Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Summary

O allograft composto vascularized oferece benefícios Life-alterando aos receptores da transplantação, mas as causas biológicas da rejeição da corrupção e do vasculopatia permanecem mal compreendidas. O modelo cirúrgico do roedor apresentado aqui apresenta um modelo de transplante reprodutível e clinicamente relevante, permitindo que os pesquisadores avaliem eventos de rejeição e potenciais estratégias terapêuticas para prevenir sua ocorrência.

Abstract

O allotransplante composto vascularized (VCA) é um campo relativamente novo na cirurgia reconstrutiva. As realizações clínicas na VCA humana incluem transplantações da mão e da cara e, mais recentemente, parede abdominal, útero, e transplantes urogenital. Os resultados funcionais excederam as expectativas iniciais, e a maioria dos destinatários desfruta de uma melhor qualidade de vida. Entretanto, como a experiência clínica se acumula, a rejeição crônica e as complicações da imunossupressão devem ser abordadas. Em muitos casos onde os enxertos falharam, a patologia causativa tem sido vasculopatia isquêmica. Os mecanismos biológicos da rejeição aguda e crônica associados à VCA, especialmente vasculopatia isquêmica, são importantes áreas de pesquisa. No entanto, devido ao pequeno número de pacientes com VCA, a avaliação dos mecanismos propostos é melhor abordada em um modelo experimental. Vários grupos usaram modelos animais para abordar algumas das questões não resolvidas relevantes na rejeição de VCA e vasculopatia. Vários modelos de modelos envolvendo uma variedade de espécies são descritos na literatura. Aqui nós apresentamos um modelo reprodutível da aleta osteomyocutaneous do hindtopic do membro de VCA no rato que pode ser utilizada para a pesquisa translacional de VCA. Este modelo permite a avaliação seriada do enxerto, incluindo biópsias e diferentes modalidades de imagem, mantendo um baixo nível de morbidade.

Introduction

A cirurgia reconstrutiva para a perda catastrófica do tecido da amputação, de ferimentos da explosão, de malignidades, e de defeitos congenitais é limitada pela disponibilidade do tecido do paciente e da morbosidade adicional causada no local doador. Em alguns casos, como vítimas de queimadura ou amputados quadrilaterais, o tecido viável para a reconstrução não está disponível do paciente. Em 1964, o primeiro transplante de mão moderno foi realizado no Equador. Quando este era um sucesso técnico, o imunossupressão disponível na altura era insuficiente para impedir a rejeição, e a corrupção foi perdida em menos de 3 semanas¹. Em 1998 e 1999, os transplantes de primeira mão na era moderna de imunossupressão foram realizados em Lyon, França² e Louisville, Kentucky, EUA³. Pela primeira vez, os cirurgiões reconstrutivos poderiam substituir como com como. A transplantação da cara foi executada primeiramente em 2005⁴, e um número outros de corrupções de VCA é executado agora rotineiramente, tal como a parede abdominal⁵, uterine, e os transplantações urogenital⁶.

Ao contrário da transplantação contínua do órgão, a maioria de técnicas de VCA envolvem a presença da pele fornecedora altamente antigénica. A experiência clínica determinou que a rejeição aguda da pele é relativamente fácil de controlar, mas pode contribuir para a rejeição crônica dos tecidos e vasos subjacentes, que não respondem bem ao tratamento⁷. A disfunção vascular associada a uma resposta aloimune é um obstáculo mais ameaçante para o campo da VCA⁷. As macrovasculopatias levam a déficits de perfusão, cicatrização tardia e condições pró-inflamatórias. O grande-vaso agressivo confluente e a hiperplasia intimal focal focais ocorrem em receptores da transplantação da mão⁷. Adicionalmente, os microvasculopathies contribuem provavelmente às complicações de VCA também e podem mesmo conduzir aos eventos da rejeição. Quando os fatores imunes e nonimmune jogarem provavelmente um papel no vasculopatia de receptores da transplantação da mão, os mecanismos específicos que promovem a deficiência orgânica longe do ponto de origem da embarcação em VCA não são sabidos, particular no contexto da rejeição low-grade, crônica. Estas perguntas não respondidas necessitam o desenvolvimento de um modelo animal de VCA que permita a avaliação de série da corrupção durante o curso clínico da rejeição/manutenção e do vasculopathy de VCA. Tal modelo oferecerá insights sobre a rejeição e vasculopatia em face da imunossupressão, desafio infeccioso e/ou outras lesões traumáticas pós-operatórias^8,9.

