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Immunology and Infection

सीटू संकरण में इम्यूनो आरएनए-फ्लोरेसेंस का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का दृश्य

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/62067
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 1
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

Summary

यहां, हम एक सरल विधि का वर्णन करते हैं जो गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) आरएनए की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ सीटू संकरण (आरएनए-फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस को जोड़ती है। यह प्रोटोकॉल एक एकल-सेल स्तर पर सार्स-सीओवी-2 आरएनए-होस्ट इंटरैक्शन की आणविक विशेषताओं की समझ बढ़ा सकता है।

Abstract

यह पांडुलिपि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) सेल लाइन में आरएनए और मानव वायुमार्ग एपिथेलियम की त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृतियों की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ मिलकर एक प्रोटोकॉल प्रदान करती है। विधि जांच स्थानीयकरण द्वारा शुरू किए गए एचसीआर पर भरोसा करके वायरल आरएनए के अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील दृश्य की अनुमति देती है। स्प्लिट-सर्जक जांच फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एम्पलीफायरों द्वारा सिग्नल को बढ़ाने में मदद करती है, जिसके परिणामस्वरूप कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में नगण्य पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस होता है। विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग एम्पलीफायर विभिन्न लक्ष्यों की एक साथ मान्यता की सुविधा प्रदान करता है। यह, बदले में, ऊतकों में संक्रमण के मानचित्रण को एकल कोशिका स्तर पर वायरल रोगजनन और प्रतिकृति को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ इस विधि को युग्मन करने से मेजबान-वायरस इंटरैक्शन की बेहतर समझ की सुविधा हो सकती है, जिसमें मेजबान एपिजेनोम और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्गों का परिवर्तन शामिल है। संवेदनशील और विशिष्ट एचसीआर तकनीक के कारण, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नैदानिक उपकरण के रूप में भी किया जा सकता है। यह भी याद रखना महत्वपूर्ण है कि तकनीक को आसानी से संशोधित किया जा सकता है ताकि भविष्य में उभरने वाले गैर-कोडिंग आरएनए और आरएनए वायरस सहित किसी भी आरएनए का पता लगाया जा सके ।

Introduction

सार्स-सीओवी-2 एक उपन्यास मानव बीटाकोरोनेवस है जो 2019 के अंत में उभरा, जिससे कुछ महीनों बाद अभूतपूर्व महामारी पैदा हुई। क्योंकि वायरस विज्ञान के लिए नया है, अपने जीव विज्ञान के बहुत और मेजबान कोशिकाओं पर इसके प्रभाव अज्ञात रहते हैं । इसलिए, संक्रमण के दौरान वायरस-सेल और -ऊतक ट्रॉपिज्म का मानचित्रण महत्वपूर्ण है यदि इसकी बुनियादी जैविक विशेषताओं और मेजबान पर इसके प्रभाव को समझना होगा। जैव रासायनिक, जैविक और शारीरिक परख सहित वायरस-होस्ट परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। सीटू संकरण में एक आम तरीका है जो पूरक डीएनए, आरएनए, या संशोधित न्यूक्लिक एसिड जांच को नियोजित करता है, जो कोशिका या ऊतक में विशिष्ट डीएनए या आरएनए दृश्यों के लिए स्थानीयकरण करता है।

सीटू संकरण (आरएनए-फिश) विधि में एक नया आरएनए फ्लोरोसेंट विकसित किया गया है जिसमें एचसीआर1के माध्यम से सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाकर संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए संशोधनों को शामिल किया गया है। एचसीआर एकल-कोशिका स्तर पर आरएनए स्थानीयकरण के अध्ययन की अनुमति देता है। इसकी उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और संकल्प के कारण, यह विधि न केवल बुनियादी विज्ञान अध्ययनों के लिए, बल्कि लागू परियोजनाओं, जैसे निदान के लिए भी उपयोगी है। हाल ही में, इस विधि की व्यवहार्यता को पूरी तरह से विभेदित 3 डी मानव वायुमार्ग एपिथेलियम (एचएई) संस्कृतियों2 के भीतर सिलिएटेड कोशिकाओं के लिए स्थानीय सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए प्रदर्शित किया गया था। एचएई संस्कृतियां "प्राकृतिक संक्रमण" माइक्रोएनवायरमेंट3,4के संदर्भ में वायरल संक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे उन्नत उपकरणों में से एक है।

