Summary
Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l'invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.
Abstract
Il saggio di invasione in vitro utilizza una matrice ricca di proteine in una camera di Boyden per misurare la capacità delle cellule coltivate di passare attraverso la matrice e una membrana porosa in un processo analogo alle fasi iniziali della metastasi delle cellule tumorali. Le cellule testate possono essere modificate per l'espressione genica o trattate con inibitori per testare i cambiamenti nel potenziale di invasione. Questo esperimento testa il fenotipo aggressivo delle cellule tumorali mammarie dei topi per scoprire e caratterizzare i potenziali oncogeni che promuovono l'invasione cellulare. Questa tecnica, tuttavia, può essere versatile e adattata a molte applicazioni diverse. L'esperimento stesso può essere fatto in un giorno e i risultati vengono acquisiti dalla microscopia leggera in meno di un giorno. I risultati includono i conteggi del numero di celle invasori per il confronto e l'analisi. Il test di invasione in vitro è un metodo rapido, economico e chiaro per determinare il comportamento cellulare in una coltura che può essere utilizzata come valutazione iniziale prima di ulteriori sottovalutazioni di analisi in vivo.
Introduction
Il saggio di invasione in vitro può essere uno strumento utile quando si misura la capacità di una cellula di migrare attraverso una membrana rivestita di proteine, analoga ai primi passi nella metastasi. Una caratteristica chiave delle cellule tumorali maligne è la loro capacità di migrare attraverso e invadere i tessuti vicini. Il cancro che si è diffuso o metastatizzato pone più sfide di trattamento e ha tassi più bassi di sopravvivenza a lungo termine, mentre i tumori localizzati sono più facili da trattare e hanno tassi più elevati di sopravvivenza a lungo termine. Per metastatizzare, le cellule tumorali devono lasciare il tumore primario e migrare nel sistema circolatorio o linfatico, un processo che richiede il passaggio attraverso la matrice extracellulare e la membrana seminterrato1. Nel processo chiamato transizione epiteliale mesenchymal (EMT), le cellule tumorali devono rompere i contatti delle cellule cellulari, migrare direzionalmente e invadere i vasi sanguigni o linfatici vicini. I primi passi di questa cascata di metastasi sono di grande interesse poiché questi passaggi sono ciò che può rendere il cancro più letale. I fattori genetici ed epigenetici coinvolti nelle prime fasi della metastasi sono al centro di una grande quantità di ricerca, ma sono necessari strumenti sperimentali accurati e affidabili per testare questi primi passi sia in vivo che in vitro.
Gli strumenti per misurare i cambiamenti nella migrazione cellulare come i saggi di guarigione delle ferite (graffio) o la crescita in ambienti 3D come i test di agar morbido possono affrontare parzialmente la necessità di metodi sperimentali per misurare i primi passi della metastasi, ma un saggio per misurare l'invasione è più impegnativo dal momento che il processo si verifica nel corpo all'interno di un complesso microambiente tumorale. Ai fini dello screening di farmaci o alterazioni genetiche per determinare fattori importanti nell'invasione e nella metastasi, un sistema che può essere utilizzato in vitro con cellule coltivate e imitare le sfide affrontate dalle cellule metastatiche in vivo è il saggio di invasione2, 3. Il cancro al seno è il tipo di cancro più comunemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di morte per cancro nelle donne, quindi comprendere i geni responsabili dell'invasione delle cellule tumorali e delle metastasi è di fondamentale importanza per la salute pubblica. Inoltre, le cellule del topo sono un utile sistema modello per studiare il cancro al seno e la sua progressione.
Il saggio di invasione in vitro si basa sull'assemblea della Camera di Boyden, dove due camere di mezzo di crescita sono separate da una membrana porosa3. Per imitare il microambiente tumorale, un gel ricco di proteine è incluso anche per separare le cellule in una camera da un chemioattraente nell'altra e agire come una barriera di membrana seminterrato. Per migrare verso il chemioattraente, le cellule devono prima passare attraverso la barriera ricca di proteine e poi passare attraverso la membrana porosa - un processo analogo a come le cellule metastatiche migrano attraverso lo stroma. Il gel ricco di proteine può essere modificato in base alle esigenze dell'esperimento, ma di solito è costituito da collagene, o estratto di membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel)4. È una complessa miscela di proteine, proteoglicani e fattori di crescita, ma per lo più è costituito da laminoine e collagene IV 4,5. Le cellule devono quindi passare attraverso una membrana porosa tipicamente in policarbonato, poliestere o politetrafluoroetilene (PTFE). Le membrane possono essere acquistate commercialmente con o senza un gel proteico (tipicamente collagene), oppure il gel può essere acquistato separatamente e aggiunto. La dimensione del poro può essere regolata in base alle dimensioni della cella. Mentre le dimensioni dei pori sono disponibili da 0,4 - 8,0 m, solo i pori da 3,0 a 8,0 m sono abbastanza grandi per la migrazione cellulare. Il saggio di invasione è stato utilizzato per determinare l'efficacia degli inibitori sulla capacità delle cellule di migrare e invadere. Pur mancando l'esatto microambiente tumorale presente in vivo, il test dell'invasione in vitro è utile per lo screening di molte condizioni in breve tempo riducendo al minimo la necessità di modelli animali. L'obiettivo di questi esperimenti è confrontare l'espressione genica di oncogeni sospetti e determinare gli effetti sul comportamento delle cellule tumorali e sull'aggressività della malattia usando il saggio di invasione in vitro e altri test. Nel complesso, il test di invasione fornisce risultati coerenti, quantitativi e rapidi per determinare il potenziale metastatico, pur essendo un metodo relativamente economico, semplice e adattabile.
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Protocol
Tutti gli esperimenti e i metodi sono stati eseguiti come autorizzati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali dell'Università di Villanova (IACUC).
1. Espressione genica nelle cellule tumorali mammarie dei topi colti
- In primo luogo, preparare le linee cellulari da testare.
-
Utilizzare una colonia riproduttiva di topi BALB/cV. Questi topi portano il ceppo BALB/cV del virus del tumore mammario dei topi, trasmesso ai cuccioli nel latte6,7. Il 50% delle femmine riproduttive sviluppa tumori mammari di 10 mesi di età.
- Per stabilire una linea cellulare tumorale, sacrificare una diga portante del tumore utilizzando un protocollo approvato dall'IACUC. Immergere la pelle addominale nel 70% EtOH e rimuovere il tumore in condizioni sterili in un cappuccio a flusso laminare. I tumori sono sottocutanei, quindi fai attenzione a evitare di forare il peritoneo.
- Posizionare frammenti tumorali da aree non necrotiche in una piastra di Petri con una piccola quantità di Hanks Balanced Saline Solution (HBSS) sterile e tritare molto finemente con una lama sterile.
- Trasferire i ciuffi di cellule disperse in una fiaschetta di coltura cellulare T25 contenente 5 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM (4,5 g/L di glucosio, fenolo rosso e L-glutamina) integrato con 50% Siero Bovino fetale o FBS e 1% soluzione antibiotica/antimycotica. Coltiva cellule in flaconi di coltura cellulare trattata in un'incubatrice con 5% di CO2 e 100% di umidità a 37 gradi centigradi.
- Lavare le cellule non aderenti dopo 24-48 h e sostituire il DMEM con il 50% di FBS e l'1% di soluzione antibiotica/antimicotica. Riportare le cellule all'incubatrice.
- Sostituire i supporti di coltura liquida ogni 3 giorni.
- Dividere o passare le cellule quando sono 90% confluente. Rimuovere i mezzi di coltura e lavare le cellule aderenti con HBSS (senza calcio o magnesio). Incubare cellule con soluzione Trypsin-EDTA dello 0,25% per 1-5 min a 37 gradi centigradi fino a quando le cellule non vengono arrotondate e staccate. Diluire le cellule 1:10 in supporti di coltura freschi e aggiungere a una nuova fiaschetta. Un flacone di coltura cellulare T-25 richiede 5-8 mL di coltura media, 5 mL di HBSS per lavare, e 1 mL di trypsin-EDTA per il passaggio. Riporta il pallone all'incubatrice.
- Riduci la concentrazione di FBS al 40% dopo il primo passaggio, poi al 30% dopo il secondo passaggio, poi al 20% dopo il terzo passaggio, e infine al 10% per tutti i passaggi successivi. Il processo di crescita del mezzo DMEM standard con 10% FBS richiede quattro passaggi e 2 - 8 mesi.
-
Una volta stabilite le linee cellulari, alterare l'espressione di sospetti oncogeni mediante trasfezione di mRNA di puntamento shRNA o CRISPR per geni non essenziali.
- Stabilire linee cellulari stabili resistenti agli antibiotici con singoli cloni che sono verificati da macchie occidentali e/o RT-qPCR per risultati coerenti, tuttavia, le trafetti transitorie possono funzionare anche poiché il test richiede solo 22 h. Linee cellulari di controllo con sono necessarie anche sequenze di destinazione non specifiche.
2. In Vitro Invasion Assay
- Coltivare cellule tumorali di topo aderenti in una fiaschetta T25 fino al 70-90% confluente per il primo giorno dell'esperimento.
NOT: Altre linee cellulari o condizioni sperimentali possono richiedere diversi mezzi di coltura cellulare. Per esempio, Se le cellule di cancro al seno ormone-reattivo sono in fase di test, siero filtrato a carbone può essere necessario per rimuovere i composti che attivano gli estrogeni o altri recettori ormonali. - Preparare gli inserti da camera Boyden riscaldandoli a temperatura ambiente (da -20 gradi centigradi) per circa 20 min in una cappa cellulare. Evitare cicli di congelamento-scongelamento per gli inserti inutilizzati. Usa tre inserti (replica) per generare dati statisticamente validi per ogni linea di celle per ogni esperimento.
- Aggiungete il supporto DMEM preriscaldato a 37 gradi senza siero al pozzo e poi all'inserto. Per gli inserti progettati per piatti 24-well, aggiungere 500 L di DMEM senza siero al pozzo e poi 500 -L di DMEM senza sieri all'inserto in modo che la membrana porosa e gel siano idratate su entrambi i lati.
NOT: Per inserti più grandi progettati per un piatto a 6 pozzetti, utilizzare 2 mL di DMEM senza sieri su entrambi i lati.
- Aggiungete il supporto DMEM preriscaldato a 37 gradi senza siero al pozzo e poi all'inserto. Per gli inserti progettati per piatti 24-well, aggiungere 500 L di DMEM senza siero al pozzo e poi 500 -L di DMEM senza sieri all'inserto in modo che la membrana porosa e gel siano idratate su entrambi i lati.
- Collocare il piatto con inserti in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 100% di umidità per almeno 2 h per idratarsi completamente e acclimatarsi.
- Preparare le cellule rimuovendo il supporto di crescita e risciacquando le cellule con 5 mL HBSS.
- Rimuovere l'HBSS e aggiungere 1 mL 0.25% soluzione trypsin-EDTA per 1 - 5 min a 37 gradi centigradi o fino a quando le cellule appaiono arrotondate o mostrano segni di distacco dal pallone.
- Toccare delicatamente il pallone per staccare tutte le cellule. Risospendere le cellule in 5 mL di DMEM - 10% FBS e trasferirle su un tubo di centrifuga sterile da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 5 min per pellet delicatamente le cellule. Rimuovere il supporto e sostituirlo con DMEM senza siero da 5 mL per sospendere nuovamente le celle.
- Ripetere la centrifugazione e la sospensione nei media senza siero due volte di più per un totale di 3 fuorti.
- Risospendere accuratamente le cellule negli ultimi 5 mL di DMEM senza siero e assicurarsi che non vi siano grumi di cellule.
- Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro. Conta solo le cellule vitali. Diluire la sospensione cellulare a 5 x 104 celle/mL in 5 mL di DMEM senza siero.
NOT: Questa concentrazione produce 2.500 cellule per inserto in un piatto di 24 pozzetti. Questo numero di cellule è sufficiente per le cellule tumorali aggressive con alti tassi di migrazione e invasione. Linee cellulari meno aggressive possono richiedere più cellule, fino a 10.000 celle per inserto per le cellule invasori osservabili. Se è prevista l'invasione cellulare ridotta, prendere in considerazione la massimizzazione delle cellule invasori aumentando il numero di cellule. Se si prevede una maggiore invasione cellulare, iniziare con meno cellule. - Rimuovere il piatto di coltura cellulare dall'incubatrice e aspirare delicatamente il supporto dall'inserto. Sollevare l'inserto e aspirare il supporto dal pozzo. Lavorando rapidamente, aggiungere il chemioattraente alla camera inferiore. Per un piatto a 24 pozze, aggiungere 750 L di DMEM con 5% FBS.
- Posizionare l'inserto nel pozzo e aggiungere le celle all'inserto. Per un piatto di 24 pozze, utilizzare 500 l- di sospensione cellulare. Per un inserto piatto di 6 pozze, utilizzare 2,5 mL di chemioattraente e 2 mL di cellule. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria su entrambi i lati della membrana.
- Riportare il piatto nell'incubatrice a coltura cellulare per 22 ore.
- Dopo 22 h, fissare e macchiare le cellule. Preparare una soluzione dell'1% di paraformaldeide in 1x fosfato buffered salina (PBS) per la fissazione.
- In un piatto di coltura cellulare pulito 24-well, aggiungere 1 mL di fissativo ai singoli pozzi in modo che ce ne sia uno bene per ogni inserto.
- Preparare la soluzione di colorazione (frescamente fatta) di 0,1% di viola di cristallo (w/v) in una soluzione di PBS con 10% di etanolo (v/v). Allo stesso modo, aggiungere 1 mL di soluzione di colorazione a un pozzo pulito in un piatto di coltura 24-well per ogni inserto.
- Rimuovere ogni inserto uno alla volta con pinze e posizionare un tampone di cotone sterile all'interno dell'inserto e tamponare il lato superiore della membrana per rimuovere le cellule non migrati.
- Ripetere con un secondo tampone di cotone. La membrana è piuttosto forte, quindi una pressione delicata durante lo swabbing non compromette l'integrità della membrana.
- Rimuovere il supporto rimanente dall'interno dell'inserto e aggiungere 750 luna di PBS per lavare via le cellule staccate.
- Rimuovere il PBS e ripetere il lavaggio. Posizionare l'inserto in un pozzo fisso per fissare le cellule migrate nella parte inferiore della membrana. Ripetere l'operazione per tutti gli inserti.
- Fissare gli inserti per 15 min a temperatura ambiente.
- Dopo fissaggio rimuovere l'inserto. Lavare nuovamente l'inserto con 750 PBS.
- Inserire l'inserto nel pozzo con la soluzione di colorazione per macchiare tutte le celle migrate e fisse. Macchiare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.
NOT: Per gli inserti a 6 pozze, utilizzare 2 mL di soluzione fissativa, una soluzione di colorazione di 2 mL e 2 mL di lavaggio PBS.
- Utilizzare un becher con acqua distillata per destare gli inserti. Rimuovere gli inserti e immergere nell'acqua distillata fino a quando l'acqua che scorre fuori l'inserto è chiaro.
- Rimuovere eventuali goccioline d'acqua in eccesso e posizionare gli inserti su una carta da filtro lateralmente all'aria secca (di solito durante la notte).
- Preparare la membrana per l'imaging etichettando un vetrino in vetro pulito per ogni inserto e posizionare una piccola goccia di olio di immersione al microscopio al centro del vetrino.
- Staccare la membrana dall'inserto utilizzando un bisturi per tagliare intorno al perimetro della membrana all'interno dell'inserto di plastica.
- Rimuovere la membrana con pinze e posizionare sulla parte superiore della goccia d'olio sulla diapositiva per tenerlo in posizione.
NOT: Le membrane sono molto sottili e molto leggere, quindi possono essere facilmente perse dal flusso d'aria dolce.
3. Imaging e analisi
- Poiché le membrane porose sono cellule chiare e coloranti con viola cristallo dare loro contrasto, utilizzare un microscopio di luce composta per visualizzare le cellule. Utilizzare una fotocamera e/o un software per quantificare per molti campioni, ma non è necessario. Visualizzare le celle con ingrandimento di 5x, 10x o 20x. Per la quantificazione, utilizzare più immagini non sovrapposte con un ingrandimento di 10 volte. In alternativa, contare tutte le cellule migrate sulla membrana a un ingrandimento di 10 volte.
- Determinare il numero totale di celle o celle invasori per area per tutti i campioni. Per ogni esperimento, eseguire ogni condizione nel saggio con tre inserti replicare e ripetere più volte per risultati statisticamente utili.
- Quando si confrontano linee cellulari diverse con diversi tassi di crescita e tassi di migrazione, fare un esperimento parallelo per confrontare le cellule che invadono attraverso una matrice proteica e confrontare con un assemblaggio Boyden Chamber senza matrice proteica (solo cellule migrate). Calcolare l'invasione percentuale per ogni linea cellulare (Numero di celle invase/ numero di celle migrate x 100%).
NOT: Questo approccio può aiutare a confrontare il tasso di invasione con i tassi di migrazione. Se si confrontano diverse condizioni applicate alla stessa linea cellulare, calcolare l'invasione da solo è calcoli più rilevanti. Il bordo esterno della membrana a volte ha un numero maggiore di cellule rispetto alle aree centrali ed è, quindi, meno preciso. In questo caso, escludere tali cellule dalla quantificazione e assicurarsi che tutte le cellule vengano rimosse da un tampone di cotone in un esperimento di ripetizione.
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Representative Results
Questo metodo di invasione in vitro attraverso una matrice proteica è stato utilizzato per valutare i fenotipi aggressivi e i comportamenti cellulari oncogeni delle cellule tumorali dei topi con espressione alterata della proteina delle dita di zinco , C3H88. In concomitanza con altri approcci che esaminano anche la migrazione e la crescita delle cellule in ambienti 3D, si è scoperto che livelli più elevati di espressione di c3h8 nelle linee cellulari tumorali, o per espressione mediata dal plasmide, hanno provocato tassi rapidi di cellule proliferazione, migrazione veloce, crescita in ambienti 3D, e aumento dell'invasione nel test di invasione in vitro8. Al contrario, la diminuzione dell'espressione da parte dei costrutti di shRNA ha provocato una proliferazione meno aggressiva, la migrazione e l'invasione8. Questi risultati sono stati confermati in vivo, dove l'espressione superiore di c3h8 ha prodotto tumori più grandi che sono apparsi rapidamente, mentre l'espressione diminuita ha prodotto meno tumori che erano più piccoli e meno frequenti8.
Per espandere il lavoro, i plasmidi di espressione in grado di salvare il knockdown mediato da shRNA dell'espressione di c3h8 sono stati trasfettati stabilmente nelle cellule mammarie dei topi per valutare se la crescita e il comportamento delle cellule aggressive potessero essere ristabiliti in queste cellule. Tutte le espressioni sono state verificate da western blot o RT-qPCR8. Un assaggio di invasione è stato utilizzato con 5.000 celle per camera in un piatto di 24 pozzetti e documentato con fotografie come mostrato Figura 1 e Figura 2. La figura 3 mostra i risultati dell'attitudine che dimostrano come l'invasione cellulare sia diminuita al knockdown dello shRNA dell'espressione di c3h8, ma che l'invasione venga salvata quando l'espressione viene salvata. Questi dati mostrano che il saggio di invasione può fornire un metodo rapido per testare le linee cellulari in vitro prima di intraprendere approcci più costosi e lunghi.
Figura 1: Componenti di assaggio dell'invasione. (A) Inserto da camera Boyden per un piatto di coltura dei tessuti a 24 pozzetto. (B) Un piatto di coltura dei tessuti a 24 pozze, utilizzato per fissare, colorare e lavare dopo 22 h incubazione con le cellule. I numeri 1, 2 e 3 sono repliche di una singola linea di celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diagramma di flusso del saggio di invasione con la scala temporale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati di analisi dell'invasione di esempio di cellule tumorali mammarie di topo alterate per l'espressione di c3h8, che cambia il fenotipo oncogenico. (A, B) Le cellule isolate dai tumori mammari dei topi sono state trascate stabilmente con lo shRNA che mirava a una sequenza di controllo dell'mRNA o mirava a un mRNA di mRNA. (C) La linea cellulare successiva è stata poi salvata esprimendo ricombinante , progettato per non essere influenzato dallo shRNA. Le cellule sono macchiate di viola di cristallo e catturate all'ingrandimento di 10 volte utilizzando un microscopio luminoso. La quantificazione della barradi scala (D) mostra che l'espressione ridotta di c3h8 ha diminuito il numero di cellule invasori e il potenziale di metastasi. Il salvataggio dell'espressione genica salva tassi più elevati di invasione cellulare. I valori rappresentano il numero totale di cellule invasori da un inserto di assaggio invasione 24-well. Per ogni replica nell'esperimento, è stato calcolato il numero medio di cellule invasori. Questo è stato ripetuto per tre esperimenti. Le barre di errore indicano un errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il test di invasione in vitro è un metodo economico, rapido, quantitativo e diretto per studiare i fattori che promuovono l'invasione delle cellule tumorali. Il cancro al seno è il cancro più comunemente diagnosticato tra le donne. Dei tre principali sottotipi di cancro al seno, triplo negativo, (o ER-, PR-, HER2/neu-), è il più aggressivo, più probabile che metastatizza, e più mortale9. Pertanto, comprendere i geni e l'espressione che causano la metastasi può aiutare a trovare nuovi bersagli terapeutici e marcatori genetici per la malattia. Sebbene molti dei geni importanti per l'invasione delle cellule tumorali e la metastasi siano stati identificati e caratterizzati, i livelli di espressione e l'attività dei driver di metastasi rispetto ai soppressori della metastasi possono essere un aspetto critico della progressione della malattia9, 10.
Oltre all'espressione genica, il saggio di invasione in vitro è stato utilizzato anche per studiare il ruolo del microRNA e di altri regolatori nella promozione o nella prevenzione dell'invasione delle cellule tumorali11,12. Il metodo di configurazione dell'invasione in vitro può essere utilizzato per lo studio di inibitori, ambienti tumorali di tipo multi-cellula, cellule modificate CRISPR o cambiamenti a breve termine in ambienti di crescita cellulare. La versatilità e l'adattabilità rendono questo saggio molto vantaggioso.
Il saggio di invasione può essere utilizzato in una prima fase nell'analisi dei geni e dei fattori che contribuiscono o impediscono la progressione del tumore. (2010) ha utilizzato i saggi di invasione in vitro per definire il ruolo del GATA-3 nel sopprimere il contenuto di un eMT mediante la linea cellulare del cancro al seno molto aggressiva MDA-MB 23113. Sono stati poi in grado di dimostrare che questa soppressione era correlata con una ridotta capacità di formare metastasi in un assaggio in vivo13. Le potenziali strategie terapeutiche possono inizialmente essere caratterizzate dalla capacità degli inibitori della via di limitare l'invasione attraverso Matrigel, correlando anche con l'effetto di questi inibitori sulla formazione del tumore nei modelli animali. Il test di invasione in vitro può essere utilizzato per un'analisi più approfondita degli oncogeni noti e potenziali e dei partner interagenti. Ad esempio, la dissezione molecolare di motivi funzionali noti di un'oncoproteina o una rapida analisi delle mutazioni può essere fatta con il saggio di invasione in vitro come uno schermo iniziale o una valutazione del significato. Questo può fornire preziose informazioni sui domini critici e una comprensione funzionale dei fenotipi cellulari a livello molecolare.
Mentre il saggio di invasione della camera di Boyden ha molti vantaggi, ci sono limitazioni. Per esempio, il saggio di invasione guarda solo l'invasione, uno dei primi passi della metastasi, ma non i passi successivi quando le cellule tumorali colonizzano le posizioni secondarie. Pertanto, solo una visione parziale del potenziale di metastasi può essere conclusa. La lunghezza di 22 h del saggio, sebbene flessibile, non può escludere una divisione cellulare che potrebbe alterare sottili cambiamenti nella misurazione dell'invasione delle popolazioni di cellule asincrone. Inibitori come la mitomicina C possono essere utilizzati per prevenire la divisione cellulare nel caso di cellule che si immergiscono rapidamente. Infine, l'uso della soluzione FBS del 5% per la chemiotassi si diffonderà lentamente nel tempo ed equilibrate tra entrambe le camere superiori e inferiori. La densità del gel proteico rallenta questa diffusione e presenta alle cellule la possibilità di migrare lateralmente attraverso il gel e la membrana (haplotaxis) o attraverso la matrice proteica e attraverso i pori verso le più alte concentrazioni di FBS (chemotaxis). Gli agenti alternativi di chemiotassi possono essere sostituiti o per l'invasione possono essere utilizzati indennità di tempo più brevi per l'invasione per misurare solo le cellule che hanno invaso prima dell'eclacco. È la flessibilità, non la rigidità, del saggio di invasione in vitro che consente la personalizzazione che rende questo saggio così utile. Gli adattamenti futuri di questo saggio includono uno screening su larga scala dei composti, cambiamenti dell'espressione genica e una valutazione dell'efficacia specifica dei farmaci allele. Inoltre, un sistema a doppia camera con supporti circolanti potrebbe sfidare le cellule ad invadere attraverso una matrice proteica, attraversare un ambiente liquido e ristabilire su una seconda matrice proteica in una posizione secondaria. Infine, una membrana più impegnativa può essere utilizzata con il sistema di analisi dell'invasione in vitro, come un monostrato di cellule non invasive che sarebbe più difficile da attraversare per le cellule tumorali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R15CA169978 dei National Institutes of Health. Ulteriori finanziamenti provenivano dall'Università di Villanova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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