Summary
アルドステロンの連続リリースで、動脈硬化の食事と飼育アポ-/-マウスの大動脈における動脈硬化を誘発するプロトコルについて述べる。プラークの組成の同定手法について述べる。
Abstract
動脈硬化は、血管内皮細胞に影響を与える慢性的な炎症反応によるもので、高血圧、高脂血症、糖尿病などいくつかの要因によって促進されます。日には、心血管疾患の開発のための危険因子としてのアルドステロンを循環させるための役割を支持する証拠があります。トランスジェニック マウス モデルは、動脈硬化につながる細胞および分子プロセスの研究に生成されています。本稿では、アポ-/-マウスでアルドステロンの連続的な注入の利点を受け取り、治療の 4 週間後大動脈で動脈硬化性プラークを生成するプロトコルについて述べる。我々 は、したがって、定量化及び大動脈レベルでアテローム性動脈硬化病変の評価のための方法を示しています。アルドステロン注入の付加価値は、脂質や炎症性細胞の豊富な動脈硬化病変の治療の 4 週間後の世代で表されます。我々 は詳細にプラークの中で脂質とマクロファージの含量を定量化する染色の手順を説明します。特に、このプロトコルでは、心臓組織の抗原性を保持し、興味の抗原の検出を容易にするために 10 月に組織埋め込む心を実行します。プラーク表現型の分析は、動脈硬化の進展の病態を検討し、抗動脈硬化薬の開発のための新しい薬理学的ターゲットを識別するために有効なアプローチを表します。
Introduction
動脈硬化症は、死亡率と罹患率世界1の主要な原因の一つです。それは、血管が脂質と動脈硬化性プラークの形成を決定する白血球で潜入している慢性炎症状態が特徴です。急性の心臓イベントの大半は、プラークの破裂による血栓性イベントに関連付けられます。破裂しやすいプラークは、「傷つきやすい」定義され、プロ炎症性白血球、壊死性コアと薄い線維性被膜2の高められた浸透によって特徴付けられます。最後の十年では、臨床的および実験的研究は、病気の複雑な病態を明らかにしました。いくつかの動物モデルは、アテローム性動脈硬化3の誘導に関与する分子メカニズム解明のために使用されます。現在、マウスは人間と比較してその病態における既存のいくつかの種特異的な違いにもかかわらずアテローム性動脈硬化を勉強する最も頻繁に使用される種であります。特に、コレステロールを循環主にで構成される高密度リポタンパク質 (antiatherogenic プロパティ) を持つマウス モデルで人間を主に低密度リポタンパク質 (LDL) として運ばれるコレステロールを循環しながらおそらくなぜ、野生型マウスの自発性動脈硬化4を開発しない主な理由を表します。さらに、野生型マウスが約食餌療法のコレステロール4の 50% を吸収する人間に対し一般的に食事からのコレステロールの吸収に耐性。これらの制限を克服するためにいくつかの遺伝子組み換えマウス モデルが生成されています。アポ E-欠損マウス (アポ−/−) と LDL 受容体-欠損マウス (来す−/−) が活躍しています。高脂肪高コレステロール食、アポ e−/−マウス開発プラークより多くを来す−/−マウスに比べて急速にアポ−/−マウスの使用は、この理由のため、来す−/−マウス5,6のそれよりもより広範です。アポ−/−マウスは、アテローム性動脈硬化のあらゆる段階で病変を開発し、マウスのプラクは不安定な表現型7を表示しないが、人間で観察に匹敵します。一般的に、アポ e−/−マウスは自発的にアテローム性動脈硬化を開発し、このプロセスは西部の食事療法3加速します。頚動脈、肺、大腿や腕頭動脈、大動脈のルート6のレベルでは、アテローム性動脈硬化の重症度を評価できます。特に、大動脈の根は、マウスにおける動脈硬化病変を開発する傾向が解剖学的サイトを表します。このため、この地域の動脈硬化性プラークの形成を評価する方法が一般的です。
いくつかの研究は、アルドステロン、アテローム性動脈硬化8,9,10の開発に関与しているを示しています。アポ−/−マウス動脈硬化飼料におけるアルドステロン輸液は、炎症や脂質に富むプラーク形成10を誘導する大動脈の動脈硬化病変の開発を加速します。