É apresentado aqui um modelo osteomyocutaneous do retalho do hindtopic heterotópico do rato de aloeneic VCA. Baseado em modelos previamente publicados de VCA, este procedimento é tècnica fácil de executar, reprodutível em um grande número, e exibe a morbosidade e o incómodo mínimos ao animal do receptor. Este modelo foi projetado para permitir avaliações clínicas e histopatológicas da aceitação vs. rejeição de VCA, e fornece uma oportunidade de avaliar os mecanismos imunes e nonimmune subjacentes envolvidos na rejeição.

Protocol

Todas as cirurgias animais foram realizadas de acordo com os protocolos aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade de Louisville (protocolo aprovado pelo IACUC 18198) e o guia dos institutos nacionais de saúde (NIH) para o cuidado e uso de Animais de laboratório¹⁰. Brown-Noruega masculino quatro-mês-velho (RT1. Aⁿ) e 4-mês-velho masculino Lewis (rt1. A^l) ratos foram utilizados como doador VCA e receptores, respectivamente.

1. colheita do allograft do doador

1. Sedate o animal doador usando isoflurano vaporizado aplicado através de uma câmara.
2. Raspar a área doadora do enxerto (membro posterior), bem como as áreas de virilha e abdômen. Depois disso, trate com creme depilatório, a fim de reduzir a quantidade de fuzz deixados pelos cortadores.
3. Anestesiam profundamente os animais doadores usando cetamina intraperitoneal (IP) (60 mg/kg)/xilazina (15 mg/kg)/acepromazina (2 mg/kg). Administrar uma dose inicial de 0,2 mL/100 g de peso corporal e doses adicionais de 0,2 mL a cada h. Para a conveniência, é opcional executar esta etapa antes da etapa 2.
4. Monitore continuamente os animais enquanto estiver anestesia para respiração, temperatura corporal e profundidade da anestesia, usando o teste de reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
5. Administrar 30 U de solução de heparina por via subcutânea (SC) na área do scruff antes da cirurgia para prevenir a coagulação.
6. Use uma máscara, uma tampa de cabeça, um vestido descartável da isolação, e luvas descartáveis.
7. Coloque o doador supino animal em uma almofada de aquecimento. Produza um campo cirúrgico estéril pregando, esfregando, e drapejando a área cirúrgica que inclui os aspectos ventral e dorsal do pé. Don luvas estéreis.
8. Faça uma incisão da pele de 3 cm na concavidade da virilha usando a lâmina do bisturi #15 e reflita a almofada gorda inguinal lateralmente usando a tesoura da íris.
9. Expor os vasos femorais comuns e colocar um gancho de arame com uma faixa elástica para retrair os músculos abdominais.
10. Usando um microscópio de dissecação (40x), dissecar o pedículo proximalmente da emergência das embarcações femoral comuns o ligamento inguinal e distalmente à confluência de embarcações poplítea no enxerto.
11. Usando microclipes e pinça de joalhas bipolares, ligadura e divida os grandes ramos arteriais e venosos, tais como vasos femorais circunflexos laterais, vasos epigástrica caudais superficiais, a artéria safena e os vasos femoral caudais proximal, para mobilizar principais vasos femorais. Cauterizar quaisquer ramos pequenos usando multa pinça bipolar.
12. Faça uma incisão cutânea do centro da pele anterior cortada ao longo do lado ventral do membro posterior, para a área do tornozelo, usando tesouras de íris.
13. Corte o músculo grácil, bem como os outros músculos adutores embaixo dela, de forma vertical para expor e ligar os vasos geniculares proximal medial, os vasos pequenos de ramificação profunda e o nervo ciático.
    Nota: Neste ponto, em uma mesa cirúrgica separada, o outro cirurgião deve intubar e anestesitizar (2,5% – 3% isoflurano) o animal receptor; Isto permite que os cirurgiões Preparem o local cirúrgico do receptor a tempo para a colocação da corrupção e minimizem o tempo isquêmico da corrupção.
14. No animal doador, faça incisões cutâneas circunferenciais ao nível do joelho e tornozelo. Desarticule o joelho e o tornozelo, remova o músculo e o tecido estranhos, e faça uma incisão vertical da pele no lado dorsal do hindmembro para liberar a corrupção. Neste ponto, o enxerto (composto de fíbula e tíbia, coberto com músculos relacionados e ilha da pele nutrida por seus perfuradores) é conectado apenas pelo pedículo.
15. Coloque as braçadeiras pequenas o mais proximalmente possível na artéria e na veia femoral, e corte o pedículo como proximalmente como possível, perto do ligamento inguinal.
16. Para liberar o enxerto de sangue, injetar soro fisiológico heparinizado (30 U/mL) na artéria femoral usando uma cânula sem corte de 27 G de rubor.
    Nota: Dilatar a artéria antes da liberação da heparina permite fácil acesso para a inserção da cânula. Durante o flush, monitore de perto a saída da veia femoral. Uma vez que o fluido desobstruído sai da veia femoral, pare o flush.
17. Enrole o enxerto isolado em gaze morna e embebido em soro fisiológico e transporte-o imediatamente para a mesa do animal beneficiário. Neste momento, o local cirúrgico do receptor já deve estar preparado para a anastomose vascular.
18. Após a colheita do enxerto, eutanizar imediatamente o rato doador via pneumotórax.

