Summary
В этой статье мы описываем выделение стволовых клеток, полученных из макак-резусов (ADSC), с использованием протокола переваривания ферментативной ткани. Далее мы опишем пролиферацию ADSC, которая включает в себя отслоение клеток, подсчет и покрытие. Наконец, дифференциация ADSC описывается с использованием специфических адипогенных индуцирующих агентов. Кроме того, мы описываем методы окрашивания для подтверждения дифференциации.
Abstract
Жировая ткань обеспечивает богатый и доступный источник мультипотентных стволовых клеток, которые способны к самообновлению. Эти стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), обеспечивают последовательную клеточную систему ex vivo, которая функционально похожа на систему адипоцитов in vivo. Использование ADSC в биомедицинских исследованиях позволяет проводить клеточное исследование метаболической регуляции и функции жировой ткани. Дифференцировка ADSC необходима для адекватного расширения адипоцитов, а субоптимальная дифференцировка является основным механизмом жировой дисфункции. Понимание изменений в дифференциации ADSC имеет решающее значение для понимания развития метаболической дисфункции и заболеваний. Протоколы, описанные в этой рукописи, при соблюдении, дадут зрелые адипоциты, которые могут быть использованы для нескольких функциональных тестов in vitro для оценки метаболической функции ADSC, включая, но не ограничиваясь, анализами, измеряющими поглощение глюкозы, липолиз, липогенез и секрецию. Макаки-резусы (Macaca mulatta) физиологически, анатомически и эволюционно похожи на людей, и поэтому их ткани и клетки широко используются в биомедицинских исследованиях и для разработки методов лечения. Здесь мы описываем выделение ADSC с использованием свежей подкожной и жировой клетчатки сальника, полученной от 4-9-летних макак-резусов. Образцы жировой ткани ферментативно перевариваются в коллагеназе с последующей фильтрацией и центрифугированием для выделения ADSC из стромальной сосудистой фракции. Изолированные ADSC размножаются в стромальных средах с последующим примерно 14-21 днем дифференцировки с использованием коктейля из 0,5 мкг/мл дексаметазона, 0,5 мМ изобутилметилксантина и 50 мкМ индометацина в стромальных средах. Зрелые адипоциты наблюдаются примерно на 14 день дифференцировки. В этой рукописи мы описываем протоколы изоляции, распространения и дифференциации ADSC in vitro. Хотя мы сосредоточились на ADSC из жировой ткани макаки-резуса, эти протоколы могут быть использованы для жировой ткани, полученной от других животных с минимальными корректировками.
Introduction
Жировая ткань состоит из гетерогенной смеси клеток, преимущественно зрелых адипоцитов и стромальной сосудистой фракции, включая фибробласты, иммунные клетки и стволовые клетки жирового происхождения (ADSCs)1,2,3. Первичные ADSC могут быть выделены непосредственно из белой жировой ткани и стимулированы к дифференцировке в адипоциты, хрящевые или костные клетки4. ADSC демонстрируют классические характеристики стволовых клеток, такие как поддержание мультипотентности in vitro и самообновление; и придерживаются пластики в культуре 5,6. ADSC представляют важный интерес для использования в регенеративной медицине из-за их мультипотентности и способности легко собираться в больших количествах с использованием неинвазивных методов7. Адипогенная дифференцировка ADSC продуцирует клетки, которые функционально имитируют зрелые адипоциты, включая накопление липидов, инсулин-стимулируемое поглощение глюкозы, липолиз и секрецию адипокина8. Их сходство со зрелыми адипоцитами привело к широкому использованию ADSC для физиологического исследования клеточных характеристик и метаболической функции адипоцитов. Появляется все больше доказательств, подтверждающих идею о том, что развитие метаболической дисфункции и нарушений происходит на клеточном или тканевом уровне 9,10,11,12. Оптимальная дифференцировка ADSC необходима для достаточного расширения жировой ткани, правильной функции адипоцитов и эффективной метаболическойрегуляции 13.
