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
    7. कोशिकाओं की एक aliquot ले लो और यह 3.5% formaldehyde समाधान के साथ मिश्रण ।
    8. hemocytometer द्वारा कोशिकाओं गिनती और उनकी एकाग्रता निर्धारित करते हैं । microfuge ट्यूब में कोशिकाओं की वांछित संख्या स्थानांतरण । Lysate से तैयार 0.5 x108-2x108 कोशिकाओं/एमएल एक सुक्रोज ढाल लदान के लिए पर्याप्त है ।
    9. 8 मिनट के लिए 1,800 x g और 4 ° c पर कोशिकाओं स्पिन । supernatant को त्यागें ।
    10. lysis बफर से युक्त की 1 मिलीलीटर में बर्फ पर सेल गोली reसस्पैंड अवरोधकों और RNase अवरोध करनेवाला (20 mM HEPES-KOH, पीएच 7.4, 100 mm KCl, 10 mm MgCl2, 2 mm डीटीटी, 1% NP-40, 1x टीज़र कॉकटेल (EDTA-free), 200 यूनिट्स/
    11. एक 23 गेज सुई के माध्यम से lysate तीन बार दर्रा । lysate सुई के माध्यम से पारित होने के बाद पारदर्शी हो जाना चाहिए ।
    12. lysate को स्पष्ट करने के लिए 10 मिनट के लिए ११,२०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक । एक ताजा ट्यूब के लिए स्पष्ट lysate स्थानांतरण और सुक्रोज ढाल ultracentrifugation जब तक बर्फ पर रख ।
    13. (बाद में विश्लेषण करने के लिए) इनपुट के रूप में lysate के 400 500 μL लीजिए, यह सही दूर भविष्य के प्रोटीन विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थिर या आरएनए विश्लेषण के लिए ठंड से पहले आरएनए शोधन रिएजेंट जोड़ें ।
  2. कल्चरल ह्यूमन हेला सेल से Cytoplasmic lysate तैयारी
    1. हेला कोशिकाओं को विभाजित और DMEM मध्यम के 20 मिलीलीटर में उंहें बीज 10% FBS और पेनिसिलिन/streptomycin मिश्रण (100 इकाइयों और 100 μg/एमएल अनुरूप) के साथ सेल गिनती 2x10 एक 15 सेमी प्लेट में5 कोशिकाओं/
    2. हेला कोशिकाओं में वृद्धि 37 ° c, 5% CO2 के लिए 20-24 h. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए अभिकर्मक प्रदर्शन ।
    3. 37 ° c, 5% CO2पर अभिकर्मक के बाद 24 घंटे के लिए कक्षों का प्रचार करें ।
    4. 100 μg/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए बड़े हेला कोशिकाओं को cycloheximide जोड़ें के लिए अनुवादित mRNAs पर ribosomes की गिरफ्तारी और 10 मिनट के लिए मशीन 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर । महाप्राण माध्यम. बर्फ पर ठंडे DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं ।
    5. lysis बफर के 500 μL जोड़ें (20 मिमी HEPES-कोह पीएच 7.4, 100 मिमी KCl, 5 मिमी MgCl2, 1 मिमी डीटीटी, 0.5% NP-40, 1x चिढ़ाने के कारण (EDTA मुक्त) कॉकटेल, 200 इकाइयों/एमएल के RNase अवरोधक या 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन) प्लेट को और बर्फ पर कोशिकाओं परिमार्जन ।
    6. लीजड ड कोशिकाओं microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । NP-40 से 0.5% की एकाग्रता समायोजित करें और नमूना की वृद्धि हुई मात्रा के अनुसार MgCl2 से 5 मिमी ।
    7. एक 23 गेज सुई के माध्यम से lysate 3-6 बार दर्रा ।
    8. lysate को स्पष्ट करने के लिए 8 मिनट के लिए ११,२०० x g और 4 ° c पर स्पिन । केंद्रापसारक के बाद, एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण । कक्ष lysis दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए और ग्रेडिएंट पर लोडिंग के लिए नमूना राशि निर्धारित करने के लिए spectrophotometer का उपयोग करें । 0.1% सोडियम Dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 0.5 मिलीलीटर के लिए नमूना के 10 μL जोड़ें । 0.1% एसडीएस के विरुद्ध रिक्त । 260 एनएम में अवशोषित उपाय । अपेक्षित अवशोषण मूल्य 15-20 इकाइयों के आसपास है/
    9. सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक से पहले एक ही अवशोषक मूल्य के लिए lysis बफर के साथ सभी नमूनों पतला । सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक तक बर्फ पर नमूने रखें ।
  3. माउस वृषण से Cytoplasmic lysate तयारी
    1. काटना माउस वृषण । tunica albuginea में एक छोटा सा चीरा बनाओ और परीक्षण के सेमिनीफेरस नलिकाओं इकट्ठा करने और उंहें एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 0.1 mM DPBS फ्लोराइड (phenylmethylsulfonyl) के साथ पूरक PMSF के 5 मिलीलीटर युक्त में स्थानांतरण ।
    2. टिशू को कई बार पलटने से जोरदार मिश्रण । ऊतक 5 मिनट के लिए बर्फ पर इकाई गुरुत्वाकर्षण पर बसने के लिए अनुमति दें ।
    3. निकालें और बादलों संयोजी कोशिकाओं और ऊतक टुकड़े युक्त बफर त्यागें । प्रक्रिया को 2-3 बार दोहराएं । शेष सफेद गोली सेमिनीफेरस नलिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं के लिए समृद्ध है ।
    4. 1 मिनट के लिए 500 x g पर एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और स्पिन के लिए सेमिनीफेरस tubule गोली हस्तांतरण । supernatant को त्यागें ।
    5. lysis बफर के 500 µ l को जोड़ें (20 mM Tris-HCl, पीएच 7.4, 100 mm KCl, 5 mm MgCl2, 1 mm डीटीटी, 0.5% NP-40, 1x को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल (EDTA-free), 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन या 200 यूनिट्स/RNase के लिए नलिकाओं अवरोधक) । ऊतक triturate करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें ।
    6. निलंबन एक छोटे (0.5-1.0 एमएल) Dounce homogenizer के लिए स्थानांतरण । गिलास खल के सात से आठ स्ट्रोक के साथ ऊतक को बाधित करें ।
    7. lysate को 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    8. lysate स्पष्ट करने के लिए 8 मिनट के लिए 12,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना केंद्रापसारक । सुक्रोज ढाल पर लोड हो रहा है जब तक एक नई ट्यूब और बर्फ पर स्टोर करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
    9. इनपुट नमूना के रूप में lysate के 50 μL लीजिए, यह सही दूर पर स्थिर-80 भविष्य प्रोटीन विश्लेषण के लिए ° c; या आरएनए विश्लेषण के लिए ठंड से पहले आरएनए शुद्धि रिएजेंट जोड़ें.

