Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee

Published: September 14, 2018 doi: 10.3791/58173
Automatic Translation
1,2, 1, 2
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

For å teste hemmende effekten av farmakologisk agenter på fosfolipase C (PLC) i ulike regioner av honeybee hjernen, presenterer vi en biokjemiske analysen for å måle PLC aktivitet i disse regionene. Denne analysen kan være nyttige for sammenligning PLC aktivitet blant vev, og bier viser forskjellige virkemåter.

Abstract

Honeybee er en modell organisme for å vurdere komplekse atferd og høyere hjernefunksjon, for eksempel læring og hukommelse arbeidsdeling. Sopp kroppen (MB) er en høyere hjernen center foreslått å være nevrale underlaget komplekse honeybee atferd. Selv om tidligere studier identifisert gener og proteiner som er ulikt uttrykt i MBs og andre områder av hjernen, er aktiviteter proteinene i hver region ennå ikke fullt ut forstått. For å vise funksjonene av disse proteinene i hjernen, pharmacologic analyse er en mulig tilnærming, men det er først nødvendig for å bekrefte at pharmacologic manipulasjoner faktisk endre protein aktiviteten i disse områder av hjernen.

Vi tidligere identifisert en høyere uttrykket av gener som koder fosfolipase C (PLC) i MBs enn i andre områder av hjernen og vurdert farmakologisk involvering av PLC i honeybee atferd. I denne studien, vi biokjemisk testet to pharmacologic agenter og bekreftet at de redusert PLC aktivitet i MBs og andre områder av hjernen. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av hvordan oppdage PLC aktivitet i honeybee hjernen homogenate. I denne analysen system, homogenates avledet fra forskjellige hjernen regioner er reagerte med en syntetisk fluorogenic substrat og fluorescens skyldes PLC aktivitet er kvantifisert og forhold mellom områder av hjernen. Også beskriver vi våre evaluering av hemmende effekten av visse legemidler PLC aktivitet bruker samme system. Selv om dette systemet er sannsynligvis påvirket av andre endogene fluorescens forbindelser og/eller absorbansen analysen komponentene og vev, måling av PLC aktivitet med dette systemet er tryggere og enklere enn det benytter tradisjonelle analysen, som krever radiolabeled underlag. Enkel prosedyre og manipulasjoner tillate oss å undersøke PLC aktivitet i hjernen og andre vev av honeybees involvert i ulike sosiale aktiviteter.

Introduction

Europeiske honeybee (APIene mellifera L.) er et eusocial insekt kvinnelige bier Vis caste-avhengige reproduksjon og alder-avhengige arbeidsdeling. For eksempel i sterilt kastesystemet av bier referert til som "arbeidere", mate yngre enkeltpersoner de han funderer mens eldre grovfôr nektar og pollen utenfor strukturen1. Læring og hukommelse evne er kritisk viktig i livet til honeybee, fordi sankere må gjentatte ganger går frem og tilbake mellom mat kilder og deres reir og deretter kommunisere plasseringen av god mat kilder til deres nestmates gjennom dans kommunikasjon1. Tidligere studier har vist at MB, en høyere hjernen sentrum i insekter, er involvert i læring og hukommelse evne til honeybee2,3,4. Ulikt uttrykt gener og proteiner er blitt identifisert i ulike områder av hjernen av honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, noe som tyder på at de er knyttet til unike funksjoner av hver hjernen regionen. Men farmakologisk hemming eller aktivering av et protein av interesse er en godt brukt tilnærming til avsløre funksjonen av protein i honeybee atferd12,13,14, er det ukjent om alle medisiner har funksjonelle effekter i ulike områder av honeybee hjernen. Validering av funksjonene til slike legemidler vil styrke konklusjonene i studier av atferdsmessige farmakologi.

