Summary
I den här artikeln beskriver vi isolering av rhesus makak härledda fett-härledda stamceller (ADSC) med hjälp av ett enzymatiskt vävnadsuppslutningsprotokoll. Därefter beskriver vi ADSC-proliferation som inkluderar cellavskiljning, räkning och plätering. Slutligen beskrivs ADSC-differentiering med användning av specifika adipogena inducerande medel. Dessutom beskriver vi färgningstekniker för att bekräfta differentiering.
Abstract
Fettvävnad ger en rik och tillgänglig källa till multipotenta stamceller, som kan förnya sig själv. Dessa fett-härledda stamceller (ADSC) ger ett konsekvent ex vivo cellulärt system som är funktionellt som det för in vivo adipocyter. Användning av ADSC i biomedicinsk forskning möjliggör cellulär undersökning av fettvävnadens metaboliska reglering och funktion. ADSC-differentiering är nödvändig för adekvat adipocytutvidgning, och suboptimal differentiering är en viktig mekanism för fettdysfunktion. Att förstå förändringar i ADSC-differentiering är avgörande för att förstå utvecklingen av metabolisk dysfunktion och sjukdom. Protokollen som beskrivs i detta manuskript, när de följs, kommer att ge mogna adipocyter som kan användas för flera in vitro-funktionella tester för att bedöma ADSC-metabolisk funktion, inklusive men inte begränsat till analyser som mäter glukosupptag, lipolys, lipogenes och utsöndring. Rhesus makaker (Macaca mulatta) är fysiologiskt, anatomiskt och evolutionärt lika människor och som sådana har deras vävnader och celler använts i stor utsträckning i biomedicinsk forskning och för utveckling av behandlingar. Här beskriver vi ADSC-isolering med färsk subkutan och omental fettvävnad erhållen från 4-9-åriga rhesusmakaker. Fettvävnadsprover smälts enzymatiskt i kollagenas följt av filtrering och centrifugering för att isolera ADSC från den stromala vaskulära fraktionen. Isolerade ADSC prolifereras i stromala medier följt av cirka 14–21 dagars differentiering med användning av en cocktail av 0,5 μg / ml dexametason, 0,5 mM isobutylmetylxantin och 50 μM indometacin i stromala medier. Mogna adipocyter observeras vid ungefär 14 dagars differentiering. I detta manuskript beskriver vi protokoll för ADSC-isolering, spridning och differentiering in vitro. Även om vi har fokuserat på ADSC från rhesus makak fettvävnad, kan dessa protokoll användas för fettvävnad erhållen från andra djur med minimala justeringar.
Introduction
Fettvävnad består av en heterogen blandning av celler, övervägande mogna adipocyter och en stromal vaskulär fraktion inklusive fibroblaster, immunceller och fett-härledda stamceller (ADSC)1,2,3. Primära ADSC kan isoleras direkt från vit fettvävnad och stimuleras att differentieras till adipocyter, brosk eller benceller4. ADSC uppvisar klassiska stamcellsegenskaper såsom upprätthållande av multipotens in vitro och självförnyelse; och är vidhäftande till plast i kultur 5,6. ADSC är av viktigt intresse för användning inom regenerativ medicin på grund av deras multipotens och förmåga att enkelt skördas i stora mängder med hjälp av icke-invasiva tekniker7. Adipogen differentiering av ADSC producerar celler som funktionellt efterliknar mogna adipocyter inklusive lipidackumulering, insulinstimulerat glukosupptag, lipolys och adipokinsekretion8. Deras likhet med mogna adipocyter har lett till utbredd användning av ADSC för fysiologisk undersökning av cellulära egenskaper och metabolisk funktion av adipocyter. Det finns ökande bevis som stöder tanken att utvecklingen av metabolisk dysfunktion och störningar har sitt ursprung på cell- eller vävnadsnivå 9,10,11,12. Optimal ADSC-differentiering krävs för tillräcklig fettvävnadsutvidgning, korrekt adipocytfunktion och effektiv metabolisk reglering13.