2. cirurgia de transplante de receptores

1. Após a indução de sedação utilizando isoflurano vaporizado aplicado através de uma câmara, anestesiando profundamente o animal receptor através de um tubo endotraqueal controlado por ventilador e 2,5% – 3% de isoflurano.
   Nota: Nesta fase, o rato doador ainda está anestesiado.
2. Monitore continuamente a frequência cardíaca, a frequência respiratória, a temperatura corporal e a profundidade da anestesia do animal receptor, usando o teste de reflexo de retirada da pinça do dedo do pé.
3. Para prevenir a desidratação e a hipoglicemia, Injete 2 mL de solução de Ringer com lactato e 2,5% de dextrose por via subcutânea no início e outros 2 mL no final da cirurgia.
4. Raspar a área da virilha, em seguida, tratar com creme depilatório, a fim de reduzir a quantidade de fuzz deixados pelos cortadores.
5. Use uma máscara, uma tampa de cabeça, um vestido descartável da isolação, e luvas estéreis.
6. Coloque o animal supino em uma almofada de aquecimento. Aplique a pomada ophthalmic para impedir abrasões córneos durante a anestesia. Produza um campo cirúrgico estéril pregando, esfregando, e drapejando a área cirúrgica.
7. Faça uma incisão da pele de 3 cm na concavidade da virilha usando a lâmina do bisturi #15 e reflita a almofada gorda inguinal lateralmente usando a tesoura da íris.
8. Expor os vasos femorais comuns e colocar um gancho de arame com uma faixa elástica para retrair os músculos abdominais.
9. Ligate e dividir ramos de Murphy.
10. Usando 10-0 nylon suturas interrompidas, anasto, vasos de doadores para vasos receptores através de técnica venosa de ponta a ponta e técnica de ponta a extremidade arterial. Solte gradualmente os grampos da artéria e, em seguida, a veia. Monitore os locais anastomotic para sangrar e adicione suturas adicionais se necessário.
11. Avaliar visualmente a anastomose vascular, a fim de assegurar a efetiva reperfusão do enxerto.
12. Inset o enxerto no bolso inguinal e orientá-lo de cabeça para baixo, com a articulação do tornozelo superior e inferior da articulação do joelho.
13. Usando suturas de dobrando, prenda a corrupção aos músculos adjacentes. Feche a pele através da pele horizontal interrompida do colchão 4-0 Suturas absorvíveis.
14. Retire o animal receptor da anestesia e desmame-lo fora do ventilador. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para o suporte térmico.
    Nota: O tempo de operação total é entre 3 a 4 h, dependendo da experiência do cirurgião e familiaridade com o procedimento cirúrgico.
15. Administrar Meloxicam (1 mg/kg) por via subcutânea para a supressão da dor e monitor até que o animal é totalmente recuperado e móvel.

