Summary
İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.
Abstract
İn vitro invazyon assay bir Boyden odasında bir protein açısından zengin matris kullanır ve kanser hücresi metastani ilk adımlarına benzer bir süreçte matris ve gözenekli bir membran geçmesine kültürlü hücrelerin yeteneğini ölçmek için. Test edilen hücreler, gen ifadesi için değiştirilebilir veya invazyon potansiyelinin değişikliklerini test etmek için inhibitörler ile tedavi edilebilir. Bu deney, hücre istilasını teşvik eden potansiyel onkogenleri keşfetmek ve karakterize etmek için fare meme tümör hücrelerinin agresif fenotipini sınar. Ancak bu teknik çok yönlü olabilir ve birçok farklı uygulamaya adapte edilebilir. Deney bir gün içinde yapılabilir ve sonuçlar ışık mikroskobu tarafından bir günden az bir sürede elde edilir. Sonuçlar, karşılaştırma ve analiz için işgalci hücrelerin sayısının sayılarını içerir. İn vitro invazyon assay, daha önce daha fazla yer alan vivo assays olarak ilk değerlendirme olarak kullanılabilecek bir kültürde hücre davranışını belirlemek için hızlı, ucuz ve net kesilmiş bir yöntemdir.
Introduction
İn vitro invazyon tahlil bir hücre yeteneğini bir protein kaplı membran üzerinden göç için ölçüm yaparken yararlı bir araç olabilir, metasjen ilk adımlara benzer. Malign kanser hücrelerinin önemli bir özelliği yoluyla göç ve yakın dokularda istila yeteneğidir. Yayılan veya metaslenmiş kanser daha fazla tedavi zorlukları pozlar ve uzun vadeli hayatta kalma düşük oranlar vardır, lokalize tümörlerin tedavisinde daha kolay ve uzun vadeli hayatta kalma yüksek oranlar var. Metassel için, kanser hücrelerinin primer tümör bırakmak ve dolaşım veya lenfatik sisteme göç gerekir, ekstrasellüler matris ve Bodrum membranı üzerinden geçen gerektiren bir süreç1. Epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) denilen süreçte, tümör hücreleri hücre-hücre temaslarını kırmalı, yön geçirmeli ve yakındaki kan veya lenf damarlarını işgal etmelidir. Bu adımlar kanser ölümcül yapabilir ne olduğundan bu metastaf Cascade ilk adımlar büyük ilgi vardır. Metastakların erken adımlarında yer alan genetik ve epigenetik faktörler, büyük miktarda araştırmanın odağı olmaktadır, ancak bu erken adımları hem in vivo hem de vitro olarak test etmek için doğru ve güvenilir deneysel araçlar gereklidir.
Yara iyileşmesi (çizik) gibi hücre göç değişiklikleri ölçmek için araçlar veya Soft agar gibi 3D ortamlarda büyüme kısmen metastazın erken adımlarını ölçmek için deneysel yöntemler ihtiyacını ele alabilir, ama bir tahlil invazyonu ölçmek için karmaşık bir tümör mikroçevre içinde vücutta meydana beri daha zorlu. İnvazyon ve metastaz açısından önemli faktörleri belirlemek için ilaçların veya gen değişikliklerinin taranması amacıyla, kültürlü hücrelerle içinde vitro olarak kullanılabilecek bir sistem ve in vivo metastatik hücrelerin karşılaştığı zorlukları taklit eden invazif tahlil2, 3' ü yapın. Meme kanseri kadınlarda kanser en sık teşhis türü ve kadınlarda kanser ölümü ikinci önde gelen nedeni, bu yüzden meme kanseri hücre invazyonu ve metastatik sorumlu genler anlayış kamu sağlığı için kritik öneme sahiptir. Dahası, fare hücreleri meme kanseri ve ilerlemesini incelemek için yararlı bir model sistemidir.