Her fokusere vi på PLC, en av enzymer innblandet i musen kognisjon15,16,17,18. PLC utløser kalsium signalering av nedverdigende phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inn inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 åpner IP3 reseptorer på det endoplasmatiske retikulum (ER), fører til utgivelsen av kalsiumioner fra ER. Utgitt kalsium aktiverer både kalsium/calmodulin-avhengige protein kinase II (CaMKII) med calmodulin og protein kinase C (PKC) i nærvær av DAG. Begge protein kinaser er involvert i læring og hukommelse22,23, konsekvent med involvering av PLC i denne prosessen. Foretak kategoriseres subtyper, inkludert PLCβ, PLCγ og PLCε, basert på deres strukturer20. Hver PLC undertype aktiveres i en annen sammenheng20, og gener som koder de subtyper uttrykkes ulikt i forskjellige vev. Vi viste tidligere at honeybee MBs express gener som koder PLCβ og PLCε subtyper på høyere nivå enn de resterende hjerne regioner24og at to pan-PLC hemmere (edelfosine og neomycin sulfate [neomycin]) redusere PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner og, faktisk, påvirke læring og hukommelse evne til honeybee24.

Tradisjonelt har den enzymatiske aktiviteten PLC blitt målt med radiolabeled PIP225, som krever hensiktsmessig opplæring, utstyr og fasiliteter. Nylig, et syntetisk fluorogenic substrat plc har vært etablert26, gjør det enkelt å vurdere PLC aktivitet i standard laboratoriet. Her presenterer vi en detaljert protokoll å oppdage PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner i honeybee bruker fluorogenic underlaget og deretter teste hemmende effekten av edelfosine og neomycin på PLC i disse vev. Fordi protokollen krever bare grunnleggende manipulasjoner, kan det være aktuelt å studier av PLC aktivitet i andre vev eller hjernen områder i bier tildelt forskjellige sosiale aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ta av Foraging Honeybees

  1. Kjøpe honeybee kolonier fra en forhandler.
  2. Bruker et insekt nettet, fange forager bier som til strukturen med pollen poser på deres bakben ben. Overføre bier til en standard 50 mL plast konisk rør og lue røret (figur 1). Legge røret på is til å bedøve bier.
    Merk: Bruk de angitte Jakkene for birøkt å unngå bie stikk. Sykepleie bier kan også samles avhengig av eksperimentet. For å fange sykepleier bier, observere bee's opptreden på voks kam og fange sykepleier bier, som dytte hodet i Foreldreomsorg og yngelens celler å mate larvene, av vingen eller syn ved hjelp av pinsett. Deretter plassere bier til en 50-mL plastrør, cap røret og sette det på is som nevnt i trinn 1.2.
  3. Fange 12 sankere tilfeldig.
    Merk: Denne protokollen bruker to bier per mye, noe som resulterer i seks mange. Flere bier kan være fanget i en tube, og antall bier i et enkelt rør er ikke viktig, som bier i hver mye kombineres senere (se trinn 3.1.1). Holde røret kjølig om sommeren som den høye temperaturen i røret skader bier.

