Summary
In dit artikel beschrijven we isolatie van van resusapen afgeleide vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) met behulp van een enzymatisch weefselverteringsprotocol. Vervolgens beschrijven we ADSC-proliferatie, waaronder celonthechting, tellen en plating. Ten slotte wordt ADSC-differentiatie beschreven met behulp van specifieke adipogene inducerende middelen. Daarnaast beschrijven we kleuringstechnieken om differentiatie te bevestigen.
Abstract
Vetweefsel biedt een rijke en toegankelijke bron van multipotente stamcellen, die zichzelf kunnen vernieuwen. Deze van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) bieden een consistent ex vivo cellulair systeem dat functioneel lijkt op dat van in vivo adipocyten. Het gebruik van ADSC's in biomedisch onderzoek maakt cellulair onderzoek van metabole regulatie en functie van vetweefsel mogelijk. ADSC-differentiatie is noodzakelijk voor adequate adipocytenexpansie en suboptimale differentiatie is een belangrijk mechanisme van vetdisfunctie. Het begrijpen van veranderingen in ADSC-differentiatie is cruciaal voor het begrijpen van de ontwikkeling van metabole disfunctie en ziekte. De protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zullen, wanneer ze worden gevolgd, volwassen adipocyten opleveren die kunnen worden gebruikt voor verschillende in vitro functionele tests om de ADSC-metabole functie te beoordelen, inclusief maar niet beperkt tot testen die glucoseopname, lipolyse, lipogenese en secretie meten. Resusapen (Macaca mulatta) zijn fysiologisch, anatomisch en evolutionair vergelijkbaar met mensen en als zodanig zijn hun weefsels en cellen op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en voor de ontwikkeling van behandelingen. Hier beschrijven we ADSC-isolatie met behulp van vers subcutaan en omentieel vetweefsel verkregen van 4-9-jarige resusapen. Vetweefselmonsters worden enzymatisch verteerd in collagenase gevolgd door filtratie en centrifugatie om ADSC's te isoleren van de stromale vasculaire fractie. Geïsoleerde ADSC's worden verspreid in stromale media, gevolgd door ongeveer 14-21 dagen differentiatie met behulp van een cocktail van 0,5 μg / ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine en 50 μM indomethacine in stromale media. Rijpe adipocyten worden waargenomen na ongeveer 14 dagen differentiatie. In dit manuscript beschrijven we protocollen voor ADSC-isolatie, proliferatie en differentiatie in vitro. Hoewel we ons hebben gericht op ADSC's van resusaap vetweefsel, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vetweefsel verkregen van andere dieren met minimale aanpassingen.
Introduction
Vetweefsel bestaat uit een heterogeen mengsel van cellen, overwegend volwassen adipocyten en een stromale vasculaire fractie, waaronder fibroblasten, immuuncellen en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)1,2,3. Primaire ADSC's kunnen rechtstreeks uit wit vetweefsel worden geïsoleerd en gestimuleerd om te differentiëren tot adipocyten, kraakbeen of botcellen4. ADSC's vertonen klassieke stamcelkenmerken zoals het behoud van multipotentie in vitro en zelfvernieuwing; en houden zich aan plastic in cultuur 5,6. ADSC's zijn van groot belang voor het gebruik in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun multipotentie en het vermogen om gemakkelijk in grote hoeveelheden te worden geoogst met behulp van niet-invasieve technieken7. Adipogene differentiatie van ADSC's produceert cellen die functioneel volwassen adipocyten nabootsen, waaronder lipidenaccumulatie, insuline-gestimuleerde glucose-opname, lipolyse en adipokine-secretie8. Hun gelijkenis met volwassen adipocyten heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van ADSC's voor fysiologisch onderzoek van cellulaire kenmerken en metabole functie van adipocyten. Er is steeds meer bewijs dat het idee ondersteunt dat de ontwikkeling van metabole disfunctie en aandoeningen ontstaat op cellulair of weefselniveau 9,10,11,12. Optimale ADSC-differentiatie is vereist voor voldoende uitbreiding van vetweefsel, een goede adipocytenfunctie en effectieve metabole regulatie13.
Protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zijn eenvoudige technieken die gebruikmaken van standaard laboratoriumapparatuur en basisreagentia. Het manuscript beschrijft eerst het protocol voor de isolatie van primaire ADSC's uit vers vetweefsel met behulp van mechanische en enzymatische spijsvertering. Vervolgens wordt het protocol voor proliferatie en passaging van ADSC's in stromaal medium beschreven. Ten slotte wordt het protocol voor adipogene differentiatie van ADSC's beschreven. Na differentiatie kunnen deze cellen worden gebruikt voor studies om het metabolisme van adipocyten en de mechanismen van disfunctie beter te begrijpen. De protocollen voor bevestiging van adipogene differentiatie en lipidedruppeldetectie met behulp van Oil Red O en borium-dipyrromethen (BODIPY) kleuring worden ook beschreven. De details van deze protocollen waren gericht op primaire ADSC's geïsoleerd uit vers omentaal vetweefsel van resusapen. Wij en anderen hebben dit protocol gebruikt om ADSC's met succes te isoleren van resusapen subcutane en omentale vetweefseldepots14,15. Voor dezelfde hoeveelheid weefsel die wordt gebruikt, hebben we waargenomen dat onderhuids vetweefsel dichter en taaier is en minder cellen oplevert uit de spijsvertering in vergelijking met omentieel vetweefsel. Dit protocol is ook gebruikt om ADSC's te isoleren van menselijke vetmonsters16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle verkregen weefsels en procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH-publicatie nr. 85-12, herzien 1996).
1. Bereiding van buffers en oplossingen
- Bereid steriele 5-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (5-PBS) oplossing door 5% penicilline / streptomycine (pen / streptop) en 0,25 μg / ml schimmelremmer toe te voegen aan 1x PBS. Bereid steriele 2-PBS wasbuffer (2-PBS) oplossing door toevoeging van 2% pen/streptokokken en 0,25 μg/ml schimmelremmer in 1x PBS. Wasbuffers kunnen bij 4 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik en moeten binnen 4 weken worden gebruikt.
OPMERKING: 5-PBS-buffer wordt gebruikt voor het verzamelen van vetweefsel en het initiële wassen om mogelijke besmetting te minimaliseren, omdat weefselmonsters die bij obductie zijn verkregen, worden verzameld in een niet-steriele omgeving. - Bereid steriele collagenasebuffer (CB) door 0,075% collagenase type I (125 eenheden/mg activiteit), 2% pen/streptokokken en 0,25 μg/ml schimmelremmer in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) te combineren met 1% runderserumalbumine. CB moet binnen 1 uur worden gebruikt.
- Bereid steriel ADSC-groeimedium voor met behulp van α-MEM-buffer. Combineer 100 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml 200 mM L-glutamineoplossing, 500 μl 0,25 μg/ml schimmelremmer en 10 ml pen/streptokokkenoplossing in 394 ml α-MEM-buffer. ADSC groeimedium kan worden bewaard bij 4 °C en moet binnen 4 weken worden gebruikt.
OPMERKING: Warmte-inactivering van FBS is niet nodig. - Bereid steriel ADSC-differentiatiemedium door ADSC-groeimedium zoals hierboven bereid en inductiemiddelen te combineren om een eindconcentratie van 0,5 μg/ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine en 50 μM indomethacine te bereiken.
2. ADSC isolatie
- Weefselvoorbereiding en spijsvertering
- Pipet ~ 10 ml 5-PBS-buffer in vier celkweekschalen van 100 mm.
- Breng ~50 g vetmonster over naar een van de 100 mm schotels met 5-PBS. Was het verzamelde vetweefselmonster vier keer door het achtereenvolgens over de vier kweekschalen met 5-PBS over te brengen.