Протоколы, описанные в этой рукописи, представляют собой простые методы с использованием стандартного лабораторного оборудования и основных реагентов. В рукописи сначала описывается протокол выделения первичных АЦДК из свежей жировой ткани с использованием механического и ферментативного сбраживания. Далее описывается протокол распространения и прохождения АЦП в стромальной среде. Наконец, описан протокол адипогенной дифференциации АЦП. После дифференцировки эти клетки могут быть использованы для исследований, чтобы лучше понять метаболизм адипоцитов и механизмы дисфункции. Также описаны протоколы подтверждения адипогенной дифференцировки и обнаружения липидных капель с использованием окрашивания Oil Red O и бора-анпирромэтена (BODIPY). Детали этих протоколов были сосредоточены на первичных ADSC, выделенных из свежей жировой ткани сальника макак-резусов. Мы и другие использовали этот протокол для успешного выделения ADSC из депо подкожной и жировойклетчатки макак-резусов 14,15. Для того же количества используемой ткани мы заметили, что подкожная жировая ткань более плотная, жесткая и дает меньше клеток от пищеварения по сравнению с жировой тканью сальника. Этот протокол также использовался для изоляции ADSC из образцов жировой массы человека16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все полученные ткани и процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Центре медицинских наук Университета штата Луизиана и были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (публикация NIH No 85-12, пересмотренная в 1996 году).
1. Подготовка буферов и растворов
- Готовят стерильный 5-фосфатно-буферный солевой промывочный раствор (5-PBS), добавляя 5% пенициллин/стрептомицин (ручка/стрептококк) и 0,25 мкг/мл грибкового ингибитора к 1x PBS. Приготовьте стерильный 2-PBS промывочный буферный раствор (2-PBS), добавив 2% ручку/стрептококк и 0,25 мкг/мл грибкового ингибитора в 1x PBS. Моющие буферы могут храниться при 4 °C для будущего использования и должны использоваться в течение 4 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер 5-PBS используется для сбора жировой ткани и первоначальной промывки для минимизации возможного загрязнения, поскольку образцы тканей, полученные при некропсии, собираются в нестерильной среде. - Приготовьте стерильный коллагеназный буфер (CB), комбинируя 0,075% коллагеназы типа I (активность 125 единиц / мг), 2% ручки / стрептококка и 0,25 мкг / мл грибкового ингибитора в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с 1% бычьим сывороточным альбумином. CB необходимо использовать в течение 1 ч.
- Подготовьте стерильную питательную среду ADSC, используя буфер α-MEM. Объедините 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл 200 мМ раствора L-глутамина, 500 мкл 0,25 мкг/мл грибкового ингибитора и 10 мл раствора ручки/стрептококка в 394 мл буфера α-MEM. Питательная среда ADSC может храниться при 4 °C и должна использоваться в течение 4 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инактивация тепла FBS не требуется. - Готовят стерильную дифференцировочную среду ADSC путем комбинирования питательной среды ADSC, приготовленной выше, и индукционных агентов для достижения конечной концентрации 0,5 мкг/мл дексаметазона, 0,5 мМ изобутилметилксантина и 50 мкМ индометацина.
2. Изоляция ADSC
- Подготовка и переваривание тканей
- Пипетка ~10 мл буфера 5-PBS в четыре чашки для клеточных культур по 100 мм.
- Переложите ~50 г жирового образца на одну из 100 мм тарелок, содержащих 5-PBS. Вымойте собранный образец жировой ткани четыре раза, последовательно перемещая его по четырем блюдам культуры, содержащим 5-PBS.
- Переложите образец жира в чистую 100-миллиметровую культуральную посуду и тщательно измельчите жировую ткань ножницами или двумя стерильными скальпелями. Измельчение позволяет увеличить площадь поверхности для эффективного и полного ферментативного пищеварения.