2. Disseksjon av Honeybee hjernen

  1. I laboratoriet, plass 50 mL røret på is minst 30 min6 til bedøve bier.
  2. For å forberede disseksjon scenen, brett et stykke dental voks i to (resulterende størrelsen er ca 3,5 x 7,5 cm) og skyv det inn en plast rett (60 x 15 mm).
    Merk: Brettet voksen holder fast insekt pinnene.
  3. Under en kikkert mikroskop, skille bee's head fra kroppen med pinsett og fikse det på dental voks ved å sette inn insekt pinnene på bunnen av hver antenne holde det fremre hodet i en oppadgående posisjon (figur 2A).
    Merk: Vask pinsett før bruk, etanol eller sterilisert vann.
  4. Hell nok saltvannsoppløsning (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl og 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) på hodet for å dekke. Pierce hodet igjen med pinnene hvis hodet flyter i løsningen. Bruk en iskald saltvann, om nødvendig.
    Merk: Denne protokollen fungerer imidlertid uten kaldt saltvann.
  5. Fjerne antenner ved hjelp av pinsett (figur 2B).
  6. Gjøre en horisontal kuttet nær baser av antenner og langs grensen til den sammensatte øynene, bruke en skalpell. Deretter lage en vannrett kutt på toppen av hodet. Fjerne cuticle å åpne et vindu over hjernen (figur 2C).
    Merk: Hvis det er nødvendig, vask skalpell med etanol eller sterilisert vann før bruk.
  7. Fjerne retinae fra ocelli og tracheae i fremre overflaten av hjernen, ved hjelp av pinsett (figur 2D).
  8. Utvid kutt på grensen til den sammensatte øynene på ryggen og ventrally, bruker skalpell (figur 2E). Deretter fjerne bindevev mellom styrke den sammensatte øynene og retinae ved å sette inn pinsett direkte under øyet cuticle (figur 2F).
  9. Kast styrke den sammensatte øynene. Velg dorsal tips av retinae av den sammensatte øynene med pinsett og flytte pinsett i ventrale retning å nøye skrelle av retinae (figur 2G).
  10. Forsiktig fjerne de gjenværende tracheae i fremre overflaten av hjernen, ved hjelp av pinsett (figur 2H).
  11. Skjær bindevevet mellom hjernen og rundt vev, ved hjelp av pinsett, og dissekere hjernen fra hodet kapselen (figur 2H).
  12. Løsner tracheae på bakre overflaten av hjernen, ved hjelp av pinsett (figur 2jeg).
  13. Bruker en skalpell, kuttet forbindelsen mellom MBs og andre områder av hjernen ved loddrette lobes, som er en del av MBs (figur 2J).
  14. Sted dissekert MBs og gjenværende hjernen vev i 1,5-mL rør og raskt fryse dem med tørris eller flytende nitrogen (figur 2K). Lagre frosne vev ved-80 ° C før bruk.
    Merk: Håndtere flytende nitrogen med den angitte hansker og ventilasjon for å unngå kalde brenne og kvelning. Tørris bør også håndteres forsiktig med hansker. Protokollen kan pauses her. Disseksjon og lagring av hjernen vev skal være utført en bee å unngå protein fornedrelse.

3. forberedelse av hjernen Homogenates

  1. Legge til 10 µL av homogenisering buffer består av 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L KCl og 1,0 mmol/L CaCl2 til den frosne hjernen vev og homogenize vevet i 1,5-mL tube ved manuelt å legge press med en plast støter. Hjerneslag vevet minst 200 x.
    Merk: Utføre manipulasjoner beskrevet i del 3 på is. Bruke en støter passer rett i røret å knuse tilstrekkelig vev, som lett flyte i homogenisering bufferen.
    1. Overføre homogenisert vev løsningen til neste vev i mye og homogenize vev på samme måte.
      Merk: Honeybees i hver mye kombineres på dette trinnet. Denne protokollen bruker seks mye.
  2. Legge til 30 µL av homogenisering bufferen.
  3. Sentrifuge homogenisert vev utvalget for 10 min på ca 900 x g27 og 4 ° C.
  4. Overføre nedbryting til en ny 1.5-mL tube og sentrifuge det igjen etter 20 min på ca 9500 x g27 og 4 ° C.
  5. Plass nedbryting i en ny 1.5-mL tube. Lagre homogenate på 20 ° C før bruk.
    Merk: Protokollen kan pauses her.
  6. Bestemme protein konsentrasjonen med bicinchoninic syre (BCA) analysen.
    1. Fortynne 2,5 µL av homogenate med 17,5 µL sterilisert vann (dermed diluting homogenate åtte ganger) og bruke alle utvannet homogenate.
      Merk: Utvalg homogenate ved hjelp av brønnene må utføres nøye på grunn av dens høy viskositet.
    2. Utføre BCA analysen bruker 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1.0 og 2,0 mg/mL av bovin serum albumin (BSA) i 20 µL som standarder.
      Merk: Endre omfanget av BCA analysen etter behov, basert på volum av homogenate og standard prøver. Protokollen kan pauses her.