要約すると、アルドステロン注入、動脈硬化食事供給、アポ-/-マウスの動脈硬化病変の評価・定量化心臓組織の埋め込みを含むプロトコルについて述べる。この手順では、炎症を起こして、脂質の豊富な動脈硬化性プラークの効率的な形成を促進して、粥状動脈硬化の研究の貴重なモデルを表します。
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Protocol
研究は、イタリア国民協会の健康ケアおよび使用委員会承認番号 493/2016-広報によって承認されました。実験動物の使用のための欧州共同体のガイドラインに従ってすべてのプロシージャを行った (欧州指令 2010/63/UE)。
注: 車両 (食塩エタノール) やアルドステロンを含む浸透圧側脳室内の皮下注入 (240 μ g kg-1 ・・・ d-1) 8-10 週間で-古い男性マウスApoE遺伝子の欠損。一般的に、8-10 週で-古い男性アポ−/−マウス約 25 〜 26 グラムの重量を量る。
1. アルドステロンの溶解
- 無水エタノール 1 mL にアルドステロン パウダーの 5 mg を溶解します。
- 2.27 μ g の濃度を得るために食塩水の 68.3 μ L に (エタノールに溶解) アルドステロンの 56.7 μ L を追加/μ L (各側脳室内の最大容量が 125 μ L) このソリューションの 125 μ L で完全に全体の浸透圧ミニポンプを記入します。
- 0.11 μ L/h; の側脳室内の流量を使用します。したがってソリューションの 2.64 μ L をリリースごとの 24 時間を与える各マウス約 6 μ g ·28 日のアルドステロンの d-1 。
2. 浸透圧ポンプ充填・注入
注: ポンプは 2 つの別々 のパーツ供給: ポンプや流量制御の本体。
- 記入し、手術用手袋を使用してミニポンプを処理します。
注: 皮脂ミニポンプのパフォーマンスを妨げる可能性があります。滅菌の層流フードでは、次の手順を実行する必要があります。 - 1 mL シリンジに充填チューブ (、ミニポンプに付属) を添付し、アルドステロン ソリューションまたは車両を描画します。
注: ポンプに気泡の形成を防ぐために管からソリューションを吸引しながら、注射器の中の空気を悟られないようにすることが重要です。 - それはさらに行くことができるまで、側脳室内の上部に穴を充填チューブを挿入 (図 1 a-1 b)。ゆっくりとアルドステロンや車両でポンプを入力します。流体のレベルを示すポンプ内部の暗い影に注意してください。充填ポンプと共にこのレベルの上昇を見る。
- 流体のビードが上がるとポンプ本体からポンプを充填を停止します。
- 慎重に充填チューブ、流量制御を (図 1) 側脳室内の本体に挿入します。ポンプ本体とレギュレータがしっかりと装着されていることを確認します。マウス (プライミングの手順) で移植前に 24 h までの 37 ° C で滅菌生理食塩を含むビーカーで塗りつぶされた浸透圧ポンプを残します。
- 無菌を促進する 70% エタノールで消毒エリアでの手術を行ってください。
- 0.25% ブピバカインの切開部位を 1-3 滴を適用し、3% イソフルランと動物を麻酔します。供給ガスを入れますと誘導室動物 500-1000 mL/分の場所に流量計を設定し、上部をシールします。5% イソフルラン気化器をオンにし、リカンベントまでマウスを監視します。
- ノーズに流れるシステムを切り替えます。商工会議所とノーズの位置から動物を削除します。2-3 分でマウスは目を覚ますを開始します。100-200 mL/分の流量計とで 3% イソフルラン気化器でガスの流れを再起動します。
- ペダルの撤退と眼瞼反射神経をテストすることによって手順を実行する前に麻酔の十分な深さを確保します。呼吸およびプロシージャ中の刺激への応答を監視し、必要に応じて気化器を調整します。
- 眼軟膏を適用することによって完全に乾くことから、角膜を保護します。