Protokoll som beskrivs i detta manuskript är enkla tekniker som använder standard laboratorieutrustning och grundläggande reagenser. Manuskriptet beskriver först protokollet för isolering av primära ADSC från färsk fettvävnad med hjälp av mekanisk och enzymatisk matsmältning. Därefter beskrivs protokollet för spridning och passering av ADSC i stromalt medium. Slutligen beskrivs protokollet för adipogen differentiering av ADSC. Efter differentiering kan dessa celler användas för studier för att bättre förstå adipocytmetabolism och mekanismer för dysfunktion. Protokollen för bekräftelse av adipogen differentiering och lipiddroppdetektering med användning av Oil Red O och bor-dipyrromethene (BODIPY) färgning beskrivs också. Detaljerna i dessa protokoll fokuserade på primära ADSC isolerade från färsk omental fettvävnad av rhesus makaker. Vi och andra har använt detta protokoll för att framgångsrikt isolera ADSC från rhesus macaque subkutan och omental fettvävnad depåer14,15. För samma mängd vävnad som används har vi observerat att subkutan fettvävnad är tätare, hårdare och ger mindre celler från matsmältningen jämfört med omental fettvävnad. Detta protokoll har också använts för att isolera ADSC från humana fettprover16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla erhållna vävnader och procedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Louisiana State University Health Sciences Center och utfördes i enlighet med riktlinjerna från National Institute of Health (NIH-publikation nr 85-12, reviderad 1996).
1. Beredning av buffertar och lösningar
- Förbered steril 5-fosfatbuffrad saltlösningsbuffert (5-PBS) genom att tillsätta 5% penicillin / streptomycin (penna / strep) och 0,25 μg / ml svamphämmare till 1x PBS. Förbered steril 2-PBS tvättbuffertlösning (2-PBS) genom att tillsätta 2% penna / strep och 0,25 μg / ml svamphämmare i 1x PBS. Tvättbuffertar kan förvaras vid 4 °C för framtida bruk och måste användas inom 4 veckor.
OBS: 5-PBS-buffert används för uppsamling av fettvävnad och initial tvättning för att minimera eventuell kontaminering eftersom vävnadsprover som erhållits vid obduktion samlas in i en icke-steril miljö. - Förbered steril kollagenasbuffert (CB) genom att kombinera 0,075% kollagenas typ I (125 enheter/mg aktivitet), 2% penna/strep och 0,25 μg/ml svamphämmare i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med 1% bovint serumalbumin. CB måste användas inom 1 timme.
- Förbered sterilt ADSC-tillväxtmedium med α-MEM-buffert. Kombinera 100 ml fetalt bovint serum (FBS), 5 ml 200 mM L-glutaminlösning, 500 μl 0,25 μg/ml svamphämmare och 10 ml penna/strep-lösning i 394 ml α-MEM-buffert. ADSC-tillväxtmedium kan förvaras vid 4 °C och måste användas inom 4 veckor.
OBS: Värmeinaktivering av FBS är inte nödvändig. - Förbered sterilt ADSC-differentieringsmedium genom att kombinera ADSC-tillväxtmedium enligt ovan och induktionsmedel för att uppnå en slutlig koncentration av 0,5 μg/ml dexametason, 0,5 mM isobutylmetylxantin och 50 μM indometacin.
2. ADSC-isolering
- Vävnadsberedning och matsmältning
- Pipettera ~ 10 ml 5-PBS-buffert i fyra 100 mm cellodlingsskålar.
- Överför ~ 50 g fettprov till en av 100 mm skålarna som innehåller 5-PBS. Tvätta det uppsamlade fettvävnadsprovet fyra gånger genom att överföra det sekventiellt över de fyra odlingsskålarna som innehåller 5-PBS.
