Summary
血管化複合同種移植片は、移植患者に生命を変える利点を提供するが、移植片拒絶および vasculopathy の生物学的原因はあまり理解されないままである。ここに提示されたげっ歯類外科手術モデルは、再現性のある、臨床的に関連する移植モデルを提供し、研究者がその発生を防ぐために拒絶事象および潜在的な治療戦略を評価することを可能にする。
Abstract
血管化コンポジット他家移植 (VCA) は、再建手術で比較的新しい分野です。人間の VCA で臨床的な成果には、手と顔の移植と、より最近では、腹壁、子宮、および泌尿生殖器移植が含まれます。機能的な成果は当初の期待を上回り、ほとんどの受信者は生活の質の向上を享受しています。しかし、臨床経験が蓄積するにつれて、免疫抑制からの慢性拒絶および合併症が対処されなければならない。移植片が失敗した多くの場合、その原因となる病理は虚血性 vasculopathy であった。VCA、特に虚血性 vasculopathy に関連した急性および慢性拒絶反応の生物学的メカニズムは、研究の重要な領域である。しかし、VCA 患者の数が非常に少ないため、実験モデルでは提案されたメカニズムの評価の方が適切です。複数のグループは、VCA 拒否と vasculopathy の関連する未解決の質問のいくつかに対処するために動物モデルを使用しています。様々な種を含むいくつかのモデルデザインが文献に記載されている。ここでは、トランスレーショナル VCA 研究に利用できる、ラットの VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップの再現性のあるモデルを紹介します。このモデルは罹患率の低いレベルを維持している間、バイオプシーおよび異なったイメージ投射様相を含む接木の連続的な評価を、可能にする。
Introduction
切断、ブラスト傷害、悪性腫瘍、および先天性欠損症による壊滅的な組織損失のための再建手術は、患者からの組織の利用可能性およびドナー部位で生じる追加の罹患率によって制限される。いくつかのケースでは、熱傷犠牲者または四辺形切断者など、再建のための生存可能な組織は、患者から入手できない。1964年、エクアドルで初めての近代的な手の移植が行われました。これは技術的な成功でしたが、現時点で利用可能な免疫抑制は拒絶を防ぐには不十分であり、移植片は3週間未満で失われました。1998および1999では、免疫抑制の現代における最初の手移植は、リヨン、フランス2とルイビル、ケンタッキー州、USA3で行われました。初めて、再建外科医は同じように置き換えることができます。顔面移植は 20054で最初に行われ、多くの他の VCA 移植片が、腹壁5、子宮、および泌尿生殖器移植6のような現在日常的に行われている。
固形臓器移植とは異なり、ほとんどの VCA 技術は、高抗原性ドナー皮膚の存在を伴います。臨床経験は、皮膚の急性拒絶反応が比較的容易に制御されることを決定したが、治療7によく反応しない基礎組織および血管の慢性拒絶に寄与し得る。同種免疫応答に関連付けられている血管機能障害は、VCA7のフィールドのためのより不吉な障害物です。Macrovasculopathies は、灌流障害、治癒の遅延、および炎症誘発性の状態につながります。両方のコンフルエント積極的な大血管 vasculopathy および焦点 intimal 過形成は、手移植レシピエント7において生じる。さらに、microvasculopathies は、おそらく VCA 合併症にも貢献し、拒絶イベントにつながる可能性もあります。免疫と非免疫系の両方の要因は、おそらく、手の移植のレシピエントの vasculopathy において役割を果たすが、VCA における遠位血管機能不全を促進する特定のメカニズムは、特に低悪性度、慢性拒絶反応の文脈においては知られていない。これらの未回答の質問は、VCA 拒否/メンテナンスと vasculopathy の臨床コース中に移植片の連続評価を可能にする動物 VCA モデルの開発を要します。このようなモデルは、免疫抑制、感染性チャレンジ、および/または他の術後外傷性損傷8,9に直面して拒絶および vasculopathy に関する洞察を提供する。