3. monitoração do receptor de VCA

1. Abrigar os ratos receptores isoladamente e monitorá-los diariamente para sinais clínicos de dor, desidratação, perda de peso, e diminuição da atividade, além de falha cirúrgica (para os primeiros 48 – 72 h) ou rejeição. Administrar Meloxicam por via subcutânea (1 mg/kg) diariamente durante os primeiros 3 dias para a supressão da dor.
2. Com base no Endpoint de pesquisa, escolha um fármaco imunossupressor a ser administrado.

4. histologia

1. anestesia inalatória de isoflurano (2,5% – 3%), obter a pele seriada e as biópsias musculares subjacentes do enxerto doador nos momentos desejados. A pele deve ser esfregadela e drapeada antes de obter uma biópsia, e um campo estéril e técnica deve ser realizada.
2. Feche a ferida com um a dois pontos, usando suturas 4-0 absorvíveis. Devolva o animal à sua gaiola e deixe-o recuperar da anestesia.
3. Fixar os tecidos biopsiados em tubos separados em formalina a 10%.
4. No ponto de tempo terminal e anestesia inalatória de isoflurano (2,5% – 3%), tomar uma biópsia de pele maior que abrange a fronteira doador/receptor. Localize cuidadosamente o par de coleira do navio no local das anastomoses; o local apropriado será aparente devido às suturas. Tome as amostras desejadas da embarcação da artéria e/ou da veia. Fixar todas as amostras separadamente em formalina a 10%. Após a coleta de amostras de tecido, e enquanto o animal ainda está anestesia isoflurana, imediatamente eutanizar o animal via pneumotórax.
5. Usando um processador do tecido (ou a outra técnica de incorporação preferida), parafina-incorpore cada biópsia em seu próprio bloco. Para amostras de pele, orientar o tecido de modo que todas as camadas epidérmicas e dérmicas podem ser vistas em uma única fatia. Para as amostras de vasos, orientar os vasos de modo que as secções transversais podem ser obtidas.
6. Usando um micrótomo, corte 6 seções μm-grossas e aplique-as às corrediças para a coloração da hematoxilina e da eosina (H & E).
7. Mancha para H & E usando um protocolo padrão.
8. Obter imagens representativas de todas as amostras de tecido desejadas utilizando técnicas de microscopia de campo.

Representative Results

O modelo osteomyocutaneous do retalho do hindtopic do membro de VCA do rato permite a sobrevivência a longo prazo do allograft o immunosuppression. O modelo é confiável, reprodutível e simples de executar. A aleta é bem escondida na área do virilha e constitui a morbosidade e o incómodo mínimos ao animal. A apresentação cutânea é uma manifestação clínica da sobrevida e rejeição do aloenxerto (Figura 1). O projeto da aleta permite a monitoração clínica bruta e cria uma oportunidade para várias técnicas da imagem latente, tais como o laser Doppler (Figura 2). Biópsias seriadas da pele, músculo e artérias possibilitam a realização de acompanhamento histopatológico e análise em diferentes estágios de rejeição (Figura 3).

