Summary
כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של סוכנים תרופתי על phospholipase C (PLC) באזורים שונים של המוח הונאיבי, נציג של assay ביוכימי כדי למדוד PLC פעילות באזורים אלה. Assay זה יכול להיות שימושי לצורך השוואת פעילות PLC בין רקמות, כמו גם בין דבורים מפגין התנהגויות שונות.
Abstract
דבורת הדבש היא אורגניזם מודל להערכת התנהגויות מורכבות ותפקוד המוח גבוה יותר, כגון למידה, זיכרון, חלוקת עבודה. הגוף פטריות (MB) הוא מרכז המוח גבוה יותר הציע להיות המצע עצבית של התנהגויות מורכבות דבורת הדבש. למרות שמחקרים קודמים לזיהוי גנים וחלבונים אשר באה לידי ביטוי באופן שונה את MBs, באזורים אחרים במוח, הפעילות של החלבונים בכל אזור אינם עדיין לגמרי מובנים. כדי לחשוף את הפונקציות של חלבונים אלו במוח, ניתוח תרופתי היא גישה אפשרית, אבל זה הכרחי הראשון כדי לאשר כי מניפולציות תרופתי אכן לשנות את פעילות החלבון באזורים האלה במוח.
אנו זוהו בעבר ביטוי גבוה יותר של גנים קידוד phospholipase C (PLC) ב- MBs מאשר באזורים אחרים במוח, פרמקולוגית העריכו את מעורבותם של בקר לוגי מיתכנת בהתנהגות דבורת הדבש. במחקר הזה, אנחנו מבחינה ביוכימית נבדקו שני סוכנים תרופתי ולא אישרו כי הם ירדו PLC פעילות ב- MBs ואזורים אחרים במוח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של איך לזהות פעילות PLC הונאיבי המוח homogenate. במערכת זו assay, homogenates נגזר אזורי מוח שונים הם הגיבו עם מצע fluorogenic סינתטי, זריחה כתוצאה מפעילות PLC לכמת, בהשוואה בין אזורי המוח. גם נתאר את ההערכות שלנו מעכבות ההשפעות של תרופות מסוימות על פעילות PLC באמצעות אותה שיטה. למרות מערכת זו סביר מושפע תרכובות אחרות פלורסצנטיות אנדוגני ו/או את ספיגת של רכיבים assay ורקמות, המדידה של בקר לוגי מיתכנת פעילות באמצעות מערכת זו הוא יותר קל מאשר כי שימוש מסורתי וזמינותו, אשר דורש radiolabeled סובסטרטים. הליך פשוט ואת המניפולציות מאפשר לבחון PLC פעילות המוח ורקמות אחרות של דבורי הדבש מעורב פעילויות חברתיות שונות.
Introduction
דבורת הדבש האירופית (בומבוס ל') הוא חרק eusocial, דבורים הנשי להראות תלויי-קאסטה רבייה תלויי-גיל חלוקת עבודה. לדוגמה, בקאסטה סטרילי דבורים המכונה 'עובדים', אנשים צעירים להאכיל את האפרוחים ואילו המבוגרים יותר מספוא צוף ואבקה בחוץ הכוורת1. למידה וזיכרון היכולת היא ללא ספק חשובה בחייו של דבורת הדבש, כי איוראו עליו שוב ושוב הולכות הלוך ושוב בין מקורות המזון ואת הקן שלהם, ואז לתקשר את המיקומים של מקורות מזון טוב כדי nestmates שלהם דרך הריקוד תקשורת1. מחקרים קודמים הראו כי מגה, מרכז המוח גבוה יותר חרקים, מעורב יכולת למידה וזיכרון של דבורת דבש2,3,4. באופן שונה ביטוי גנים, חלבונים זוהו אזורים שונים במוח של דבורת דבש5,6,7,8,9,10 ,11, רומז כי הן קשורות פונקציות ייחודיות של כל אזור במוח. למרות עיכוב תרופתי או הפעלה של חלבון עניין בגישה המשומשת כדי לחשוף את תפקוד החלבון של דבורת הדבש התנהגות12,13,14, זה לא ידוע כל תרופות יש תופעות פונקציונלי באזורים שונים של המוח דבורת הדבש. האימות של הפונקציות של תרופות מסוג זה יחזק מסקנות מחקרים התנהגותיים פרמקולוגיה.