2. सुक्रोज ढाल तैयारी और Ultracentrifugation

  1. दो सुक्रोज ढाल समाधान तैयार (20 मिमी HEPES-KOH, पीएच 7.4, 100 मिमी KCl, 10 मिमी MgCl2, 1 मिमी डीटीटी, 1x चिढ़ाने के कॉकटेल), या तो 10% सुक्रोज या 50% सुक्रोज युक्त । (Tris-एचसीएल, पीएच 7.4, HEPES के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है) । प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार 200 इकाइयां/एमएल RNase अवरोधक या 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन जोड़ें । दप 41 रोटर के लिए मार्कर ब्लॉक में एक ultracentrifuge ट्यूब प्लेस और ब्लॉक के ऊपरी स्तर के साथ लाइन आकर्षित । एक स्थिर रैक में ट्यूब स्थानांतरण ।
  2. एक 10-एमएल लेयरिंग डिवाइस संलग्न के साथ सिरिंज ले लो और 10% सुक्रोज समाधान के साथ सिरिंज को भरने (ऊपर के रूप में तैयार). धीरे यह ultracentrifuge ट्यूब के तल पर रिलीज जब तक यह ट्यूब पर निशान तक पहुंचता है ।
  3. 50% सुक्रोज समाधान के साथ एक और सिरिंज भरें और ध्यान से ट्यूब के नीचे करने के लिए 10% सुक्रोज परत के माध्यम से अपनी लेयरिंग डिवाइस डालें. धीरे नीचे से शुरू सुक्रोज समाधान जारी जब तक यह ट्यूब पर निशान तक पहुंचता है । प्रदान की टोपी के साथ ट्यूब सील ।
  4. सुक्रोज ग्रैडिएंट तैयार करने के लिए, ग्रैडिएंट मेकर डिवाइस चालू करें । ऊपर या नीचे बटन और प्रेस कियाका उपयोग कर प्लेट स्तर । leveling ढाल की रैखिकता के लिए महत्वपूर्ण है ।
  5. के बाद प्लेट प्रेस स्नातक ढाल मेनू खोलने के लिए । ग्रेडिएंट मेनू पर सूची पर जाएं और SW 41 Ti रोटर का चयन करें । फिर ऊपर और नीचे बटन का उपयोग कर मेनू की सूची से वांछित सुक्रोज ढाल चुनें । उपयोगदबाएं ।
  6. ग्रैडिएंट मेकर प्लेट पर ग्रेडिएंट ट्यूब होल्डर रखें । धारक में ट्यूब हस्तांतरण । 6 ग्रेडिएंट तक एक ही समय में तैयार किए जा सकते हैं । चलाएंदबाएं । ढाल निर्माता एक रैखिक ढाल बनाने क्रमादेशित गति और कोण पर ट्यूबों घूमता है । यह ढाल तैयार करने के लिए केवल कुछ मिनट लग जाएगा ।
  7. जब प्रक्रिया पूरी हो गई है, एक रैक में ट्यूबों जगह है । टोपियां उतार लें । ultracentrifuge ट्यूबों के ऊपर से नमूना मात्रा के रूप में एक ही मात्रा निकालें ।
  8. सावधानीपूर्वक लोड ४००-५०० μL की lysate जिसमें से १५-२० एक२६० इकाइयाँ ऊपर की polysomes. रोटर बाल्टी में ट्यूबों प्लेस और उंहें संतुलन ।
  9. २६०,००० x g पर और 4 ° c के लिए 2 ज दप 41 रोटर का उपयोग कर ।

3. Polysome भिन्नीकरण और नमूना संग्रह

नोट: जबकि lysate तैयारी स्रोत के आधार पर कुछ अंतर है, ढाल तैयारी और polysome भिन्नीकरण प्रोटोकॉल lysates के सभी प्रकार के लिए एक ही हैं.