- かみそり (図 1) を使用して手術部位から髪を削除することによって動物を準備します。通常皮下注入ポンプの用地は背面にあります。
- 不織布パッド材 70% イソプロピル アルコールで飽和状態で手術部位を準備します。
- (70% エタノールで消毒) 清潔で専用スペースを使用し、滅菌ドレープで覆われています。ガラス ビーズ滅菌器で器具の先端を配置します。滅菌機器で手術を開始し、無菌の楽器を処理します。
- 外科はさみを使用して 0.8 1 cm 切開 (尾の近くに約 2 cm) のように、 1E 1F の数字します。滅菌手袋と楽器の先端手術専用スペース以外に触れていないが、無菌性を維持します。
- 皮膚のみがない基になる組織を削減する注意してください。切開を開く鉗子を保持するために 1 つの手を使用します。上向きに (マウスの右または左側) に肩甲骨を背面からポンプのためのポケットを作成するために皮膚を広めるにトロカールを保持するために他の手を使用します。
- 切開にポンプを挿入します。ポケット (図 1 H) に、完全にポンプをそっと押し込みます。テンションがないと傷を閉じるために無料または必要な皮膚のストレッチ、十分な皮膚があるはずです。ポンプを挿入すると、縫合手術ワイヤー (polyglactin 910 縫合サイズ 6 - 0) で切開
メモ: レギュレータの頭はマウス (図 1) の前面を向いてなければなりません。 - クリーン綿棒 (図 1I) と 10% ポビドン ヨード軟膏を適用し、地球温暖化の段階で動物を飼います。胸骨の横臥を回復するまで無人でマウスを放置しないでください。水分補給状態を評価し、必要に応じて 0.9% 食塩液 0.5 mL を皮下に管理します。動物をそのルーチンの筐体に戻ります。
- ドキュメントの機関のガイドラインに従ってください (例えば、手術と術後については、プロシージャと日付更新ケージのカードと手術フォームに記入) (ブプレノルフィン、0.05 mg/kg) 手術後の痛みを軽減する鎮痛剤を提供し、抗生物質 (エンロフロキサシン 85 mg/kg) 手術後の感染症を避けるために。
- 毎日の監視を継続し、痛みの兆候を調べます。傷口が完全に閉じて、皮下ポケットに側脳室内を維持に注意を払います。傷が開くことができます、マウスは、側脳室内を失う可能性があります。
3. 心臓の解剖
- 犠牲、80-100 mg/kg 筋肉内投与した Zoletil の anestethize マウスの時。Zoletil は、深い麻酔を誘導します。注: マウスは、ペダルおよび眼瞼反射のテスト手順を実行する前に麻酔の十分な深さを確認します。マウスは、深い麻酔中灌流されます。胸骨は、胸骨の頭に向かって取り消し中に肋骨を横方向に切断することによってはさみや鉗子を使用して、胸腔内を開きます。
- 10-15 ml の冷たいダルベッコ リン酸緩衝食塩液 (PBS) と血管系を修正する中性緩衝ホルマリンの 10% の 40-50 mL の重力灌流システムによって左心室を介してマウスを灌流します。固定は、マウスが積極的な筋収縮を展示し、硬直するときに示されます。
注: 固定プロセス 10 〜 20 分の場所になります。蛍光抗体法や免疫組織化学的解析を実行する固定臓器や組織を使用することが可能です。重要なは、このような固定組織は遺伝子発現および西部のしみが付く分析を使用できません。 - 鉗子で中心を押し (図 2 a) の損傷を引き起こすことがなく、心にできるだけ近く、大動脈の軸に垂直にハサミやメスの刃で切断で大動脈から心臓を区切ります。右および左心房 (図 2 b) のより低い点を結合する直線に沿って横にカットするメスの刃を使用します。
- 最適な切削化合物 (OCT) (を通して心の空洞) 断面の心臓の上の部分を塗りつぶし (図 2 D-2E)。10 月 (図 2 f) でカバーして長方形金型のベースに垂直に置かれた大動脈の軸に cryosection プラスチック金型内の組織を置きます。閉じ込められた空気の泡はないはずです。任意のバブルが存在する場合は端に移動ましょう。