- Переложить измельченную жировую ткань в 50 мл пластиковой конической трубки, содержащей 13 мл CB (участок ткани 1–3 см на 15 мл CB).
- Смойте чашку для культивирования 2 мл CB и перенесите среду в пластиковую коническую трубку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе должно быть в общей сложности 15 мл CB с тканью в пластиковой конической трубке объемом 50 мл. - Пипетка вверх и вниз несколько раз с использованием серологической пипетки 25 мл для облегчения механического переваривания тканей.
- Инкубируют пластиковую коническую трубку объемом 50 мл, содержащую ткань в CB, на коромысле со средней скоростью при 37 °C в течение 30–60 мин.
- Покрытие ADSC для культуры
- Добавьте 10 мл питательной среды ADSC в пробирку объемом 50 мл, содержащую ткань, чтобы нейтрализовать активность ферментов. Пипетка вверх и вниз несколько раз с использованием серологической пипетки 25 мл для разделения любых агрегатов жировой ткани.
- Переложите жидкую часть в новую стерильную коническую трубку объемом 50 мл, оставив твердые вещества позади. Промыть оригинальную трубку объемом 50 мл 3 раза с помощью ~7 мл буфера 2-PBS и перенести жидкую часть в трубку объемом 50 мл.
- Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин для получения ячейки гранулы. Осторожно удалите как можно больше супернатанта с помощью серологической пипетки, не нарушая клеточную гранулу. Не декантировать.
- Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл 1x буфера лизиса эритроцитов (эритроцитов) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавьте 5 мл питательной среды ADSC в пробирку и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин, затем осторожно удалите и выбросьте супернатант.
- Добавить 5 мл питательной среды ADSC и центрифугу по 500 х г в течение 5 мин для промывки ячейки гранулы. Выбросьте супернатант.
- Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл питательной среды ADSC и фильтруйте через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую стерильную пластиковую коническую трубку объемом 50 мл.
- Промыть клеточный ситечко дополнительными 2 мл питательной среды ADSC. Переложить 4 мл суспензии, содержащей АЦСК, из конической трубки объемом 50 мл в стерильную 100 мм культуральную чашку.
- Вымойте коническую трубку объемом 50 мл 2 раза с 3 мл питательной среды ADSC и переложите жидкость в 100 мм культуральную чашку, содержащую ADSC, в общей сложности 10 мл среды в чашке для культивирования.
- Просмотрите ячейки под инвертированным микроскопом с 10-кратным увеличением, чтобы проверить наличие плавающих клеток в среде, как показано на рисунке 1A. Клетки должны поддерживаться в инкубаторе CO2 при 37 °C при 5% CO2 и 100% относительной влажности.
- Через 24 часа просмотрите клетки под перевернутым микроскопом, чтобы проверить сцепление клеток. Аспирировать питательную среду ADSC из пластины и заменить 10 мл свежей, теплой (37 °C) средой. Удаляйте и заменяйте среду каждые 48 ч до тех пор, пока ячейки не станут сливающимися на 80–90% (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 10-20% клеток будут прилипать к 24 ч. Проверьте культуру клеток на наличие признаков загрязнения, таких как зернистость клеток, мутность среды или рост спор. Как только клетки становятся на 80% сливающимися, их можно собирать для пролиферации и криоконсервации или индуцировать к дифференцировке. ADSC могут быть расширены до 4-6 проходов, прежде чем потерять свою способность эффективно размножаться или дифференцироваться.
3. Распространение ADSC
- Отслоение клеток
- Удалите питательную среду ADSC с помощью аспиратора/пипетки. Смойте сливающиеся АЦДК 2 раза 2 мл стерильного PBS комнатной температуры.
- Аспирировать PBS и добавить 2 мл 0,25 % трипсина-ЭДТА на 100 мм культуральную пластину. Убедитесь, что вся площадь поверхности покрыта трипсином.