Figura 1 : Imagens representativas de animais transplantados. (A) sobrevida singeneica de VCA a longo prazo, sem tratamento de imunossupressão, no dia pós-operatório 45 (Pod 45); Anote a diferença no sentido do crescimento da pele devido à orientação invertida da corrupção. (B) VCA alogénica, tratada diariamente com um fármaco imunossupressor, no pod 5. C) sobrevivência alogénica de VCA a longo prazo, tratada diariamente com um fármaco imunossupressor, no pod 40; Anote o crescimento normal da pele indicando a perfusão apropriada da corrupção, sem sinais da rejeição. (D) VCA allogeneic na rejeição em POD 33. O tratamento de imunossupressão foi interrompido completamente no POD 14; observar os sinais clínicos de rejeição (Atrofia cutânea, descamação, perda de pele). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Sistema da imagem latente do laser Doppler para monitorar o revascularização superficial da pele do allograft. O aloenxerto apresentado foi monitorado nos dias pós-operatórios 4, 14 e 64. Os painéis à esquerda mostram a perfusão sanguínea medida pela imagem Doppler, enquanto os painéis à direita mostram a área sendo fotografada pelo Doppler. Anote a mudança da perfusão sanguínea mínima imediatamente borne-VCA ao revascularização cheio da aleta no dia 64. Este allograft foi mantido o imunossupressão apropriado sem sinais da rejeição. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Histopatologia de H &Amp; E do allograft em transplantações syngeneic vs. allogeneic. (A) biópsia cutânea de um aloenxerto singeneico no pod 45 (ampliação de 10x); observar a morfologia normal dos componentes da pele (epiderme, adnexa e nenhum sinal de infiltração de células mononucleares). (B) biópsia cutânea de um aloenxerto alogênico em rejeição ao Pod 75, tratado diariamente com uma dose mais baixa de um imunossupressor (ampliação de 10x); Anote a atrofia epidérmica, a atrofia do adnexa, a infiltração mononucleares da pilha, a infiltração perivascular, e o thrombosis capilar. (C) biópsia muscular de um allograft syngeneic em vagem 45 (ampliação 10x); Observe a morfologia normal do músculo estriado. (D) biópsia muscular de um aloenxerto alogênico em rejeição ao Pod 98, tratado diariamente com uma dose mais baixa de um imunossupressor (ampliação de 10x); Anote a atrofia do músculo e a infiltração mononucleares da pilha. (E) biópsia da artéria femoral de um allograft syngeneic em Pod 45 (ampliação 20x); Observe a morfologia normal da artéria. F) biópsia da artéria femoral de um aloenxerto alogênico em rejeição ao Pod 98, tratada diariamente com uma dose mais baixa de um imunossupressor (ampliação de 20x); Anote a hiperplasia intimal, o lúmen estreito, e a infiltração perivascular. Barra de escala = 200 μm (A–D); 100 μm ( e e F). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

No desenvolvimento deste modelo de VCA, foram consideradas várias questões-chave. Primeiro, foi importante incluir osso intacto (tíbia e fíbula), medula óssea e pele no enxerto. Quando os transplantes clínicos da mão dos doadores adultos não transferirem quantidades significativas de medula ativamente hematopoiéticas, os estudos do papel do Niche da medula são espelhados melhor usando um osso intacto, vascularizado um pouco do que um osso longo cortado, que resulte em fibrose da medula exposta. Além disso, o projeto osteomyocutaneous do retalho do osso fechado reduz o risco de infecção e de sangramento. A medula óssea e a pele são tecidos altamente imunogênicos, que podem ser usados para desencadear uma resposta imune, se desejado. Segundo, não foi necessário que o enxerto fosse funcional, eliminando a necessidade de um modelo ortotópico que requeira osteossíntese complexa e re-enervação do enxerto. Isso também previne algumas das conseqüências problemáticas bem conhecidas dos modelos ortotópicos, como um procedimento cirúrgico prolongado e desconforto animal^11,12. No entanto, é importante notar que o delineamento heterotópico não permite medidas funcionais de desfecho ósseo e cartilaginoso, bem como a função muscular, que são de interesse significativo na pesquisa da VCA. Em terceiro lugar, o enxerto precisava ser acessível a sistemas de imagem, acompanhamento clínico e biópsias seriadas. Finalmente, para fins de throughput, as cirurgias de enxertia precisavam ser prontamente realizadas sem complicações. Com estas considerações na mente, um modelo osteomyocutaneous do rato modificado de VCA foi desenvolvido em que o hindmembro longe do ponto de origem, entre o joelho e o tornozelo do doador (Brown-Noruega), incluindo a pele sobrejacente e a vasculatura associada, foi transplantado no região inguinal no receptor (Lewis). Neste caso, a fonte vascular à corrupção ocorreu através das anastomoses da artéria e da veia femoral.

Como a pele é um importante fator chave para monitorar a rejeição da VCA, foi feito um cuidado específico na preparação do enxerto para preservar os perfuradores de pequena artéria que suportavam a perfusão cutânea. Ao estabelecer esse modelo, realizamos experimentos preliminares utilizando angiografia com indocyanine Green (ICG) (resultados não mostrados) para confirmar o desenho da perfusão cutânea do modelo.