İn vitro invazyon tahlil iki büyüme medya odaları gözenekli bir membran ile ayrılır Boyden odası montaj dayanmaktadır3. Tümör mikroortamını taklit etmek için, bir oda içindeki hücreleri diğer bir kemoatraktan 'dan ayıran ve bir Bodrum membran bariyeri olarak hareket eden protein bakımından zengin bir jel de dahil edilir. Chemoattractant doğru göç etmek için, hücreler önce protein açısından zengin bariyer geçmesi gerekir sonra gözenekli membran geçmesi-metastatik hücrelerin stroma üzerinden göç nasıl benzer bir süreç. Protein açısından zengin jel denemenin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir, ancak genellikle kollajen veya Bodrum membran ekstresi oluşur (örneğin, Matrigel)4. Bu proteinler, proteoglikanlar ve büyüme faktörlerinin karmaşık bir karışımıdır, ancak çoğunlukla lamininlerin ve kollajen IV 4,5oluşur. Hücreler daha sonra genellikle polikarbonat, polyester, veya Politetrafloroetilen (PTFE) yapılmış bir gözenekli membran geçmesi gerekir. Membranlar, bir protein jeli (genellikle collagens) ile veya olmadan ticari olarak satın alınabilir veya jel ayrı olarak satın alınabilir ve eklenebilir. Gözenek boyutu hücre boyutuna göre ayarlanabilir. Gözenek boyutları 0,4-8,0 μm ' den itibaren kullanılabilir durumdayken, sadece 3,0-8,0 μm ' den gelen gözenekler hücre göçü için yeterince büyüktür. İstila tahlil, hücrelerin göç ve istila yeteneğine karşı inhibitörlerinin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. İçinde bulunan tam tümör mikroçevre eksik iken Vivo, in vitro invazyon tahlil hayvan modelleri için ihtiyaç minimize ederken kısa bir süre içinde birçok koşul tarama yararlıdır. Bu deneylerin amacı, şüpheli onkogenler gen ifadesi karşılaştırmak ve kanser hücresi davranış ve hastalık saldırganlık içinde vitro invazyon tahlil ve diğer testleri kullanarak etkilerini belirlemek için. Genel olarak, invazif tahlil, nispeten ucuz, basit ve uyarlanabilir bir yöntem olmakla beraber metastatik potansiyeli belirlemek için tutarlı, nicel ve hızlı sonuçlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ve Yöntemler Villanova Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından yetkilendirilmiş olarak gerçekleştirildi.
1. kültürlü fare mammary tümör hücrelerinde gen Ifadesi
- İlk olarak, test edilecek hücre satırlarını hazırlayın.
-
BALB/cV fareler bir üreme kolonisi kullanın. Bu fareler fare meme tümör virüsü Balb/cV strain taşımak, süt6,7içinde pups iletilir. 50 üreme kadınların yüzde 10 ay meme tümörleri geliştirmek.
- Bir tümör hücresi hattı kurmak için, ımanuc onaylı bir protokol kullanılarak tümör taşıyan barajın feda edilmesi. 70% EtOH içinde karın cildi ıslatın ve laminar akış kaputunda steril koşullarda tümör çıkarın. Tümörler subkütan, bu yüzden peritonumu delmemek için özen yapın.
- Küçük bir miktar steril Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile bir petri çanak içinde nekrotik olmayan alanlardan tümör parçaları yerleştirin ve steril bir jilet ile çok ince kıyma.
- 5 mL Dulbecco modifiye kartal orta veya DMEM (4,5 g/L glikoz, fenol kırmızı ve L-glutamin) içeren bir T25 hücre kültürü Flask için dağınık hücre kümeleri transfer 50% fetal Sığır serum veya FBS ve% 1 antibiyotik/antimikozik solüsyon. % 5 Co2 ve 37 °c ' de% 100 nem ile bir kuluçte tedavi hücre kültürü şişeler hücreleri büyümek.
- 24-48 h 'den sonra yapışmayan hücreleri yıkayın ve DMEM 'i 50% FBS ve% 1 antibiyotik/Antimikotik çözelti ile değiştirin. Hücreleri kuluçyanına geri dön.
- Sıvı kültürü ortamını her 3 günde bir değiştirin.