- Breng vetweefsel over naar een schone kweekschaal van 100 mm en gehakt vetweefsel grondig met een schaar of twee steriele scalpels. Gehakt maakt het mogelijk om het oppervlak te vergroten voor een efficiënte en volledige enzymatische spijsvertering.
- Breng het gehakte vetweefsel over naar 50 ml plastic conische buis met 13 ml CB (1-3 cm doorsnede weefsel per 15 ml CB).
- Spoel de kweekschaal af met 2 ml CB en breng het medium over op de 50 ml plastic conische buis.
OPMERKING: Op dit punt moet er in totaal 15 ml CB zijn met weefsel in een plastic conische buis van 50 ml. - Pipet meerdere keren op en neer met behulp van 25 ml serologische pipet om de vertering van mechanisch weefsel te vergemakkelijken.
- Incubeer de 50 ml plastic conische buis met weefsel in CB op een rocker met gemiddelde snelheid bij 37 °C gedurende 30-60 minuten.
- ADSC-beplating voor cultuur
- Voeg 10 ml ADSC-groeimedium toe aan de buis van 50 ml die weefsel bevat om de enzymactiviteit te neutraliseren. Pipetteer meerdere keren op en neer met behulp van 25 ml serologische pipet om eventuele vetweefselaggregaten te scheiden.
- Breng het vloeibare gedeelte over in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml en laat de vaste stoffen achter. Was de originele buis van 50 ml 3 keer met ~ 7 ml 2-PBS-buffer en breng het vloeibare gedeelte over naar de buis van 50 ml.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten om een celpellet te verkrijgen. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant met behulp van een serologische pipet zonder de celkorrel te verstoren. Niet decanteren.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml 1x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 5 ml ADSC-groeimedium toe aan de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg.
- Voeg 5 ml ADSC-groeimedium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g om celpellets te wassen. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 2 ml ADSC-groeimedium en filter door een celzeef van 70 μm in een nieuwe steriele 50 ml plastic conische buis.
- Spoel de celzeef af met nog eens 2 ml ADSC groeimedium. Breng 4 ml van de suspensie met ADSC's over van de conische buis van 50 ml naar een steriele kweekschaal van 100 mm.
- Was de conische buis van 50 ml 2 keer met 3 ml ADSC-groeimedium en breng de vloeistof over in de 100 mm kweekschaal met ADSC's voor een totaal van 10 ml medium in kweekschaal.
- Bekijk cellen onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 10x om te controleren op zwevende cellen in de media zoals weergegeven in figuur 1A. Cellen moeten in een CO2-incubator worden gehouden bij 37 °C bij 5% CO2 en 100% relatieve vochtigheid.
- Bekijk na 24 uur cellen onder een omgekeerde microscoop om te controleren op celtrouw. Aspirateer ADSC groeimedium uit de plaat en vervang door 10 ml verse, warme (37 °C) media. Verwijder en vervang media om de 48 uur totdat de cellen 80% -90% confluent zijn (figuur 1B).
OPMERKING: Ten minste 10-20% van de cellen zal na 24 uur hechten. Controleer de celcultuur op tekenen van besmetting zoals celkorreligheid, troebelheid van de media of groei van sporen. Zodra cellen voor 80% samenvloeien, kunnen ze worden geoogst voor proliferatie en cryopreservatie of worden geïnduceerd om te differentiëren. ADSC's kunnen worden uitgebreid tot 4-6 passages voordat ze hun vermogen verliezen om zich efficiënt te verspreiden of te differentiëren.
3. ADSC-proliferatie
- Celonthechting
- Verwijder ADSC groeimedium met behulp van een aspirator/pipet. Spoel confluente ADSC's 2 keer met 2 ml steriele PBS op kamertemperatuur.
- Aspirateer PBS en voeg 2 ml 0,25 % trypsine-EDTA per kweekplaat van 100 mm toe. Zorg ervoor dat het volledige oppervlak bedekt is met trypsine.
- Incubeer de plaat gedurende ~ 7 minuten bij 37 ° C in 5% CO2 totdat ADSC's zijn losgemaakt. Verwijder de plaat uit de couveuse en maak cellen mechanisch los door de trypsine-oplossing krachtig in de plaat te pipetteren.