- ドライアイスに金属板を配置し、(図 2) の金型を慎重に。OCT は白になると、銀の箔を金型をラップし、-80 ° C で保存
4. 切削部大動脈のルート
- -20 ° C にクライオスタット マシンを設定します。切る前に埋め込まれた組織を置いて、この温度を調整する約 15 分間、それを残してください。-17 ° c (図 3 a) 試料ホルダーの温度を設定します。
- クライオスタット (図 3 b) のブロックの温度を平衡と (図 3) 金型から冷凍の心ブロックを取るクライオスタット マシンの内部凍結心ブロックを配置します。良い標本ホルダー (図 3 D) にブロックの寸法を合わせて冷凍ブロックから余分な 10 月をカットします。
- 心室に外側を向きますと指向試料ホルダーに冷凍の心ブロックをマウント (図 3E-3 i)、頭 (図 3J) を方向づける標本試料ホルダーに挿入します。大動脈基部をブレード (図 3 K) に垂直になるようためにブロックの切断を許可する試料ホルダーの向きを調整します。
- ブロックを切り、大動脈のルートに到達するまでのスライスを放棄 (図 3 L-3 n)。連続切片を収集し、(図 3O) スライド ガラスの上に置きます。すべて 3 大動脈弁が表示されるまでは、顕微鏡下で大動脈の解剖学的プロファイルを監視 (図 3 P-第 3 四半期)。
- オイル赤 O の Picro シリウス赤染色、10 μ m/セクション、6 セクションを収集 μ m/セクションの MAC3 (図 3 r) を染色します。周り収集 (ハート) の 3 つの弁のいずれかまでの 6-8 スライドが消えるか、もはやそのままではないです。
5. 免疫組織化学
注: 次のプロトコルで報告されたすべての染色手順は、ガラス Coplin 染色瓶に実行されます。
-
中性脂肪のオイル赤 O 染色
- 70 mL の水道水で 5 分洗浄 37% ホルムアルデヒドのセクションを修正し、余分な水をしみ。
- 32 mL のオイル赤い O を取得する蒸留水でオイル赤い O (イソプロパノールは 0.5%)、48 mL を希釈 0.3%。
- オイル赤 O の 70 mL で切片を染めると、10 分で 10 分洗浄セクション水道の 0.3%。
- マイヤーのヘマトキシリンの 70 mL で 1 分間染色します。1 分の水道水のセクションを洗います。
- 70 mL に 0.5% 炭酸リチウムのセクションを浸します。1 分の水道水で洗ってください。
- 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用して水溶液の取り付け中、キャプチャ画像のセクションをマウントします。
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Picro シリウス赤のコラーゲンの汚れ
- 10 μ m 冷凍セクションをカットし、スライドの下部にマウントします。
- 70 mL で 5 分、乾燥した空気、水で簡単に洗浄用アセトンのセクションを修正します。
- 70 mL 0.2% リンモリブデン酸 5 分水で簡単に洗浄のためのセクションに配置します。
- 70 ml の 0.01 N HCl。 破棄ソリューションの 90 分すすぎ 1 回 0.1 %picro シリウス液 70 mL セクションに配置します。
- 2 分簡単にリンスの 0.01 N HCl の 70 mL で蒸留水。空気が乾燥。
- 70% のエタノールの 70 mL で簡潔に場所。
- 完全に乾いたら、テルペン由来のエージェントをクリア 70 mL に配置し、ポリを使用してセクションをマウント (ブチル メタクリル酸-co-メタクリル酸メチル) 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用中、キャプチャ イメージのマウント ベースします。
注: Picro シリウス赤染色の利点の 1 つはタイプを識別することが可能だ (太い繊維, 黄色オレンジ色の複屈折) ・偏光顕微鏡11 でタイプ III (薄い繊維、緑色の複屈折) コラーゲン繊維ネットワーク.