- Инкубировать пластину в течение ~7 мин при 37 °C в 5% CO2 до тех пор, пока ADSC не будут отсоединены. Извлеките пластину из инкубатора и механически вытесните клетки, принудительно пипетируя раствор трипсина в пластине.
- Добавьте 2 мл питательной среды ADSC к смещенным клеткам и аккуратно перемешайте. Перенесите ячейки в стерильную пластиковую коническую трубку объемом 50 мл. Чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток, промыть культуральную посуду еще 2 мл питательной среды ADSC и перенести среду в коническую трубку, содержащую отслоившиеся клетки.
- Центрифугировать коническую трубку объемом 50 мл при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для получения ячейки гранулы. Тщательно декантируйте супернатант, не нарушая ячейку гранулы.
- Повторное суспендирование клеточной гранулы в 5–6 мл питательной среды ADSC на 1 х 106 клеток.
- Количество ячеек и покрытие
- В микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл разбавляют 10 мкл клеточного раствора сверху и 10 мкл 0,04% раствора трипана синего (0,4% трипан синего разбавленного 1:10 в PBS) и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра.
- Повторное суспендирование нужного количества АЦП в питательной среде. Для 100 мм питательной чашки нанесите ~3,0 х 105 ячеек в 10 мл питательной среды ADSC, чтобы обеспечить 80% слияние через 72 ч или 100% слияние через 96 ч.
- Осмотрите тарелку под перевернутым микроскопом при 10-кратном увеличении перед инкубацией, чтобы убедиться в наличии взвешенных клеток. Поддерживайте ячейки при температуре 37 °C при 5% CO2 и 100% относительной влажности.
- Каждые 48 ч аспирировать питательную среду и заменять теплой (37 °C) средой до тех пор, пока клетки не станут сливающимися на 80-90%, как показано на рисунке 1B.
- Повторите шаги из разделов 3.1 и 3.2 для соответствующего количества проходов для получения желаемого номера ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: После проходов с 5 по 6 первичные клетки, по-видимому, подвергаются старению; поэтому стремитесь получить желаемые номера ячеек с помощью отрывка 4.
4. Адипогенная дифференциация ADSC
- Аспират ADSC питательная среда из прилипших ADSC, которые достигли слияния от 80% до 90%.
- Быстро промойте слой клеток ADSC стерильным PBS комнатной температуры.
- Добавьте среду дифференциации ADSC. На 100 мм культуральную посуду добавить 10 мл дифференциационной среды ADSC.
- Заменяйте среду каждые 3 дня в течение примерно 14–21 дня. Зрелые адипоциты обычно наблюдаются после 14 дней дифференцировки.
- Исследуйте клетки под инвертированным световым микроскопом при 40-кратном увеличении, чтобы подтвердить наличие липидной капли, как показано на рисунке 2А.
5. Обнаружение адипоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе будут описаны протоколы окрашивания, используемые для обнаружения липидных капель в дифференцированных адипоцитах, однако иммунофлуоресцентное окрашивание для CD105, маркера мезенхимальных стволовых клеток, также может быть использовано для подтверждения ADSC.
- Окрашивание маслом Red O
- Приготовьте 0,5% раствор Oil Red O в изопропаноле. Для 20 мл раствора Oil Red O растворите 100 мг Oil Red O в 20 мл изопропанола. Отфильтруйте раствор через стерильный шприцевой фильтр с мембраной 0,2 мкм.
- Осторожно аспирируйте дифференцирующую среду и промывайте клетки 2 раза, добавляя PBS по бокам лунки, чтобы не нарушить клеточный монослой.
- Осторожно аспирируйте PBS из клеток и добавьте достаточно нейтрального буферизованного формалина (NBF, 10%), чтобы покрыть клеточный слой. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30–60 мин.