- Voeg 2 ml ADSC-groeimedium toe aan de losgeraakte cellen en pipetteer voorzichtig om te mengen. Breng cellen over naar steriele 50 ml plastic conische buis. Om maximaal celherstel te garanderen, spoelt u de kweekschaal met nog eens 2 ml ADSC-groeimedium en brengt u het medium over naar de conische buis met losse cellen.
- Centrifugeer de conische buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen. Decanteer supernatant voorzichtig zonder de celpellet te verstoren.
- Resuspend cel pellet in 5-6 ml ADSC groeimedium per 1 x 106 cellen.
- Celtelling en beplating
- Verdun in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 10 μL celoplossing van bovenaf en 10 μL 0,04% trypanblauwe oplossing (0,4% trypanblauw verdund 1:10 in PBS) en tel cellen met behulp van een hemocytometer.
- Resuspendeer het gewenste aantal ADSC's in groeimedium. Voor 100 mm kweekschaal, plaat ~ 3,0 x 105 cellen in 10 ml ADSC-groeimedia om 80% samenvloeiing in 72 uur of 100% samenvloeiing in 96 uur mogelijk te maken.
- Bekijk het gerecht onder een omgekeerde microscoop bij 10x vergroting voorafgaand aan incubatie om de aanwezigheid van gesuspendeerde cellen te garanderen. Houd de cellen op 37 °C bij 5% CO2 en 100% relatieve vochtigheid.
- Adem om de 48 uur het groeimedium op en vervang het door warm (37 °C) medium totdat de cellen voor 80% tot 90% samenvloeien, zoals weergegeven in figuur 1B.
- Herhaal de stappen uit de punten 3.1 en 3.2 voor het juiste aantal passages om het gewenste celnummer te verkrijgen.
OPMERKING: Na passages 5 tot 6 lijken primaire cellen senescentie te ondergaan; streef daarom naar het verkrijgen van gewenste celnummers door passage 4.
4. ADSC adipogene differentiatie
- AspirateER ADSC-groeimedium van aanhangende ADSC's die 80% tot 90% samenvloeiing hebben bereikt.
- Spoel de ADSC-cellaag snel af met steriele PBS op kamertemperatuur.
- Voeg ADSC-differentiatiemedium toe. Voeg voor een kweekschaal van 100 mm 10 ml ADSC-differentiatiemedium toe.
- Vervang medium om de 3 dagen gedurende ongeveer 14-21 dagen. Rijpe adipocyten worden over het algemeen waargenomen na 14 dagen differentiatie.
- Onderzoek cellen onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een vergroting van 40x om de aanwezigheid van lipidedruppels te bevestigen, zoals weergegeven in figuur 2A.
5. Adipocyten detectie
OPMERKING: In dit gedeelte worden kleuringsprotocollen beschreven die worden gebruikt voor lipidedruppeldetectie in gedifferentieerde adipocyten, maar immunofluorescente kleuring voor CD105, een mesenchymale stamcelmarker, kan ook worden gebruikt voor ADSC-bevestiging.
- Olie Rode O kleuring
- Bereid 0,5% Oil Red O stockoplossing in isopropanol. Los voor 20 ml Olie Rode O-stamoplossing 100 mg Olierood O op in 20 ml isopropanol. Filtreer de oplossing door een steriel spuitfilter met een membraan van 0,2 μm.
- Aspirateer het differentiatiemedium zorgvuldig en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
- Aspirateer PBS zorgvuldig uit cellen en voeg voldoende neutraal gebufferd formaline (NBF, 10%) toe om de cellaag te bedekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 min.
- Bereid tijdens de formalinefixatiestap de Oil Red O-werkoplossing door 3 delen oil red O-voorraadoplossing te verdunnen met 2 delen gedestilleerd water. Meng de oplossing en filter door een steriel spuitfilter met een membraan van 0,2 μm. Werkoplossing is stabiel tot 2 uur.