-
マクロファージの汚損のための Mac3 汚れ
- 6 μ m 冷凍セクションをカットし、スライドの下部にマウントします。
- 70 mL で 5 分間つかる 70 mL の PBS の 2 分間冷アセトンのセクションを修正します。
- ピペットを使用すると、カバー部 1% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) ソリューションと抗原検索のため室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。70 mL の PBS 5 分間浸します。
- ピペットを使用して、20 分洗浄 70 mL の PBS 3 時間 5 分の 0.3% 過酸化水素とスライスをカバーします。
- アビジン-ビオチン複合体 (ABC) を使用して、-次の手順のための HRP キット。
- ピペットを使用して、20 分間室温で通常ウサギ血清中のセクションをブロックします。洗い流さないでください。
- MAC3 で染色 (1: 300) で 90 分間した洗浄 70 mL の PBS の 5 分の 3 回。
- PBS 3 時間 5 分の 70 mL としたリンスの 45 分の二次ビオチン化抗ラット IgG (レバレッジ) で染色します。
- 30 分間の PBS 3 時間 5 分の 30 mL でリンスしたウサギ IgG ABC とセクションをカバーしてください。
- 10 回で蒸留水 70 ml の 10 分間すすぎ 3-アミノ--9-エチルカルバゾル (AEC) のセクションをカバーします。
- マイヤーのヘマトキシリンの 70 mL で 1 分間染色します。1 分の水道水のセクションを洗います。
- 0.5% の 70 mL でセクションを浸す炭酸リチウム。1 分の水道水で洗ってください。
- 光学顕微鏡にデジタル カメラを使用して水溶液の取り付け中、キャプチャ画像のセクションをマウントします。
6. 大動脈基部の節でアテローム性動脈硬化病変の像
注: 興味の抗体または MAC3 オイル赤 O 染色大動脈のルート セクションは、(材料の表で示される) 適切なソフトウェアを使用して分析できます。染色の関心のコンポーネントの肯定的な合計のピクセルは、全体のプラークの面積に正規化されます。画像が収集し、, 解析治療盲目捜査官。
-
校正
- ソフトウェアを開き、分析する (jpg) の画像を選択します。
- ホームを選択 |作成|迅速な校正。
- 画像のキャリブレーションを設定するには、イメージのスケール バーに沿って線を描画します。
- キャリブレーションの設定を保存します。
-
画像解析
- [オプション] メニューから保存したセットアップ校正を選択 |空間キャリブレーション オプション。
- 校正を選択 |を適用します。
- [選択] メニューの [ポリゴン] ツールを選択し、に沿ってすべての動脈硬化病変の境界を描画します。
- 数/サイズを選択 |タイプ。メニューからエリアと% 領域を追加します。
- 数/サイズ」メニューから選択マニュアルと新しいウィンドウが開きます。
- このウィンドウから画像を色を選択ツールをクリックし、 HSIモードを選択します。
- 色の範囲を作成する興味のマーカーの肯定的なピクセル [マウス カーソルをポイントします。
- カウントをクリックし、値合計、測定表の観察は、アテローム性動脈硬化病変の全領域に関して (μ m2も表現) マーカーの領域の割合を示します。
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Representative Results
8 〜 10 週間 Apo-/-マウスのミニポンプが車両やアルドステロンを吹き込むに移植された (図 1E-1I) と 4 週間 (調整カロリー ダイエット脂肪から 42%) 動脈硬化食事を供給します。治療の最後に、マウスが安楽死、PBS と前述の通り 10% ホルマリン潅流します。大動脈は心臓の先端部から分離され、OCT (図 2) に埋め込まれました。大動脈の根の断面は、クライオスタット機 (図 3) を使用して、異なる染色ために準備されました。
動脈硬化性プラークの組成は、プラークの開発の段階を定義する特定のコンポーネントの染色によって特徴付けることができます。5.1 の手順で説明したように動脈硬化病変の脂質含量を調べるためオイル赤 O 染色、5.2 の手順で説明するようにコラーゲン含有量を決定するために使用 Picro シリウス赤染色、説明したマクロファージの量を測定する採用 Mac3 染色5.3 をステップします。アルドステロンによる治療の 4 週間後マウス脂質 (図 4 a-4 C) と大動脈のルート レベルでは、動脈硬化性プラークのマクロファージ内容 (図 4-4 階) に大幅な増加を表示が、相違点はありませんでした。コラーゲン含有量の観察 (図 4-4I) 車両を投与したマウスと比較して。確かに、アルドステロンは血管の炎症が、(図 4) 線維化を誘導するこのモデルで粥状動脈硬化を加速しました。