ここで紹介したのは同種ラット VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップモデルです。以前に公開された VCA モデルに基づいて、この手順は技術的に簡単に実行でき、多数で再現性があり、レシピエント動物に最低の罹患率と不快感を呈する。このモデルは、VCA 承認と拒否の臨床的および病理組織学的評価を可能にするように設計されており、拒絶に関与する根底にある免疫および非免疫系のメカニズムを評価する機会を提供します。
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Protocol
すべての動物の手術は、ルイビル大学の機関動物ケアと使用委員会 (IACUC-承認されたプロトコル 18198) とのケアと使用のための国立衛生研究所 (NIH) のガイドによって承認されるプロトコルに従って実施しました実験動物10.生後4ヶ月のオスブラウン-ノルウェー (RT1.An) と4ヶ月の男性ルイス (RT1.L) ラットは、それぞれ、VCA ドナーと受信者として使用された。
1. ドナー同種移植片収穫
- イソフルランを通して塗布された気化したものを用いてドナー動物を鎮静する。
- 移植片ドナー領域 (後肢) だけでなく、鼠径部と腹部領域を剃る。その後、バリカンで残っているファズの量を減らすために脱毛クリームで処理します。
- 腹腔内 (IP) ケタミン (60 mg/kg)/xylazine (麻酔/kg)/acepromazine (2mg/kg) を用いてドナー動物を深く投与する。0.2 mL/100 g の体重と 0.2 mL の追加用量の投与をすべての h.便宜上、手順2の前にこの手順を実行することはオプションです。
- 呼吸、体温、麻酔の深さのために麻酔下で継続的に動物を監視し、つま先のピンチ離脱反射テストを使用します。
- 血液凝固を防ぐために、手術前に首筋領域で 30 U のヘパリン溶液を皮下投与する (SC)。
- マスク、ヘッドカバー、使い捨ての隔離ガウン、使い捨て手袋を着用してください。
- ドナー動物の仰向けを加熱パッドに置きます。足の腹部と背の両方の側面を含む外科領域を準備し、スクラブし、ドレープすることによって無菌手術場を生成する。無菌手袋をしてください。
- メスブレード #15 を用いて鼠径部くぼみに3cm の皮膚切開を行い、鼠径部の脂肪パッドを横方向に虹彩はさみを使用して反射させる。
- 共通の大腿骨の容器を露出し、腹部筋肉を撤回するために伸縮性があるバンドが付いているワイヤーホックを置きなさい。
- 解剖顕微鏡 (40 倍) を使用して、鼠径靱帯の下の一般的な大腿血管の出現から椎弓根近位を解剖し、膝窩の血管の合流を移植片に遠位。
- Microclips およびバイポーラ宝石の鉗子を使用して、結紮とそのような横曲折性大腿骨血管、表面上尾窩血管、伏在動脈、および近位尾大腿血管などの大きな動脈および静脈枝を分割し、動員する主要な大腿骨の容器。包む準備は細い両極鉗子を使用してあらゆる小さい枝を利用する。
- 前の皮膚の中心から皮膚の切開を後肢の腹側に沿って切断し、足首領域に、虹彩はさみを使用した。
- Gracilis の筋肉だけでなく、その下の他の内転筋の筋肉をカット, 垂直方向に露出し、隣接する genicular 血管の内側を結紮します, 深部分枝小血管, および坐骨神経.