- Zuig NBF voorzichtig aan en was de cellaag snel (~ 15 s) met gedestilleerd water. Voeg voldoende 60% isopropanol toe om de cellaag te bedekken na het aanzuigen van water en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Aspirateer isopropanol voorzichtig na 5 minuten incubatie en voeg voldoende Olie Rode O-werkoplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
- Zuig de Oil Red O-werkoplossing voorzichtig af en was de cellaag meerdere keren met gedestilleerd water totdat het water helder wordt.
- Voeg PBS toe aan de celkweekschaal en onderzoek cellen onder een omgekeerde microscoop op indicatie van differentiatie en aanwezigheid van lipidedruppels (figuur 2B).
- BODIPY Kleuring
- Bereid 5 mM BODIPY-voorraadoplossing door 1,3 g BODIPY op te lossen in 1 ml DMSO. Bereid 2 μg/ml BODIPY-werkoplossing door de voorraadoplossing 1:25.000 keer in PBS te verdunnen.
- Aspirateer het differentiatiemedium zorgvuldig en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
- Zuig PBS voorzichtig aan en voeg voldoende BODIPY-werkoplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Bescherm vanaf dit punt cellen tegen licht door de plaat te bedekken met folie. - Zuig de BODIPY-werkoplossing zorgvuldig aan en was de cellaag 3 keer met PBS.
- Fixeer cellen door 4% paraformaldehyde toe te voegen en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
- Zuig de fixatiebuffer voorzichtig op en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
- Voeg PBS toe aan de celkweekschaal en onderzoek cellen onder een omgekeerde fluorescerende microscoop op bewijs van differentiatie en aanwezigheid van lipidedruppel (figuur 2C). Afbeeldingscellen met een FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma-filterset. Excitatiegolflengte is bij 480 nm met een bandbreedte van 40 nm en emissiegolflengte is bij 535 nm met een bandbreedte van 50 nm. Een vergelijkbare of geschikte filterset en microscoop kunnen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ADSC's geïsoleerd uit rhesus makaken vetweefselmonsters werden gezaaid op kweekplaten en is weergegeven in figuur 1. Op de dag van plating zijn cellen niet-hechtend en drijven ze in de kweekschaal zoals weergegeven in figuur 1A. Binnen 72 uur worden ADSC's voor 80% confluent en zijn ze klaar voor adipocytendifferentiatie (figuur 1B). ADSC's vertonen sterke adipogene eigenschappen na chemische inductie. Na 14 dagen differentiatie kunnen rijpe adipocyten worden waargenomen via lichtmicroscopie (figuur 2A). Om ADSC adipogene differentiatie te bevestigen, kunnen verschillende vlekken worden gebruikt om lipidedruppels van de gedifferentieerde volwassen adipocyten te visualiseren. Op dag 14 van de differentiatie werden cellen gekleurd en gefixeerd met Olie Rode O (Figuur 2B) en BODIPY (Figuur 2C) voor lipidedruppelvisualisatie. De zwarte pijl stelt een gedifferentieerde adipocyt voor (figuur 2B). Deze gegevens geven aan dat volgens dit protocol ADSC's werden gegenereerd uit resusapen vetweefsel en gedifferentieerd tot volwassen adipocyten.