- 90% confluent olduğunda Hücreleri Böl veya geçişi yapın. Kültür ortamını çıkarın ve HBSS (kalsiyum veya magnezyum olmadan) ile yapışan hücreleri yıkayın. Hücreler yuvarlanmış ve ayrılıncaya kadar 37 °C ' de 1-5 dakika için 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi olan hücreleri kulyur. Taze kültür medyasında seyreltmeli hücreler 1:10 ve yeni bir Flask ekleyin. T-25 hücre kültürü Flask 5-8 mL kültür ortamı, 5 mL HBSS yıkama ve 1 mL tripsin-EDTA geçiş gerektirir. Flask 'a geri dön.
- İlk geçişte% 40, sonra ikinci geçit sonra% 30, sonra üçüncü geçit sonra% 20 ve sonunda tüm sonraki pasajlar için% 10 FBS konsantrasyonu azaltın. Standart DMEM orta% 10 FBS ile büyüme kurma süreci dört pasajlar ve 2-8 ay gerektirir.
-
Hücre hattı (ler) kurulduktan sonra, shRNA 'nın mRNA veya NıSPR 'yi hedefleyerek temel olmayan genler için transfeksiyon yoluyla şüphelenilen ongenlerin ifadesini değiştirin.
- Tutarlı sonuçlar için Batı leke ve/veya RT-qPCR tarafından doğrulanmıştır bireysel klonlar ile antibiyotik dirençli istikrarlı hücre hatları kurmak, ancak, geçici transfeksiyonlar aynı zamanda tahlil sadece 22 h gerektirir beri çalışabilirsiniz. ile kontrol hücre hatları özel olmayan hedef dizileri de gereklidir.
2. In vitro Istilası tahlil
- Bir T25 Flask kadar uyum fare meme tümör hücreleri büyümeye 70-90 gün 1 deneme için confluent.
Not: Diğer hücre hatları veya deneysel koşullar farklı hücre kültürü medya gerektirebilir. Örneğin, Eğer hormon duyarlı meme kanseri hücreleri test ediliyor, kömür filtre serum östrojen veya diğer hormon reseptörleri etkinleştirmek bileşikleri kaldırmak için gerekli olabilir. - Bir hücre kültürü kaputu yaklaşık 20 dakika için oda sıcaklığına (-20 °C depolama) ısıtarak Boyden oda ekler hazırlayın. Kullanılmayan ekler için dondurmayı çözme döngüleri kaçının. Her deneme için her hücre satırı için istatistiksel olarak geçerli veri oluşturmak üzere üç ekler (çoğaltır) kullanın.
- Pre-warmed 37 °C serum-ücretsiz DMEM medya iyi ve sonra Ekle ekleyin. 24-kuyu yemekleri için tasarlanmış ekler için, kuyu ve daha sonra 500 μL serum-ücretsiz DMEM için 500 μL eklemek gözenekli membran ve jel her iki tarafta sulu böylece eklemek için.
Not: 6-kuyu tabağı için tasarlanmış büyük uçlar için, her iki tarafta da 2 mL serum-ücretsiz DMEM kullanın.
- Pre-warmed 37 °C serum-ücretsiz DMEM medya iyi ve sonra Ekle ekleyin. 24-kuyu yemekleri için tasarlanmış ekler için, kuyu ve daha sonra 500 μL serum-ücretsiz DMEM için 500 μL eklemek gözenekli membran ve jel her iki tarafta sulu böylece eklemek için.
- Bir 37 ° c hücre kültürü kuluçkucu ile çanak yerleştirin 5% CO2 ve% 100 nem en az 2 h için iyice hidrat ve acclimate.
- Büyüme ortamını kaldırarak ve hücreleri 5 mL HBSS ile durulama ile hücreleri hazırlayın.
- HBSS 'yi çıkarın ve 37 °C ' de 1-5 dk için 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin veya hücreler yuvarlatılmış olarak görünür veya Flask 'den dekolmanı gösterebilir.