כאן, אנו מתמקדים PLC, אחד של אנזימים בהפרות העכבר קוגניציה15,16,17,18. בקר לוגי מיתכנת מפעיל סידן איתות על ידי משפילים phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) לתוך אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP3) ו- diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 נפתח IP3 רצפטורים על תוך-פלזמית (ER), מוביל שחרור של יוני הסידן מחדר המיון. הסידן שפורסמו מפעיל קינאז החלבון קלמודולין-סידן/תלויי II (CaMKII) עם קלמודולין וגם חלבון קינאז C (PKC) בנוכחות דאג. שני חלבונים kinases מעורבים לימוד, זיכרון22,23, עקבי עם המעורבות של בקר לוגי מיתכנת בתהליך זה. בקרים מתוכנתים מסווגים לתוך תת, כולל PLCβ, PLCγ PLCε, בהתבסס על מבנים שלהם20. כל סוג של בקר לוגי מיתכנת מופעלת ב- הקשר שונה20, גנים קידוד יחוברו אלה מתבטאים באופן שונה ברקמות שונות. אנחנו הפגינו בעבר כי הונאיבי MBs גנים קידוד תת PLCβ ו- PLCε ברמות גבוהות יותר מאשר האזורים הנותרים המוח24ו פאן-PLC שני מעכבי (edelfosine ו- neomycin סולפט [neomycin]) להקטין את הפעילות בקר לוגי מיתכנת שונים במוח אזורים, ואכן, משפיעה על יכולתו למידה וזיכרון של דבורת הדבש24.
באופן מסורתי, הפעילות האנזימטית מתרחשת של בקר לוגי מיתכנת יש כבר נמדד באמצעות radiolabeled פיפ225, המחייב הכשרה מתאימה, ציוד ומתקנים. לאחרונה, מצע fluorogenic סינתטי של בקר לוגי מיתכנת כבר הוקמה26, ולכן קל להעריך PLC פעילות במעבדה רגילה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לאתר בקר לוגי מיתכנת פעילות באזורי מוח שונים מדבורת הדבש באמצעות המצע fluorogenic, ולאחר מכן לבחון את ההשפעה המעכבת של edelfosine ו neomycin על בקר לוגי מיתכנת ברקמות אלה. כי הפרוטוקול דורש רק בסיסי מניפולציות, ייתכן החלים על מחקרים של בקר לוגי מיתכנת פעילות ברקמות אחרות או המוח באזורים דבורים המוקצה לפעילויות חברתיות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לכידתו של הרעיה דבורי הדבש
- לרכוש הונאיבי מושבות של מפיץ מקומי.
- באמצעות רשת של חרקים, לתפוס דבורים באיסוף אשר לחזור לכוורת בשקיות אבקה על רגליהם האחוריות. להעביר את הדבורים סטנדרט 50-mL חרוט צינור פלסטיק, קאפ הצינור (איור 1). לשים את הצינורית על קרח כדי עזים ומתנגד הדבורים.
הערה: ללבוש מעילים המיועד כוורנות למנוע עקיצות דבורה. האבות הדבורים ניתן גם שנאספו בהתאם הניסוי. לתפוס הדבורים האחות, בהתנהגות של הדבורה על המסרק שעווה ולתפוס האחות דבורים, אשר לתקוע את ראשם לתוך תאים שבוחרים להאכיל את הזחלים, על ידי אגף או החזה באמצעות פינצטה. אז, במקום הדבורים לתוך צינור פלסטיק 50-mL, קאפ הצינור, שים את זה על הקרח כפי שהוזכר בשלב 1.2. - ללכוד את איוראו 12 באופן אקראי.
הערה: פרוטוקול זה משתמש שני דבורים לוט, וכתוצאה מכך הרבה שש. דבורים מרובים יכולים להיתפס בצינור אחד, ואת מספר הדבורים צינור יחיד אינה חשובה, כמו דבורים במגרש כל משולבים מאוחר יותר (ראה שלב 3.1.1). לשמור הקריר צינור בקיץ, כמו טמפרטורה גבוהה בצינור פצעה את הדבורים.