- Överför fettprovet till en ren 100 mm odlingsskål och hacka fettvävnaden noggrant med sax eller två sterila skalpeller. Mincing möjliggör ökning av ytan för effektiv och fullständig enzymatisk matsmältning.
- Överför den malet fettvävnaden till 50 ml koniskt plaströr innehållande 13 ml CB (1–3 cm vävnadssektion per 15 ml CB).
- Skölj odlingsskålen med 2 ml CB och överför mediet till 50 ml plastkoniskt rör.
OBS: Vid denna tidpunkt bör det finnas totalt 15 ml CB med vävnad i ett 50 ml plastkoniskt rör. - Pipettera upp och ner flera gånger med 25 ml serologisk pipett för att underlätta mekanisk vävnadssmältning.
- Inkubera det koniska plaströret på 50 ml som innehåller vävnad i CB på en vippa med medelhastighet vid 37 °C i 30–60 minuter.
- ADSC-plätering för kultur
- Tillsätt 10 ml ADSC-tillväxtmedium till 50 ml röret som innehåller vävnad för att neutralisera enzymaktiviteten. Pipettera upp och ner flera gånger med 25 ml serologisk pipett för att separera eventuella fettvävnadsaggregat.
- Överför den flytande delen till ett nytt sterilt 50 ml koniskt rör som lämnar de fasta ämnena kvar. Tvätta det ursprungliga 50 ml röret 3 gånger med ~ 7 ml 2-PBS-buffert och överför vätskedelen till 50 ml röret.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter för att erhålla en cellpellet. Ta försiktigt bort så mycket supernatant som möjligt med en serologisk pipett utan att störa cellpelleten. Dekantera inte.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml 1x röda blodkroppar (RBC) lysbuffert och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Tillsätt 5 ml ADSC-tillväxtmedium till röret och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter, ta sedan försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Tillsätt 5 ml ADSC-tillväxtmedium och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter för att tvätta cellpelleten. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 2 ml ADSC-tillväxtmedium och filtrera genom en 70 μm cellsil till ett nytt sterilt 50 ml plastkoniskt rör.
- Skölj cellsilen med ytterligare 2 ml ADSC-tillväxtmedium. Överför 4 ml av suspensionen innehållande ADSC från 50 ml koniskt rör till en steril 100 mm odlingsskål.
- Tvätta det 50 ml koniska röret 2 gånger med 3 ml ADSC-tillväxtmedium och överför vätskan till 100 mm odlingsskålen som innehåller ADSC för totalt 10 ml medium i odlingsskålen.
- Visa celler under ett inverterat mikroskop med 10x förstoring för att söka efter flytande celler i mediet som visas i figur 1A. Cellerna bör hållas i en CO 2-inkubator vid 37 °C vid 5 %CO2 och 100 % relativ fuktighet.
- Efter 24 timmar, visa celler under ett inverterat mikroskop för att kontrollera cellföljsamhet. Aspirera ADSC-tillväxtmedium från plattan och ersätt med 10 ml färskt, varmt (37 °C) medium. Ta bort och byt ut media var 48: e timme tills cellerna är 80%–90% sammanflytande (figur 1B).
OBS: Minst 10–20 % av cellerna kommer att vara vidhäftande med 24 timmar. Kontrollera cellkulturen för tecken på kontaminering såsom cellgranularitet, grumlighet i mediet eller tillväxt av sporer. När cellerna är 80% sammanflytande kan de skördas för spridning och kryokonservering eller induceras att differentiera. ADSC kan utökas till 4–6 passager innan de förlorar sin förmåga att effektivt sprida sig eller differentiera.
3. ADSC-spridning
- Cellavskiljning
- Ta bort ADSC-tillväxtmedium med en aspirator / pipett. Skölj sammanflytande ADSC 2 gånger med 2 ml steril PBS i rumstemperatur.
- Aspirera PBS och tillsätt 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA per 100 mm odlingsplatta. Se till att hela ytan är täckt med trypsin.