注:この時点で、別の手術台で、他の外科医は、intubate および麻酔 (2.5%-3% イソフルラン) レシピエント動物を必要とする。これは外科医が接木の配置の間に受信者の外科場所を準備し、接木の虚血性時間を最小にすることを可能にする。 - ドナー動物には、膝と足首のレベルで円周の皮膚切開を行います。膝と足首を Disarticulate、余分な筋肉や組織を取り除き、後肢の背側に垂直の皮膚切開を行い、移植片を遊離させる。この時点で、移植片 (腓骨および脛骨で構成され、その穿孔によって養われる関連筋肉および皮膚島で覆われる) は、椎弓根によってのみ接続される。
- 大腿動脈と静脈に可能な限り小さなクランプを近位、鼠径靱帯の近くで、椎弓根を可能な限り近位に切断します。
- 血液の移植片をフラッシュするために、27 G フラッシング鈍いカニューレを使用して大腿動脈にヘパリン処理生理食塩水 (30 U/mL) を注入する。
注:ヘパリンフラッシュの前に動脈を拡張することは、カニューレの挿入のための容易なアクセスを可能にする。フラッシュの間に、大腿静脈からの流出を注意深く監視してください。透明な流体が大腿静脈から出たら、フラッシュを停止します。 - 暖かい生理食塩水に浸したガーゼで孤立した移植片を包み、レシピエント動物のテーブルにすぐに運びます。このとき、レシピエント手術部位はすでに血管吻合のために準備されなければならない。
- 移植片を収穫した後、直ちに euthanize を介してドナーラットを再度採取する。
2. レシピエント移植手術
- チャンバを通して適用される気化イソフルランを用いた鎮静誘導に続いて、人工呼吸器制御の気管内チューブを介してレシピエント動物を深く麻酔し、2.5% 〜 3% イソフルラン。
注:この段階では、ドナーラットは依然として麻酔される。 - 心拍数、呼吸数、体温、およびレシピエント動物の麻酔の深さを連続的に監視し、つま先のピンチ離脱反射試験を使用する。
- 脱水症状と低血糖を予防するために、手術終了時に lactated リンガー溶液 2 mL と 2.5% デキストロースの皮下注射を行います。
- 鼠径部を剃り、脱毛クリームで治療して、バリカンで残っているファズの量を減らします。
- マスク、ヘッドカバー、使い捨ての隔離ガウン、無菌手袋を着用してください。
- 動物は、加熱パッドに仰向けに置きます。麻酔中に角膜の擦り傷を防ぐために眼科用軟膏を塗布する。外科区域を準備し、洗い、そしてドレープすることによって生殖不能の外科分野を作り出す。
- メスブレード #15 を用いて鼠径部くぼみに3cm の皮膚切開を行い、鼠径部の脂肪パッドを横方向に虹彩はさみを使用して反射させる。
- 共通の大腿骨の容器を露出し、腹部筋肉を撤回するために伸縮性があるバンドが付いているワイヤーホックを置きなさい。
- マーフィーの枝を結紮て割る
- 10-0 のナイロンの中断された縫合糸を使用して、anastomose は静脈のエンドツーサイド技術および幹線エンドツーエンドの技術によってレシピエントの容器にドナーの容器を提供する。徐々に動脈からクランプを解放し、その後静脈.出血のための吻合サイトを監視し、必要に応じて縫合糸を追加します。
- 効果的な移植片再灌流を保証するために、血管吻合を視覚的に評価します。
- 鼠径部のポケットに移植片をはめ込みと逆さまに、足首関節の優れたと膝関節の劣って向きます。
- タック縫合を使用して、隣接する筋肉に移植片を固定します。中断された水平マットレス皮膚吸収性4-0 縫合糸を介して皮膚を閉じる。
- レシピエント動物を麻酔から取り出し、それを人工呼吸器から引き離す。熱支持のための加熱パッドの上に動物を置きます。
注:全体の操作時間は3から 4 h の間に、外科医の経験および外科プロシージャの知人によってある。 - 疼痛抑制のための皮下 (1 mg/kg) を投与し、動物が完全に回復し、移動するまで監視します。
3. VCA 受信者モニタリング
- レシピエントラットを単独で収容し、疼痛、脱水、体重減少、および外科的不全 (最初の48〜72時間) または拒絶に加えて活性の低下の臨床的徴候について毎日それらを監視する。疼痛抑制のための最初の3日間のメロキシカムの皮下 (1mg/kg) を毎日管理します。
- 研究の終点に基づいて、投与する免疫抑制薬を選択します。
4. 組織学