  1. ultracentrifugation के पूरा होने के बाद, बर्फ पर ट्यूबों के साथ रोटर बाल्टी जगह है । अंश संग्राहक और ग्रैडिएंट fractionator चालू करें । क्लिक करें, स्कैन fractionator मेनू पर । अंश कलेक्टर में 24 संग्रह ट्यूबों के साथ एक रैक रखो ।
  2. fractionator के किनारे पर पानी के साथ एक कुल्ला जलाशय भरें । fractionator पर पंप कुल्ला करने के लिए 10 एस के लिए कुल्ला कुंजी दबाएं । अंशांकन के लिए पिस्टन के लिए पानी से भरा सिरिंज के साथ एक कुल्ला अनुकूलक संलग्न ।
  3. कंप्यूटर पर fractionator सॉफ़्टवेयर खोलें । प्रेस जांचना । डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें और ठीकदबाएं । सिरिंज से पानी इंजेक्ट करने के लिए तैयार रहें ।
  4. अंशांकन करने के लिए ठीक दबाएं । तुरंत अगले 5 एस के लिए इंजेक्शन पानी शुरू । इस समय के दौरान, पानी यूवी डिटेक्टर फ्लो सेल के माध्यम से प्रवाह होगा और उपकरण पर तुले हो जाएगा । साइन शूंय अंशांकन पूर्ण दिखाई देगा । साधन अंश के लिए तैयार है ।
  5. सिरिंज के साथ कुल्ला अनुकूलक निकालें । fractionator के पिस्टन के लिए एक टिप देते हैं ।
  6. पीतल हवा वाल्व खोलें और 10 एस के लिए प्रेस एयर कुंजी सूखी टयूबिंग और फ्लो सेल के लिए । एयर वाल्व बंद ।
  7. धीरे रोटर बाल्टी से ढाल ट्यूब निकालें और रैक में जगह है । ट्यूब के शीर्ष करने के लिए ट्यूब धारक टोपी लागू करें और ध्यान से ट्यूब धारक में ट्यूब ले जाने के लिए और स्थिति में यह ताला ।
  8. fractionator के पिस्टन के तहत धारक प्लेस । अक्सर, polysomal बैंड आंख से देखा जा सकता है । भिन्न संख्याओं और वॉल्यूम के लिए इच्छित सेटिंग्स का परिचय दें (24 अंशों पर 500 μL/अंश आमतौर पर पर्याप्त हैं) । फ़ाइल को उचित रूप से नाम । ठीकदबाएं, और उसके बाद ग्राफ़ बटन पर जाएं । अगली विंडो में, स्कैन प्रारंभ करेंदबाएं । सेटिंग्स दिखाई देंगी, तो ठीकदबाएं । कलेक्टर पहले अंश को गटर से ले जाएंगे और पिस्टन को ट्यूब में ले जाएंगे । जब पिस्टन ढाल के शीर्ष तक पहुंचता है यह चयनित गति को धीमा होगा और भागों एकत्र किया जाएगा । जब पूरा हो गया, पिस्टन ढाल ट्यूब से बाहर ले जाता है ।
  9. fractionator पर पीतल हवा वाल्व और प्रेस एयर कुंजी अंतिम अंश प्राप्त करने के लिए खोलें ।
  10. बर्फ पर रैक से ट्यूबों हटो ।
  11. प्रत्येक अंश को आरएनए शुद्धि रिएजेंट के 2 संस्करणों जोड़ें और आरएनए शुद्धि तक तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज । वैकल्पिक रूप से, यदि प्रोटीन की जरूरत है विश्लेषण करने के लिए, 10% की अंतिम एकाग्रता के लिए trichloroacetic एसिड जोड़ने के लिए उंहें पश्चिमी सोख्ता के लिए ध्यान केंद्रित (8 अनुभाग देखें) ।

4. RT-qPCR डेटा विश्लेषण के दौरान mRNAs स्तरों के सामान्यीकरण के लिए इन विट्रो में सिंथेटिक आरएनए की तैयारी

नोट: ई. कोलाई OmpA mRNA सामांय के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । किसी भी अन्य आरएनए कि अध्ययन किए गए जीव के mRNAs के साथ व्यापक पहचान नहीं है (स्तनधारी या Leishmania) किया जा सकता है ।

  1. OmpA जीन30युक्त एक प्लाज्मिड से एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया द्वारा SP6 प्रमोटर अनुक्रम युक्त OmpA डीएनए टुकड़ा तैयार करें ।
  2. तैयार मिश्रण के 100 µ एल: 80 मिमी HEPES-कोह, पीएच 7.5, 16 एमएम MgCl2, 2 एमएम Spermidine, 10 एमएम डीटीटी, 3 एमएम एटीपी, 3 एमएम CTP, 3 एमएम UTP, 3 एमएम GTP, 0.5 यू/μL RNase अवरोधक, 1 μg की OmpA पीसीआर डीएनए, 3 μL SP6 आरएनए पोलीमरेज़ , ०.००५ भ/μL pyrophosphatase.
  3. 2 एच के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर मशीन
  4. एक आरएनए शुद्धि किट द्वारा आरएनए शुद्ध ।
  5. spectrophotometer द्वारा एकाग्रता उपाय और agarose जेल ट्रो द्वारा की जांच ।

5. आरएनए अलगाव ढाल अंशों और सीडीएनए तैयारी से

नोट: एक RNase अवरोध करनेवाला एक ribonuclease अवरोधक के रूप में इस्तेमाल किया गया था अगर आरएनए शुद्धि के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ सीधे आगे बढ़ें. हालांकि, जब एक ribonuclease अवरोधक के रूप में इस्तेमाल किया, हेपरिन रिवर्स transcriptase सीडीएनए तैयारी में इस्तेमाल किया रोकना होगा । इसलिए, आरएनए के अतिरिक्त शुद्धिकरण की जरूरत होगी अगर हेपरिन lysis बफर और ढाल में इस्तेमाल किया गया था । हेपरिन इस्तेमाल किया गया था अगर सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए तैयार करने के लिए धारा 6 देखें.