- Inkubera plattan i ~ 7 minuter vid 37 ° C i 5% CO2 tills ADSC lossnar. Ta bort plattan från inkubatorn och lossa cellerna mekaniskt genom att kraftigt pipettera trypsinlösningen i plattan.
- Tillsätt 2 ml ADSC-tillväxtmedium till de lossnade cellerna och pipettera försiktigt för att blanda. Överför celler till sterilt 50 ml plastkoniskt rör. För att säkerställa maximal cellåtervinning, skölj odlingsskålen med ytterligare 2 ml ADSC-tillväxtmedium och överför mediet till det koniska röret som innehåller fristående celler.
- Centrifugera det koniska 50 ml det koniska röret vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att erhålla en cellpellet. Dekantera försiktigt supernatant utan att störa cellpelleten.
- Återsuspendera cellpellet i 5–6 ml ADSC-tillväxtmedium per 1 x 106 celler.
- Cellantal och plätering
- I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, späd 10 μL celllösning ovanifrån och 10 μL 0,04% trypanblå lösning (0,4% trypanblå utspädd 1:10 i PBS) och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Återsuspendera önskat antal ADSC:er i tillväxtmediet. För 100 mm odlingsskål, platta ~ 3,0 x 105 celler i 10 ml ADSC-tillväxtmedium för att möjliggöra 80% sammanflöde i 72 h eller 100% sammanflöde i 96 h.
- Visa skålen under ett inverterat mikroskop med 10x förstoring före inkubation för att säkerställa närvaro av suspenderade celler. Håll cellerna vid 37 °C vid 5 % CO2och 100 % relativ luftfuktighet.
- Var 48:e timme aspireras tillväxtmediet och ersätt med varmt (37 °C) medium tills cellerna är 80 % till 90 % sammanflytande enligt figur 1B.
- Upprepa stegen från avsnitt 3.1 och 3.2 för lämpligt antal passager för att erhålla önskat cellnummer.
OBS: Efter passagerna 5 till 6 verkar primära celler genomgå åldrande; Sträva därför efter att erhålla önskade cellnummer genom passage 4.
4. ADSC adipogen differentiering
- Aspirera ADSC-tillväxtmedium från vidhäftade ADSC: er som har nått 80% till 90% sammanflöde.
- Skölj snabbt ADSC-cellskiktet med sterilt PBS i rumstemperatur.
- Lägg till ADSC-differentieringsmedium. För 100 mm odlingsskål, tillsätt 10 ml ADSC-differentieringsmedium.
- Byt ut medium var 3: e dag i cirka 14-21 dagar. Mogna adipocyter observeras vanligtvis efter 14 dagars differentiering.
- Undersök celler under ett inverterat ljusmikroskop med 40x förstoring för att bekräfta närvaron av lipiddropp som visas i figur 2A.
5. Adipocytdetektering
OBS: Detta avsnitt kommer att beskriva färgningsprotokoll som används för lipiddroppdetektering i differentierade adipocyter, men immunofluorescerande färgning för CD105, en mesenkymal stamcellsmarkör, kan också användas för ADSC-bekräftelse.
- Olja Röd O färgning
- Bered 0,5% Oil Red O stamlösning i isopropanol. För 20 ml Oil Red O stamlösning, lös 100 mg Oil Red O i 20 ml isopropanol. Filtrera lösningen genom ett sterilt sprutfilter med 0,2 μm membran.
- Aspirera försiktigt differentieringsmediet och tvätta cellerna 2 gånger genom att tillsätta PBS längs brunnens sidor för att inte störa cellmonoskiktet.
- Aspirera försiktigt PBS från celler och tillsätt tillräckligt med neutralt buffrat formalin (NBF, 10%) för att täcka cellskiktet. Inkubera vid rumstemperatur i 30–60 min.