図 1。準備、車両やアルドステロンと浸透圧側脳室内注入。A-B)車両やアルドステロンと浸透圧ミニポンプを埋めるための手順を実行します。C)流量制御でポンプの本体をクローズするの手順を実行します。D F)マウスの背面に注入ポンプのため切開を作成する手順。G-私)浸透圧側脳室内と切開の縫合の注入。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。心臓や大動脈の根を埋め込み、区分の準備。A-B)心は右および左心房の下のポイントを結合する直線に沿って横に切断します。中心の頂端部は、大動脈の動脈硬化病変組成を定量化する処理されます。C)心の中から大動脈。D E)10 月の中心部の空洞の充填F)型に切り裂かれた心の向きは前 10 月でいっぱい (金型の下の方向に中心部の空洞) とG)金型で 10 月に切り裂かれた心の凍結します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。クライオスタット ミクロトームを用いた大動脈基部の断面。A)事前冷却クリオスタットとマシンとチャックの適切な温度を設定します。B ~ D)固体 10 月ブロック、金型から分離し、刃を使用して心臓の周りの余分な 10 月を排除します。E-私)サポートによる液体 10 月 10 月のブロックが固定されています。J K)サポートは、チャックに挿入、心室に外側を向きますと指向します。L M)セクション切り裂かれた心が完全に露出するまでブロックします。N O)10/6 μ m の厚さを設定し、ガラスのスライスを収集します。P Q)顕微鏡下ですべての 3 つのバルブの存在を確認します。R)その後スライスを収集しているように、1 つまたは複数のバルブがもう観察されていませんまで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。動脈硬化性プラークの組成でアルドステロンまたは車両-処理アポ-/-の定量化。A-B)代表の赤オイル O 8-10 週間で大動脈基部の断面をステンド グラス-古いアポ-/-マウスの車両 (A) または (B) アルドステロンと扱われ、4 週間の動脈硬化の飼料。C)肯定的な染色/総プラーク エリアのパーセンテージとして脂質含量の定量。D E)代表 Mac3 ステンド大動脈基部の断面です。F)肯定的な染色/総プラーク エリアのパーセンテージとしてマクロファージ コンテンツの定量化。G H)代表 Picro シリウス赤染色、大動脈基部の断面です。私)肯定的な染色/総プラーク エリアのパーセンテージとしてコラーゲン含有量の定量化。値は平均 ± 標準誤差を意味として表されます (SEM; n = 各グループの 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
動脈硬化は、マクロファージ、T リンパ球、血管内皮細胞、平滑筋細胞1など、複数のセル型の間の相互作用を含む大型と中型の血管に関連する慢性炎症性疾患です。マウスの動脈硬化モデルの制限にもかかわらずアテローム性動脈硬化の過程に関する証拠の大きいボディがあり。これらのモデルには、特定の年齢や性別の実験的コホートを急速に生成する利点があります。マウスはまた定義され、均質な遺伝的背景を示します。
動脈硬化性プラークの開発は、動脈硬化になりやすいマウス モデルで観察部分的に不安定プラーク形成4を除いてヒトで観察に似ています。プラーク破裂およびそれに続く血栓症、ヒトでは、心筋梗塞の主な原因は、動脈硬化マウスモデルでは認められなかった。私たちの最近の論文で、アルドステロンの注入が誘導して、できることを示した 4 週間後アポ-/-マウスの不安定プラークの表現型は、HFD10を供給します。実際には、この治療はプラーク エリア、脂質含量、未処理のマウス10と比較してコラーゲン含有量の有意な差、大動脈レベルで炎症の範囲を増やすことができます。注記のうち、これらのマウスは、アルドステロン治療10血圧が大幅改変されていないことを考える、動脈硬化高血圧非依存の増加開発を表示します。
本稿で我々 は詳細 10 月中心のティッシュの一連のステップ、すなわち、大動脈基部断面とプラーク分析を埋め込む技術プロシージャを示しています。パラフィンに比べると、10 月はクライオスタット ミクロトームと最小限のティッシュの処理の厚さ (1-100 μ m) の高い範囲でセクション準備をことができます。制限、氷結晶の形成の潜在的影響を受ける凍結するティッシュの品質を含むと細胞内の詳細を変更して免疫組織学的染色により検出可能な成果物を生成できます。確かに、凍結保存は抗原と抗原性保持の一助と考えられます。実際には、凍結組織は抗原の構造を維持します。さらに、免疫組織化学処理凍結するティッシュは有毒で発がん性化合物であるホルマリンの使用を避けることができます。
大動脈は、組織学的処理のために識別するために比較的簡単なサイトです。解剖学的動脈硬化病変におけるアテローム性動脈硬化になりやすいマウスを研究するためのゴールド スタンダードです。この特定の地域の分析によって得られたデータには、同じグループまたは異なる実験グループに属するマウスの間で比較が可能します。実際には、大動脈基部の断面、中にすべての 3 つのバルブの存在によって特徴付けられる特定の領域を認識するように簡単です。特定の領域を取得するためには、埋め込み、区分の中にいくつかの重要な手順に特に注意を払うことを厳密にお勧めします。セクションの完全性を妥協することができます組織内の気泡の形成を避けるために 10 月に区分けされ心臓の上の部分の空洞を入力することが重要です。さらに、断面中に切削角度を上行大動脈に垂直な正確されるように上部の断面心組織型の底面に垂直の方向を指定する必要です。そのままスライスを得るために、クライオスタットの温度は-20 ° C で正確する必要があります。実際には、低温がセクションの品質を妥協できる (すなわち、ブレード使用できないようにセクションが崩れる可能性があります)。
