Использование мыши молочных опухолевых клеток в in vitro Вторжение анализа в качестве меры онкогенной клеточной поведения

Summary

Анализ вторжения клеток in vitro используется для измерения потенциала метастазирований рака путем количественной оценки клеточного потенциала для вторжения и миграции с помощью вставок клеточной культуры, содержащих белковую матрицу. Клетки бросают вызов, чтобы мигрировать через белковую матрицу и пористую мембрану, к хемоаттракторанту, а затем количественно с помощью световой микроскопии.

Abstract

In vitro анализ вторжения использует богатые белком матрицы в камере Бойден для измерения способности культивированных клеток пройти через матрицу и пористую мембрану в процессе, аналогичном первоначальным шагам метастазирования раковых клеток. Испытанные клетки можно изменить для выражения гена или обработать с ингибиторами для того чтобы испытать для изменений в потенциале нашествия. Этот эксперимент тестирует агрессивный фенотип клеточных опухолевых клеток мыши, чтобы обнаружить и охарактеризовать потенциальные онкогены, которые способствуют вторжению клеток. Этот метод, однако, может быть универсальным и адаптированы к различным приложениям. Сам эксперимент можно провести за один день, и результаты получены с помощью световой микроскопии менее чем за день. Результаты включают подсчет числа вторгшихся ячеек для сравнения и анализа. In vitro вторжения анализ является быстрым, недорогим и четким методом для определения поведения клеток в культуре, которые могут быть использованы в качестве первоначальной оценки, прежде чем более активное участие в vivo анализы.

Introduction

Анализ вторжения in vitro может быть полезным инструментом при измерении способности клетки мигрировать через мембрану с покрытием белка, по аналогии с первыми шагами в метастазах. Ключевой особенностью злокачественных раковых клеток является их способность мигрировать через и вторгаться в близлежащие ткани. Рак, который распространился или метастазы создает больше проблем лечения и имеет более низкие показатели долгосрочного выживания, в то время как локализованные опухоли легче поддаются лечению и имеют более высокие показатели долгосрочного выживания. Для метастазирования, раковые клетки должны покинуть первичную опухоль и мигрировать в кровеносную или лимфатическую систему, процесс, который требует прохождения через внеклеточной матрицы и подвальной мембраны¹. В процессе, называемом эпителиальным мезенхимальным переходом (ЭМТ), опухолевые клетки должны разорвать контакты клеток клеток, мигрировать на правую сторону и вторгаться в близлежащие кровеносные или лимфатические сосуды. Первые шаги этого метастазов каскада представляют большой интерес, поскольку эти шаги, что может сделать рак смертоноснее. Генетические и эпигенетические факторы, участвующие в ранних этапах метастазов, находятся в центре внимания большого количества исследований, но точные и надежные экспериментальные инструменты необходимы для проверки этих ранних шагов как in vivo, так и in vitro.

Инструменты для измерения изменений в миграции клеток, такие как заживление ран (царапина) анализы или рост в 3D средах, таких как мягкие анализы агара может частично решить необходимость экспериментальных методов измерения ранних шагов метастазов, но анализ для измерения вторжения более сложным, поскольку процесс происходит в организме в сложной микросреде опухоли. Для целей скрининга наркотиков или изменения генов для определения важных факторов вторжения и метастазов, система, которая может быть использована в пробирке с культивированными клетками и имитировать проблемы, с которыми сталкиваются метастатические клетки in vivo является вторжение анализ^{2, 3}. Рак молочной железы является наиболее часто диагностируется тип рака у женщин и второй ведущей причиной смерти от рака у женщин, поэтому понимание генов, ответственных за вторжение раковых клеток молочной железы и метастаз я критически важно для общественного здравоохранения. Кроме того, мышиные клетки являются полезной моделью системы для изучения рака молочной железы и его прогрессирования.