- Tüm hücreleri ayırmak için Flask hafifçe dokunun. 5 mL DMEM + 10% FBS hücrelerinde resuspend ve steril 15 mL Santrifüjü tüp transfer.
- Hücreleri yavaşça Pelet için 5 dakika 1.000 x g de santrifüjler. Ortamı çıkarın ve hücreleri yeniden pelletini 5 ml serum-ücretsiz dmem ile değiştirin.
- Santrifüjleme ve süspansiyonu toplam 3 yıkanma için iki kez daha serum-ücretsiz medyada tekrarlayın.
- Son 5 ml 'lik serum-ücretsiz dmem hücrelerinde iyice pelletini ve hücrelerin hiçbir kümeleri olduğundan emin olun.
- Bir hemokytometer kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin. Sadece uygun hücreleri say. Hücre süspansiyon 5 x 104 hücreler/mL 5 ml serum-ücretsiz dmem için seyreltin.
Not: Bu konsantrasyon verir 2.500 bir 24-kuyu çanak her Ekle hücreleri. Bu hücre sayısı, yüksek göç ve istila oranları ile agresif kanser hücreleri için yeterlidir. Daha az agresif hücre çizgileri, gözlemlenebilir işgal hücreleri için ek başına 10.000 hücreye kadar daha fazla hücre gerektirebilir. Azaltılmış hücre istilası bekleniyorsanız, hücre numarasını artırarak işgal hücrelerini maksimize düşünün. Artan hücre istilası beklenirse, daha az hücre ile başlayın. - Hücre kültürü çanak kuluçca çıkarın ve hafifçe kesici uç gelen medya Aspire. Ekle kaldırın ve kuyu gelen medya Aspire. Hızlı çalışma, alt odasına kemoatraktan ekleyin. 24-kuyu çanak için, 5% FBS ile DMEM 750 μL ekleyin.
- Kuyusu içine yerleştirin ve eklemek hücreleri ekleyin. 24-kuyu tabağı için 500 μL hücre süspansiyonu kullanın. 6-kuyu çanak eklemek için, 2,5 mL chemoçekmek ve hücre 2 mL kullanın. Membran her iki tarafında hava kabarcıkları mevcut olduğundan emin olun.
- 22 h için hücre kültürü kuluçk için çanak dönün.
- 22 saat sonra, düzeltmek ve hücreleri leke. Sabitleme için 1% civarında formaldehite, 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın.
- Temiz bir 24-Well hücre kültürü çanak, her Ekle için bir iyi olduğu için bireysel kuyular için fiksatif 1 ml ekleyin.
- % 10 etanol (v/v) ile PBS çözeltisi% 0,1 kristal menekşe (w/v) boyama çözeltisi (taze yapılmış) hazırlayın. Benzer şekilde, her bir Ekle için 24-iyi kültür çanak temiz bir kuyu için boyama çözeltisi 1 mL ekleyin.
- Her bir kesici uç bir seferde forseps ile çıkarın ve taşınamaz hücreleri kaldırmak için membranın üst tarafını takın ve sıkıştırın içinde steril bir pamuklu çubuk yerleştirin.
- İkinci bir pamuklu çubukla tekrarlayın. Membran oldukça güçlü, çok nazik bir basınç iken sürüntü membranın bütünlüğünü tehlikeye değil.
- Kalan tüm medyayı eklemin içinden çıkarın ve ayrılmış hücreleri yıkamak için 750 μL PBS ekleyin.
- PBS çıkarın ve yıkama tekrarlayın. Membranın alt tarafındaki taşınan hücreleri düzeltmek için, eklemi iyi içeren bir sabitleme içine yerleştirin. Tüm ekler için tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika için ekler düzeltin.
- Düzeltmesi aşağıdaki kesici uç kaldırın. 750 μL PBS ile kesici uç yeniden yıkayın.
- Tüm taşınan ve sabit hücreleri lekelemek için boyama solüsyonu ile kuyun içine yerleştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika hücreleri leke.
Not: 6-well çanak uçlar için, 2 ml fikreatif çözelti, 2 ml boyama çözeltisi ve 2 mL PBS yıkama kullanın.