4. PLC reaksjon i hjernen Homogenates

  1. Klargjør lager løsning av fluorogenic substrat WH-1526 oppløst i steriliserte vann på 50 µmol/L og lagre den på-80 ° C.
    Merk: Dekk løsningene som inneholder underlaget med folie å hindre falming.
  2. Forberede reaksjon premixture i et bestemt volum å oppnå følgende sammensetning i 10 µL av reaksjonsblandingen: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L KCl, 1.0 mmol/L CaCl2, 2.0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA og 12,5 µmol/L WH-15.
  3. Fortynn homogenate med homogenisering buffer, hvis nødvendig.
  4. Bland reaksjon premixture og homogenate som inneholder 1.3 µg proteiner i et utvalg kjedereaksjon (PCR) rør å oppnå et endelig antall 10 µL av reaksjonsblandingen.
    1. Forberede to typer kontroll blandinger for statistisk analyse: sette homogenate men ikke WH-15 i blanding (kontroll blanding 1), og omvendt (kontroll blanding 2).
      Merk: Forberede reaksjon blandinger og kontroll blandinger på is for å hindre protein fornedrelse og reaksjon plc. Kontroll blandinger 1 og 2 brukes til å oppdage fluorescens fra homogenate og gratis underlaget, henholdsvis.
  5. Tømme røret og Inkuber det i en termisk cycler i 30 min på 25 ° C.
  6. Stoppe reaksjonen ved å legge til 2 µL av 25 mmol/L etylenglykol bis (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre.
    Merk: Riktig protein beløp og reaksjonstid varierer mellom eksperimenter. Dermed, for å optimalisere betingelsen reaksjon, det kan være nødvendig å gjenta prosedyrene som er beskrevet i trinnene 4.1-5.3 i foreløpige eksperimenter ved å endre protein beløp og inkubasjon tiden til fluorescensen øker lineært. For referanse, når homogenate avledet fra de andre hjernen områdene, reaksjonen fungerer vanligvis lineært med 1,3 µg eller mindre av proteiner i 30 min, men linearitet reduseres enten minst 2,7 µg proteiner eller med en inkubasjon tid 90 min eller lo nger.

5. påvisning av fluorescens skyldes PLC aktivitet

  1. Sentrifuge reaksjonsblandingen og kontroll blandinger for 5 min på ca 310 x g28 og overføre 10 µL nedbryting av forskjellige brønner på en 384-vel microplate gjelder for fluorescens gjenkjenning.
    Merk: For å forhindre falming og en forurensning med støv, dekk platen med folie.
  2. Tømme microplate ved hjelp av en sentrifuge for microplate.
  3. Stille inn platen i en microplate leser og oppdage fluorescens med en teknisk tre eksemplarer.
    Merk: Eksitasjon og utslipp bølgelengdene er 344 nm og 530 nm, henholdsvis. Hvis det er aktuelt (avhengig av microplate leseren), bland eksempel blandinger for 5 før hver gjenkjenning. Protokollen kan stoppes her.

6. test av handlingen hemmende Pharmacologic agenter

  1. Klargjør lager løsninger edelfosine og neomycin på riktig konsentrasjonen og lagre dem til bruk: edelfosine på 5,0 mmol/L og 20 ° C; Neomycin 550 mmol/L og 4 ° C.
  2. Når du forbereder reaksjon premixture som beskrevet i trinn 4.2., legge til hemmere premixture å oppnå de aktuelle siste konsentrasjonene: edelfosine, 1.0 mmol/L; Neomycin, 0.55 mmol/L.
  3. Legge til homogenate til reaksjon premixture og riktig blandinger som i trinn 4.4.
    1. Forberede tre typer kontroll blandinger: inn i homogenate og hemmer, men ikke underlaget kontroll blanding 1; legge til underlaget og hemmer men ikke homogenate i kontrollen blanding 2; og inhibitor, men ikke homogenate eller substrat kontroll blanding 3.
  4. Utføre PLC reaksjon og påvisning av fluorescens som beskrevet i trinnene 4.5-5.3.

7. statistisk analyse

  1. For påvisning av PLC aktivitet bruker blandinger beskrevet i del 4, beregne fluorescens avledet fra reaksjonen PLC og underlaget ved å trekke fluorescens slippes ut fra homogenate eller gratis substrat som følger.