Figuur 1: Lichtmicrografieën van ADSC's op de dag van beplating en bij 80% celconfluentie. (A) Representatieve lichtmicrografie van stromale vasculaire cellen op de dag van plating na ADSC-isolatie van vers resusaap vetweefsel (10x vergroting). (B) Representatieve lichtmicrografie van ADSC's bij 80% samenvloeiing (20x vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Micrografieën van ADSC's op dag 14 van differentiatie. (A) Representatieve lichtmicrograaf verkregen op dag 14 van ADSC-differentiatie (40x vergroting). (B) Representatieve microfoto van olierode O-kleuring op dag 14 van ADSC-differentiatie (20x vergroting). (C) Representatieve micrografie van boor-dipyrrometheen (BODIPY) kleuring op dag 14 van ADSC differentiatie (20x vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC-isolatie-, proliferatie- en differentiatieprotocollen zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar ze vereisen een zorgvuldige techniek om adequate isolatie, gezonde expansie en efficiënte differentiatie te garanderen. Een steriele werkomgeving is van cruciaal belang voor alle celkweekexperimenten. Bacteriën of schimmels kunnen in celculturen worden geïntroduceerd via besmette gereedschappen, media of werkomgeving. Schimmelbesmetting wordt aangegeven door sporengroei in de cultuur, terwijl bacteriële besmetting wordt aangegeven door de aanwezigheid van troebelheid van de media. We raden aan om de bioveiligheidskast en alle pipetten, flessen en gereedschappen voor gebruik te desinfecteren, de laminaire luchtstroom ten minste 15 minuten voor gebruik van de bioveiligheidskast in te schakelen en de kast en alle pipetten na gebruik te desinfecteren om het risico op besmetting te verminderen. Ook raden we autoclaverende niet-filterpipettips voor vacuümaspiratie voor en het spoelen van de aspirator met steriel water gevolgd door 70% ethanol na gebruik. Een kweekschaal met alleen media kan gedurende enkele dagen bij 37 °C en 5 % CO2 in de bevochtigde incubator worden geplaatst om de steriliteit van de media te controleren. Besmette culturen moeten gedurende 30 minuten worden gebleekt en weggegooid. De celkweekincubator moet ook worden gedesinfecteerd.
Een belangrijk verschil tussen de protocollen in dit manuscript en de eerder gepubliceerde protocollen is het gebruik van BSA in onze ADSC collagenase-verteringsbuffer die isolatie van volwassen adipocyten en ADSC's mogelijk maakt. Bovendien maakt ons protocol gebruik van ADSC-groeimedium aangevuld met 20% FBS in vergelijking met 10% FBS zoals gesuggereerd door de meeste protocollen. We hebben gemerkt dat rhesus makaak primaire ADSC's zich vermenigvuldigen en beter differentiëren met 20% FBS. ADSC-differentiatie in vitro wordt geïnduceerd door afstammingsspecifieke inductiemiddelen. De inductiemiddelen die in dit protocol worden gebruikt, worden algemeen aanvaard voor in vitro adipogene differentiatie van ADSC's. In tegenstelling tot veel eerder gepubliceerde protocollen bevat de adipogene differentiatiecocktail echter geen insuline of PPARγ-agonisten. Wij en anderen hebben dit protocol gebruikt om met succes onderscheid te maken tussen zowel resusakaak als menselijke ADSC's 14,15,16.
In dit protocol wordt ADSC adipogene differentiatie bevestigd door lipidedruppeldetectie met behulp van Oil Red O- en BODIPY-kleuringstechnieken. Hoewel deze vlekken goed worden herkend in het veld, zijn er andere methoden die vaak worden gebruikt, waaronder flowcytometrie voor detectie van CD105 om ADSC's te identificeren, of markers van endotheel- en immuuncellen om de zuiverheid van ADSCs17 vast te stellen.
Het gebruik van ADSC's biedt een waardevol hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde en metabolisch onderzoek. ADSC-isolatie en proliferatie produceert een groot aantal stamcellen die kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen en experimentele technieken, waaronder maar niet beperkt tot die beschreven in dit protocol. Een belangrijk bedoeld gebruik voor gedifferentieerde adipocyten in dit protocol omvat het gebruik van metabole testen zoals insuline-gestimuleerde glucose-opname, lipogenese en gestimuleerde lipolyse18. Bovendien kunnen ADSC's worden gedifferentieerd in osteogene en chondrogene afstamming en worden gebruikt voor downstream-analyse, waaronder voor tissue engineering7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
De auteurs willen Curtis Vande Stouwe bedanken voor zijn technische assistentie. Het onderliggende onderzoek naar de ontwikkeling van de protocollen werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 en 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