  1. गल-आरएनए शोधन रिएजेंट युक्त नमूने, RT-qPCR परिणामों के सामान्यीकरण के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में सिंथेटिक आरएनए के 20 एनजी जोड़ें. एक संशोधन को छोड़कर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए तैयारी के साथ आगे बढ़ें । आरएनए ग्रेड ग्लाइकोजन (20 µ g) के 1 µ एल जोड़ें पूर्व isopropanol वर्षण । RNase-मुक्त पानी की 20-25 µ एल में आरएनए छर्रों भंग.
    नोट: ग्लाइकोजन एक वाहक के रूप में कार्य करता है और नुकसान से बचने और शुद्धि के दौरान आरएनए गोली कल्पना में मदद करता है । OmpA mRNA RT-qPCR प्रतिक्रियाओं में आगे सामान्यीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. पर्याप्त उपज सुनिश्चित करने के लिए spectrophotometer का उपयोग आरएनए एकाग्रता उपाय. prepolysomes के रूप में 40, 60 के दशक और monosomes युक्त आरएनए अंशों के बराबर मात्रा का मिश्रण । 2-4 ribosomes युक्त अंश हल्के polysomes के रूप में गठबंधन और ५-८ ribosomes के साथ भागों भारी polysomes के रूप में गठबंधन.
  3. एक किट का उपयोग कर cDNAs तैयार करने के लिए संयुक्त भागों से आरएनए के 5-10 µ एल का उपयोग करें और निर्माता की सिफारिशों के बाद.
  4. nuclease मुफ्त पानी के 80 µ l को सीडीएनए के 20 µ l में डालें । -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए नमूने फ्रीज ।

6. हेपरिन संदूषण से आरएनए शुद्धि

नोट: हेपरिन रिवर्स transcriptase जैसे न्यूक्लिक एसिड प्रोसेसिंग एंजाइमों को रोकता है । इसलिए, जब हेपरिन lysis बफ़र और/या ग्रैडिएंट में उपयोग किया जाता है, तो इस अतिरिक्त शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।

  1. शुद्ध आरएनए नमूनों को 1 मीटर अंतिम एकाग्रता में LiCl जोड़ें ।
  2. मिश्रण के नमूने और 1 एच के लिए बर्फ पर गर्मी ।
  3. 15 मिनट के लिए 16,000 x g और 4 ° c पर नमूनों स्पिन ।
  4. एक पिपेट का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में पूरा supernatant निकालें ।
  5. एयर-के बारे में 5 मिनट के लिए छर्रों सूखी ।
  6. RNase-मुक्त पानी की प्रारंभिक मात्रा में छर्रों को पुनः निलंबित.
  7. आरएनए की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 260 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप निष्पादित करें । आमतौर पर, नमूने की हानि कम है ।

7. RT-qPCR और mRNA वितरण का डेटा विश्लेषण

  1. का मिश्रण 10.2 μL पानी की, 20 μL SYBR ग्रीन, 4.8 जीन विशिष्ट प्राइमरों के μL (2.5 माइक्रोन प्रत्येक सेट), 5 μL के सीडीएनए, अच्छी तरह से मिश्रण और μL में 10 triplicates प्रति अच्छी तरह से लोड 384-अच्छी तरह से थाली ।
  2. कवर प्लेट कसकर चिपकने वाली फिल्म के साथ और 5 मिनट के लिए 1,800 x g पर प्लेट केंद्रापसारक ।
  3. एक वास्तविक समय पीसीआर साधन का उपयोग कर तालिका 1में दिखाया शर्तों के तहत qPCR प्रतिक्रिया सेट.
  4. चक्र थ्रेशोल्ड (Ct) मानों और तुलनात्मक CT (ΔΔCt) विधि31 का उपयोग करके एक संशोधन के साथ32 वर्णित के रूप में prepolysomes, प्रकाश, और भारी polysomes में mRNA वितरण का प्रतिशत (%) RT-qPCR डेटा विश्लेषण में डेटा सामान्यीकरण के लिए सिंथेटिक आरएनए (यहाँ OmpA) का उपयोग करें. सिंथेटिक आरएनए एक सामांय नियंत्रण है कि रिश्तेदार mRNAs स्तर की गणना और उंहें एक ढाल के विभिंन भागों में तुलना की अनुमति देता है प्रदान करता है ।