सार्स-सीओवी-2 सहित मानव कोरोनावायरस (एचकोवी) पर कई रिपोर्टें, एचकोवी संक्रमण और रोगविज्ञान के संबंध में एपिजेनेटिक संशोधनों के महत्व को उजागर करती हैं [5में समीक्षा की गई], उदाहरण के लिए, जीन का मिथाइलेशन पैटर्न एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एसीई-2) रिसेप्टर6,7। दिलचस्प बात यह है कि मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक स्क्रीनिंग ने कई एपिजेनेटिक कारकों की पहचान की जो सार्स-सीओवी-2 प्रोटेम 8 के साथ बातचीतकरतेहैं । अधिक विशेष रूप से, गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 5 (एनएसपी 5) एपिजेनेटिक नियामक, हिस्टोन डीसेटाइलेज 2 से बांधता है, और उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय एनएसपी5 (C145A) tRNA मिथाइलट्रांसफरेज 1 (24) के साथ बातचीत करता है। इसके अतिरिक्त, एनएसपी16 मिथाइलट्रांसफेरेज गतिविधि को मिथाइलट्रांसफेरेज अवरोधक, सिनेफुंगिन 9 द्वारा अवरुद्ध कियाजाताहै। हालांकि, COVID-19 में इन एपीजेनेटिक कारकों की सही भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है । एचकोवी की प्रतिकृति संक्रमित कोशिका के साइटोप्लाज्म में होती है, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करती है जो एपिजेनेटिक संशोधनों द्वारा विनियमित होती हैं10।

उदाहरण के लिए, HCoV-229E ठीक धुनों परमाणु कारक-कापा बी संकेत और गहराई से कुछ क्षेत्रों में H3K36 और H4K5 के एसीटिलेशन में वृद्धि करके मेजबान सेलुलर क्रोमेटिन परिदृश्य reprograms11। मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम से संबंधित कोरोनावायरस संक्रमण H3K27me3 के स्तर को बढ़ाता है और विशिष्ट इंटरफेरॉन-संवेदनशील जीन12के सबसेट के प्रमोटर क्षेत्रों में H3K4me3 को कम करता है । इसके अतिरिक्त, वायरल आरएनए सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है, जैसा कि फ्लेविवायरस13,रेट्रोवायरस14, 15और कोरोनावायरस16के लिए प्रदर्शित किया गया है। वायरल आरएनए पर एपिजेनेटिक मार्कर सेलुलर सेंसर द्वारा मान्यता में भूमिका निभा सकते हैं, जैसा कि मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस-1 आरएनए17के m7A मिथाइलेशन के लिए दिखाया गया है। हालांकि, सवाल रहते हैं: प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर सार्स-CoV-2 आरएनए का क्या प्रभाव है, और एपीजेनेटिक मार्क्स शामिल हैं?

यहां, सेल लाइनों और 3 डी ऊतकों (पूरी तरह से विभेदित HAE) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के साथ मिलकर एक अनुकूलित आरएनए-मछली विधि का वर्णन किया गया है। यद्यपि मछली और इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसे साइटोलॉजिकल तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, एचसीआर पर आधारित सीटू संकरण विधि में इस नई पीढ़ी का उपयोग वायरस का पता लगाने (हाल ही में प्रकाशन को छोड़कर) 2 के लिएकभीनहीं किया गया है। सामान्य तौर पर, इम्यूनोदाता और मछली को निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता होती है: जांच या एंटीबॉडी के प्रवेश को सक्षम करने के लिए पारमेबिलाइजेशन; निर्धारण जिसमें सेलुलर सामग्री को ठीक किया जाता है और संरक्षित किया जाता है; पता लगाना जिसमें एंटीबॉडी या न्यूक्लिक एसिड जांच लागू की जाती है; और अंत में, दृश्य के लिए नमूनों की बढ़ती।

हालांकि मौजूदा प्रोटोकॉल इन सामान्य सुविधाओं को साझा करते हैं, वे शामिल मापदंडों के संबंध में स्पष्ट रूप से भिन्न होते हैं। यहां, एचएई संस्कृतियों और वेरो कोशिकाओं में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित, सरल, इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तकनीक में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं का निर्धारण; (2) डिटर्जेंट या मेथनॉल (MeOH) के साथ पारमेबिलाइजेशन; (3) MeOH समाधान (केवल HAE संस्कृतियों) की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से रिहाइड्रेशन; (4) पता लगाना; (5) सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए एचसीआर प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रवर्धन; (6) इम्यूनोदाता; और (7) एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे इमेजिंग।