- 吸入イソフルラン麻酔下 (2.5% – 3%) で、所望の時点でドナー移植片から連続皮膚および基礎筋生検を得る。皮膚は、生検を得る前にスクラブしてドレープする必要があり、無菌のフィールドとテクニックを実行する必要があります。
- 吸収性4-0 縫合糸を使用して、1〜2つのステッチで創傷を閉じます。動物をケージに戻し、麻酔から回復させます。
- 10% ホルマリンで別々のチューブに生検組織を固定します。
- 終末時点および吸入イソフルラン麻酔下 (2.5% – 3%) で、ドナー/レシピエントの境界にまたがるより大きな皮膚生検をとる。慎重に吻合のサイトで船のリーシュのペアを見つけます。縫合糸のために適切な部位が明らかになる。動脈および/または静脈から所望の血管サンプルを取る。10% ホルマリンで個別にすべてのサンプルを固定します。組織サンプルの収集後、および動物がまだイソフルラン麻酔下にある間、すぐに気胸を介して動物を euthanize。
- 組織プロセッサ (または他の好ましい埋め込み技術) を使用して、パラフィン-それぞれの生検を独自のブロックに埋め込む。皮膚サンプルについては、すべての表皮層および真皮レイヤーが単一のスライスに見えるように組織を配向させる。容器サンプルの場合は、断面が得られるように容器の向きを合わせる。
- ミクロトームを使用し、6μ m 厚の切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色のスライドに塗布する。
- 標準プロトコルを使用した H & E 用の染色。
- 明視野の顕微鏡検査の技術を使用してすべての望ましいティッシュのサンプルの代表イメージを得なさい。
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Representative Results
ラット VCA heterotopic 後肢 osteomyocutaneous フラップモデルは、免疫抑制の下で長期的な移植片生存を可能にします。このモデルは信頼性が高く、再現性があり、簡単に実行できます。フラップは、鼠径部によく隠されており、動物には最低の罹患率と不快感を構成しています。皮膚の提示は、同種移植片の生存および拒絶反応の臨床症状である (図 1)。折り返しの設計は総体の臨床監視を可能にし、レーザーのドップラーのようなさまざまなイメージ投射技術のための機会を作成する (図 2)。皮膚、筋肉、および動脈のシリアル生検は、異なる拒絶段階で組織病理学的フォローアップおよび分析を達成することを可能にする (図 3)。
図 1: 移植動物からの代表的な画像。(A) 同系の VCA 長期生存、免疫抑制治療なし、術後日 45 (POD 45);移植片の逆方向によるファーの成長方向の違いに注意してください。(B) 同種 VCA は、免疫抑制薬を用いて毎日、ポッド5上で処置した。(C) 同種 VCA 長期生存、ポッド40上の免疫抑制薬で毎日治療;拒絶の徴候なしで、移植片の適切な灌流を示す通常の毛皮成長に注意してください。(D) ポッド33上の拒絶反応中の同種 VCA。免疫抑制治療は、ポッド14上で完全に停止しました。拒絶の臨床的徴候 (皮膚萎縮、落屑、毛皮の喪失) に注意してください。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 同種移植片の表面皮膚血管再生を監視するレーザードップラーイメージングシステム。提示された同種移植片は、術後日4、14、および64においてモニターした。左のパネルはドップラーイメージングで測定した血液灌流を示し、右側のパネルはドップラーによって撮像されている領域を示しています。最低血の灌流からすぐに64のフラップの完全な血管再生に-VCA ポストのシフトに注意してください。この同種移植片は拒絶反応の兆候なしに適切な免疫抑制の下で維持された。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 同系対同種移植における H &Amp; E 組織病理学の移植性(A) POD 45 における同系同種移植片の皮膚生検 (10x 倍率);皮膚成分 (表皮、adnexa、および単核細胞浸潤の no 兆候) の正常な形態に注意してください。(B) POD 75 における拒絶反応における同種異系同種移植片の皮膚生検を、免疫抑制剤の低用量 (10x 倍率) で毎日処置した。注意表皮萎縮、adnexa 萎縮、単核細胞浸潤、血管周囲浸潤、および毛細血管血栓症。