8. पश्चिमी सोख्ता द्वारा Polysomal अंशों में प्रोटीन का विश्लेषण

  1. एक 100% (डब्ल्यू/trichloroacetic अम्ल (टीसीए) को चयनित अंशों में जोड़ें (500 μL) 10% की अंतिम एकाग्रता के लिए, बर्फ पर कम से 15 मिनट के लिए रखने के लिए, 5 मिनट के लिए एक microfuge में, supernatant त्यागें, बर्फ के साथ दो बार धोने-शीत एसीटोन और S के 25 μL में भंग DS-पृष्ठ नमूना ट्रो के लिए बफ़र लोड कर रहा है ।
  2. एसडीएस-पृष्ठ पर लोड और PVDF झिल्ली को हस्तांतरण निंनलिखित के साथ मानक ट्रो आचरण । वेस्टर्न सोख्ता के लिए आगे बढ़ें33।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हम तीन विभिंन स्रोतों के लिए polysomal रूपरेखा तकनीक के आवेदन का वर्णन: परजीवी Leishmania प्रमुख, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं, और माउस वृषण । Leishmania कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से निलंबन में तरल मीडिया में वृद्धि, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं अनुयाई monolayer प्लेटों पर में वृद्धि, और माउस वृषण एक ऊतक नमूने का प्रतिनिधित्व करता है । विधि आसानी से निलंबन, ऊतकों के विभिंन प्रकार, या किसी अंय जीव से स्वतंत्र रूप से उगाया कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है, और संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के । दृष्टिकोण चार प्रमुख कदम होते हैं: lysate तैयारी, एक सुक्रोज ढाल तैयारी और ultracentrifugation कदम, polysome भिन्नीकरण और नमूना संग्रह अंशों के विश्लेषण के बाद. विभिंन स्रोतों से कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं, धोया और एक सुई या Dounce homogenizer के माध्यम से पारित द्वारा lysis बफर में लीजड ड । केंद्रापसारक सेल मलबे को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है, lysate स्पष्ट । ग्रैडिएंट अंशों की योजना चित्र 1aमें दिखाई गई है । एक सतत सुक्रोज ग्रैडिएंट एक ग्रैडिएंट मेकर में 10% और 50% सुक्रोज समाधान के मिश्रण के द्वारा बनाई गई है । lysate ग्रैडिएंट के शीर्ष पर लोड है । Ultracentrifugation ribosomes की एक अलग संख्या है जो भिन्नीकरण के दौरान एक यूवी डिटेक्टर द्वारा नजर रखी है के साथ जुड़े mRNAs अलग, एक अलग अवशोषक स्पेक्ट्रम बनाने. एकत्र अंशों आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण (चित्र 1b) के लिए उपयोग किया जाता है । आरएनए उत्तरी दाग के बाद ट्रो द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है या polysomes के साथ व्यक्तिगत mRNAs के संघ का विश्लेषण करने के लिए एक RT-qPCR प्रतिक्रिया के बाद सीडीएनए उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एक जीनोम व्यापक पैमाने पर7पर mRNAs की शोधों की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । polysomal अंश के प्रोटीन विश्लेषण के लिए, प्रोटीन trichloroacetic एसिड के साथ उंहें ध्यान केंद्रित करने के लिए उपजी हैं । प्रोटीन तो पश्चिमी सोख्ता द्वारा या proteome स्तर पर मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।

Leishmania प्रमुख सक्रिय रूप से बढ़ती संस्कृति से उत्पंन एक ठेठ polysomal प्रोफ़ाइल चित्रा 2aमें दिखाया गया है । अंश का अवशोषण ग्राफ ribosome उपइकाई (40 और 60 के दशकों), एकल ribosomes (80 के दशक या monosomes) और polysomes के लिए ठेठ चोटियों के साथ एक अलग आकार है ।

मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (आरटी-qPCR) ribosomes और polysomes के साथ व्यक्तिगत Leishmania mRNAs के सहयोग का पता लगाने के लिए कार्यरत था । तुलनात्मक सीटी (ΔΔCटी)31 विधि कोशिकाओं में सापेक्ष mRNAs के स्तर का अध्ययन करने के लिए एक सरल और उपयुक्त दृष्टिकोण है । इस विधि एक आंतरिक नियंत्रण (एक स्थिर mRNA, कि उपचार या प्रयोग की शर्तों के दौरान अभिव्यक्ति परिवर्तन नहीं करता है) की गणना के लिए की आवश्यकता है । हालांकि, polysomal अंशों में कोई आंतरिक नियंत्रण नहीं है क्योंकि किसी भी mRNA या राइबोसोमल आरएनए का स्तर भिन्नताओं में भिन्न होगा, ribosomes, polysomes के साथ उनके जुड़ाव के आधार पर, आदि एक आंतरिक नियंत्रण की समस्या को हल करने के लिए, हम भागों में रिश्तेदार व्यक्तिगत Leishmania mRNA स्तर के सामान्यीकरण के लिए सिंथेटिक बैक्टीरियल OmpA mRNA का उपयोग किया है । OmpA mRNA इन विट्रो में संश्लेषित किया गया था और आरएनए निकालने से पहले प्रत्येक अंश के बराबर मात्रा में जोड़ा । सिंथेटिक आरएनए के अलावा महत्वपूर्ण है क्योंकि यह RT-qPCR डेटा की गणना अधिक सटीक बनाता है, तुलनात्मक सीटी (ΔΔCटी) विधि द्वारा गणना के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवारत.

ग्रेडिएंट अंशों के Aliquots को तीन समूहों में मिलाया गया था: prepolysomes (उपइकाई और monosomes), हल्का polysomes (2-4 ribosomes से मिलकर), और भारी polysomes (५-८ ribosomes से मिलकर). आरटी-qPCR संयुक्त अंश से आरएनए पर प्रदर्शन किया गया था इन संयुक्त भागों (चित्रा बी) के बीच mRNA वितरण का विश्लेषण. 18S राइबोसोमल आरएनए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । RT-qPCR द्वारा निर्धारित इसकी सापेक्ष स्तर लघु राइबोसोमल उपइकाईयों (मुक्त उपइकाई, और monosomes और polysomes के एक भाग के रूप में) के स्पेक्ट्रम पर अनुमानित वितरण के साथ अच्छी तरह से संबंधित है । RT-qPCR विश्लेषण से पता चला कि व्यक्तिगत mRNAs परीक्षण Leishmania विकास के लघुगणक चरण के दौरान अनुवाद में सगाई की एक अलग डिग्री है । Tubulin mRNA भारी polysomes के साथ तरजीही संबद्ध है, कुशल अनुवाद का सुझाव । इसके विपरीत, Sherp mRNA मुख्य रूप से prepolysomes और प्रकाश polysomes tubulin mRNA के साथ तुलना में कम सक्रिय अनुवाद का समर्थन के साथ पाया जाता है ।