- Ekler Solusyon için damıtılmış su ile bir kabı kullanın. Kesici uçları çıkarın ve damıtılmış suya dalın ve su, kesici uç kapalıyken suya daldırın.
- Herhangi bir fazla su damlacıkları çıkarın ve kuru (genellikle bir gecede) hava için bir filtre kağıda yana üzerine ekler yerleştirin.
- Her bir Ekle için temiz bir cam mikroskop slayt etiketleme ve slayt ortasına mikroskop Daldırma yağ küçük bir damla yerleştirmek için görüntüleme için membran hazırlayın.
- Plastik kesici uç içindeki membranın çevresini kesmek için bir neşter kullanarak membranı kesici uç üzerinden ayırın.
- Forseps kullanarak membran çıkarın ve yerine tutmak için slayt üzerinde yağ damlası üstünde yer.
Not: Membranlar çok ince ve çok hafiftir, bu yüzden yumuşak hava akımı ile kolayca kaybolabilirler.
3. görüntüleme ve analiz
- Gözenekli membranların berrak olduğundan ve kristal menekşe ile boyama hücreleri onlara kontrast vermek, hücreleri görmek için bir bileşik ışık mikroskop kullanın. Birçok numune için ölçmek için bir kamera ve/veya yazılım kullanın ama gerekli değildir. Hücreleri 5x, 10X veya 20X büyütmede görüntüleyin. Miktar için, 10X büyütmede birden fazla, çakışan olmayan görüntüler kullanın. Alternatif olarak, membran üzerindeki tüm taşınan hücreleri 10X büyütmede sayabilirsiniz.
- Tüm örnekler için alan başına işgal hücrelerinin veya hücrelerin toplam sayısını belirleyin. Her deney için, üç çoğaltma ekler ile tahlil her koşulu gerçekleştirin ve istatistiksel olarak yararlı sonuçlar için birden çok kez tekrarlayın.
- Farklı büyüme hızları ve göç oranlarıyla farklı hücre çizgilerini karşılaştırırken, bir protein matrisinden işgal eden hücreleri karşılaştırmak ve protein matrisli olmayan bir Boyden odası montajını karşılaştırmak için paralel bir deney yapın (yalnızca taşınan hücreler). Her hücre hattı için yüzde invazyonu hesaplayın (işgal edilen hücrelerin sayısı/göç edilen hücrelerin sayısı x 100%).
Not: Bu yaklaşım, istila oranını göç oranlarına karşılaştırmanıza yardımcı olabilir. Aynı hücre çizgisine uygulanan farklı koşullar karşılaştırırsanız, tek başına istila hesaplamak daha alakalı hesaplamalardır. Membranın dış kenarı bazen merkezi alanlardan daha yüksek sayıda hücreye sahiptir ve bu nedenle daha az doğrudur. Bu durumda, bu hücreleri miktardan dışlayın ve tüm hücrelerin bir tekrar denemede bir pamuk çubukla kaldırıldığından emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir protein matrisinin içinde bulunan bu in vitro invazyon yöntemi, fare meme tümör hücrelerinin agresif fenotipleri ve Onkojenik hücre davranışlarını, çinko parmak proteini ZC3H88' in değiştirilmiş ifadesiyle değerlendirmek için kullanılmıştır. Aynı zamanda 3D ortamlarda hücre göç ve büyüme incelemek diğer yaklaşımlar ile birlikte, bu tümör hücre hatları Zc3h8 ifade daha yüksek düzeyde, veya bir Plasmid tarafından Promoter-aracılı ifade tarafından, hücre hızlı oranlarda sonuçlandı bulundu proliferasyon, hızlı göç, 3D ortamlarda büyüme ve in vitro invazyon tahlil8artan invazyonu. Tersine, shRNA yapıları tarafından azalan ifade daha az agresif proliferasyon, göç ve istila sonuçlandı8. Bu sonuçlar, Zc3h8 daha yüksek ifade, hızlı bir şekilde ortaya çıkan daha büyük tümörlerin ürettiği, azalmış ifade daha küçük ve daha az sıklıkla8daha az tümör ürettiği durumlarda onaylandı.
