Summary
Bal arısı beyin farklı bölgelerinde farmakolojik ajanların inhibitör etkileri Fosfolifaz C (PLC) üzerinde test etmek için biz bu bölgelerde PLC etkinliği ölçmek için biyokimyasal bir tahlil mevcut. Bu tahlil PLC etkinlik dokular arasında hem de farklı davranışlar sergileyen arılar arasında karşılaştırmak için yararlı olabilir.
Abstract
Balarısı karmaşık davranış ve öğrenme, bellek ve iş bölümü gibi daha yüksek beyin fonksiyonları değerlendirmek için bir model organizmadır. Mantar (MB) daha yüksek bir beyin merkezi sinir substrat karmaşık bal arısı davranışların olmak için önerilen organıdır. Genler ve proteinler differentially MBs ve diğer beyin bölgeleri ifade önceki çalışmalarda tespit rağmen her bölgedeki proteinlerin faaliyetleri henüz tam olarak anlaşılır değil. Bu proteinler beyin fonksiyonları ortaya çıkarmak için farmakolojik analizidir uygun bir yaklaşım farmakolojik manipülasyonlar gerçekten bu beyin bölgeleri protein etkinliğinde alter onaylamak için ilk gerekli değildir
Biz daha önce Fosfolifaz C (PLC) MBs diğer beyin bölgeleri içinde kodlama genlerin daha yüksek bir ifade tanımlanmış ve farmakolojik PLC katılımı bal arısı davranış değerlendirildi. Bu çalışmada, biyokimyasal olarak iki farmakolojik ajanlar test ve PLC MBs ve diğer beyin bölgeleri etkinliğinde azalma doğruladı. Burada, bal arısı beyin homogenate PLC bir etkinlik tespit nasıl ayrıntılı bir açıklama mevcut. Bu tahlil sistemdeki farklı beyin bölgelerden elde edilen homogenates sentetik fluorogenic substrat ile tepki ve PLC aktivitesinden kaynaklanan floresans sayılabilir ve beyin bölgeleri arasında karşılaştırıldığında. Ayrıca aynı sistemi kullanarak PLC faaliyete değerlendirmemizi bazı ilaçlar inhibitör etkilerinin açıklar. Bu sistem diğer endojen floresans bileşikler ve/veya tahlil bileşenleri ve dokuların absorbans tarafından etkilenen olasılığı olmasına rağmen bu sistemi kullanarak PLC etkinlik ölçümü daha güvenli ve bu geleneksel tahlil kullanarak daha kolay olan radiolabeled yüzeylerde gerektirir. Basit bir prosedür ve manipülasyonlar PLC aktivite beyni ve arıları farklı sosyal görevleri dahil diğer dokuların incelemek için bize izin verir.
Introduction
Avrupa bal arısı (Apis mellifera L.) eusocial böcek ve dişi arılar kast bağımlı üreme ve yaş bağımlı işbölümü göstermek. Örneğin, büyük olanlar yem nektar ve polen kovan1dışında iken 'işçi' olarak anılacaktır arılar steril kast içinde genç bireyler broods yem. Öğrenme ve hafıza toplayıcılar art arda gıda kaynakları ve onların yuva arasında ileri geri gidin ve onların nestmates dans aracılığıyla için iyi gıda kaynaklarının konumları iletişim kurmak çünkü bal arısı, hayatta önemli yeteneğidir iletişim1. Önceki çalışmalar MB, böcekler, daha yüksek bir beyin merkezinde bal arısı2,3,4öğrenme ve bellek yeteneği ilgilenmektedir gösterdi. Bal arısı5,6,7,8,9,10 , çeşitli beyin bölgelerinde differentially ifade genler ve proteinler tespit edilmiştir ,11her beyin bölgesi benzersiz işlevleri için ilişkili düşündüren,. Farmakolojik inhibisyon veya aktivasyon bir protein ilgi bal arısı davranış12,13,14proteinin işlevini ortaya çıkarmak için kullanılmış bir yaklaşım olmakla birlikte, bu olup tüm uyuşturucu bilinmiyor bal arısı beyin farklı bölgelerinde işlevsel etkileri vardır. Bu tür ilaçların fonksiyonların doğrulama çalışmaları sonuçlarını davranış Farmakoloji güçlendirecektir.