- На этапе фиксации формалина приготовьте рабочий раствор Oil Red O, разбавив 3 части раствора Oil Red O 2 частями дистиллированной воды. Перемешайте раствор и процедите через стерильный шприцевой фильтр с мембраной 0,2 мкм. Рабочий раствор стабилен до 2 ч.
- Тщательно аспирировать NBF и быстро промыть (~ 15 с) слой клеток дистиллированной водой. Добавьте достаточное количество 60% изопропанола для покрытия клеточного слоя после аспирации воды и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Осторожно аспирировать изопропанол после 5 мин инкубации и добавить достаточное количество рабочего раствора Oil Red O для покрытия клеточного слоя и инкубации при комнатной температуре в течение 10–15 мин.
- Осторожно аспирируйте рабочий раствор Oil Red O и несколько раз промойте слой клеток дистиллированной водой, пока вода не станет прозрачной.
- Добавьте PBS в чашку для клеточной культуры и исследуйте клетки под инвертированным микроскопом для индикации дифференцировки и присутствия липидных капель (рисунок 2B).
- Окрашивание БОДИПИ
- Готовят 5 мМ раствора БОДИПИ, растворяя 1,3 г БОДИПИ в 1 мл ДМСО. Приготовьте 2 мкг/мл рабочего раствора BODIPY, разбавляя стандартный раствор 1:25 000 раз в PBS.
- Осторожно аспирируйте дифференцирующую среду и промывайте клетки 2 раза, добавляя PBS по бокам лунки, чтобы не нарушить клеточный монослой.
- Осторожно аспирируйте PBS и добавьте достаточное количество рабочего раствора BODIPY, чтобы покрыть клеточный слой и инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента защитите клетки от света, покрыв пластину фольгой. - Тщательно аспирируйте рабочий раствор BODIPY и промойте слой клеток 3 раза PBS.
- Зафиксируйте клетки, добавив 4% параформальдегида и инкубируя при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Осторожно аспирируйте буфер фиксации и промывайте ячейки 2 раза, добавляя PBS по бокам лунки, чтобы не нарушить монослой клеток.
- Добавьте PBS в чашку для культивирования клеток и исследуйте клетки под перевернутым флуоресцентным микроскопом на предмет признаков дифференцировки и присутствия липидной капельки (рисунок 2C). Ячейки изображения с использованием набора фильтров FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. Длина волны возбуждения составляет 480 нм при ширине полосы 40 нм, а длина волны излучения составляет 535 нм при полосе пропускания 50 нм. Можно использовать аналогичный или соответствующий набор фильтров и микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образцы жировой ткани резус-макак были посеяны на культуральных пластинах и показаны на рисунке 1. В день нанесения покрытия клетки не адгезивны и плавают в чашке для культивирования, как показано на рисунке 1А. В течение 72 ч АЦДК станут на 80% сливающимися и готовы к дифференцировке адипоцитов (рисунок 1В). ADSC проявляют сильные адипогенные характеристики после химической индукции. После 14 дней дифференцировки зрелые адипоциты можно наблюдать с помощью световой микроскопии (рисунок 2А). Для подтверждения адипогенной дифференцировки ADSC различные пятна могут быть использованы для визуализации липидных капель дифференцированных зрелых адипоцитов. На 14-й день дифференцировки клетки окрашивали и фиксировали маслом Red O (рисунок 2B) и BODIPY (рисунок 2C) для визуализации липидных капель. Черная стрелка представляет собой дифференцированный адипоцит (рисунок 2B). Эти данные указывают на то, что следуя этому протоколу, ADSC были получены из жировой ткани макак-резусов и дифференцированы в зрелые адипоциты.