    Fl (PLC aktivitet) = Fl (reaksjon mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
    ​
    Merk: Fl (PLC aktivitet), Fl (reaksjon mix), Fl (ctrl 1) og Fl (ctrl 2) betegne bona fide fluorescens avledet fra PLC aktivitet, fluorescens oppdaget i reaksjonsblandingen og kontroll blandinger 1 og 2, henholdsvis.
    1. Etter måling av fluorescens i blandinger som beskrevet i trinnene 4.1-5.3, beregne Fl (PLC-aktivitet) i henhold til formelen i trinn 7.1, og deretter gjennomsnittet Fl (PLC aktivitet) av den tekniske tre eksemplarer for hver homogenate.
    2. Bruker den mener Fl (PLC aktivitet) av den tekniske tre eksemplarer innhentet i trinn 7.1.1, beregne igjen den mener Fl (PLC aktivitet) av biologiske replikat MBs og andre områder av hjernen og sammenligne verdiene mellom hjernen vev.
  2. Eksamen PLC aktivitet i nærvær av hemmere bruker blandinger beskrevet i del 6, beregne fluorescens avledet fra reaksjonen blant homogenate, substratet, og hemmer som følger.

    Fl (PLC aktivitet med hemmer) = Fl (reaksjon mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)

    Merk: Her, Fl (PLC aktivitet med hemmer) er bona fide fluorescens skyldes PLC aktivitet i nærvær av inhibitor. Fl (reaksjon mix), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) og Fl (ctrl 3) er fluorescens signaler i reaksjonsblandingen, kontroll blanding 1, kontrollerer blanding 2 og kontroll blanding 3, henholdsvis.
    1. Etter måling av fluorescens i blandinger som beskrevet i trinnene 6.1-6.4, beregne Fl (PLC aktivitet med hemmer) i henhold til formelen i trinn 7.2. Deretter få den mener Fl (PLC aktivitet med hemmer) av den tekniske tre eksemplarer for hver homogenate.
    2. Bruker middelverdien beregnet i trinn 7.2.1 Oppgi, beregne den mener Fl (PLC aktivitet med hemmer) av biologiske replikat avledet fra hver hjernevev. Sammenligne Fl (PLC aktivitet med hemmer) og Fl (PLC aktivitet) fikk i trinn 7.1.2 i hver hjernevev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein konsentrasjonene i hjernen Homogenates:
Vi forberedt homogenates bruker forager bier. De beregnede protein konsentrasjonene i den opprinnelige homogenates er vist i Figur 3. De omtrentlige protein konsentrasjonene i de opprinnelige homogenate var som følger: 1.5 mg/mL i MBs og 2,3 mg/mL i andre områder av hjernen. Vi brukte to bier per mye og seks mange ble analysert.

Påvisning av PLC aktivitet i hjernen-Homogenates:
I pilotprosjekt oppdaget vi høyere fluorescens i andre hjernen områder enn i MBs. Derfor vi gjentatte foreløpige eksperimenter med homogenate av andre hjernen regioner og reaksjonstid (dvs., 30 min) og protein beløpet (dvs., 1,3 µg). Resultatet av reaksjonen under disse forholdene er vist i Figur 4A. Reaksjon blandinger som inneholder både vev homogenate og fluorogenic underlaget utstilt > 4.2-fold høyere fluorescens enn kontroll blandinger som inneholder vev homogenate eller fluorogenic underlaget, antyder at PLC aktivitet var oppdaget i reaksjon blandinger. Relativ fluorescens var ca 3.4-fold høyere i andre hjernen områder enn i MBs (Figur 4B).

Analyse av hemmende effekten av farmakologisk agenter PLC aktivitet:
For å undersøke virkningene av den pan-PLC hemmere edelfosine og neomycin PLC aktivitet, utført vi reaksjonen i nærvær av 1.0 mmol/L edelfosine eller 0.55 mmol/L neomycin, bruker de samme homogenate som analyseres ovenfor. I nærvær av edelfosine, hvilket fluorescens redusert til ca 6.0% og 5,4% i MBs og andre områder av hjernen, henholdsvis sammenlignet kontroller uten edelfosine (Figur 4C). Neomycin behandling redusert fluorescens nivået til 44% og 20% som av ubehandlet styrer i MBs og andre områder av hjernen, henholdsvis (Figur 4D).