Bu iş genişletmek için, Zc3h8 ifade shrna-aracılı nakavt kurtarabilirsiniz ifade plazmids stabil fare meme hücrelerinde agresif hücre büyüme ve davranış bu hücrelerde yeniden olup olmadığını değerlendirmek için transfekte edildi. İfadelerin tüm sahte ve kurtarma Batı leke veya RT-qPCR8tarafından doğrulandı. Bir işgal tahlil ile kullanılmıştır 5.000 oda başına hücreleri 24-kuyu çanak ve resimde gösterildiği gibi fotoğraflar ile belgelenmiş Şekil 1 ve Şekil 2. Şekil 3 , hücre istilasının Zc3h8 ifadesinin shrna nakavt üzerine nasıl azaldığını gösteren işgal tahlil sonuçlarını gösterir, ancak bu istila ifade kurtarıldığında kurtarılır. Bu veriler, istila tahlil daha pahalı ve uzun yaklaşımlar başlamadan önce vitro hücre hatları test etmek için hızlı bir yöntem sağlayabilir gösterir.
Şekil 1: istila tahlil bileşenleri. (A) 24-iyi doku kültürü çanak için Boyden odası ekleyin. (B) 24-iyi doku kültürü yemek sabitleme için kullanılan, boyama, ve yıkama sonra 22 saat kuluçk hücrelerle. Sayılar 1, 2 ve 3 tek bir hücre satırının çoğaltır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: zaman ölçeği Ile istila tahlil akış şeması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Zc3h8 ifadesi için değiştirilmiş bir fare meme tümör hücrelerinin örnek istilası tahlil sonuçları, Onkojenik fenotipi değiştirir. (A, B) Fare meme tümörleri izole hücreler, mRNA bir kontrol dizisi hedefleme veya Zc3h8 mRNA hedefleme shrna ile stabil transfekte edildi. (C) daha sonra hücre hattı daha sonra shrna etkilenmez olarak tasarlanmış rekombinant Zc3h8 ifade ederek kurtarıldı. Hücreler kristal menekşe ile lekelenmiş ve bir ışık mikroskop kullanarak 10X büyütme yakalanan. Ölçek çubuğu = 500 μm. (D) Zc3h8 'nin azaltılmış ifadesinin, işgal hücrelerinin sayısını ve metasüri potansiyelini azalttı. Gen ifadesi kurtarma hücre istilası yüksek oranlar kurtarır. Değerler, 24-kuyu istilası tahlil ekleminden gelen toplam işgal hücrelerinin sayısını temsil eder. Deneydeki her çoğaltma için, ortalama işgal hücresi sayısı hesaplandı. Bu üç deney için tekrarlanmıştı. Hata çubukları ortalama standart hata gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İn vitro invazif tahlil, kanser hücresi istilasını teşvik eden faktörleri incelemek için ucuz, hızlı, nicel ve basit bir yöntemdir. Meme kanseri kadınlar arasında en sık teşhis edilen kanserdir. Meme kanseri üç büyük alt türleri, Üçlü negatif, (veya ER-, PR-, HER2/Neu-), en agresif, en metasrat ve en ölümcül9muhtemeldir. Bu nedenle, metastatik sonuca neden olan genler ve ifadeyi anlamak, hastalığın yeni terapötik hedeflerini ve genetik belirteçlerini bulmanıza yardımcı olabilir. Kanserli hücre invazyonu ve metasgen için önemli olan genlerin çoğu tespit edilmiş ve karakterize edilirken, metastam bastırıcı ve metastas sürücülerinin ifade seviyeleri ve aktivitesi hastalığın ilerlemesinin kritik bir yönü olabilir9, 10' a kadar.