(C) POD 45 における同系同種移植片の筋生検 (10x 倍率);横紋筋の正常な形態に注意してください。(D) POD 98 上の拒絶反応における同種異系同種移植片の筋生検を、免疫抑制剤の低用量で毎日処置した (10x 倍率)。筋萎縮と単核細胞浸潤に注意してください。.(E) POD 45 における同系同種移植片の大腿動脈生検 (20 倍倍率);動脈の正常な形態に注意してください。.(F) POD 98 上の拒絶反応における同種異系同種移植片の大腿動脈生検を、免疫抑制剤のより低い用量で毎日処置した (20 倍倍率)。intimal 過形成、狭い内腔、および血管周囲浸潤に注意してください。スケールバー = 200 μ m (A~D);100μ m (EおよびF)。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
VCA のこのモデルの開発では、いくつかの重要な問題を検討しました。まず、移植片中に無傷の骨 (脛骨および腓骨)、骨髄、および皮膚を含むことが重要であった。成人ドナーからの臨床的な手の移植は、積極的に造血骨髄のかなりの量を転送しませんが, 骨髄ニッチの役割の研究は、より良いミラーリングされた長い骨ではなく、無傷の血管化骨を使用して, 結果露出した骨髄の線維症。さらに、閉鎖した骨の osteomyocutaneous のフラップの設計は伝染および出血の危険を減らす。骨髄および皮膚はいずれも、高度に免疫原性の組織であり、所望であれば免疫応答を誘発するために使用され得る。第2に、移植片が機能するために必要ではなく、複雑な骨接合および移植片の再 enervation を必要とする orthotopic モデルの必要性を排除する。これはまた、長期の外科的処置および動物の不快感11、12などの orthotopic モデルのよく知られた厄介な結果のいくつかを防ぐ。しかし、heterotopic の設計は、そのすべてが VCA 研究に大きな関心を持っている、骨や軟骨の機能的な結果測定だけでなく、筋肉機能を可能にしないことに注意することが重要です。第三に、移植片は、イメージングシステム、臨床フォローアップ、およびシリアル生検にアクセス可能である必要がありました。最後に、スループットの目的のために、グラフト手術は、合併症を伴わずに容易に行う必要があった。このような考慮事項を念頭において、osteomyocutaneous の修正ラット・モデルである VCA (ブラウン-ノルウェー) の膝と足首の間に、上にある皮膚とそれに関連する血管構造を含む、遠位の後肢が移植された。レシピエント上の鼠径部 (ルイス)。この場合、移植片への血管供給は、大腿動脈および静脈吻合を介して生じた。
皮膚は VCA 拒絶反応を監視する重要なキーファクターであるため、皮膚灌流をサポートする小動脈穿孔を維持するために移植片の調製に特異的な注意が取られた。このモデルを確立する際に、インドシアニングリーン (ICG) 血管造影 (結果は示さず) を用いた予備実験を行い、モデルの皮膚灌流設計を確認しました。
移植片が逆さまに配向されているので、移植片の遠位部分がより優れており、移植片の近位部分が劣っているように、よじれることを避けるために長い椎弓根が必要とされる。従って、ドナー大腿血管は可能な限り近位として分割されるべきであり、そしてレシピエント大腿動脈はできるだけ遠位に分割されるべきであることが強調されるべきである。
2人の外科医の同時参加はドナーの接木の最終的な準備/分離の間に推薦される;1人の外科医は、移植片分離を完了し、他方の外科医はレシピエント動物を麻酔して intubates し、吻合のために血管を準備し始めるべきである。スペースと機器が利用可能である場合、第三の外科医は、第二のレシピエント動物を準備することができ、両方のドナーの足は、VCA グラフトに使用することができます。外科医は、吻合前に最小の移植片虚血時間を確保するために互いに調整しなければならない。私たちの経験では、術後の死亡率のほとんどは麻酔の技術に起因しています。可能な場合は、チームの別のメンバーが手術中に麻酔の監視を担当することをお勧めします。このモデルを正常に実行するためには、基本的な微小血管技術を備えた訓練を受けた外科医が必要であることは言うまでもない。外科医の経験によって、モデルは2から6の外科試みに続いて首尾よく達成することができる。
同系ラットは、拒絶反応とは無関係の治癒力学を説明するための対照群として用いられてもよい。レシピエントラットの対脚は、特に画像化および生検を行う場合に、コントロールとして使用されてもよい。