- Under formalinfixeringssteget, förbered Oil Red O arbetslösning genom att späda 3 delar Oil Red O stamlösning med 2 delar destillerat vatten. Blanda lösningen och filtrera genom ett sterilt sprutfilter med 0,2 μm membran. Arbetslösningen är stabil i upp till 2 timmar.
- Aspirera försiktigt NBF och tvätta snabbt (~ 15 s) cellskiktet med destillerat vatten. Tillsätt tillräckligt med 60% isopropanol för att täcka cellskiktet efter aspirerande vatten och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Aspirera försiktigt isopropanol efter 5 minuters inkubation och tillsätt tillräckligt med Oil Red O-arbetslösning för att täcka cellskiktet och inkubera vid rumstemperatur i 10–15 minuter.
- Aspirera försiktigt bort Oil Red O-arbetslösningen och tvätta cellskiktet flera gånger med destillerat vatten tills vattnet blir klart.
- Lägg till PBS i cellodlingsskålen och undersök celler under ett inverterat mikroskop för indikation på differentiering och närvaro av lipiddroppar (figur 2B).
- BODIPY färgning
- Bered 5 mM BODIPY stamlösning genom att lösa 1,3 g BODIPY i 1 ml DMSO. Bered 2 μg/ml BODIPY-arbetslösning genom att späda stamlösningen 1:25 000 gånger i PBS.
- Aspirera försiktigt differentieringsmediet och tvätta cellerna 2 gånger genom att tillsätta PBS längs brunnens sidor för att inte störa cellmonoskiktet.
- Aspirera försiktigt PBS och tillsätt tillräckligt med BODIPY-arbetslösning för att täcka cellskiktet och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
OBS: Från denna punkt, skydda celler från ljus genom att täcka plattan med folie. - Aspirera försiktigt BODIPY-arbetslösningen och tvätta cellskiktet 3 gånger med PBS.
- Fixera celler genom att tillsätta 4% paraformaldehyd och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
- Aspirera försiktigt fixeringsbufferten och tvätta cellerna 2 gånger genom att tillsätta PBS längs brunnens sidor för att inte störa cellmonoskiktet.
- Lägg till PBS i cellodlingsskålen och undersök celler under ett inverterat fluorescerande mikroskop för bevis på differentiering och närvaro av lipiddroppe (figur 2C). Bildceller med en FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma-filteruppsättning. Excitationsvåglängden är vid 480 nm med en bandbredd på 40 nm och emissionsvåglängden är vid 535 nm med en bandbredd på 50 nm. En liknande eller lämplig filteruppsättning och mikroskop kan användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADSC: erna isolerade från rhesus makak fettvävnadsprover såddes på odlingsplattor och visas i figur 1. På pläteringsdagen är cellerna icke-vidhäftande och flyter i odlingsskålen som visas i figur 1A. Inom 72 timmar blir ADSC 80% sammanflytande och är redo för adipocytdifferentiering (figur 1B). ADSC uppvisar starka adipogena egenskaper efter kemisk induktion. Efter 14 dagars differentiering kan mogna adipocyter observeras via ljusmikroskopi (figur 2A). För att bekräfta ADSC adipogen differentiering kan olika fläckar användas för att visualisera lipiddroppar av de differentierade mogna adipocyterna. På dag 14 av differentieringen färgades cellerna och fixerades med Oil Red O (Figur 2B) och BODIPY (Figur 2C) för visualisering av lipiddroppar. Den svarta pilen representerar en differentierad adipocyt (figur 2B). Dessa data indikerar att efter detta protokoll genererades ADSC från rhesus makak fettvävnad och differentierades till mogna adipocyter.