Figure 1
Figur 1 : Fange en forager honeybee. En forager tilbake til hennes strukturen ble fanget i et insekt nettet, og hun var begrenset til en 50-mL konisk plastrør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk fremstilling av disseksjon prosedyren. (A) aksene av honeybee hjernen nevnt i protokollen vises. Bee fra hodet til fremre thorax vises fra den laterale siden. (B - K) Bilder og illustrasjoner av disseksjon prosedyrer vises. Se hovedteksten for detaljer. Bare hodet på honeybee presenteres. En illustrasjon av tracheae utelates. MBs = sopp organer. Skala barer svarer til 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Protein konsentrasjonene i hjernen vev homogenates. Protein konsentrasjonene i den opprinnelige homogenates ble målt ved BCA analysen og beregnes. Mener konsentrasjonen med standardavvik vises. To forager bier ble brukt for hver mye, og seks mange ble analysert. MBs = sopp organer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Fluorescens oppdaget i reaksjoner. (A) dette panelet viser fluorescens i hvert vev med eller uten fluorogenic substrat. Reaksjonen ble utført for 30 min med 1,3 µg protein. Fluorescens ble målt microplate leseren. Verdiene for eksempel brønnene ble korrigert av Tom brønner og vist i vilkårlig enheter (AUs). (B) dette panelet viser en sammenligning av fluorescens mellom hjernen vev. Dataene i panelet A ble korrigert for kontroll blandinger av subtraksjon og normalisert av den beregnede fluorescensen i MBs. * P < 0.005, Mann-Whitney U test. Paneler C og D viser relativ fluorescens i nærvær av (C) 1.0 mmol/L edelfosine og (D) 0.55 mmol/L neomycin. De samme homogenates brukes i paneler A og B ble analysert. Fluorescens verdiene var normalisert av resultatene av kontroll eksperimentet uten behandling for hvert vev. Dataene i kontrollen reaksjonene i panelet C er det samme som panelet B. I panelet Dble alle homogenates analysert igjen i et annet eksperiment. Mener fluorescens verdiene med standardavvik vises. To bier ble brukt for hver mye, og seks mange ble analysert. P < 0,05, Diversified signert rekkene test. Ingen Hg = kontroll blandingen ikke inneholder homogenate; MBs = sopp organer. Paneler B - D ble endret fra Suenami et al. 24 med utgiverens tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biokjemiske undersøkelse av protein aktivitet er svært viktig for å forstå molekylær signalering i hjernen, fordi aktiviteten til et enzym påvirkes av ulike molekyler, som underlag og hemmere, og kan dermed endre sammen med dyr atferd (f.eks, læring og hukommelse)5. I honeybee studier, er enzymer som syklisk AMP-avhengige protein kinase A, syklisk GMP-avhengige protein kinase, PKC, fosforylert CaMKII og adenylate cyclase rapportert å være ulikt uttrykt i ulike områder av hjernen basert på immunohistochemistry5,10,29,30,31. Forskjeller i enzymatisk aktivitet blant områder av hjernen, men er bare delvis rapportert6. Her beskrev vi en detaljert protokoll for å oppdage PLC aktivitet og vurdere hemmende effekten av farmakologisk agenter i MBs og andre områder av hjernen.

Det er noen mulige faktorer forstyrrer fluorescens gjenkjenning. Først er det viktig å beskytte protein fra fornedrelse når biokjemiske analyser. I protokollen beskrevet her, kreves en rask disseksjon og frysing av hjernen. Det anbefales at vevsprøver er frosset og lagret snart etter hver syklus av disseksjon. En minimering av tine/Frys syklusen av homogenate er også avgjørende for å hindre at protein.