In vitro вторжения анализ основан на Бойден палаты ассамблеи, где две камеры роста средств массовой информации разделены пористой мембраны³. Для имитации микросреды опухоли, богатый белком гель также включен в отдельные клетки в одной камере от химиоаттрактора в другой и выступать в качестве мембранного барьера подвала. Для того, чтобы мигрировать к химиоаттрактору, клетки должны сначала пройти через богатый белком барьер, а затем пройти через пористую мембрану - процесс, аналогичный тому, как метастатические клетки мигрируют через стромы. Богатый белком гель может быть изменен в зависимости от потребностей эксперимента, но обычно состоит из коллагена, или экстракта мембраны в подвале (например, Matrigel)⁴. Это сложная смесь белков, протеогликанов и факторов роста, но в основном состоит из ламининов и коллагена IV ^4,5. Клетки должны затем пройти через пористую мембрану, как правило, из поликарбоната, полиэстера или политетрафтотрилена (ПТФЕ). Мембраны могут быть приобретены на коммерческой приобрести с или без белка гель (как правило, коллагенов), или гель может быть приобретен отдельно и добавлены. Размер поры можно регулировать в зависимости от размера ячейки. В то время как размеры пор доступны от 0,4 до 8,0 мкм, только поры от 3,0 - 8,0 мкм достаточно велики для миграции клеток. Вторжение ассси был использован для определения эффективности ингибиторов на способность клеток мигрировать и вторгаться. Хотя не хватает точной микросреды опухоли, которая присутствует в vivo, in vitro вторжения анализ является полезным при скрининге многих условиях в течение короткого времени, сводя к минимуму потребность в животных моделей. Целью этих экспериментов является сравнение экспрессии генов подозреваемых онкогенов и определить влияние на поведение раковых клеток и агрессивность болезни с помощью анализа вторжения in vitro и других тестов. В целом, анализ вторжения обеспечивает последовательные, количественные и быстрые результаты для определения метастатического потенциала, а также является относительно недорогим, простым и адаптируемым методом.

Protocol

Все эксперименты и методы проводились по санкции Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Вилланова (IACUC).

1. Выражение гена в культурных мышечных опухолевых клеток

1. Во-первых, подготовить клеточные линии для тестирования.
2. Используйте племенную колонию мышей BALB/cV. Эти мыши несут BALB /cV штамм мыши молочной опухоли вируса, передается щенкам в молоке^6,7. Пятьдесят процентов размножаться женщин развивать опухоли молочной железы в возрасте 10 месяцев.
   1. Чтобы установить линию опухолевых клеток, жертвуйте опухолевой плотиной, используя протокол, одобренный IACUC. Замочите брюшной кожи в 70% EtOH и удалить опухоль в стерильных условиях в ламинарный поток капот. Опухоли подкожные, поэтому будьте осторожны, чтобы избежать прокалывание перитонеума.
   2. Поместите фрагменты опухоли из некротических областей в чашку Петри с небольшим количеством стерильных Хэнкс сбалансированный соленовый раствор (HBSS) и фарш очень мелко с стерильным лезвием бритвы.
   3. Передача рассеянных клеточных скоплений в колбу культуры Т25, содержащую 5 мл Dulbecco's Modified Eagle Medium или DMEM (4,5 г/л глюкозы, фенола красного и L-глютамина) дополнены 50% фетальной сыворотки крупного рогатого скота или FBS и 1% антибиотик/антимикотический раствор. Выращивайте клетки в обработанных колбах клеточной культуры в инкубаторе с 5% CO₂ и 100% влажностью при 37 градусах Цельсия.
   4. Смойте неадекторные клетки после 24-48 ч и замените DMEM 50% FBS и 1% антибиотик/антимикотическое решение. Верните клетки в инкубатор.
   5. Заменяйте средства жидкой культуры каждые 3 дня.
   6. Разделение или прохождение клеток, когда они 90% слияния. Удалите культурную среду и промойте клетки адептов с помощью HBSS (без кальция или магния). Инкубировать клетки с 0,25% Трипсин-ЭДТА раствор для 1-5 мин при 37 градусов по Цельсию, пока клетки округлены и отделены. Разбавить клетки 1:10 в свежих средствах массовой информации культуры и добавить в новую колбу. Т-25 клеточной культуры колбу требует 5-8 мл культуры средств массовой информации, 5 мл HBSS для мытья, и 1 мл трипсин-EDTA для прохождения. Верните колбу в инкубатор.
   7. Снизить концентрацию FBS до 40% после первого прохода, затем 30% после второго прохода, затем 20% после третьего прохода, и, наконец, 10% для всех последующих проходов. Процесс установления роста в стандартной среде DMEM с 10% FBS требует четырех проходов и 2 - 8 месяцев.
3. Как только линия клетки (ы) установлена, измените выражение подозреваемых онкогенов путем трансфекции shRNA ориентации мРНК или CRISPR для несущественных генов.
   1. Установить устойчивые к антибиотикам стабильные клеточные линии с отдельными клонами, которые проверяются западным пятном и/или RT-qPCR для последовательных результатов, однако, переходные преклонные действия могут работать также, так как проверка требует только 22 ч. Контрольные линии клеток с неспецифические целевые последовательности также необходимы.