Figur 1: Lätta mikrografer av ADSC på pläteringsdagen och vid 80% cellsammanflöde. (A) Representativ ljusmikrograf av stromala kärlceller på pläteringsdagen efter ADSC-isolering från färsk rhesus makak fettvävnad (10x förstoring). (B) Representativ ljusmikrograf för ADSC vid 80% sammanflöde (20x förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikrografer av ADSC vid dag 14 av differentiering. (A) Representativ ljusmikrograf erhållen dag 14 av ADSC-differentiering (40x förstoring). (B) Representativ mikrograf av oljeröd O-färgning vid dag 14 av ADSC-differentiering (20x förstoring). (C) Representativ mikrograf av bor-dipyrrometen (BODIPY) färgning vid dag 14 av ADSC-differentiering (20x förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC-isolerings-, spridnings- och differentieringsprotokoll är enkla och reproducerbara, men de kräver noggrann teknik för att säkerställa adekvat isolering, hälsosam expansion och effektiv differentiering. En steril arbetsmiljö är avgörande för alla cellodlingsexperiment. Bakterier eller svampar kan föras in i cellkulturer genom förorenade verktyg, medier eller arbetsmiljö. Svampförorening indikeras av sportillväxt i kulturen, medan bakteriell förorening indikeras av närvaron av grumlighet hos mediet. Vi föreslår att du desinficerar biosäkerhetsskåpet och alla pipetter, flaskor och verktyg före användning, slår på det laminära luftflödet minst 15 minuter innan du använder biosäkerhetsskåpet och desinficerar skåpet och alla pipetter efter användning för att minska risken för kontaminering. Vi föreslår också autoklavering av icke-filterpipettspetsar för vakuumaspiration och spolning av aspiratorn med sterilt vatten följt av 70% etanol efter användning. En odlingsskål med endast media kan placeras i den fuktade inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 under några dagar för att kontrollera mediernas sterilitet. Förorenade kulturer ska blekas i 30 minuter och kasseras. Cellodlingsinkubatorn bör också desinficeras.
En stor skillnad mellan protokollen i detta manuskript och de som tidigare publicerats är användningen av BSA i vår ADSC-kollagenasförtunningsbuffert som möjliggör isolering av mogna adipocyter och ADSC. Dessutom använder vårt protokoll ADSC-tillväxtmedium kompletterat med 20% FBS jämfört med 10% FBS som föreslås av de flesta protokoll. Vi har märkt att rhesus macaque primära ADSC: er sprider sig och differentierar bättre med 20% FBS. ADSC-differentiering in vitro induceras av härstamningsspecifika induktionsmedel. Induktionsmedlen som används i detta protokoll är allmänt accepterade för in vitro adipogen differentiering av ADSC. Men till skillnad från många tidigare publicerade protokoll inkluderar den adipogena differentieringscocktailen inte insulin eller PPARγ-agonister. Vi och andra har använt detta protokoll för att framgångsrikt skilja både rhesus makak och mänskliga ADSCs14,15,16.
I detta protokoll bekräftas ADSC-adipogen differentiering genom lipiddroppdetektering med användning av Oil Red O och BODIPY-färgningstekniker. Även om dessa fläckar är välkända inom området, finns det andra metoder som vanligtvis används, inklusive flödescytometri för detektion av CD105 för att identifiera ADSC, eller markörer för endotel- och immunceller för att fastställa renheten hos ADSC17.
Användning av ADSC ger ett värdefullt verktyg för regenerativ medicin och metabolisk forskning. ADSC-isolering och -spridning producerar ett stort antal stamceller som kan användas för flera nedströmstillämpningar och experimentella tekniker, inklusive men inte begränsat till de som beskrivs i detta protokoll. En viktig avsedd användning för differentierade adipocyter i detta protokoll inkluderar användning av metaboliska analyser såsom insulinstimulerat glukosupptag, lipogenes och stimulerad lipolys18. Dessutom kan ADSC differentieras till osteogen och kondrogen härstamning och användas för nedströmsanalys inklusive för vävnadsteknik7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Curtis Vande Stouwe för hans tekniska hjälp. Den forskning som ligger till grund för utvecklingen av protokollen stöddes av bidrag från National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 och 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