移植された皮膚の上の毛皮の再生は、移植片灌流の成功の最良の適応症の1つである。一方、毛皮の損失、皮膚紅斑、および脱上皮化は、フラップの一部に対する拒絶事象および血液供給の減少を示すことがある。非常に高度な拒絶段階では、皮膚は壊死および剥離を示すことがある。同種移植筋量の減少は、denervation 萎縮のために高度な段階で示されている。動物は通常、体重 (10% まで) を失う最初の 7-10 日で、しかし、その後、回復し、繁栄します。レシピエントラット栄養を支持するために、最初の術後数日間に栄養強化水ゲル (例えば DietGel 回復) を添加することを推奨する。非常に少数の動物 (50 以上の実験動物のうち2つ) で、皮膚感染とオートファジーを目撃しました。
結論として、ここに提示された heterotopic、同種後肢 osteomyocutaneous VCA 移植片の修正モデルは、再現性のある汎用性の高い移植パラダイムを提供します。シリアル生検とイメージングは、拒絶反応イベントの時間経過に関する情報を提供します。この方法で研究することができる様々な臨床症状は、これから何年もの間に数多くの洞察に富んだ発見の可能性を秘めた、適応性の高いトランスレーショナルモデルになります。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作品は、賞を受けた Congressionally の医学研究プログラムを通じて、保健省国防長官の事務所によって支持されました。W81XWH-13-2-0057。意見、解釈、結論、および勧告は、著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine | Henry Schein | 5700850 | |
| Adventitia Scissors | ASSI | SAS15R8 | |
| Approximator Clamp (Double) | ASSI | ABB2V, ABB22V | |
| Approximator Clamp (single) | FST | 00398-02 | |
| Clamp Applying Forceps | ASSI | CAF4 | |
| Dissecting Scissors | ASSI | SDS18R8 | |
| Flushing blunt needle 27 G | SAI | ||
| Heparin Sodium | Sagent | 25021-400-30 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar | ASSI | 103000BPS03 | |
| Jewelers forceps #3 | FST | 11231-30 | |
| Ketamine HCl 100 mg/mL | Zoetis | 043-304 | DEA License required |
| Lactated Ringer Solution | Hospira | 0409-7953-03 | |
| Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose | Hospira | 0409-7953-09 | |
| Meloxicam | Henry Schein | 11695-6925-2 | |
| Micro forceps | ASSI | JFAL3 | |
| Micro needle holder | ASSI | B138 | |
| Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL | Astellas | 0469-3016-01 | |
| Suture, 10-0 Prolene | Ethicon | W2790 | or 10-0 Ethilon (2830) |
| Suture, 4-0 Coated Vicryl | Ethicon | J714D | |
| Vessel Dilator Forceps | ASSI | D5AZ | |
| Xylazine | VetOne | 13985-612-50 |
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