2. В Vitro Вторжение Анализа

1. Расти приверженец мыши молочных опухолевых клеток в колбе T25 до 70-90% слияния для первого дня эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие клеточные линии или экспериментальные условия могут потребовать различных носителей клеточной культуры. Например, если гормон-ответные клетки рака молочной железы проходят испытания, уголь фильтрованных сыворотки могут быть необходимы для удаления соединений, которые активируют эстроген или другие рецепторы гормонов.
2. Подготовьте вставки камеры Бойдена, нагревая их до комнатной температуры (от -20 градусов по Цельсию) в течение примерно 20 минут в капюшоне клеточной культуры. Избегайте циклов замораживания-оттепели для неиспользованных вставок. Используйте три вставки (репликации) для генерации статистически достоверных данных для каждой клеточной линии для каждого эксперимента.
   1. Добавьте предварительно подогретые 37 градусов по сыворотке, не DMEM-носителя DMEM, а затем вставьте. Для вставок, предназначенных для 24-колодцев, добавьте 500 qL без сыворотки DMEM к скважине, а затем 500 л dMEM без сыворотки dMEM к вставке, чтобы пористая мембрана и гель увлажняются с обеих сторон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших вставок, предназначенных для 6-колодец блюдо, используйте 2 мл сыворотки без DMEM с обеих сторон.
3. Поместите блюдо с вставками в инкубатор культуры 37 градусов Цельсия с 5% CO₂ и 100% влажности, по крайней мере 2 ч тщательно гидрат и акклиматизироваться.
4. Подготовка клеток путем удаления роста средств массовой информации и промывки клеток с 5 мл HBSS.
   1. Удалите HBSS и добавьте 1 мл 0,25% трипсин-EDTA решение для 1 - 5 мин при 37 градусов по Цельсию или до тех пор, пока клетки появляются округлые или показать признаки отрешенности от колбы.
   2. Аккуратно коснитесь колбы, чтобы отсоединить все клетки. Приготовьте клетки в 5 мл DMEM и 10% FBS и перенесите в стерильную 15 мл центрифуги трубки.
   3. Центрифуги клетки на 1000 х г в течение 5 минут, чтобы мягко гранулы клетки. Удалите носители и замените DMEM с ыватом объемом 5 мл, чтобы повторно приостановить работу клеток.
   4. Повторите центрифугацию и подвеску в сывороточных носителях в два раза больше в общей сложности 3 стирок.
   5. Тщательно resuspend клетки в окончательном 5 мл сыворотки без DMEM и обеспечить Есть нет скоплений клеток.
5. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Подсчитайте только жизнеспособные клетки. Разбавить суспензию клеток до 5 х 10⁴ клеток/мл в 5 мл безсырей DMEM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта концентрация дает 2500 клеток на вставку в 24-хорошо блюдо. Это количество клеток достаточно для агрессивных раковых клеток с высоким уровнем миграции и вторжения. Менее агрессивные клеточные линии могут потребовать больше клеток, до 10000 клеток на вставку для наблюдаемых вторгающихся клеток. Если ожидается пониженное вторжение клеток, рассмотрите возможность максимального вторжения в клетки за счет увеличения числа клеток. Если ожидается увеличение нашествия клеток, начните с меньшего количества клеток.
6. Удалите блюдо клеточной культуры из инкубатора и осторожно аспирировать средства массовой информации из вставки. Поднимите вставку и аспирируй средства из колодца. Работая быстро, добавить химиоатант в нижнюю палату. Для 24-хорошо блюдо, добавить 750 зл.
   1. Поместите вставку в колодец и добавьте клетки в вставку. Для 24-хорошо блюдо, используйте 500 л клеточной подвески. Для 6-хорошей вставки блюда используйте 2,5 мл хемопривлекательных и 2 мл клеток. Убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют по обе стороны от мембраны.
   2. Верните блюдо в инкубатор клеточной культуры на 22 ч.
7. После 22 ч, исправить и пятно клеток. Подготовьте раствор 1% параформальдегида в 1x фосфат буферном сольне (PBS) для фиксации.
   1. В чистой 24-хорошо клеточной культуры блюдо, добавить 1 мл фиксатора для отдельных скважин так что есть один колодец для каждой вставки.
   2. Подготовьте раствор окрашивания (свежесделанного) 0,1% кристаллофийного (w/v) в растворе PBS с 10% этанолом (v/v). Аналогичным образом, добавить 1 мл окрашивающего раствора для чистого колодца в 24-хорошо культуры блюдо для каждой вставки.
   3. Удалите каждую вставку по одному с щипками и поместите стерильный ватный тампон внутри вставки и мазок верхней стороне мембраны, чтобы удалить немигрированных клеток.
   4. Повторите со вторым ватным тампоном. Мембрана достаточно сильная, поэтому мягкое давление при мазке не ставит под угрозу целостность мембраны.
   5. Удалите все оставшиеся носители из внутренней стороны вставки и добавьте 750 Л Л PBS, чтобы смыть отдельные клетки.
   6. Снимите PBS и повторите стирку. Поместите вставить в хорошо содержащие фиксатор для фиксации мигрированных клеток на нижней стороне мембраны. Повторите для всех вставок.
   7. Закрепите вставки в течение 15 минут при комнатной температуре.
   8. После фиксации удалите вставку. Снова вымойте вставку с помощью 750 Л ПБС.
   9. Поместите вставить в колодец с окрашивающим раствором, чтобы запятнать все мигрированные и фиксированные клетки. Попятнать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 6-хорошей вставки для посуды используйте 2 мл фиксаторного раствора, 2 мл окрашивающего раствора и 2 мл смыва PBS.
8. Используйте стакан с дистиллированной водой, чтобы разложить вставки. Удалите вставки и окунуться в дистиллированной воды, пока вода, бегущий от вставки ясно.
   1. Удалите излишки капель воды и поместите вставки на фильтровальную бумагу боком, чтобы высушить воздух (обычно на ночь).
9. Подготовьте мембрану для визуализации, помечая чистый стеклянный микроскоп слайд для каждой вставки и поместите небольшую каплю масла погружения микроскопа в центре слайда.
   1. Отсоедините мембрану от вставки с помощью скальпеля, чтобы разрезать по периметру мембраны на внутренней стороне пластиковой вставки.
   2. Удалите мембрану с помощью щипочек и поместите на верхней части падения масла на слайде, чтобы держать его на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны очень тонкие и очень легкие, поэтому они могут быть легко потеряны нежным потоком воздуха.