2. ניתוח של המוח דבורת דבש
- במעבדה, במקום הצינור 50-mL על קרח במשך לפחות 30 דקות6 עזים ומתנגד הדבורים.
- כדי להכין את הבמה לנתיחה, מקפלים את חתיכת שעווה שיניים לשניים (הגודל המתקבל הוא כ 3.5 x 7.5 ס מ) ודחף לתוך צלחת פלסטיק (60 x 15 מ מ).
הערה: השעווה מקופל מחזיקה בחוזקה את הסיכות חרקים. - תחת מיקרוסקופ דו-עינית, להפריד הדבורה הראש מגופו עם פינצטה ולתקן אותה על השעווה שיניים על-ידי הוספת סיכות חרקים בבסיס של כל אנטנה להחזיק הקדמי של הראש בעמדה כלפי מעלה (איור 2א).
הערה: יש לשטוף את הפינצטה לפני השימוש, באמצעות אתנול או מים מעוקר. - יוצקים תמיסת מספיק (0.13 מול/ליטר NaCl 5 mmol/L אשלגן כלורי, mmol/L 1-2 H2CaCl2O) על הראש כדי לכסות את זה. פירס הראש שוב עם הפינים אם הראש צף בפתרון. משתמשים בפתרון מלוחים קפואים, במידת הצורך.
הערה: עם זאת, פרוטוקול זה עובד בלי תמיסת מלח קר. - הסר מחושיהם באמצעות פינצטה (איור 2B).
- לעשות חתך אופקי בקרבת הבסיסים של מחושיהם ולאחר longitudinally על הגבול של עיניים מורכבות, באמצעות אזמל. לאחר מכן, בצע חתך אופקי בחלק העליון של הראש. הסר את הקוטיקולה לפתוח חלון על המוח (איור 2C).
הערה: אם יש צורך, לשטוף את האזמל עם אתנול או מעוקר מים לפני השימוש. - הסר את retinae את ocelli ולא את tracheae על המשטח הקדמי של המוח, באמצעות פינצטה (איור 2D).
- הרחב את החתך על הגבול של העיניים תרכובת dorsally ו- ventrally, באמצעות את האזמל (איור 2E). בשלב הבא, להסיר את רקמת החיבור בין את הקוטיקולה בעיניים תרכובת retinae על-ידי הוספת את הפינצטה ישירות מתחת לציפורן העין (איור 2F).
- למחוק את הקוטיקולה בעיניים המתחם. לבחור את הטיפים הגבי של retinae העיניים מתחם עם פינצטה, להזיז את הפינצטה לכיוון הגחון לקלף בזהירות את retinae (איור 2G).
- הסר בזהירות את tracheae שנותרו על המשטח הקדמי של המוח, באמצעות פינצטה (איור 2H).
- לחתוך את רקמת החיבור בין המוח לבין סביב הרקמות, באמצעות פינצטה, ומנתחים את המוח של הקפסולה ראש (איור 2H).
- לקלף את tracheae על המשטח האחורי של המוח, באמצעות את הפינצטה (איור 2אני).
- באמצעות אזמל, חותכים את הקשר שבין MBs של אזורים במוח אחרים ליד האונות אנכי, אשר הם חלק MBs (איור 2J).
- המקום MBs ביתור ואת הנותרת ברקמות המוח בתוך צינורות 1.5-mL, במהירות להקפיא אותם עם קרח יבש או חנקן נוזלי (איור 2K). לאחסן את רקמות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
הערה: להתמודד עם חנקן נוזלי עם כפפות המיועד, אוורור כדי למנוע כוויית קור מחנק. צריך גם לטפל קרח יבש בזהירות עם כפפות. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. ניתוח ואחסון של המוח רקמות צריך להיות לבצע דבורה אחת בכל פעם כדי למנוע השפלה חלבון.