注記のうち、3 つのバルブが表示されます実行する解析のタイプに応じて、異なる厚みをもつ組織を切断する推奨です。一部のスライドがプラークの進展による使用されます残りのスライドを異なる染色に使用できるに対し実際には、(すなわち。、 Picro シリウス、Mac3 など。)。
アルドステロンを投与したマウスの動脈硬化病変が豊富で脂質、マクロファージ (脂質染色) 用オイル赤い O、(マクロファージ染色) の Mac3、シリウス レッド (汚損のため、コラーゲンの)、またはの他の特定の抗体の使用によって特徴付けられる表示します。興味の蛋白質。10 月埋め込み、パラフィン包埋とは異なり、削除病変の脂質の内容は有機溶剤の使用が回避できることを強調することが重要です。したがって、脂質オイル赤 O 染色は、OCT 埋め込まれたセクションで可能であり、動脈硬化性プラークの脂肪含量を正確に定量化することができます。
本稿ではアルドステロン注入アポ-/-マウスの動脈硬化を促進する貴重な方法であることを示した。In fact、アポ-/-マウスでアルドステロン注入は、することができる: 1) 接着と動脈硬化性プラークの初期の段階で単球の移行に関与する分子の発現の増加によって示すように、血管内皮細胞の活性化を高める形成12,13;・ 2) 脂質と大動脈のルート レベル10,13プロ炎症性マクロファージ コンテンツを増やします。これらの効果は、血行アルドステロン10の原因ではないです。 結論としては、提案プロトコルを表す有効なメソッドを生成し、マウスの動脈硬化の特徴これは、病気の初期段階をモニターし治療的介入とアテローム性動脈硬化のリハビリの成果を助けることができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、イタリア保健省 (Ricerca グラーヴェ、GR-2009-1594563、司会に PE-2011-02347070) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
| Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
| Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
| Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
| Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
| 10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
| Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
| Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
| Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
| Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
| Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
| Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
| Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
| Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
| Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
| Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
| Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
| Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
| Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
| Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
| Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
| Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
| 3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
| Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
- de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
- Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
- McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018 (2013).
- Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
- Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
- Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).