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Protocol

1. बफर तैयारी

  1. 2x PHEM बफर के 500 एमएल के लिए, 18.14 ग्राम पिपराज़ीन-एन,एन'-बीआईएस(2-एथेसुल्फोनिक एसिड) (पाइप), 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) के 6.5 ग्राम- 1-पाइप का मिश्रण करेंrazine एथेल्सुल्फोनिक एसिड (HEPES), 3.8 ग्राम एथिलीन ग्लाइकोल टेट्राएस्टेटिक एसिड (ईजीटीए), और 0.99 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट (एमजीएसओ4)। आसुत पानी (डीएच2ओ) के साथ ~ 400 एमएल तक की मात्रा बनाएं, हलचल करें, और पीएच को 10 मीटर पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) या सोडियम हाइड्रोक्साइड (नाओएच) का उपयोग करके 7.0 तक समायोजित करें। अंतिम मात्रा को 500 एमएल तक बनाएं, और फिर 50 एमएल एलिकोट्स में विभाजित करें। आवश्यकता पड़ने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: जब तक पीएच 7.0 तक नहीं पहुंचता तब तक बफर स्पष्ट नहीं होगा।
  2. 37% w/v पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। 50 एमएल के लिए, एक कांच की बोतल में पीएफए के 18.5 ग्राम और डीएच2ओ के 35 एमएल मिलाएं। हीटिंग के साथ एक चुंबकीय उभारने वाला पर बोतल रखें। 1 एम कोह या नाओएच के 900 माइक्रोन जोड़ें, और समाधान स्पष्ट होने तक हिलाएं। शांत और एक 50 एमएल शंकुकेंद्रित्र ट्यूब को स्थानांतरित करने की अनुमति दें; डीएच2ओ के साथ 50 एमएल तक टॉप करें। समाधान की आवश्यकता तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: फॉर्मलडिहाइड को सुरक्षात्मक दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहने हुए एक धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए।
  3. फिक्सेशन बफर (पीएचईएम के साथ 3.7% पीएफए बफर) तैयार करें। 50 एमएल के लिए, 37% पीएफए समाधान के 5 एमएल, 2x पीएचईएम बफर के 25 एमएल, और 50 एमएल शंकुकीय सेंट्रलाइज ट्यूब में डीएच 2 ओ के20एमएल को मिलाएं। आवश्यकता पड़ने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: विगलन के बाद, बफर को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. पीबीएसटी (1x फॉस्फेट-बफर खारा [पीबीएस]) में 0.1% ट्वीन-20 तैयार करें। 50 एमएल के लिए 100% ट्वीन-20 से 50 एमएल 1x पीबीएस के 50 माइक्रोन डालें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: समाधान कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  5. 3:1, 1:1, और 1:3 (प्रत्येक के १०० एमएल की अंतिम मात्रा; तालिका 1देखें) के अनुपात में MeOH/PBST के संयोजन से रिहाइड्रेशन बफ़र्स तैयार करें ।
    नोट: MeOH बहुत विषाक्त और ज्वलनशील है। चूंकि यह ऑप्टिक तंत्रिका को नुकसान पहुंचा सकता है, इसलिए इसे किसी भी खुली लपटों से बचने के लिए एक धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए। चूंकि मेकोह और पीएसएसटी मिश्रण एक एक्सोथर्मिक प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है, बर्फ पर समाधान जोड़ता है।
  6. 20x एसएससी के 1000 एमएल के लिए, एक बीकर में सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 175.3 ग्राम और सोडियम साइट्रेट के 88.2 ग्राम को मिलाएं, और डीएच2ओ के 800 एमएल से भरें। भंग होने तक हिलाएं, और पीएच को एनएएच का उपयोग करके 7.2 में समायोजित करें। 1000 मिलीएल की कुल मात्रा में डीएच2ओ जोड़ें, और ऑटोक्लेव या फ़िल्टर के माध्यम से 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से एक ऑटोक्लेव बोतल में जोड़ें।
  7. 5x एसएससीटी के 50 एमएल के लिए, 20x एसएससी बफर के 12.5 एमएल को 37.5 एमएल डीएच2ओ के साथ मिलाएं, और 100% ट्वीन-20 के 50 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।
  8. 50% 5x SSCT/50% पीबीएसटी के 50 एमएल के लिए, 5x एसएससीटी के 25 एमएल के साथ पीबीएसटी के 25 एमएल के साथ मिलाएं।
  9. 2x एसएससी के 50 एमएल के लिए, 10x एसएससी बफर के 5 एमएल को 45 एमएल के साथ डीएच 2 ओ मिक्स अच्छीतरहसे मिलाएं।
    नोट: सभी एसएससी बफ़र्स अंधेरे में आरटी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए ।