3. Визуализация и анализ

1. Так как пористые мембраны ясны и окрашивания клеток с кристально фиолетовым дать им контраст, использовать сложный световой микроскоп для просмотра клеток. Используйте камеру и/или программное обеспечение для количественной оценки многих образцов, но это не обязательно. Просмотр ячеек в 5x, 10x или 20x увеличение. Для количественной оценки используйте несколько недублирующихизображений при 10-кратном увеличении. Кроме того, подсчитайте все мигрированные клетки на мембране при 10-м увеличении.
2. Определите общее количество вторгшихся клеток или клеток на площадь для всех образцов. Для каждого эксперимента, выполнить каждое условие в ассе с тремя репликати вставок и повторить несколько раз для статистически полезных результатов.
3. При сравнении различных клеточных линий с различными темпами роста и скоростью миграции, сделайте параллельный эксперимент, чтобы сравнить клетки, которые вторгаются через белковую матрицу и сравнить с ассамблеей Бойденской камеры без белковой матрицы (только мигрированные клетки). Рассчитайте вторжение процентов для каждой линии клеток (количество вторгшихся ячеек/количество мигрированных ячеек x 100%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход может помочь сравнить уровень вторжений с темпами миграции. При сравнении различных условий, применяемых к одной и той же линии ячейки, расчет вторжения только более релевантным расчетами. Внешний край мембраны иногда имеет большее количество клеток, чем центральные области и, следовательно, менее точным. Если это происходит, исключить эти клетки из количественной оценки и убедитесь, что все клетки удаляются ватным тампоном в повторном эксперименте.