संस्कृतिया कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति अध्ययन की विविध श्रेणियों में एक महत्वपूर्ण प्रायोगिक दृष्टिकोण है । यहां, हम एक और नमूना स्रोत में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन mRNAs के polysomal profiling, संस्कृति मानव कोशिकाओं का एक उदाहरण पेश करते हैं । हेला कोशिकाओं क्षणिक transfected plasmids व्यक्त रिकॉमबिनेंट सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR)34 या Norrie रोग प्रोटीन (एनडीपी) के साथ थे । इन दो स्वतंत्र संस्कृतियों से polysome अंश के अवशोषक स्पेक्ट्रा बहुत समान थे और विशिष्ट चोटियों इसी राइबोसोमल उपइकाई (40 और 60 के दशक), monosomes (80), और polysomes (चित्रा 3) निहित । इन प्रयोगों से स्पेक्ट्रा में समानता ग्रैडिएंट भिन्नीकरण की reproducibility को दर्शाता है. जैसे कि Leishmania अध्ययनों में, mRNAs का वितरण prepolysomes, लाइट polysomes, और हेवी polysomes (चित्र बी) का प्रतिनिधित्व करने वाले अंशों में RT-qPCR द्वारा निर्धारित किया गया था । छोटे राइबोसोमल उपइकाई 18S आरएनए का पता लगाने के स्पेक्ट्रा में उनके अनुमानित वितरण के साथ संबंधित है । एनडीपी mRNAs ज्यादातर प्रकाश और भारी polysomal भागों के साथ जुड़े थे, जबकि CFTR mRNAs ज्यादातर prepolysome भागों में पाए गए, सुझाव है कि एनडीपी और अधिक कुशलता से अनुवाद किया है । जबकि एनडीपी एक अपेक्षाकृत छोटे प्रोटीन है, CFTR एक बहुत बड़ा प्रोटीन है (1480 एमिनो एसिड अवशेषों) कई डोमेन से मिलकर, कि अनुवाद के दौरान स्वतंत्र रूप से गुना35। polysomes के साथ CFTR mRNA की निचली संलग्नता धीमी अनुवाद को प्रतिबिंबित कर सकती है जो इसके विशिष्ट डोमेन के cotranslational तह के लिए आवश्यक है ।

Polysome अंश भी प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ढाल भागों में प्रोटीन का पता लगाने हेला कोशिकाओं में राइबोसोमल प्रोटीन के उदाहरण पर आयोजित किया गया था (चित्रा 4) । प्रोटीन के साथ वर्षण द्वारा केंद्रित थे 10% टीसीए अंशों से और पश्चिमी ब्लाट छोटे उपइकाई राइबोसोमल प्रोटीन RPS6 और बड़ी उपइकाई राइबोसोमल प्रोटीन RPL11 (चित्रा 4, शीर्ष पैनल) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. उनके वितरण अवशोषक स्पेक्ट्रम पर अलग चोटियों के साथ अच्छी तरह से संबद्ध । ये प्रयोग स्पष्ट रूप से दर्शाते हैं कि polysome अंशों का उपयोग उन में प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है.

कई भिंन सुक्रोज सांद्रता ग्रैडिएंट (उदाहरण के लिए, 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%8, और अंय) polysomes भिन्नीकरण के लिए उपयोग किए गए थे । यहां, हम दो ग्रेडिएंट 10-50% और 17-51% (चित्र 5) की तुलना करते हैं । हालांकि, 17-51% स्वीकार्य परिणाम का उत्पादन किया, 10-50% ढाल में जुदाई समग्र बेहतर था ।

यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि chelating एजेंटों, जैसे EDTA, बाधित ribosomes और polysomes8,9। के रूप में यह चित्र 6में दिखाया गया है, ढाल पर लदान से पहले हेला lysate के EDTA उपचार चोटियों के गायब होने की ओर जाता है, monosomes और polysomes के लिए इसी, और ribosome उपइकाईयों चोटियों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है । यह प्रयोग एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया और प्रदर्शन किया कि EDTA उपचार के बिना मनाया चोटियों वास्तव में राइबोसोमल monosomes और polysomes हैं ।

चित्र 7 माउस परीक्षण से polysome भिन्नीकरण के परिणाम दिखाता है । अवशोषक स्पेक्ट्रम में Leishmania और हेला कोशिकाओं से उन लोगों के साथ समानताएं हैं: राइबोसोमल उपइकाईयों, monosomes और polysomes की अलग चोटियों । उनके आकार और वितरण एक हस्ताक्षर उपस्थिति का उत्पादन, कि यह आसान उंहें अलग polysomal स्पेक्ट्रा पर पहचान करने के लिए बनाते हैं । कुल RNAs भागों से शुद्ध थे और चयनित भागों से RNAs agarose जेल में ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया (चित्रा 7, शीर्ष पैनल) । ट्रो 18S और 28S राइबोसोमल RNAs के विशिष्ट वितरण से पता चलता है । उनके तेज बैंड नमूनों की अक्षुण्णता का संकेत देते हैं. जेल एक निम्न उत्तरी दाग द्वारा व्यक्तिगत mRNAs पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या यह आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण पर आगे प्रयोगों से पहले नमूनों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-प्रसार राइबोसोमल RNAs बैंड नमूनों में आरएनए गिरावट का संकेत.

हमारे अध्ययन के दौरान, हम lysates और सुक्रोज ढाल में RNase अवरोधकों के रूप में RNase अवरोधक और हेपरिन का इस्तेमाल किया । जबकि उन दोनों के संतोषजनक परिणाम प्रदान की, RNase अवरोध करनेवाला का उपयोग आरएनए विश्लेषण के लिए बेहतर था क्योंकि यह सीडीएनए और RT-qPCR प्रतिक्रियाओं को बाधित नहीं करता है. इस प्रकार, यह अतिरिक्त आरएनए शोधन कदम की आवश्यकता नहीं थी । हालांकि, अगर शोधकर्ताओं polysome तैयारी के दौरान हेपरिन का उपयोग करने के लिए तय है, ध्यान रखें कि हेपरिन डाउन-स्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे RT-qPCR और अतिरिक्त आरएनए शुद्धि चरण के लिए आवश्यक है (देखें प्रोटोकॉल खंड 6).