Burada, PLC, fare biliş15,da16,17,18karıştığı enzimler ele. PLC tarafından aşağılayıcı phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol (DAG)19,20,21sinyal kalsiyum tetikler. IP3 kalsiyum iyonları serbest bırakmak--dan ER önde gelen IP3 reseptörleri endoplazmik retikulum (ER), üzerinde açılır. Yayımlanan kalsiyum kalsiyum/calmodulin-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) ile calmodulin ve protein kinaz C (PKC) huzurunda DAG'ı etkinleştirir. Her iki protein kinaz öğrenme ve bellek22,23, PLC tutulumu bu süreçte tutarlı katılmaktadırlar. PLC'ler içine alt türlerinden, PLCβ, PLCγ ve PLCε, onların yapıları20tarihinde dayalı gibi kategorize edilir. Her PLC alt türü farklı bir bağlamda20dakikaya etkinleştirilir ve bu alt türlerinden kodlama genler differentially farklı dokularda ifade edilir. Biz daha önce bal arısı MBs kalan beyin bölgeleri24daha yüksek düzeyde PLCβ ve PLCε alt türlerinden kodlama genler express ve iki pan-PLC inhibitörleri (edelfosine ve paromisin sülfat [paromisin]) PLC aktivitesinde azalma gösterdi farklı beyin bölgelerini ve gerçekten de, bal arısı24öğrenme ve bellek yeteneğini etkiler.
Geleneksel olarak, PLC enzimatik aktivite uygun eğitim, ekipman ve tesisleri gerektiren radiolabeled PIP225, kullanarak ölçülen. Son zamanlarda, PLC, sentetik fluorogenic substrat kurulan26Standart laboratuvar PLC etkinliğini değerlendirmek kolaylaştırır, olmuştur. Burada, detaylı bir protokol PLC faaliyet fluorogenic substrat kullanarak bal arısı, farklı beyin bölgelerinde tespit etmek ve daha sonra bu dokularda edelfosine ve paromisin PLC inhibitör etkilerini test etmek için mevcut. Protokol yalnızca temel işlemler gerektirdiğinden, PLC aktivite diğer dokularda veya farklı sosyal görevler için ayrılan arılar beyin alanlarında çalışmaları için geçerli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yiyecek arıları yakalama
- Bal arısı kolonileri yerel bir distribütörden satın.
- Bir böcek net kullanarak, kendi ayakları üzerinde polen çanta ile kovan dönmek forager arılar yakalamak. Arılar bir standart 50 mL Plastik Konik tüp için aktarmak ve Tüp (Şekil 1) kap. Tüp arılar anestezi buza koy.
Not: Arıcılık arı sokması önlemek için belirlenen ceket giymek. Hemşirelik arılar da deneme bağlı olarak toplanan olabilir. Hemşire arılar yakalamak için balmumu tarak arının davranış gözlemlemek ve kanat veya cımbız kullanarak göğüs larvalar beslemek için kuluçka hücrelere başlarını poke hemşire arılar yakalamak. Sonra arılar 50 mL plastik tüpün içine yerleştirin, tüp kap ve adım 1.2 belirtildiği gibi buza koy. - 12 toplayıcılar yakalama rastgele.
Not: Altı çok kaynaklanan lot başına iki arılar bu protokolü kullanır. Birden çok arı-ebilmek var olmak caught içinde bir tüp ve arılar her yerinde daha sonra kombine olarak tek bir tüp arılar sayısı önemli değildir (bkz. Adım 3.1.1). Tüp yüksek sıcaklıkta arılar yaralı olarak tüp serin yaz aylarında tutmak.
2. bal arısı beyin diseksiyon
- Laboratuvarda, buz arılar anestezi en az 30 dk6 50 mL tüp koyabilir.
- Diseksiyon sahne hazırlamak için Diş balmumu parçası ikiye katlıyorsun (elde edilen boyutu yaklaşık 3.5 x 7, 5 cm olan) bir plastik tabak (60 x 15 mm) içine itin.
Not: Katlanmış balmumu sıkıca böcek iğne tutar. - Binoküler mikroskop altında arının kafa cımbız ile onun vücudundan ayırmak ve Diş balmumu dibinde bir yukarı doğru pozisyonda (Şekil 2A) ön kafa tutmak için her anten böcek pimleri ekleyerek tamir.