3. הכנת המוח Homogenates
- להוסיף 10 µL של המגון הכוללת מאגר של 50 mmol/L HEPES-קו (pH 7.2), 70 mmol/L אשלגן כלורי, 1.0 mmol/L CaCl2 כדי קפואים רקמת המוח, homogenize הרקמה בצינור 1.5-mL על ידי באופן ידני הפעלת לחץ עם כבעלי פלסטיק. ללטף את הרקמה לפחות 200 x.
הערה: מבצע המניפולציות המתוארות בסעיף 3 על קרח. השתמש כבעלי מתאימה בצינור מספיק לרסק את הרקמות, אשר בקלות לצוף במאגר המגון.- העברת הפתרון הומוגני רקמה לרקמת הבא במגרש, homogenize את הרקמה באופן זהה.
הערה: דבורי הדבש במגרש כל משולבים בשלב זה. פרוטוקול זה משתמש שישה מגרשים.
- העברת הפתרון הומוגני רקמה לרקמת הבא במגרש, homogenize את הרקמה באופן זהה.
- להוסיף 30 µL של המאגר המגון.
- Centrifuge דגימת הרקמות הומוגני 10 דקות כ 900- g27 ו- 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL ו- centrifuge זה שוב למשך 20 דקות כ 9500- g27 ו- 4 מעלות צלזיוס.
- מקם את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL. לאחסן את homogenate ב-20 ° C עד השימוש.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. - לקבוע ריכוז חלבון באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו.
- למהול 2.5 µL של homogenate עם µL 17.5 מים סטיריליים (ובכך דילול של homogenate עיר אסורה כאנסאר) ולהשתמש את כל homogenate מדולל.
הערה: דגימה homogenate באמצעות micropipette יש לבצע בזהירות בגלל צמיגות גבוהה שלה. - ביצוע וזמינותו BCA שימוש 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 ו- 2.0 mg/mL של אלבומין שור (BSA) ב- 20 µL באמות מידה.
הערה: שינוי קנה המידה של BCA וזמינותו לפי הצורך, בהתבסס על הנפח של homogenate ודוגמאות סטנדרטי. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.
- למהול 2.5 µL של homogenate עם µL 17.5 מים סטיריליים (ובכך דילול של homogenate עיר אסורה כאנסאר) ולהשתמש את כל homogenate מדולל.
4. בקר לוגי מיתכנת תגובה Homogenates מוח
- להכין הפתרון מניות של fluorogenic המצע WH-1526 מומס במים סטיריליים-50 µmol/L, לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: לכסות את הפתרונות המכיל את המצע בנייר כסף כדי למנוע דהייה. - להכין את התגובה premixture באמצעי האחסון הנדרש כדי להשיג את הרכב הבא ב- 10 µL תערובת התגובה: 50 mmol/L HEPES-קו (pH 7.2), 70 mmol/L אשלגן כלורי, 1.0 mmol/L CaCl2, dithiothreitol 2.0 mmol/L, 50 מ"ג/ליטר BSA, 12.5 µmol/L מ- 15.
- לדלל את homogenate עם המגון מאגר, אם נדרש.
- מערבבים את התגובה premixture ואת homogenate המכיל µg 1.3 של חלבונים בצינור פולימראז תגובת שרשרת (PCR) כדי להשיג נפח סופי של µL 10 תערובת התגובה.
- להכין שני סוגי תערובות הבקרה עבור ניתוח סטטיסטי: לשים את homogenate אבל לא מ- 15 לתערובת (שליטה תערובת 1), ולהיפך (שליטה תערובת 2).
הערה: להכין את תערובות התגובה תערובות שליטה על קרח כדי למנוע השפלה חלבון ותגובה של PLC. תערובות בקרה 1 ו- 2 משמשים לגילוי קרינה פלואורסצנטית homogenate, המצע חינם, בהתאמה.
- להכין שני סוגי תערובות הבקרה עבור ניתוח סטטיסטי: לשים את homogenate אבל לא מ- 15 לתערובת (שליטה תערובת 1), ולהיפך (שליטה תערובת 2).
- ועצירה הצינור של דגירה זה ב הצנטרפוגה תרמי למשך 30 דקות ב 25 º C.