Figure 1
चित्र 1 . Polysome profile. (क) ढाल तैयार करने की योजना, polysome भिन्नीकरण और अवशोषक प्रोफ़ाइल । (ख) भिन्न विश्लेषण की योजना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . विकास की लघुगणकीय अवस्था में Leishmania प्रमुख संस्कृति का Polysome प्रोफाइल विश्लेषण । (क) Cytoplasmic lysate 10-50% सुक्रोज ढाल म fractionated था । (ख) 18S आरएनए, tubulin और Sherp mRNAs (%) के सापेक्ष वितरण prepolysomes में, प्रकाश और भारी polysomes लॉग कोशिकाओं के RT-qPCR द्वारा विश्लेषण किया । 40, 60 और monosomes युक्त भागों prepolysomes के रूप में संयुक्त थे । 2-4 ribosomes के साथ अंशों को प्रकाश polysomes के रूप में संयोजित किया गया, जबकि ५-८ ribosomes के साथ अंशों का गठन भारी polysomes. सिंथेटिक ई. कोलाई OmpA mRNA भागों पूर्व आरएनए निष्कर्षण RT-qPCR में एक सामान्य नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए जोड़ा. तुलनात्मक सीटी (ΔΔCटी)31 विधि mRNA स्तरों की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटियां दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . mRNAs ribosomes के साथ हेला कोशिकाओं में transfected के साथ रिकॉमबिनेंट CFTR और एनडीपी प्लाज्मिड संघ का Polysome अंश और विश्लेषण. (क) हेला कोशिकाओं में Polysomal प्रोफ़ाइल CFTR और एनडीपी plasmids के साथ transfected. 10%-50% सुक्रोज ढाल polysomes की जुदाई को प्राप्त करने के लिए लागू किया गया था । छोटे (40) और बड़े 60 (के लिए चोटियों) उपइकाई, साथ ही साथ monosome (80 के दशक) संकेत कर रहे हैं । भागों के रूप में पैनल A पर दिखाया गया है और आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल संयुक्त थे । (ख) विभिन्न अंशों में CFTR और एनडीपी के mRNAs का वितरण. RT-qPCR द्वारा 18S का पता लगाना polysome भिन्नीकरण के लिए एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था. आरएनए स्तर RT-qPCR विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया. सिंथेटिक mRNA का उपयोग करते हुए डाटा सामान्यीकृत किया गया । तुलनात्मक सीटी (ΔΔCटी)31 विधि mRNA स्तरों की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटियां दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . हेला polysomal अंशों में राइबोसोमल प्रोटीन्स का पता लगाना. हेला सेल lysate 10%-50% सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक द्वारा अधीन किया गया था । चुनिंदा अंशों में प्रोटीन टीसीए के साथ उपजी और 12% एसडीएस में ट्रो द्वारा विश्लेषित किया गया था-माउस का उपयोग कर पश्चिमी सोख्ता के साथ पृष्ठ मोनोक्लोनल RPS6 और खरगोश polyclonal RPL11 एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी और Peroxidase-संयुग्मित बकरी के रूप में विरोधी माउस या विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी । संकेतों के दृश्य SuperSignal पश्चिम पिको प्लस chemiluminescent सब्सट्रेट द्वारा किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . हेला polysomal की तुलना 10%-50% (काला) या 17%-51% (धूसर) सुक्रोज ग्रेडिएंट में profile. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . हेला कोशिकाओं में polysomal प्रोफ़ाइल पर EDTA उपचार का प्रभाव । हेला सेल lysate 10 मिनट के लिए बर्फ पर 10 mM EDTA के साथ इलाज किया गया था तुरंत सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक से पहले । MgCl2 सुक्रोज ढाल समाधान में 5 मिमी EDTA द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . माउस वृषण ऊतक lysate से Polysomal प्रोफ़ाइल । भिंन एक आरएनए शोधन रिएजेंट के साथ आरएनए निष्कर्षण के अधीन थे और 1% agarose जेल में ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरण चरण हालत
पकड़ चरण 1 1.6 ° c/s के साथ 25 से 50 ° c तापमान में वृद्धि
2:00 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर मशीन
चरण 2 तापमान में वृद्धि 50 से 95 ° c के साथ 1.6 ° c/
10:00 मिनट के लिए 95 ° c पर मशीन
पीसीआर चरण 1 00:15 मिनट के लिए 95 ° c पर मशीन
चरण 2 1.6 डिग्री सेल्सियस के साथ 95 से 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान में कमी/
1:00 मिनट के लिए 60 ° c पर मशीन
चक्रों की संख्या 40
पिघल वक्र step1 1.6 ° c/s के साथ 60 से 95 ° c तापमान में वृद्धि
चरण 2 1.6 ° c/s के साथ 95 से 60 ° c तापमान में कमी
1:00 मिनट के लिए 60 ° c पर मशीन
चरण 3 (पृथक्करण) तापमान में वृद्धि के साथ 60 से 95 ° c के साथ 0.05 ° c/
00:15 मिनट के लिए 95 ° c पर मशीन

तालिका 1. RT-qPCR के लिए शर्तें

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Discussion

Polysome भिन्नीकरण के साथ संयुक्त आरएनए और अंशों के प्रोटीन विश्लेषण के साथ संयोजित एक शक्तिशाली विधि के लिए व्यक्तिगत mRNAs या पूरे translatome की शोधों की स्थिति का विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन कारकों की भूमिकाओं को विनियमित शोधों सामांय शारीरिक या रोग राज्य के दौरान मशीनरी । Polysomal profiling एक विशेष रूप से उपयुक्त तकनीक है जैसे जीवों में शोधों के नियमन का अध्ययन करने के लिए जिसमें Leishmania शामिल है, जहां transcriptional नियंत्रण काफी हद तक अनुपस्थित है और जीन अभिव्यक्ति विनियमन ज्यादातर होता है अनुवाद के दौरान ।

यहां, हम तीन मॉडलों पर इस्तेमाल एक polysome अंश प्रोटोकॉल का वर्णन: Leishmania परजीवी, संस्कृतिपूर्ण मानव कोशिकाओं और माउस के ऊतकों । इस अध्ययन में प्रयुक्त विभिन्न जीवों के लिए polysome भिन्नीकरण कदम मूलतः एक ही है; हालांकि, lysate तैयारी में कुछ अंतर है । Leishmania कोशिकाओं तरल संस्कृति में वृद्धि और केंद्रापसारक द्वारा एकत्र की है और कोशिकाओं को ढाल पर बराबर लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए lysis से पहले गिना जाता है । मानव कोशिकाओं को धोया जा सकता है और प्लेट पर सीधे लीजड ड । बराबर लोडिंग ऑप्टिकल घनत्व द्वारा नियंत्रित किया जाता है । माउस के ऊतकों को कुशल lysis के लिए एक Dounce homogenizer की आवश्यकता होती है जबकि Leishmania और मानव कोशिकाओं के मामले में, यह 23 गेज सुई के माध्यम से उन्हें पारित करने के लिए पर्याप्त है ।

सभी का इस्तेमाल किया एजेंट RNase और मुक्त करना चाहिए । हम cytoplasmic lysates में RNase गतिविधि के अवरोधकों के रूप में हेपरिन और RNase अवरोधक की तुलना में । हमने पाया है कि दोनों एजेंट प्रभावी ढंग से RNase ब्लॉक कर सकते हैं । हालांकि, हेपरिन सीडीएनए तैयारी और RT-qPCR जैसे अनुप्रवाह अनुप्रयोगों को प्रभावित करता है । एक परिणाम के रूप में, आरएनए की तैयारी एक अतिरिक्त शुद्धि कदम जब हेपरिन प्रयोग किया जाता है की आवश्यकता है । हमारी राय में, RNase अवरोध करनेवाला अधिक सुविधाजनक विकल्प है और polysome रूपरेखा प्रोटोकॉल में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Polysomal रूपरेखा श्रम गहन है, जो विधि की एक प्रमुख सीमा है । छः ग्रेडिएंट तक एक ही समय में तैयार किए जा सकते हैं. ग्रैडिएंट fractionator 144 भिंन है जो समय की एक छोटी अवधि में संसाधित करने की आवश्यकता उत्पंन करता है । व्यक्तिगत अंशों का विश्लेषण समय लेने वाला और महंगा भी हो सकता है. इसलिए, पूर्व polysomes, प्रकाश और भारी polysomes में व्यक्तिगत भागों के संयोजन एक तेजी से और कम श्रमसाध्य तरीके से व्यक्तिगत mRNAs के शोधों गतिविधि का अनुमान प्रदान करता है । संयुक्त अंशों पर हमारे RT-qPCR परिणाम हमें Leishmania और हेला कक्षों (आंकड़े 2, 3) दोनों में भिंन mRNAs के अनुवाद में अंतर की पहचान करने की अनुमति दी । हालांकि, अगर महीन संकल्प की जरूरत है, तो व्यक्तिगत अंशों का विश्लेषण किया जा सकता है ।

Ribosome profiling mRNA के शोधों की स्थिति का अध्ययन करने के लिए एक और विधि है और Ribosome38द्वारा संरक्षित mRNA अंशों के अनुक्रमण के माध्यम से प्रोटीन उत्पादन की माप पर आधारित है । यह तकनीक विशिष्ट polysomal भिन्नताओं के साथ mRNA दृश्यों को जोड़कर एक नमूने में अनुवादित की जा रही मात्रात्मक जानकारी प्रदान करती है, और इसकी तुलना में codon रिज़ॉल्यूशन पर mRNAs की शोधों की स्थिति पर सटीक जानकारी प्रदान कर सकती है polysome profile technology. हालांकि, polysome रूपरेखा दोनों आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार polysomes के proteome पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने और अनुवाद के विनियमन के लिए योगदान कारकों की पहचान ।

इसलिए, polysomal profiling एक बहुमुखी तकनीक है कि व्यक्तिगत mRNAs के शोधों की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ribosome-जुड़े प्रोटीन की जांच और विभिंन प्रायोगिक के तहत विभिंन मॉडल जीवों में अनुवाद विनियमन अध्ययन शर्तों.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ऑडियो रिकॉर्डिंग के साथ मदद के लिए चिंग ली धंयवाद । अनुसंधान शुरू द्वारा समर्थित किया गया था निधियों से टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र और उत्कृष्टता के केंद्र द्वारा अनुवाद तंत्रिका विज्ञान और चिकित्सीय (CTNT) अनुदान PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW के लिए A.L.K.; K.Z. जेंस सी Huffman और िईद्भस्टेन आर Baca को NIH ग्रांट R01AI099380 द्वारा भाग में CISER थे (स्टेम शिक्षा और अनुसंधान के एकीकरण के लिए केंद्र) विद्वानों और कार्यक्रम द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

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References

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