Not: Cımbız kullanarak etanol veya steril su kullanmadan yıkayın. - Yeterli tuz solüsyonu (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl ve 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) örtbas için kafasına dökün. Eğer baş çözüm içinde yüzen pimleri ile yine baş pierce. Buz gibi bir tuzlu çözüm kullanın.
Not: Ancak, bu iletişim kuralını soğuk tuzlu çözüm çalışır. - Cımbız (Şekil 2B) kullanarak anten kaldırın.
- Anten ve boyuna bir neşter kullanarak bileşik gözler sınırında üsleri yakınındaki bir yatay kesim yapmak. O zaman, başın üst kısmında yatay bir kesim yapmak. Beyin (Şekil 2C) üzerinde bir pencere açmak için kütikül kaldırın.
Not: gerekirse, neşter etanol veya kullanmadan önce steril su ile yıkayın. - Retinae ocelli ve cımbız (Şekil 2D) kullanarak beynin ön yüzeyinde tracheae kaldırın.
- Bileşik gözler kenarlığını keser dorsally ve ventrally, neşter (Şekil 2E) kullanarak genişletin. Ardından, bileşik gözler manikür ve retinae arasındaki bağ dokusu cımbız göz kütikül (Şekil 2F) altında doğrudan ekleyerek kaldırın.
- Bileşik gözler kütikül atmak. Bileşik gözler retinae dorsal ipuçları cımbızla almak ve cımbız dikkatle retinae (resim 2G) soyma için ventral yönde hareket ettirin.
- Cımbız (Şekil 2H) kullanarak beynin ön yüzeyinde kalan tracheae dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Cımbız, kullanma belgili tanımlık doku çevresinde ve beyin arasında bağ dokusu kesmek ve baş kapsül (Şekil 2H) beyinden incelemek.
- Akasındaki cımbız (Şekil 2ben) kullanarak beynin arka yüzeyinde tracheae.
- Bir neşter kullanılarak, MBs ve MBs (Şekil 2J) bir parçası olan dikey loblar, yanındaki diğer beyin bölgeleri arasındaki bağlantıyı kesme.
- Yer disseke MBs ve beyin dokuları 1.5 mL tüpler içine ve hızla kalan onları kuru buz veya sıvı azot (Şekil 2K) ile dondurma. -80 ° C'de donmuş dokuları kullanmak kadar saklamak.
Not: Tanıtıcı nitrojen ile belirlenen eldiven ve havalandırma soğuk yanık ve boğulma önlemek için. Kuru buz da dikkatle eldiven ile ele alınmalıdır. Protokol burada duraklatılmış. Diseksiyon ve depolama doku olmalıdır beynin bir arı protein yıkımı önlemek için bir anda gerçekleştirilen.
3. beyin Homogenates hazırlanması
- Homojenizasyon 50 mmol/L HEPES tampon oluşan 10 µL eklemek-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L KCl ve 1.0 mmol/beyin doku ve el ile plastik bir havaneli ile basınç uygulayarak 1.5 mL tüp dokusunda homojenize L CaCl2 için dondurulmuş. Kontur dokusu en az 200 x.
Not: buz üzerinde 3 bölümde açıklanan uygulamaları gerçekleştirin. Tam uygun bir havaneli kullanın tüp yeterince dokular parçalamak için hangi kolayca homojenizasyon arabellekte float.- Aynı şekilde doku homojenize ve homojenize doku çözüm çok sonraki dokusunda transfer.
Not: Bu adımda her yerinde arıları birleştirilir. Bu iletişim kuralı altı çok kullanıyor.
- Aynı şekilde doku homojenize ve homojenize doku çözüm çok sonraki dokusunda transfer.
- Homojenizasyon arabelleği 30 µL ekleyin.
- Homojenize doku örneği yaklaşık 900 x g27 ve 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- Yeni bir 1.5 mL tüp süpernatant aktarmak ve yine yaklaşık 9.500 x g27 ve 4 ° c, 20 dk santrifüj kapasitesi
- Yer süpernatant yeni 1.5 mL tüp içinde. -20 ° C'de homogenate kullanmak kadar saklamak.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Bicinchoninic asit (BCA) tahlil kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.
- Homogenate 2.5 µL 17,5 µL (böylece homogenate eightfold sulandrarak) steril su ile sulandırmak ve sulandırılmış homogenate kullanın.