I tillegg til protein fornedrelse, bakgrunn fluorescens og absorbansen i reaksjonsblandingen kan påvirke resultatene i analysen systemet, fordi PLC-aktiviteten er registrert av et fluorescens signal. For eksempel har neomycin oppløst i vann en gul farge som påvirker fluorescens gjenkjenning. Selv om vi 0.55 mmol/L neomycin, en 1000-fold fortynning av lager løsningen, kan det hende at en ytterligere optimalisering av konsentrasjon nødvendig. Videre kan forurensning av andre vev også påvirke sluttresultatet. Netthinnen, som oppdager visuelle stimuli og inneholder pigmenter, består av en vev type som potensielt forstyrrer analysen.

Med dagens protokollen oppdaget vi høyere PLC aktivitet i andre hjernen områder enn i MBs24. Dette var uforenlig med resultatet av kvantitative omvendt-transkripsjon PCR analyse, som viste at MBs uttrykke høyere nivåer av PLC gener enn andre hjernen vev24. Denne selvmotsigelse kan skyldes WH-15, som er en frittflytende substrat26, og det faktum at vi ikke skille mellom membran og cytosolic deler av hjernen homogenates. Tatt i betraktning at PLCβ og PLCε er membran-assosiert enzymer32 og samvirke med endogene PIP2 underlaget, påvirker mengden av membran brøken i homogenate sannsynlig reaksjonen PLC og WH-15. En annen mulig forklaring er at PLC konsentrasjonen kan bli høyere i andre hjernen områder enn i MBs skyldes forskjeller i protein produksjon og/eller degradering priser. Derfor bona fide PLC aktivitet i hjernen avklares videre av flere eksperimenter, som ved hjelp av en nylig rapportert nye substrat innlemmet i membranen33, analysere membran-assosiert og cytosolic Foretak separat, eller kvantifisere innholdet i foretak eller PIP2 i hver hjernevev.

Tar de ovennevnte punktene hensyn, kan PLC analysen systemet beskrevet her utvides for å måle PLC aktivitet i ulike vev ikke vurdert her som fordøyelseskanalen, muskel og reproduktive organ. Det er også mulig å sammenligne PLC aktivitet mellom hjernen til forager og sykepleier bier evaluere involvering av PLC aktivitet i ulike sosiale roller.

Samlet er analysen systemet presenteres her et mulig alternativ for oppdage PLC aktivitet i vev homogenates, fordi det kan utføres med standard laboratorieutstyr, mens en tradisjonell tilnærming bruker radiolabeled PIP2 krever spesialiserte fasiliteter, trening og utstyr for radioisotopes. Dra nytte av systemet med ytterligere modifiseringer vil utdype vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende honeybee's kompleks oppførsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Figur 4B - 4 D ble endret fra Suenami et al. 24 med tillatelse fra biologi åpen. Forfatterne er takknemlig til utgiveren for tillatelse. Dette arbeidet ble støttet av den menneskelige Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami og Ryo Miyazaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227 The reagent kit for measurement of protein concentration
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL ThermoFisher Scientific 23209 The standard samples used in BCA assay
Paraffin wax GC 13B1X00155000141 Dental wax used as dissection stage
Insect pin Shiga No. 0 Stainless, solid head
PLCglow KXT Bio KCH-0001 A fluorogenic substrate of PLC
384-well microplate Corning 4511 Low-volume, round-bottom plate in black color
Gemini EM microplate reader Molecular Devices
Edelfosine Santa Cruz Biotechnology sc-201021 pan-PLC inhibitor
Neomycin sulfate Santa Cruz Biotechnology sc-3573 pan-PLC inhibitor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
  2. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
  3. Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
  4. Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
  5. Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
  6. Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
  7. Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
  8. Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
  9. Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
  10. Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
  11. Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
  12. Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
  13. Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
  14. Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
  15. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  16. Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
  17. Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
  18. Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
  19. Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
  20. Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
  21. Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
  22. Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
  23. Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
  24. Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
  25. Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
  26. Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
  27. Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
  28. Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
  29. Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
  30. Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
  31. Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
  32. Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
  33. Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).

Tags

Biokjemi problemet 139 insekt honeybee hjernen sjampinjong kroppen farmakologi fosfolipase C biokjemi
Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suenami, S., Miyazaki, R., Kubo, T.… More

Suenami, S., Miyazaki, R., Kubo, T. Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee. J. Vis. Exp. (139), e58173, doi:10.3791/58173 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter