Summary
시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.
Abstract
시험관 내 침범 분석술은 보이든 챔버에서 단백질이 풍부한 매트릭스를 사용하여 암세포 전이의 초기 단계와 유사한 과정에서 배양된 세포가 매트릭스 및 다공성 막을 통과하는 능력을 측정한다. 시험된 세포는 유전자 발현을 위해 변경되거나 억제제로 처리되어 침략 잠재력의 변화를 테스트할 수 있다. 이 실험은 마우스 유방 종양 세포의 공격적인 표현형을 시험하여 세포 침입을 촉진하는 잠재적인 종양 유전자를 발견하고 특성화합니다. 그러나 이 기술은 다재다능하고 다양한 응용 분야에 적용될 수 있습니다. 실험 자체는 하루에 할 수 있고 결과는 하루 안에 가벼운 현미경 검사법에 의해 얻어집니다. 결과는 비교 및 분석을 위한 침입 세포의 수의 수를 포함합니다. 시험관 내 침범 분석법은 생체 외 분석법에 더 관여하기 전에 초기 평가로서 사용될 수 있는 배양에서 세포 거동을 결정하기 위한 신속하고 저렴하며 명확한 방법이다.
Introduction
시험관 내 침범 분석은 전이의 첫 번째 단계와 유사하게 단백질 코팅 막을 통해 이동하는 세포의 능력을 측정할 때 유용한 도구가 될 수 있습니다. 악성 암세포의 주요 특징은 인근 조직을 통해 이동하고 침입하는 능력입니다. 퍼지거나 전이한 암은 더 많은 처리 도전을 제기하고 현지화한 종양이 취급하기 쉽고 장기 생존의 더 높은 비율이 있는 동안 장기 생존의 더 낮은 비율이 있습니다. 전이하기 위하여는, 암세포는 1 차적인 종양을 떠나 순환계 또는 림프계로 이동해야 합니다, 세포외 매트릭스 및지하 막을 통과하는 것을 요구하는 프로세스 1. 상피 중간엽 전이 (EMT)라고하는 과정에서 종양 세포는 세포 접촉을 끊고, 방향을 마이그레이션하고, 근처의 혈액 이나 림프관을 침범해야합니다. 이 전이 폭포의 초기 단계는 이 단계가 암을 치명적으로 만들 수 있는 무슨이기 때문에 큰 관심사입니다. 전이의 초기 단계에 관여하는 유전적 및 후생유전학적 요인은 많은 양의 연구의 초점이지만, 정확하고 신뢰할 수 있는 실험 도구는 생체 내 및 시험관 내에서 이러한 초기 단계를 테스트하는 데 필요합니다.
연한 한천 분석실험과 같은 3D 환경에서 상처 치유(스크래치) 분석또는 성장과 같은 세포 이동의 변화를 측정하는 도구는 전이의 초기 단계를 측정하는 실험적 방법의 필요성을 부분적으로 해결할 수 있지만, 침략을 측정하는 분석법은 프로세스가 복잡한 종양 미세 환경 내의 바디에서 생기기 때문에 더 도전적입니다. 침범 및 전이에서 중요한 인자를 결정하기 위해 약물 또는 유전자 변경을 스크리닝하기 위한 목적으로, 배양된 세포와 함께 시험관내에서 사용할 수 있고생체 내에서 전이성 세포가 직면한 과제를 모방할 수 있는 시스템은 침략 분석2, 3. 유방암은 여자에 있는 암의 가장 일반적으로 진단된 모형이고 여자에 있는 암 죽음의 두 번째 주요한 원인, 그래서 유방암 세포 침략 및 전이에 책임 있는 유전자를 이해하는 것은 공중 위생을 위해 매우 중요합니다. 더욱이, 마우스 세포는 유방암과 그것의 진행을 공부하기위한 유용한 모델 시스템입니다.
시험관 내 침략 분석제는 성장 매체의 2개의 약실이 다공성 막3에의해 분리되는 Boyden 챔버 어셈블리를 기반으로 합니다. 종양 미세 환경을 모방하기 위해, 단백질이 풍부한 겔은 또한 다른 한 챔버에서 화학력으로부터 세포를 분리하고 지하 막 장벽으로 작용하기 위해 포함된다. 화학 유착제로 이동하기 위하여는, 세포는 먼저 단백질이 풍부한 방벽을 통과하고 다공성 막을 통과해야 합니다 - 전이성 세포가 기질을 통해 이동하는 방법과 유사한 프로세스. 단백질이 풍부한 겔은 실험의 필요에 따라 변경될 수 있지만, 일반적으로 콜라겐, 또는 지하 막 추출물(예를들어, 마트리겔)4로 구성된다. 단백질, 프로테오글리칸 및 성장 인자의 복잡한 혼합물이지만 대부분 라미닌과 콜라겐 IV 4,5로구성됩니다. 세포는 일반적으로 폴리 카보네이트, 폴리 에스테르 또는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)로 만들어진 다공성 멤브레인을 통과해야합니다. 멤브레인은 단백질 겔(전형적으로 콜라겐)의 유무에 관계없이 상업적으로 구입될 수 있거나, 또는 겔을 별도로 구입하여 첨가할 수 있다. 기공 크기는 세포 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 공극 크기는 0.4 - 8.0 μm에서 사용할 수 있지만 3.0 - 8.0 μm의 기공만 세포 이동에 충분히 큽합니다. 침략 분석은 세포가 이동하고 침입하는 능력에 대한 억제제의 효과를 결정하는 데 사용되었습니다. 생체 내에서 존재하는 정확한 종양 미세 환경이 부족하면서, 시험관내 침습 분석실험은 동물 모델의 필요성을 최소화하면서 짧은 시간에 많은 조건을 스크리닝하는 데 유리하다. 이러한 실험의 목적은 의심되는 종양유전자의 유전자 발현을 비교하고 시험관내 침범 분석 및 기타 검사를 사용하여 암세포 행동 및 질병 공격성에 미치는 영향을 결정하는 것이다. 전반적으로, 침략 분석법은 상대적으로 저렴하고 간단하며 적응 가능한 방법인 동시에 전이성 전위를 결정하기 위한 일관되고 정량적이며 신속한 결과를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험과 방법은 빌라노바 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인으로 수행되었다.
1. 배양 마우스 유방 종양 세포에서 유전자 발현
- 먼저, 검사할 세포주를 준비한다.
-
BALB/cV 마우스의 사육 식민지를 사용하십시오. 이 마우스는 마우스 유방 종양 바이러스의 BALB/cV 긴장을, 우유6,7에있는 새끼에게 전달됩니다. 번식 여성의 50 %는 생후 10 개월까지 유방 종양을 개발합니다.
- 종양 세포주 확립을 위해 IACUC 승인 프로토콜을 사용하여 종양 베어링 댐을 희생합니다. 복부 피부를 70 % EtOH에 담그고 층류 후드에서 멸균 조건하에서 종양을 제거하십시오. 종양은 피하이므로 복막에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오.
- 소량의 멸균 행크스 균형 식염수 용액 (HBSS)을 가진 페트리 접시에 비 괴사 지역에서 종양 조각을 놓고 멸균 면도날로 아주 잘게 다진다.
- 분산된 세포 덩어리를 5 mL 덜베코의 변형 된 독수리 배지 또는 DMEM (4.5 g / L 포도당, 페놀 레드 및 L-글루타민)을 함유 한 T25 세포 배양 플라스크로 옮기고 50 % 태아 소 혈청 또는 FBS 및 1 % 항생제 / 항균성 용액으로 보충했습니다. 37°C에서 5% CO2 및 100% 습도를 가진 인큐베이터에서 처리된 세포 배양 플라스크에서 세포를 성장시다.
- 24-48 시간 후에 비 부착 세포를 씻어 내고 DMEM을 50 % FBS 및 1 % 항생제 / 항 균제 용액으로 교체하십시오. 세포를 인큐베이터로 되감습니다.
- 3일마다 액체 배양 매체를 교체하십시오.
- 세포를 분할하거나 통과하면 90% 수렴됩니다. 배양 배지를 제거하고 HBSS로 부착 된 세포를 씻어 내주세요 (칼슘이나 마그네슘 제외). 세포가 반올림되고 분리 될 때까지 37 °C에서 1-5 분 동안 0.25 % 트립신 -EDTA 용액으로 세포를 배양하십시오. 신선한 배양 배지에 세포를 1:10 희석하고 새로운 플라스크에 첨가합니다. T-25 세포 배양 플라스크는 5-8 mL 배양 배지, 세척하는 HBSS의 5 mL, 및 통과를 위한 트립신-EDTA의 1 mL을 필요로 한다. 플라스크를 인큐베이터로 되돌려 보세요.
- FBS 농도를 첫 번째 통로 후 40%로 낮추고, 두 번째 통로 후 30%, 제3 항도 후 20%, 그리고 모든 후속 구절에 대해 최종적으로 10%로 감소시다. 10 % FBS와 표준 DMEM 매체의 성장을 확립하는 과정은 네 구절과 2 - 8 개월이 필요합니다.
-
일단 세포주(들)가 확립되면, 비필수 유전자에 대한 shRNA 표적화 mRNA 또는 CRISPR의 형질전환에 의해 의심되는 종양유전자의 발현을 변경한다.
- 일관된 결과를 위해 서쪽 얼룩 및/또는 RT-qPCR에 의해 확인된 개별 적인 클론을 가진 항생 저항하는 안정한 세포주를 설치하십시오, 그러나, 과도 한 transfections는 분석만이 22 h를 필요로 하기 때문에 잘 작동할 수 있습니다. 비특정 대상 시퀀스도 필요합니다.
2. 체외 침공 분석
- T25 플라스크에서 부착 마우스 유방 종양 세포를 성장70-90% 실험의 첫 날에 대한 동시.
참고: 다른 세포주 또는 실험 조건은 상이한 세포 배양 배지를 요구할 수 있다. 예를 들어, 호르몬 반응 성 유방암 세포 테스트 되 고 하는 경우, 숯 여과 혈 청 에스트로겐 또는 다른 호르몬 수용 체를 활성화 하는 화합물을 제거 하는 데 필요할 수 있습니다. - 보이든 챔버 인서트를 실온(-20°C 저장으로부터)으로 약 20분 동안 세포 배양 후드로 데우면 준비한다. 사용하지 않은 인서트의 경우 동결 해동 주기를 피하십시오. 세 개의 삽입(복제)을 사용하여 각 실험에 대해 각 세포주마다 통계적으로 유효한 데이터를 생성합니다.
- 미리 온난한 37°C 혈청이 없는 DMEM 매를 웰에 넣고 인서트합니다. 24웰 접시용으로 설계된 인서트의 경우, 500 μL의 무혈청 DMEM을 웰에 추가한 다음 500 μL의 무혈청 DMEM을 인서트에 추가하여 다공성 멤브레인과 젤이 양면에 수화되도록 합니다.
참고: 6웰 접시를 위해 설계된 더 큰 인서트의 경우 양면에 2mL의 무혈청 DMEM을 사용하십시오.
- 미리 온난한 37°C 혈청이 없는 DMEM 매를 웰에 넣고 인서트합니다. 24웰 접시용으로 설계된 인서트의 경우, 500 μL의 무혈청 DMEM을 웰에 추가한 다음 500 μL의 무혈청 DMEM을 인서트에 추가하여 다공성 멤브레인과 젤이 양면에 수화되도록 합니다.
- 인서트와 함께 접시를 5% CO2 및 100% 습도가 있는 37°C 세포 배양 인큐베이터에 넣고 2시간 이상 습도를 높여 수분을 철저히 하고 적응합니다.
- 성장 매체를 제거하고 5 mL HBSS로 세포를 헹구어 세포를 준비시다.
- HBSS를 제거하고 37°C에서 1-5분 동안 또는 세포가 둥글게 나타나거나 플라스크에서 분리된 흔적을 보일 때까지 1 mL 0.25% 트립신-EDTA 용액을 추가합니다.
- 플라스크를 살짝 눌러 모든 세포를 분리합니다. DMEM + 10% FBS의 5 mL에서 세포를 다시 중단하고 멸균 된 15 mL 원심 분리튜브로 옮김.
- 세포를 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 부드럽게 펠렛합니다. 미디어를 제거하고 5 mL 무혈청 DMEM으로 교체하여 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 세럼이 없는 매체에서 원심분리와 현탁액을 총 3회 두 번 더 반복합니다.
- 혈청이 없는 DMEM의 마지막 5 mL에서 세포를 철저히 재중단하고 세포 덩어리가 없는지 확인합니다.
- 혈세포계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 실행 가능한 셀만 계산합니다. 셀 현탁액을 5 mL의 무혈청 DMEM에서 5 x 104 세포/mL로 희석합니다.
참고: 이 농도는 24 웰 접시에 삽입 당 2,500 세포를 산출합니다. 세포의 이 수는 이주와 침략의 높은 비율을 가진 공격적인 암세포를 위해 충분합니다. 덜 공격적인 세포주 더 많은 세포를 요구할 수 있습니다., 관찰 가능한 침입 세포에 대 한 삽입 당 최대 10,000 셀. 감소된 세포 침략이 예상되는 경우에, 세포 수를 증가시켜 침입 세포를 최대화하는 것을 고려하십시오. 증가 된 세포 침략이 예상되는 경우, 적은 세포로 시작합니다. - 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 제거하고 삽입물로부터 부드럽게 흡인합니다. 인서트를 들어 올려 우물에서 용지를 흡인합니다. 신속하게 작업, 하부 챔버에 화학 매력을 추가합니다. 24웰 접시의 경우, 5% FBS로 750 μL의 DMEM을 추가하십시오.
- 웰에 삽입을 배치하고 인서트를 삽입에 추가합니다. 24웰 접시의 경우 500 μL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 6웰 접시 삽입을 위해, 2.5 mL의 화학 유치와 2 mL의 세포를 사용하십시오. 멤브레인의 양쪽에 공기 거품이 없는지 확인합니다.
- 접시를 세포 배양 인큐베이터에 22 시간 동안 되돌려 보라고 한다.
- 22 시간 후에 세포를 수정하고 얼룩지게하십시오. 고정을 위해 1x 인산완충식염수(PBS)에 1% 파라포름알데히드용액을 준비한다.
- 깨끗한 24웰 셀 배양 접시에 개별 우물에 1 mL의 고정제를 추가하여 각 삽입에 대해 1 개의 웰이 있습니다.
- 10% 에탄올(v/v)으로 PBS 용액에 0.1% 크리스탈 바이올렛(w/v)의 염색 용액(갓 제조)을 준비합니다. 마찬가지로, 각 인서트를 위한 24웰 배양 접시에 1 mL의 염색 용액을 깨끗한 우물에 추가하십시오.
- 집게로 한 번에 하나씩 삽입을 제거하고 삽입 물 안쪽에 멸균 면봉을 놓고 멤브레인의 위쪽면을 면봉하여 이동되지 않은 세포를 제거합니다.
- 두 번째 면봉으로 반복합니다. 멤브레인은 다소 강하고, 스와핑하는 동안 부드러운 압력은 멤브레인의 무결성을 손상시키지 않습니다.
- 인서트가 내부에서 남은 용지를 제거하고 750 μL의 PBS를 추가하여 분리된 세포를 씻어내세요.
- PBS를 제거하고 세척을 반복합니다. 삽입을 잘 함유 된 고정제에 넣고 멤브레인 의 밑면에 마이그레이션 된 세포를 고정시킵니다. 모든 삽입에 대해 반복합니다.
- 실온에서 인서트를 15분 동안 고정합니다.
- 다음 고정은 인서트를 제거합니다. 750 μL PBS로 인서트를 다시 세척하십시오.
- 스테인링 용액으로 인서트를 웰에 넣고 모든 이동 및 고정 된 세포를 염색하십시오. 실온에서 15 분 동안 세포를 얼룩지게하십시오.
참고: 6웰 접시 인서트를 위해 2 mL의 고정 용액, 2 mL 염색 용액 및 2 mL의 PBS 워시를 사용하십시오.
- 증류수로 비커를 사용하여 인서트를 채소하십시오. 인서트를 제거하고 인서트가 흘러나오면 물이 깨끗해질 때까지 증류수에 담급강합니다.
- 여분의 물방울을 제거하고 인서트를 필터 용지에 나란히 놓아 공기 건조(보통 하룻밤)합니다.
- 각 삽입에 대해 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 라벨을 붙임으로써 이미징용 멤브레인을 준비하고 슬라이드 중앙에 현미경 침지 오일을 작은 방울로 놓습니다.
- 플라스틱 삽입의 내부에 멤브레인의 둘레를 잘라 메스를 사용하여 삽입에서 멤브레인을 분리합니다.
- 집게를 사용하여 멤브레인을 제거하고 슬라이드의 오일 드롭 상단에 놓아 제자리에 고정시킵니다.
참고: 멤브레인은 매우 얇고 매우 가볍기 때문에 부드러운 공기 흐름에 의해 쉽게 손실 될 수 있습니다.
3. 이미징 및 분석
- 다공성 멤브레인은 명확하고 크리스탈 보라색으로 세포를 염색하기 때문에 대조를 이루고, 화합물 광 현미경을 사용하여 세포를 볼 수 있습니다. 카메라 및/또는 소프트웨어를 사용하여 많은 샘플에 대해 정량화하지만 필요하지는 않습니다. 5배, 10배 또는 20배 배율로 셀을 봅니다. 정량화를 위해 10배 배율에서 겹치지 않는 여러 이미지를 사용합니다. 또는, 10 배 배율로 멤브레인에 모든 마이그레이션 된 세포를 계산합니다.
- 모든 샘플에 대한 면적당 침입 셀 또는 셀의 총 수를 결정합니다. 각 실험에 대해, 3개의 복제 삽입을 가진 분석실험에 있는 각 조건을 능력을 발휘하고 통계적으로 유용한 결과를 위해 여러 번 반복합니다.
- 상이한 세포주를 상이한 성장 속도 및 이동 속도와 비교할 때, 단백질 매트릭스를 통해 침입하는 세포를 비교하고 단백질 매트릭스가 없는 Boyden Chamber 어셈블리와 비교하기 위한 병렬 실험을 수행합니다(이동된 세포만 해당). 각 세포주에 대한 퍼센트 침공을 계산합니다(침입한 세포 수/이동된 셀 수 x 100%).
참고: 이 방법을 사용하면 침입 률과 마이그레이션 속도를 비교할 수 있습니다. 동일한 세포주에 적용되는 다른 조건을 비교하는 경우 침공만 계산하는 것이 더 관련성이 있는 계산입니다. 멤브레인의 바깥쪽 가장자리는 때때로 중앙 지역보다는 세포의 더 높은 수를 가지고 있고, 그러므로, 보다 적게 정확합니다. 이 경우, 정량화에서 그 세포를 배제하고 모든 세포가 반복 실험에서 면봉에 의해 제거되도록합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단백질 매트릭스를 통한 시험관내 침습의 이러한 방법은 아연 핑거 단백질 ZC3H8 8의 변경된 발현을 가진 마우스 유방 종양세포의 공격적인 표현형 및 종양발생 세포 거동을 평가하기 위해 사용되었다. 또한 3D 환경에서 세포 이동 및 성장을 검사하는 다른 접근법과 함께, 종양 세포주에서 Zc3h8의 발현 수준이 높거나 플라스미드에서 프로모터 매개 발현에 의해 세포의 빠른 속도를 초래한다는 것을 발견했습니다. 증식, 빠른 이동, 3D 환경에서의 성장, 시험관 내침략 분석에서의 침입 증가 8. 반대로, shRNA 구문에 의한 발현 감소는 덜 공격적인증식, 마이그레이션 및 침략 8. 이러한 결과는 Zc3h8의 높은 발현이 급속히 나타난 더 큰 종양을 생산하는 생체 내에서 확인되었으며, 감소된 발현은 더 작고 덜 빈번한 종양을 더 적게 생산하였다8.
이러한 작업을 확장하기 위해, Zc3h8 발현의 shRNA 매개 녹다운을 구출할 수 있는 발현 플라스미드는 마우스 유방 세포에서 안정적으로 형질전환되어 공격적인 세포 성장 및 행동이 이들 세포에서 재확립될 수 있는지 를 평가하였다. 표현의 모든 녹다운 및 구조는 서부 얼룩 또는 RT-qPCR8에의해 확인되었다. 침략 분석은 24 웰 접시에 챔버 당 5,000 세포와 함께 사용되었고 그림 1 및 그림 2에도시된 바와 같이 사진으로 문서화되었습니다. 도 3은 Zc3h8 식의 shRNA 붕괴 시 세포 침이 어떻게 감소했는지를 보여주는 침략 분석의 결과를 나타내지만, 발현이 구출될 때 그 침략이 구출된다. 이러한 데이터는 침략 분석이 더 비싸고 긴 접근법에 착수하기 전에 시험관내에서 세포주를 시험하기 위한 신속한 방법을 제공할 수 있음을 보여준다.
그림 1: 침략 분석 구성 요소. (A) 24웰 조직 배양 접시용 보이든 챔버 인서트를 삽입한다. (B) 세포로 배양한 후 22시간 배양 후 고정, 염색 및 세척에 사용되는 24웰 조직 배양 접시. 숫자 1, 2 및 3은 단일 세포주 복제체입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시간 척도가 있는 침공 분석 순서도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: Zc3h8의 발현을 위해 변경된 마우스 유방 종양 세포의 샘플 침입 분석 결과는 종양발생 표현형을 변화시다. (A,B) 마우스 유방 종양으로부터 분리된 세포는 mRNA의 대조군 서열을 표적화하거나 Zc3h8 mRNA를 표적화하는 shRNA로 안정적으로 형질감염되었다. (C) 이후세포주들은 shRNA에 의해 영향을 받지 않게 설계된 재조합 Zc3h8을 발현하여 구출하였다. 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 10 배 배율로 캡처됩니다. 스케일 바 = 500μm. (D) Zc3h8의 발현 감소가 침입 세포의 수 및 전이 전위를 감소시켰는것을 보여주는 정량화. 유전자 발현의 구조는 세포 침략의 더 높은 비율을 구출합니다. 값은 24웰 침입 분석 서인에서 침입 셀의 총 수를 나타냅니다. 실험에서 각 복제에 대해, 침입 세포의 평균 수를 계산하였다. 이것은 3개의 실험을 위해 반복되었다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
시험관 내 침범 분석법은 암세포 침입을 촉진하는 요인을 연구하기 위한 저렴하고, 신속하고, 정량적이며, 간단한 방법이다. 유방암은 여자 중 가장 일반적으로 진단된 암입니다. 유방암의 3개의 중요한 특수형의, 삼중 음성, (또는 ER-, PR-, HER2/neu -), 가장 공격적이고, 전이할 가능성이 가장 높으며, 가장 치명적인9. 따라서 전이를 초래하는 유전자와 발현을 이해하면 질병에 대한 새로운 치료 표적 및 유전 적 마커를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 암세포 침입 및 전이에 중요한 많은 유전자가 확인되고 특성화되었지만, 전이 동인대 전이 억제제의 발현 수준 및 활성은 질병 진행의 중요한 양상일 수 있다9, 10.