Gen ifadesinin ötesinde, in vitro invazif assay Ayrıca mikroRNA ve diğer düzenleyicilerin rolünü incelemek veya kanser hücresi istilası11,12' de önlemek için kullanılmıştır. İn vitro invazif kurulum yöntemi inhibitörler, çok hücreli tümör ortamları, CRISPR-düzenlenmiş hücreler veya hücresel büyüme ortamlarında kısa vadeli değişiklikler için kullanılabilir. Çok yönlülük ve uyum bu tahlil çok avantajlı hale.
İşgal tahlil genlerin Analizi ve katkı veya tümör ilerlemesini önlemek faktörler ilk adımda kullanılabilir. Örneğin, yan ve ark. (2010), son derece agresif meme kanseri hücre hattı MDA-MB 23113ile EMT 'i BASTıRMAYA GATA-3 rolünü tanımlamak için in vitro istilası desteklerini kullandı. Daha sonra bu bastırma bir in vivo tahlil13metastazların oluşturmak için azalmış bir yeteneği ile korelasyon göstermek başardı. Potansiyel terapötik stratejiler başlangıçta, bu inhibitörlerin hayvan modellerinde tümör oluşumu üzerine etkisi ile ilişkilendirilerek, Matrigel yoluyla istilayı sınırlamak için yol inhibitörlerinin yeteneği ile karakterize edilebilir. İn vitro invazif tahlil bilinen ve potansiyel onkogenler ve etkileşim ortakları daha derinlemesine analiz için kullanılabilir. Örneğin, bir ondeproteinin bilinen fonksiyonel motifleri veya mutasyonların hızlı analizinin moleküler diseksiyonu, ilk ekran veya anlamlı değerlendirme olarak in vitro invazif tahlil ile yapılabilir. Bu kritik etki alanları yanı sıra moleküler düzeyde hücre fenotipleri işlevsel bir anlayış içine değerli anlayış sağlayabilir.
Boyden odası işgal tahlil birçok avantajı vardır iken, sınırlamalar vardır. Örneğin, istila tahlil sadece intravasation, metastazın ilk adımlarından biri, ancak daha sonraki adımlar kanser hücreleri ikincil konumları kolonize görünüyor. Bu nedenle, sadece bir kısmi metastam potansiyeli görünümü sonucuna varılabilir. Testin 22 saat uzunluğu, esnek iken, asenkron hücre nüfus invazyonu ölçümünde ince değişiklikler eğriltme bazı hücre bölme dışlayamaz. Mitomycin C gibi inhibitörler hızla dalış hücreleri durumunda hücre bölünmesini önlemek için kullanılabilir. Son olarak, kemotaksis için% 5 FBS çözeltisi kullanımı zaman içinde yavaşça diffü ve üst ve alt odalar arasında doğrultma olacaktır. Protein jeli yoğunluğu bu difüzyon yavaşlatır ve jel ve membran (haplotaxis) boyunca yanal geçiş seçeneği ile hücreleri sunar ve protein matrisinde ve FBS yüksek konsantrasyonları (chemotaxis) doğru gözenekler aracılığıyla. Alternatif kemotaksis ajanlar yerine olabilir veya invazyonu için daha kısa zaman ödenekleri, sadece Dengeleme öncesinde işgal hücreleri ölçmek için kullanılabilir. Esneklik değil, rijitlik, bu tahlil çok yararlı kılan özelleştirme için izin in vitro invazif tahlil. Bu testin gelecekteki adaptasyonları bileşiklerin büyük ölçekli tarama içerir, gen ifade değişiklikleri, ve ALLELE özgü ilaç etkinliğini değerlendirilmesi. Ayrıca, dolaşım ortamına sahip çift oda sistemi, hücreleri bir protein matrisinden istila etmek, sıvı bir ortama geçiş yapmak ve ikincil bir konumda ikinci bir protein matrisinde yeniden kurmak için meydan okuyor. Son olarak, daha zorlu bir membran, kanser hücrelerinin geçebilmek için daha zor olacak olmayan invaziv hücrelerin bir tek tabakalı gibi in vitro invazif tahlil sistemi ile kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nden Grant R15CA169978 tarafından destekleniyordu. Villanova Üniversitesi 'nden ek finansman geldi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