- לעצור את התגובה על-ידי הוספת 2 µL של mmol/L 25 אתילן גליקול bis (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic.
הערה: כמויות חלבון המתאים ואת זמני התגובה להשתנות בין ניסויים. לפיכך, כדי למטב את תנאי התגובה, יתכן צורך לחזור ההליכים המתוארים בשלבים 4.1-5.3 בניסויים ראשוני על-ידי שינוי חלבון כמות, דגירה הזמן עד פלורסצנטיות מגדילה באופן ליניארי. לעיון, כאשר משמשת את homogenate נגזר על אזורים אחרים של המוח, התגובה בדרך כלל עובד באופן ליניארי עם 1.3 µg או פחות של חלבונים בתוך 30 דקות, אבל על ליניאריות פוחתת לפחות 2.7 µg של חלבונים או עם זמן הדגירה של 90 דקות או הלאו הציעו.
5. זיהוי של זריחה כתוצאה מפעילות בקר לוגי מיתכנת
- Centrifuge את תערובת התגובה ותערובות הבקרה עבור 5 דקות כ 310 x g28 ולהעביר µL 10 של תגובת שיקוע וולס שונים על microplate 384-ובכן ישים לגילוי קרינה פלואורסצנטית.
הערה: כדי למנוע דהייה, זיהום עם אבק, כיסוי לצלחת עם נייר כסף. - לרוקן את microplate באמצעות צנטריפוגה microplate.
- הגדר את הצלחת לקורא microplate, לזהות קרינה פלואורסצנטית עם עותק משולש טכני.
הערה: עירור, פליטה אורכי הגל הן 344 nm ו 530 ננומטר, בהתאמה. אם רלוונטי (בהתאם לקורא microplate), מערבבים את תערובות מדגם 5 s לפני כל זיהוי. הפרוטוקול ניתן לעצור כאן.
6. בדיקה של הפעולה המעכבת של סוכנים תרופתי
- להכין מלאי פתרונות של edelfosine ושל neomycin בריכוזים המתאימים ולאחסן אותם עד לשימוש: edelfosine 5.0 mmol/L ו-20 ° C; neomycin 550 mmol/L ו 4 מעלות צלזיוס.
- בעת הכנת את התגובה premixture כפי שמתואר בשלב 4.2., להוסיף premixture כדי להשיג את ריכוזי הסופית המתאימה מעכבי: edelfosine, 1.0 mmol/L; neomycin, 0.55 mmol/ל'
- הוסף את homogenate התגובה premixture ושליטה המתאימות תערובות כמו שלב 4.4.
- הכינו שלושה סוגי תערובות שליטה: לשים את homogenate, מעכב, אך לא את המצע לתערובת בקרה 1; הוסף את המצע, מעכב אבל לא את homogenate לתערובת שליטה 2; לשים את החומר המדכא, אבל לא את homogenate או המצע לתערובת שליטה 3.
- לבצע את התגובה PLC וזיהוי של קרינה פלואורסצנטית כמתואר בצעדים 4.5-5.3.
7. ניתוח סטטיסטי
- איתור PLC שתסגרו את תערובות המתוארות בסעיף 4, לחשב את קרינה פלואורסצנטית נגזר מן התגובה בין בקר לוגי מיתכנת המצע על-ידי חיסור של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים את homogenate או את המצע חינם כדלקמן.
פל (פעילות בקר לוגי מיתכנת) = Fl (מיקס. התגובה) {פל (ctrl 1) + חליל (ctrl 2)}
הערה: פל (פעילות PLC), חליל (התגובה mix), חליל (ctrl 1) וחליל (ctrl 2) מציינות פלורסצנטיות bona פיד ה הנגזרים מפעילות PLC, קרינה פלואורסצנטית זוהה תערובת התגובה, וכן תערובות בקרה 1 ו- 2, בהתאמה.- לאחר מדידת קרינה פלואורסצנטית ב תערובות כמתואר בצעדים 4.1-5.3, לחשב פל (פעילות בקר לוגי מיתכנת) לפי המשוואה בשלב 7.1, ולאחר מכן הממוצע פל (פעילות PLC) של שהפקידים טכני עבור כל homogenate.