Not: bir micropipette kullanarak örnekleme homogenate dikkatle nedeniyle yüksek viskozite gerçekleştirilmelidir. - 0, 0,1 0,2 0,4 1.0 ve 2.0 mg/mL Sığır serum albumin (BSA) 20 µL standartları olarak kullanarak BCA tahlil gerçekleştirin.
Not: Gerekirse, BCA tahlil ölçeğini göre değişen homogenate ve standart örneklere hacmi. Protokol burada duraklatılmış.
- Homogenate 2.5 µL 17,5 µL (böylece homogenate eightfold sulandrarak) steril su ile sulandırmak ve sulandırılmış homogenate kullanın.
4. PLC tepki olarak beyin Homogenates
- 50 µmol/L, steril su içinde çözünmüş fluorogenic substrat WH-1526 hisse senedi çözüm hazırlamak ve-80 ° C'de saklayın
Not: solmaya önlemek için folyo ile belgili tanımlık substrate içeren çözümleri kapsar. - Tepki premixture 10 µL aşağıdaki bileşiminde tepki karışımı elde etmek için gerekli birimindeki hazırlamak: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L CaCl2, 2.0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA ve 12.5 µmol/L WH-15.
- Homojenizasyon arabelleği ile homogenate gerekirse sulandırmak.
- Mix tepki premixture ve tepki karışımı 10 µL son hacmi elde etmek için bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp proteinlerin 1.3 µg içeren homogenate.
- İstatistiksel analiz için denetim karışımları iki tür hazırlamak: koymak belgili tanımlık homogenate ama değil WH-15 karışımı (denetim karışımı 1) içine ve ahlak bozukluğu çok yönlü (denetim karışımı 2).
Not: reaksiyon karışımları ve denetim karışımları buz protein yıkımı ve PLC reaksiyonu önlemek için hazırlayın. Denetim karışımları 1 ile 2 floresan homogenate ve ücretsiz substrat, sırasıyla algılamak için kullanılan.
- İstatistiksel analiz için denetim karışımları iki tür hazırlamak: koymak belgili tanımlık homogenate ama değil WH-15 karışımı (denetim karışımı 1) içine ve ahlak bozukluğu çok yönlü (denetim karışımı 2).
- Tüp Temizleme ve termal cycler 25 ° C'de 30 dk içinde kuluçkaya
- Reaksiyon 25 mmol/L etilen glikol bis (β-aminoethylether) 2 µL ekleyerek durdurmak-N, N, N', N'-tetraacetic asit.
Not: Uygun protein miktarları ve tepki süreleri deneyler arasında değişir. Böylece, tepki durumu en iyi duruma getirmek için bu adımları ön deneyleri 4.1-5,3 floresans doğrusal olarak artar kadar protein miktarı ve kuluçka zamanı değiştirerek açıklandığı yordamları yinelemeniz gerekli olabilir. Başvuru için diğer beyin bölgelerden elde edilen homogenate kullanıldığında, reaksiyon genellikle doğrusal olarak 1.3 µg ile çalışır veya daha az 30 dk ama doğrusallık içinde proteinlerin proteinlerin en az 2.7 µg ile veya bir kuluçka süresi 90 dk veya lo azaltır oluyor.
5. PLC aktivitesinden kaynaklanan floresans tespiti
- Reaksiyon karışımı ve denetim karışımları yaklaşık 310 x g28 , 5 min için santrifüj kapasitesi ve süpernatant ile 10 µL 384-şey Mikroplaka floresans algılama için geçerli tarih için farklı wells aktarın.
Not: solma ve toz ile kontaminasyonu önlemek için folyo ile plaka kapak. - Santrifüj için Mikroplaka kullanarak Mikroplaka floş.
- Floresans teknik bir nüsha ile tespit ve plaka Mikroplaka Okuyucu olarak ayarlayın.
Not: 344 uyarma ve emisyon dalga boylarında olan nm ve 530 nm, anılan sıraya göre. (Varsa) (bağlı olarak Mikroplaka Okuyucu), 5 örnek karışımları karıştırmak her algılama önce s. Protokol burada durdurulabilir.
6. farmakolojik ajanların inhibitör eyleminin testi
- Edelfosine ve paromisin uygun konsantrasyonlarda hisse senedi çözümleri hazırlamak ve onları kullanmak kadar saklamak: edelfosine 5.0 mmol/L ve-20 ° C; paromisin 550 mmol/L ve 4 ° C.