유전자 발현을 넘어, 시험관내 침습 분석기는 또한 암세포 침범을 촉진 또는예방하는 마이크로RNA 및 기타 조절제의 역할을 연구하기 위해 11,12를사용하였다. 시험관내 침습 설정 방법은 억제제, 다세포 형 종양 환경, CRISPR 편집 세포, 또는 세포 성장 환경에 대한 단기 적인 변화의 연구에 사용될 수 있다. 다재다능함과 적응력은 이 분석이 매우 유리합니다.
상기 침범 분석은 종양 진행에 기여하거나 예방하는 유전자 및 인자의 분석에서 제1단계에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Yan et al. (2010)은 매우 공격적인 유방암 세포주 MDA-MB 23113에의해 EMT를 억제하는 데 GATA-3의 역할을 정의하기 위해 시험관내 침범 검정을 사용했다. 그 후 생체내 분석13에서 전이를 형성하는 감소된 능력과 이러한 억제가 상관한다는것을 보여줄 수 있었다. 잠재적인 치료 전략은 처음에 Matrigel을 통해 침략을 제한하는 통로 억제제의 기능을 특징으로 할 수 있습니다, 또한 동물 모델에서 종양 형성에 이러한 억제제의 효과와 상관. 시험관 내 침략 분석은 알려진 잠재적 인 종양 유전자 및 상호 작용 파트너의 보다 심층적 인 분석을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 온코프로테인의 공지된 기능적 모티프의 분자 해부 또는 돌연변이의 신속한 분석은 시험관내 침입 분석법으로서 초기 스크린 또는 유의성의 평가로 행해질 수 있다. 이것은 중요한 도메인에 귀중한 통찰력뿐만 아니라 분자 수준에 있는 세포 표현형의 기능적인 이해를 제공할 수 있습니다.
보이든 상공 회의소 침공 분석은 많은 장점을 가지고 있지만, 한계가있다. 예를 들면, 침략 분석은 전이의 초기 단계의 한개인 intravasation에, 그러나 암세포가 이차 위치를 식민지화할 때 나중 단계에서 만 보입니다. 따라서 전이 잠재력의 부분적인 견해만 결론을 내릴 수 있습니다. 분석의 22 시간 길이는, 유연한 동안, 비동기 세포 집단의 침략을 측정에 미묘한 변화를 왜곡 할 수있는 일부 세포 분열을 배제 할 수 없습니다. 미토마이신 C와 같은 억제제는 급속하게 다이빙 세포의 경우에 세포 분열을 방지하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 화학 택시에 대한 5 % FBS 솔루션의 사용은 시간이 지남에 따라 천천히 확산되고 상부 및 하부 챔버 사이의 평형화됩니다. 단백질 젤의 밀도는 이 확산을 감속시키고 젤과 막 (haplotaxis) 또는 단백질 매트릭스를 통해서 그리고 FBS (화학요법)의 더 높은 농도를 향해 모공을 통해 측면으로 이동하는 선택권으로 세포를 제시합니다. 대체 화학요법 제제는 침범에 대한 대체 또는 더 짧은 시간 수당을 평형 전에 침입한 세포만을 측정하는데 사용될 수 있다. 그것은 유연성, 하지 강성, 이 분석기를 그렇게 유용 하 게 사용자 정의에 대 한 허용 하는 시험관 내 침략 분석의. 이 분석의 미래 적응은 화합물의 대규모 스크리닝, 유전자 발현 변경, 및 대일 특이적 약물 효과의 평가를 포함한다. 또한 순환 매체가 있는 이중 챔버 시스템은 세포가 단백질 매트릭스를 통해 침입하고, 액체 환경을 통과하고, 보조 위치에서 두 번째 단백질 매트릭스를 재확립하도록 도전할 수 있습니다. 마지막으로, 더 도전적인 막은 암세포가 교차하기 더 어려울 것이다 비침범성 세포의 단층과 같은 시험관 내 침략 분석 시스템과 함께 사용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회에서 교부금 R15CA169978에 의해 지원되었다. 추가 기금은 빌라노바 대학에서 왔다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