- באמצעות הרצ רשע (פעילות PLC) של שהפקידים טכני שהושג בשלב 7.1.1, לחשב שוב לדגל לפני רשע (פעילות PLC) של משכפל הביולוגי של MBs ואזורים אחרים במוח ולהשוות את הערכים בין הרקמות במוח.
- לבחינת פעילות PLC בנוכחות מעכבי שימוש את תערובות המתוארות בסעיף 6, לחשב את קרינה פלואורסצנטית נגזר מן התגובה בין homogenate, המצע, מעכב כדלקמן.
פל (PLC פעילות עם מעכב) = Fl (מיקס. התגובה) {פל (ctrl 1) + חליל (ctrl 2)} + חליל (ctrl 3)
הערה: כאן, חליל (PLC פעילות עם מעכב) הוא בונה פיד ה פלורסצנטיות כתוצאה מפעילות PLC בנוכחות החומר המדכא. פל (התגובה mix), חליל (ctrl 1), חליל (ctrl 2) חליל (ctrl 3) הן אותות פלורסצנטיות זוהה תערובת התגובה, שליטה תערובת 1, לשלוט תערובת 2, ואת תערובת שליטה 3, בהתאמה.- לאחר מדידת קרינה פלואורסצנטית ב תערובות כמתואר בצעדים 6.1-6.4, לחשב פל (PLC פעילות עם מעכב) לפי המשוואה בשלב 7.2. לאחר מכן, להשיג הרצ רשע (PLC פעילות עם מעכב) של שהפקידים טכני עבור כל homogenate.
- באמצעות את הערך הממוצע שחושבו בצעד 7.2.1, לחשב הרצ רשע (PLC פעילות עם מעכב) של משכפל ביולוגי נגזר כל רקמת המוח. השווה את חליל (PLC פעילות עם מעכב) ואת הרצ (פעילות בקר לוגי מיתכנת) שהושג בשלב 7.1.2 ברקמת המוח כל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ריכוז החלבון בהמוח Homogenates:
הכנו homogenates באמצעות באיסוף דבורים. ריכוז החלבון מחושבים ב- homogenates המקורי מוצגים באיור3. ריכוז החלבון משוער ב homogenate המקורי היו כדלקמן: 1.5 מ"ג/מ"ל ב- MBs ו- 2.3 מ"ג/מ"ל באזורים אחרים במוח. . היינו שני דבורים למנה, שישה מגרשים נותחו.
זיהוי של פעילות PLC Homogenates המוח:
בניסוי פיילוט, הבחנו פלורסצנטיות גבוה יותר באזורים אחרים במוח מאשר MBs. לכן, אנו חזר על הניסויים ראשוני באמצעות את homogenate של האזורים במוח אחרות, לקבוע את זמן התגובה (קרי, 30 דקות) ואת כמות חלבון (קרי, 1.3 µg). התוצאה של התגובה בתנאים אלה מוצג באיור 4א. הציג תערובות התגובה המכיל רקמות homogenate והן את המצע fluorogenic > 4.2-fold זריחה גבוה יותר מאשר תערובות פקד את homogenate רקמות או המצע fluorogenic, רומז שהיה PLC פעילות הכוללת זוהה תערובות התגובה. קרינה פלואורסצנטית היחסי היה כ 3.4-fold גבוה יותר באזורים אחרים במוח מאשר MBs (איור 4B).
ניתוח ההשפעה המעכבת של סוכנים תרופתי בפעילות PLC:
כדי לבחון את ההשפעה של פאן-PLC מעכבי edelfosine ו- neomycin על פעילות PLC, ביצענו את התגובה בנוכחות edelfosine mmol/L 1.0 או 0.55 mmol/L neomycin, באמצעות את homogenate אותו כפי שנותחו לעיל. בנוכחות edelfosine, רמת קרינה פלואורסצנטית ירד כ 6.0% ו- 5.4% ב- MBs ואזורים אחרים במוח, בהתאמה, בהשוואה פקדים ללא edelfosine (איור 4C). טיפול neomycin מופחת רמת קרינה פלואורסצנטית 44% ו-20% השולט של לא מטופל ב- MBs ואזורים אחרים במוח, בהתאמה (איור 4D).