- Adım 4.2'tepki premixture açıklandığı gibi hazırlarken., uygun son konsantrasyonları elde etmek için premixture inhibitörleri ekle: edelfosine, 1.0 mmol/L; paromisin, 0.55 mmol/l
- Homogenate tepki premixture ve uygun denetim karışımları adım 4.4 olduğu gibi ekleyin.
- Üç tür denetim karışımları hazırlamak: homogenate ve inhibitörü, ama belgili tanımlık substrate 1; denetim karışımı koyun belgili tanımlık substrate ve inhibitörü ama değil homogenate kontrol karışımı 2 ekleyin; ve engelleyici, değil homogenate veya yüzey kontrol karışımı 3 koyun.
- PLC tepki ve 4.5-5,3 adımlarda açıklandığı gibi floresan tespiti gerçekleştirin.
7. istatistiksel analiz
- 4 bölümünde açıklanan karışımları kullanarak PLC etkinliğini tespiti için homogenate veya ücretsiz substrat aşağıdaki gibi yayılan floresans çıkararak arasında PLC ve substrat reaksiyon türetilen floresans hesaplayın.
FL (PLC hareket) Fl (reaksiyon mix) - = {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Not: Fl (PLC hareket), Fl (reaksiyon mix), Fl (ctrl 1) ve Fl (ctrl 2) PLC faaliyetten elde edilen bona fide floresans göstermek, floresans tepki karışımı ve denetim karışımları 1 ve 2, sırasıyla algılandı.- Floresans 4.1-5.3, adımlarda açıklandığı gibi karışımları içinde ölçüm sonra adım 7.1 denklemde ve ortalama her homogenate için teknik nüsha Fl (PLC hareket) göre Fl (PLC hareket) hesaplar.
- 7.1.1. adımda elde teknik nüsha ortalama Fl (PLC hareket) kullanarak, tekrar MBs ve diğer beyin bölgeleri biyolojik çoğaltır ortalama Fl (PLC hareket) hesaplamak ve beyin doku arasındaki değerleri karşılaştırın.
- PLC aktivite inhibitörleri 6 bölümünde açıklanan karışımları kullanarak huzurunda incelenmesi için reaksiyon homogenate, substrat ve inhibitörü arasında aşağıdaki gibi elde floresans hesaplayın.
FL (PLC aktivite inhibitörü ile) Fl (reaksiyon mix) - = {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Not: Burada, engelleyici huzurunda PLC faaliyetinden kaynaklanan bona fide floresans Fl (PLC aktivite inhibitörü ile). FL (reaksiyon mix), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) ve Fl (ctrl 3) tepki karışımı, denetim karışımı 1, tespit floresan sinyallerini karışımı 2 ve denetim karışımı 3, sırasıyla kontrol vardır.- Floresans 6.1-6.4, adımlarda açıklandığı gibi karışımları içinde ölçüm sonra adım 7.2 denklemde göre Fl (PLC aktivite inhibitörü ile) hesaplar. Sonra her homogenate için teknik nüsha ortalama Fl (PLC aktivite inhibitörü ile) elde edilir.
- 7.2.1. adımda hesaplanan ortalama değeri kullanarak, biyolojik çoğaltır her beyin dokusundan elde edilen ortalama Fl (PLC aktivite inhibitörü ile) hesaplama. Fl (PLC aktivite inhibitörü ile) ve adım 7.1.2 her beyin dokusu içinde elde Fl (PLC hareket) karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein konsantrasyonları beyin Homogenates içinde:
Forager arılar kullanarak homogenates hazırladık. Orijinal homogenates hesaplanan protein konsantrasyonlarda Şekil 3' te gösterilmektedir. Orijinal homogenate yaklaşık protein konsantrasyonlarda aşağıdaki gibidir: 1,5 mg/mL MBs ve 2.3 mg/mL diğer beyin bölgeleri. Lot başına iki arılar kullandık ve altı çok analiz edildi.
Beyin Homogenates PLC aktivite tespiti:
Pilot deneyde, diğer beyin bölgelerinde MBs daha yüksek floresans tespit ettik. Bu nedenle, diğer beyin bölgeleri homogenate kullanarak ön deneyler tekrarladı ve reaksiyon süresi (yani, 30 min) ve protein miktarı (yani, 1.3 µg) belirledi. Bu koşullar altında reaksiyon sonucu Şekil 4' teAgösterilir. İçeren doku homogenate ve fluorogenic substrat reaksiyon karışımları sergilenen > doku homogenate veya PLC etkinlik olduğunu düşündüren fluorogenic substrat içeren denetim karışımları daha 4.2-fold daha yüksek floresan reaksiyon karışımları algıladı. Göreli floresans MBs (Şekil 4B) diğer beyin bölgelerinde yaklaşık 3.4-fold daha yüksek.