Рисунок 1: Световые микроснимки ADSC в день покрытия и при 80% стечении клеток. (A) Репрезентативная световая микрофотография стромальных сосудистых клеток в день покрытия после выделения ADSC из свежей жировой ткани макаки-резуса (10-кратное увеличение). (B) Репрезентативная световая микрофотография ADSC при 80% слиянии (20-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микрофотографии ADSC на 14 день дифференциации. (A) Репрезентативная световая микрофотография, полученная на 14-й день дифференциации ADSC (40-кратное увеличение). (B) Репрезентативная микрофотография окрашивания Oil Red O на 14-й день дифференциации ADSC (20-кратное увеличение). (C) Репрезентативная микрофотография окрашивания бором-дипирромэтелом (BODIPY) на 14-й день дифференциации ADSC (20-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы изоляции, распространения и дифференциации ADSC являются простыми и воспроизводимыми, но они требуют тщательной техники для обеспечения адекватной изоляции, здорового расширения и эффективной дифференциации. Стерильная рабочая среда имеет решающее значение для всех экспериментов с клеточными культурами. Бактерии или грибы могут быть введены в клеточные культуры через загрязненные инструменты, среды или рабочую среду. Грибковое загрязнение указывает на рост спор в культуре, в то время как бактериальное загрязнение указывает на наличие мутности среды. Мы предлагаем дезинфицировать шкаф биобезопасности и все пипетки, бутылки и инструменты перед использованием, включить ламинарный воздушный поток не менее чем за 15 минут до использования шкафа биобезопасности и продезинфицировать шкаф и все пипетки после использования, чтобы снизить риск загрязнения. Кроме того, мы предлагаем автоклавирование нефильтрующих наконечников пипеток для вакуум-аспирации и промывки аспиратора стерильной водой с последующим 70% этанолом после использования. Чашка для культивирования только со средой может быть помещена в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение нескольких дней для проверки стерильности среды. Загрязненные культуры следует отбеливать в течение 30 минут и выбрасывать. Инкубатор клеточной культуры также следует продезинфицировать.
Основным различием между протоколами в этой рукописи и ранее опубликованными является использование BSA в нашем буфере переваривания коллагеназы ADSC, который позволяет выделять зрелые адипоциты и ADSC. Кроме того, наш протокол использует среду роста ADSC, дополненную 20% FBS по сравнению с 10% FBS, как предлагается большинством протоколов. Мы заметили, что первичные ADSC макак-резусов размножаются и лучше дифференцируются с 20% FBS. Дифференциация ADSC in vitro индуцируется специфическими для линии индукционными агентами. Индукционные агенты, используемые в этом протоколе, широко приняты для адипогенной дифференцировки АДСК in vitro. Однако, в отличие от многих ранее опубликованных протоколов, коктейль адипогенной дифференцировки не включает агонисты инсулина или PPARγ. Мы и другие использовали этот протокол для успешной дифференциации как макак-резусов, так и человеческих ADSC 14,15,16.
В этом протоколе адипогенная дифференциация ADSC подтверждается обнаружением капель липидов с использованием методов окрашивания Oil Red O и BODIPY. Хотя эти пятна хорошо известны в полевых условиях, существуют и другие методы, обычно используемые, включая проточную цитометрию для обнаружения CD105 для идентификации ADSC или маркеры эндотелиальных и иммунных клеток для установления чистоты ADSC17.
Использование ADSC является ценным инструментом для регенеративной медицины и метаболических исследований. Изоляция и пролиферация ADSC производит большое количество стволовых клеток, которые могут быть использованы для нескольких последующих применений и экспериментальных методов, включая, но не ограничиваясь, те, которые описаны в этом протоколе. Основное предполагаемое использование дифференцированных адипоцитов в этом протоколе включает использование метаболических анализов, таких как инсулин-стимулированное поглощение глюкозы, липогенез и стимулированный липолиз18. Кроме того, ADSC могут быть дифференцированы на остеогенные и хондрогенные линии и использоваться для последующего анализа, в том числе для тканевой инженерии7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Кертиса Ванде Стоуве за его техническую помощь. Исследования, лежащие в основе разработки протоколов, были поддержаны грантами Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 и 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