Representative Results

Этот метод вторжения in vitro через белковую матрицу был использован для оценки агрессивных фенотипов и онкогенного клеточного поведения клеток опухолевых клеток мыши с измененным выражением белка цинкового пальца NoC3H8⁸. В сочетании с другими подходами, которые также изучают миграцию клеток и рост в 3D-средах, было установлено, что более высокие уровни экспрессии zc3h8 в опухолевых клеточных линиях, или промоулятор-опосредованное выражение плазмиды, привели к быстрым темпам клеток распространение, быстрая миграция, рост в 3D-средах и увеличение вторжения в in vitro анализ вторжения⁸. И наоборот, снижение экспрессии по конструкциям shRNA привело к менее агрессивному распространению, миграции и вторжению⁸. Эти результаты были подтверждены in vivo, где более высокая экспрессия zc3h8 производила более крупные опухоли, которые появились быстро, в то время как снижение экспрессии производило меньше опухолей, которые были меньше и менее частые⁸.

Чтобы расширить эту работу, выражение плазмиды, которые могут спасти shRNA-опосредованного нокдаун ак3h8 выражение были застежко трансфицируются в клетках молочных мышей, чтобы оценить, если агрессивный рост клеток и поведение может быть восстановлена в этих клетках. Все нокдаун и спасение выражений были проверены западной помотой или RT-qPCR⁸. Вторжение ассси был использован с 5000 клеток на камеру в 24-хорошо блюдо и документально с фотографиями, как показано на рисунке 1 и рисунке 2. На рисунке 3 показаны результаты исследования вторжения, которые демонстрируют, как вторжение клеток уменьшилось после того, как было сокращено на нокдауне c3h8, но это вторжение спасается, когда выражение спасено. Эти данные показывают, что анализ вторжения может обеспечить быстрый метод для тестирования клеточных линий in vitro, прежде чем приступать к более дорогим и длительным подходам.

Рисунок 1: Компоненты асссеива вторжения. (A) Бойден камеры вставки для 24-хорошо ткани культуры блюдо. (B) 24-хорошо ткани культуры блюдо, используемое для фиксации, окрашивания и мытья после 22 ч инкубации с клетками. Числа 1, 2 и 3 являются репликациями одной клеточной линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Вторжение асссеировать flowchart с шкалой времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Пример вторжения анализ результатов мыши молочных опухолевых клеток, измененных для выражения zc3h8, который изменяет онкогенный фенотип. (A, B) Клетки, изолированные от опухолей молочных тканей мыши, были зависшие шРНК, нацеленными на контрольную последовательность мРНК или нацеленные на Зк3х8 мРНК. (C) Более поздняя линия клетки была затем спасена путем выражения рекомбинантных zc3h8 предназначендля для не затронутых shRNA. Клетки окрашены кристаллофийным и захвачены при 10-x увеличении с помощью легкого микроскопа. Шкала бар 500 мкм. (D) Количественная оценка, показывающая, что снижение экспрессии zc3h8 уменьшило количество вторгшихся клеток и потенциал метастазов. Спасение экспрессии генов спасает более высокие темпы вторжения клеток. Значения представляют общее количество вторгшихся ячеек из 24-колодца вставки асссеа. Для каждого репликации в эксперименте было рассчитано среднее количество вторгшихся ячеек. Это было повторено в течение трех экспериментов. Бары ошибок указывают на стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Анализ вторжения in vitro является недорогим, быстрым, количественным и простым методом для изучения факторов, способствующих вторжению раковых клеток. Рак молочной железы является наиболее часто диагностируется рак среди женщин. Из трех основных подтипов рака молочной железы, тройной отрицательный, (или ER-, PR-, HER2/neu-), является наиболее агрессивным, скорее всего, метастазировать, и наиболее смертоносных⁹. Таким образом, понимание генов и экспрессии, которые приводят к метастазам может помочь найти новые терапевтические цели и генетические маркеры для болезни. Хотя многие из генов, важных для вторжения раковых клеток и метастазов были определены и характеризуются, уровни экспрессии и активность метастазов драйверов против метастазов супрессоры могут быть критическим аспектом прогрессирования болезни^{9, 10}.