PLC etkinlik farmakolojik ajanların inhibitör etkilerinin Analizi:
PLC etkinlik pan-PLC inhibitörleri edelfosine ve paromisin etkilerini incelemek için biz aynı homogenate gibi yukarıda analiz kullanarak tepki 1.0 mmol/L edelfosine veya 0.55 mmol/L paromisin, huzurunda gerçekleştirilen. Edelfosine huzurunda, floresans düzeyi yaklaşık %6.0 ve % 5,4 MBs ve diğer beyin bölgeleri için sırasıyla, denetimleri olmadan edelfosine (Şekil 4C) kıyasla azalmıştır. Paromisin tedavi azalmış floresan düzeyi % 44 ve tedavi edilmezse, MBs ve denetleyen diğer beyin bölgeleri içinde sırasıyla % 20 (Şekil 4D).
Resim 1 : Forager bal arısı yakalama. Onu kovana geri dönen bir forager bir böcek net yakalanmış ve bir 50 mL Plastik Konik tüp içine sınırlı oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Diseksiyon yordam şematik Gösterim. (A)eksenler iletişim kuralında belirtilen bal arısı beyin gösterilir. Baş bee anterior toraks ile yan taraftan görülüyor. (B - K) Fotoğraf ve illüstrasyonlar diseksiyon yordamlar gösterilir. Ayrıntılı bilgi için ana metne bakın. Sadece balarısı Başkanı sunulur. Tracheae bir örnek atlandı. MBs mantar organları =. Ölçek çubukları 1 mm. için karşılık gelen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Protein konsantrasyonları içinde beyin dokusu homogenates. Orijinal homogenates protein konsantrasyonları BCA tahlil tarafından ölçülen ve hesaplanan. Standart sapma ile ortalama konsantrasyonları gösterilir. İki forager arılar her birçok için kullanıldı ve altı çok analiz edildi. MBs mantar organları =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Floresan tespit tepkileri. (A) Bu paneli gösterir floresans her doku veya fluorogenic olmadan alt katman. Reaksiyon 30 dk protein 1.3 µg kullanılarak gerçekleştirildi. Floresans Mikroplaka Okuyucu tarafından ölçüldü. Örnek kuyu değerleri boş wells tarafından düzeltildi ve rasgele birimlerinde (AUs) gösterilir. (B) Bu panel floresans beyin doku arasında bir karşılaştırmasını gösterir. Masası'a A veri çıkarma tarafından denetim karışımları için düzeltilmiş ve içinde MBs. hesaplanan floresans tarafından normalleştirilmiş * P < 0.005, Mann-Whitney U testi. Panelleri C ve D (C) 1.0 mmol/L edelfosine ve (D) 0.55 mmol/L paromisin huzurunda göreli floresans göster. A ve B panellerde kullanılan aynı homogenates analiz edildi. Floresans değerleri her doku için ilaç tedavisi olmadan denetim deney sonuçlarına göre normalleştirilmiş. Denetim reaksiyonlar panelinde C veri paneli Bile aynıdır. Dpanelinde tüm homogenates daha farklı bir deneyde analiz edildi. Standart sapma ile ortalama floresans değerler gösterilir. İki arılar her birçok için kullanıldı ve altı çok analiz edildi. P < 0,05, Wilcoxon imzaladı-sırada testi. Hiçbir Hg denetim karışımı homogenate; içeren değil = MBs mantar organları =. Panelleri B - D Suenami ve ark. değiştirildi publisher'ın izni ile 24 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir enzim aktivitesinin yüzeylerde ve inhibitörleri, gibi çeşitli moleküller tarafından etkilenen ve böylece, ile birlikte değiştirebilirsiniz çünkü moleküler beyin, sinyal anlamak için son derece önemli protein faaliyet biyokimyasal incelenmesidir hayvan davranışları5(Örneğin, öğrenme ve hafıza). Bal arısı çalışmalarda, siklik AMP bağımlı protein kinaz A, siklik GMP-bağımlı protein kinaz, PKC, fosforile CaMKII ve adenilat cyclase gibi enzimler differentially dayalı çeşitli beyin bölgeleri ifade bildirilmiştir immünhistokimya5,10,29,30,31. Enzimatik aktivite beyin bölgeleri arasında farklılıklar ancak, sadece kısmen bildirilen6vardır. Burada, PLC aktivite tespit ve farmakolojik ajanların MBs ve diğer beyin bölgeleri inhibitör etkileri değerlendirmek için detaylı bir protokol açıklanan.