איור 1 : לכידת הונאיבי באיסוף. באיסוף לחזור לכוורת שלה נלכד ברשת חרקים, היא הייתה מרותקת לתוך צינור חרוטי פלסטיק 50-mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ייצוג סכמטי של ההליך לנתיחה. צירים (A) של המוח הונאיבי מצויה בפרוטוקול מוצגים. הדבורה מהראש לבית החזה הקדמי הוא במבט הצד הלטראלי. (B - K) תמונות ואיורים של ההליכים לנתיחה מוצגים. לראות את הטקסט העיקרי לקבלת פרטים. מוצג רק בראש של דבורת הדבש. המחשה של tracheae מושמט. MBs = גופות פטריות. פסי בקנה מידה מתאימות כדי 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ריכוז חלבון בתוך רקמת המוח homogenates. ריכוז חלבון ב homogenates המקורי היו נמדדת BCA assay, מחושב. הריכוזים כלומר עם סטיות תקן מוצגים. שני דבורים באיסוף שימשו כל לוט, שישה מגרשים נותחו. MBs = גופות פטריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : זריחה זוהה תגובות. (א) זו זריחה מראה החלונית כל רקמה עם או בלי fluorogenic את המצע. התגובה בוצע במשך 30 דקות באמצעות µg 1.3 של חלבון. קרינה פלואורסצנטית נמדדה על ידי הקורא microplate. הערכים של הבארות מדגם באמצעות בארות ריק והם תוקנו שמוצג ביחידות שרירותי (שעון). (B) חלונית זו מציגה השוואה של זריחה בין רקמות המוח. הנתונים בלוח א והם תוקנו לתערובות שליטה על-ידי חיסור מנורמל על ידי ידי קרינה פלואורסצנטית מחושב MBs. * P < 0.005, בדיקת U של מאן-ויטני. C ו- D מראות פלורסצנטיות היחסי בנוכחות edelfosine 1.0 mmol/L (ג) ו- (ד) 0.55 mmol/L neomycin. Homogenates אותו בשימוש לוחות A ו- B נותחו. קרינה פלואורסצנטית הערכים היו מנורמל על ידי התוצאות של הניסוי שליטה ללא סמים לטיפול בכל רקמה. הנתונים של תגובות הבקרה בחלונית C יהיו זהים לאלה פאנל B. בחלונית ' D, כל homogenates נותחו שוב בניסוי שונים. מוצגים הערכים פלורסצנטיות מרושע עם סטיות תקן. שני דבורים שימשו כל לוט, שישה מגרשים נותחו. P < 0.05, Wilcoxon הדרגות חתם על הבדיקה. אין Hg = תערובת בקרה אשר אינו מכיל homogenate; MBs = גופות פטריות. לוחות B - D שונו מ. Suenami et al. 24 באישור ההוצאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בחינה הביוכימי של פעילות החלבון חשוב עמוקות להבנת איתות מולקולרית במוח, כי הפעילות של אנזים מושפע מולקולות שונות, כגון מצעים, מעכבי, ולשנות, לפיכך, יחד עם התנהגות בעלי חיים (למשל, למידה וזיכרון)5. במחקרים הונאיבי, אנזימים כגון מחזורי AMP תלוית חלבון קינאז A, מחזורי GMP תלוית חלבון קינאז, PKC, phosphorylated CaMKII אדנילאט cyclase מדווחים לבוא לידי ביטוי באופן שונה באזורים שונים של המוח. בהתבסס על אימונוהיסטוכימיה5,10,29,30,31. הבדלים בפעילות אנזימטי בין אזורים במוח, אולם, הם רק באופן חלקי דווח על6. כאן, אנחנו תיאר נוהל מפורט עבור איתור פעילות PLC של הערכת ההשפעות המעכבת של סוכנים תרופתי ב- MBs ואזורים אחרים במוח.