Помимо экспрессии генов, анализ вторжения in vitro также использовался для изучения роли микроРНК и других регуляторов в поощрении или предотвращении вторжения раковых клеток^11,12. Метод установки in vitro может быть использован для изучения ингибиторов, многоклеточных опухолевых сред, клеток CRISPR-редактируемых или краткосрочных изменений в клеточных средах роста. Универсальность и адаптивность делают этот произвлеоченьстью.

Анализ вторжения может быть использован в первый шаг в анализе генов и факторов, которые способствуют или предотвратить прогрессирование опухоли. Например, Yan et al. (2010) использовали анализы вторжения in vitro для определения роли GATA-3 в подавлении EMT высокоагрессивной линией клеток рака молочной железы MDA-MB 231^13. Затем они смогли показать, что это подавление коррелирует с уменьшением способности к формированию метастазов в in vivo ассссее¹³. Потенциальные терапевтические стратегии могут быть первоначально характеризуется способностью ингибиторов пути ограничить вторжение через Matrigel, а также коррелирует с влиянием этих ингибиторов на формирование опухоли в животных моделях. Анализ вторжения in vitro может быть использован для более глубокого анализа известных и потенциальных онкогенов и взаимодействующих партнеров. Например, молекулярное вскрытие известных функциональных мотивов онкопротеина или быстрый анализ мутаций может быть сделано с анализом вторжения in vitro в качестве первоначального экрана или оценки значимости. Это может обеспечить ценную информацию в критических областях, а также функциональное понимание клеточных фенотипов на молекулярном уровне.

Хотя Бойден камеры вторжения ассея имеет много преимуществ, Есть ограничения. Например, исследование вторжения только смотрит на интравазацию, один из начальных шагов метастазирования, но не более поздние шаги, когда раковые клетки колонизировать вторичные места. Таким образом, можно сделать вывод лишь о частичном представлении о потенциале метастаз. Длина ассса в 22 ч, хотя и гибкая, не может исключать некоторых клеточных деления, которые могут исказить тонкие изменения в измерении вторжения асинхронных популяций клеток. Ингибиторы, такие как митомицин С могут быть использованы для предотвращения деления клеток в случае быстро дайвинг клеток. Наконец, использование 5% FBS решение для химиотаксиса будет медленно рассеиваться с течением времени и уравновешивается между верхней и нижней палат. Плотность белкового геля замедляет эту диффузию и представляет клетки с возможностью миграции боковочерез гель и мембрану (гаплотаксис) или через белковую матрицу и через поры к более высоким концентрациям FBS (хемотаксис). Альтернативные химиотаксисные агенты могут быть заменены или более короткие временные надбавки для вторжения могут быть использованы для измерения только клетки, которые вторглись до равновесия. Это гибкость, а не жесткость, в пробирке вторжения анализа, что позволяет настройки, что делает этот анализ так полезно. Будущие адаптации этого исследования включают крупномасштабный скрининг соединений, изменения экспрессии генов и оценку эффективности препарата, специфичного для аллелей. Кроме того, двойная камерная система с циркулирующими средствами может бросить вызов клеткам, чтобы вторгнуться через белковую матрицу, пройти жидкой среде и восстановить на второй белковой матрице в вторичном месте. Наконец, более сложные мембраны могут быть использованы с in vitro вторжения анализа системы, такие как монослой неинвазивных клеток, которые были бы более трудными для раковых клеток, чтобы пересечь.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning	353504
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermoFisher	15240062
BALB/c mice
Cell Culture Incubator
Cell Culture Treated Flasks
Clinical cenrifuge
Cotton swab	Puritan	25-806
Crystal Violet	Sigma Aldrich	C0775
Distilled water
DMEM	ThermoFisher	10566-016	high glucose, GlutaMAX
Ethanol
FBS	Sigma Aldrich	F2442-500ML
Forcepts
Glass Slide	VWR	16004-422
HBSS	ThermoFisher	14025076	no calcium, no magnesium
Hemocytometer
Imersion oil
Invasion Chambers (24-well)	Corning	354480	Cat. #354481 for 6-well
Light Microscope
Lipofectamine Transfection Reagent
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
PBS
Scalpel, disposable			#11
shRNA
Sterile Transfer pipet
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056