Floresans algılama ile müdahale mümkün bazı faktörler vardır. İlk olarak, protein yıkımı biyokimyasal testleri gerçekleştirirken korumak önemlidir. Burada açıklanan protokolünde bir hızlı diseksiyon ve beyin dondurulması gereklidir. Bu doku örnekleri donmuş ve yakında diseksiyon her döngüsü sonra saklı önerilir. Homogenate donma/çözülme döngüsü indirilmesi de protein bozulmasını önlemek çok önemlidir.
PLC etkinliği bir floresan sinyal ile algıladığından protein yıkımı ek olarak, arka plan floresans ve absorbans tepki karışımı sonuçları bu tahlil sisteminde etkileyebilir. Örneğin, suda paromisin floresan algılama etkiler sarı bir renge sahiptir. 0.55 mmol/L paromisin, hisse senedi çözüm 1000-fold bir seyreltme kullanılmış olmasına rağmen konsantrasyonu daha fazla bir optimizasyon gerekli olabilir. Ayrıca, diğer dokular tarafından kirlenme sonucu etkileyebilir. Görsel uyaranlara algılar ve pigment içeren, retina, potansiyel olarak tahlil ile engelleyen bir doku türü kapsar.
Mevcut iletişim kuralı ile diğer beyin bölgelerinde MBs24daha yüksek PLC etkinlik algıladı. Bu MBs PLC genler yüksek düzeyde diğer beyin dokuları24daha hızlı ortaya nicel Ters transkripsiyon PCR analiz sonucu ile tutarsız. Bu çelişki WH-serbest yüzer substrat26ve biz membran ve beyin homogenates sitozolik kesirler ayrım değil ki aslında 15 nedeniyle, olabilir. PLCβ ve PLCε membran ilişkili enzimler32 ve endojen PIP2 substrat ile iletişim kurabilirim göz önüne alındığında, PLC ve WH-15 arasındaki reaksiyon olasılığı homogenate membran kesir miktarını etkiler. PLC konsantrasyonu diğer beyin bölgeleri protein üretim ve/veya bozulma oranlarındaki farklılıklar nedeniyle MBs içinde daha yüksek olabilir başka bir mantıklı açıklaması bu. Bu nedenle, beyin aktivitesinde bona fide PLC açıklık gerekir daha fazla ek deneyler tarafından son zamanlarda bildirilen yeni alt katman kullanarak membran33dahil gibi membran ilişkili ve sitozolik faaliyetini çözümleme PLC'ler ayrı olarak, ya da PLC'ler veya PIP içeriğini miktarının2 her beyin dokusu içinde.
Yukarıdaki noktaları dikkate alarak, burada açıklanan PLC tahlil sistem-ebilmek var olmak genişlemek burada, sindirim sistemi, kas ve üreme organı gibi değerlendirildi değil farklı dokularda PLC etkinliği ölçmek için. PLC faaliyet forager beyinlerinin ve PLC faaliyet farklı sosyal roller katılımı değerlendirmek için hemşire arılar arasında karşılaştırmak mümkündür.
Radiolabeled PIP2 kullanarak geleneksel bir yaklaşım gerektirir iken standart Laboratuar donanımları ile yapılabilir çünkü doku homogenates PLC aktivite tespit İhtisas için genel olarak, burada sunulan tahlil sistemi uygulanabilir bir seçenek olduğunu İmkanlar, eğitim ve ekipman için radioisotopes. Daha fazla değişiklikler ile sistem yararlanarak balarısı'nın karmaşık davranış temel moleküler mekanizmaları anlayışımızı derinleştirmek olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Şekil 4B - 4 D Suenami ve ark. güncellenmiştir 24 biyoloji açık izni ile. Yazarlar için yayımcı izni için minnettarız. Bu eser insan sınır bilim programı (RGY0077/2016) Shota Suenami ve Ryo Miyazaki tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