Uma vez que o enxerto é orientado de cabeça para baixo, de modo que a parte distal do enxerto é superior e a parte proximal do enxerto é inferior, um pedículo longo é necessário para evitar a torção. Portanto, deve-se ressaltar que os vasos femorais doadores devem ser divididos o mais proximalmente possível e que a artéria femoral receptora deve ser dividida o mais distal possível.

A participação simultânea de dois cirurgiões é recomendada durante a preparação/isolação final do enxerto de doador; um cirurgião deve terminar o isolamento do enxerto, enquanto o outro cirurgião anestesiza e intubar o animal receptor e começa a preparar os vasos para as anastomoses. Se o espaço e o equipamento estão disponíveis, um terceiro cirurgião poderia preparar um segundo animal do receptor e ambas as pernas doadoras podem ser usadas para enxertos de VCA. Os cirurgiões devem coordenar-se um com o outro para assegurar o tempo isquêmico mínimo da corrupção antes das anastomoses. Em nossa experiência, a maioria das mortalidades postoperative é atribuída à técnica da anestesia. Se possível, recomendamos que um membro diferente da equipe deve ser responsável pelo monitoramento da anestesia durante a cirurgia. Escusado será dizer que, a fim de realizar este modelo com sucesso, é necessário um cirurgião treinado com técnicas microvasculares básicas. Dependendo da experiência do cirurgião, o modelo pode ser conseguido com sucesso após duas a seis tentativas de cirurgia.

Os ratos syngeneic podem ser usados como um grupo de controle para considerar a dinâmica de cura não relacionada à rejeição. O pé contralateral do rato do receptor pode igualmente ser usado como um controle, especial ao executar a imagem latente e as biópsias.

A rebrota de peles sobre a pele transplantada é uma das melhores indicações de perfusão do aloenxerto bem-sucedido. Por outro lado, perda de pele, eritema cutâneo e desepitelização podem indicar um evento de rejeição e diminuição do suprimento sanguíneo para algumas partes do retalho. Em uma fase de rejeição muito avançada, a pele pode mostrar necrose e esfoliação. Uma diminuição na massa do músculo do allograft é mostrada em um estágio avançado por causa da atrofia da denervação. Os animais geralmente perdem peso corporal (até 10%) nos primeiros 7 – 10 dias, mas depois recuperar e prosperar. Recomendamos a adição de gel de água nutritiva fortificada (por exemplo, DietGel Recovery) nos primeiros dias pós-operatórios para apoiar a nutrição de ratos receptores. Em um número muito pequeno de animais (dois fora de mais de 50 animais experimentais), nós testemunhamos a infecção de pele e a autofagia.

Em conclusão, o modelo modificado da corrupção osteomyocutaneous do Heterotopic, allogeneic do hindmembro de VCA apresentado aqui oferece um paradigma reprodutível, versátil da transplantação. As biópsias e a imagem latente de série oferecem a informação no curso do tempo de eventos da rejeição. A variedade de sintomas clínicos que podem ser estudados com este método fazem-lhe um modelo translacional altamente adaptável com o potencial para descobertas perspicazes numerosas nos anos para vir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acepromazine	Henry Schein	5700850
Adventitia Scissors	ASSI	SAS15R8
Approximator Clamp (Double)	ASSI	ABB2V, ABB22V
Approximator Clamp (single)	FST	00398-02
Clamp Applying Forceps	ASSI	CAF4
Dissecting Scissors	ASSI	SDS18R8
Flushing blunt needle 27 G	SAI
Heparin Sodium	Sagent	25021-400-30
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar	ASSI	103000BPS03
Jewelers forceps #3	FST	11231-30
Ketamine HCl 100 mg/mL	Zoetis	043-304	DEA License required
Lactated Ringer Solution	Hospira	0409-7953-03
Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose	Hospira	0409-7953-09
Meloxicam	Henry Schein	11695-6925-2
Micro forceps	ASSI	JFAL3
Micro needle holder	ASSI	B138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL	Astellas	0469-3016-01
Suture, 10-0 Prolene	Ethicon	W2790	or 10-0 Ethilon (2830)
Suture, 4-0 Coated Vicryl	Ethicon	J714D
Vessel Dilator Forceps	ASSI	D5AZ
Xylazine	VetOne	13985-612-50