ישנם כמה גורמים אפשריים המפריעים לזיהוי קרינה פלואורסצנטית. ראשית, חשוב על החלבון מפני השפלה, בעת ביצוע מבחני הביוכימי. בפרוטוקול המתוארים כאן, נדרשים ניתוח מהיר וקופא של המוח. מומלץ כי דגימות רקמה קפוא ומאוחסנים מיד לאחר כל מחזור של ניתוח. וצמצום של מחזור להפשיר/להקפיא homogenate גם הוא חיוני כדי למנוע את ההתדרדרות של החלבון.
בנוסף חלבון השפלה, רקע זריחה, ספיגת בתערובת התגובה עלולה להשפיע על התוצאות במערכת assay, כי פעילות PLC מאותרים על ידי אות זריחה. לדוגמה, neomycin מומס במים יש צבע צהוב המשפיעה על זיהוי קרינה פלואורסצנטית. למרות שהשתמשנו 0.55 mmol/L neomycin, לדילול 1000-fold הפתרון מניות, אופטימיזציה נוספת של הריכוז עשוי להידרש. יתר על כן, זיהום על ידי רקמות אחרות עשויים גם להשפיע את התוצאה. הרשתית, אשר מזהה גירויים חזותיים, מכיל פיגמנטים, כוללת סוג אחד של רקמות המפריע פוטנציאל וזמינותו.
עם הפרוטוקול הנוכחי, הבחנו פעילות PLC גבוה יותר באזורים אחרים במוח מאשר ב- MBs24. זה היה עולה בקנה אחד עם התוצאה של כמותיים ניתוח PCR הפוכה-שעתוק, אשר חשף כי MBs מביעים רמות גבוהות יותר של גנים PLC מאשר אחרים רקמות המוח24. סתירה זו עשוי לנבוע מ- 15, אשר הוא המצע לתרשים26, ואת העובדה כי אנחנו? לא להבחין ממברנה ושברים cytosolic של homogenates המוח. בהתחשב בכך PLCβ ו- PLCε הם אנזימים הקשורים ממברנה32 ו יכול לקיים אינטראקציה עם המצע2 פיפס אנדוגני, הסכום של השבר ממברנה ב homogenate סביר משפיע על התגובה בין בקר לוגי מיתכנת WH-15. הסבר נוסף הוא כי ריכוז PLC עשוי להיות גבוה יותר באזורים אחרים במוח מאשר ב- MBs בשל הבדלים בשיעורי הפקה ו/או השפלה חלבון. לפיכך, חייב להיות מובהר bona פיד ה PLC פעילות במוח עוד יותר על ידי ניסויים נוספים, כגון באמצעות מצע חדש דיווחו לאחרונה שולב ממברנה33, ניתוח הפעילות של ממברנה-הקשורים ו cytosolic בקרים מתוכנתים בנפרד, או לכימות התוכן של בקרים מתוכנתים או פיפס2 ב כל רקמת המוח.
ניקח נקודות הנ ל בחשבון, ניתן להרחיב מערכת assay PLC המתוארים כאן כדי למדוד פעילות PLC ברקמות שונות לא העריך, כגון מערכת העיכול, שרירים וכן איבר הרבייה. זה גם אפשר להשוות PLC פעילות בין מוחותיהם של באיסוף הדבורים האחות כדי להעריך את מעורבותם של פעילות PLC תפקידים חברתיים שונים.
באופן כללי, מערכת assay המובאת כאן היא אופציה אפשרית עבור מזהה פעילות PLC רקמת homogenates, כי זה יכול להתבצע עם ציוד מעבדה סטנדרטיים, בזמן בגישה המסורתית באמצעות פיפ radiolabeled2 דורש התמחות מתקני אימונים, ציוד רדיואיזוטופים. מנצל המערכת עם עוד שינויים יעמיק את הבנתנו המנגנונים המולקולריים שבבסיס התנהגות מורכבת של דבורת הדבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
איור 4B - 4 D היה שונה. Suenami et al. 24 באישורו של ביולוגיה פתוח. המחברים מודים למפרסם את ההרשאה. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע לתוכנית (RGY0077/2016) שותא Suenami, ריו מיאזאקי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