2. लक्ष्य परिभाषा, जांच, और एम्पलीफायर

  1. एम्पलीफायर और जांच डिजाइन करने के लिए निर्माता की वेबसाइट पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि जांच सार्स-CoV-2 एन जीन(अनुपूरक चित्रा 1)के रिवर्स डीएनए स्ट्रैंड के पूरक हैं ।
  2. सबसे अच्छा जांच सेट आकार निर्धारित करें (20 जांच का एक सेट दृश्य के लिए पर्याप्त है)।
  3. लक्ष्य आरएनए का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एम्पलीफायरों को सेट करें।
    1. एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ लेबल एचसीआर एम्पलीफायर बी 1 का उपयोग करें।
      नोट: एक एचसीआर एम्पलीफायर में मेटास्टेबल एचसीआर हेयरपिन एच 1 और एच 2 शामिल हैं। मल्टीप्लेक्स किए गए प्रयोगों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके डिजाइन किया जा सकता है। यदि यह योजना बनाई है, एक अलग एचसीआर एम्पलीफायर (B1, B2, ...) प्रत्येक लक्ष्य आरएनए के लिए एक ही नमूना के भीतर छवि के लिए चुनें (उदाहरण के लिए, लक्ष्य 1 के लिए एम्पलीफायर B1, लक्ष्य 2 के लिए एम्पलीफायर B2, ...) ।

3. सार्स-सीओवी-2 के साथ सेल संस्कृति और संक्रमण

  1. दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम में संस्कृति वेरो (बंदर गुर्दे एपिथेलियल कोशिकाएं) कोशिकाएं जिसमें 5% भ्रूण गोजातीय सीरम होता है।
    1. 12-अच्छी प्लेट में कवरस्लिप (नंबर 1, 15 × 15 मिमी) पर बीज 50,000 कोशिकाएं।
  2. पूरी तरह से विभेदित एचएई संस्कृतियों को तैयार करें जैसा कि पारगम्य ट्रांसवेल परवर्णित 18 झिल्ली (व्यास = 6.5 मिमी) और संस्कृति के साथ ब्रोंकियल एपिथेलियल विकास माध्यम में पूरी तरह से अनुकूल होने तक समर्थन करता है।
  3. वायरस संक्रमण
    1. 1000x औसत ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (टीसीआईडी50)प्रति एमएल पर सार्स-सीओवी-2 के साथ टीका लगाने वाली कोशिकाएं
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    3. अनबाउंड वायरस को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    4. 48 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं

4. सार्स-CoV-2 आरएनए-वेरो कोशिकाओं में मछली कवरस्लिप पर सुसंस्कृत

पहला दिन

  1. फिक्सिंग और पार करने वाली कोशिकाएं
    1. आर टी में 1 एच के लिए 3.7% w/v पीएफए समाधान के साथ संक्रमित कोशिकाओं को ठीक करें।
    2. 3.7% पीएफए समाधान को एस्पिरेट करें, और 1x पीबीएस का उपयोग करके कोशिकाओं को दो बार धोएं।
    3. आंदोलन के साथ आरटी में 10 मिनट के लिए पीबीएसटी समाधान के साथ कोशिकाओं को पार करें।
    4. पीबीएसटी को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  2. खोज
    1. 1x पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें, और आर टी में 2x एसएससी के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. 2x एसएससी समाधान को एस्पिरेट करें, और जांच संकरण बफर के कम से कम 300 माइक्रोन जोड़कर नमूनों को प्रीहाइब्रीडाइज करें। कोशिकाओं वाले कुओं को कवर करें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. जांच संकरण बफर के लिए जांच मिश्रण के 1.2 बजेोल जोड़कर जांच समाधान तैयार करें।
      1. 1 μM जांच स्टॉक के 1.2 माइक्रोन का उपयोग करने के लिए काम कर रहे स्टॉक के ३०० μL तैयार करते हैं ।
    4. प्रीहाइब्रिडाइजेशन समाधान निकालें, और कवर्लिप्स को एक आर्द्रीकृत कक्ष में स्थानांतरित करें।
      1. व्यक्तिगत बूंदों के रूप में पैराफिल्म पर जांच समाधान के 30-50 μL पिपेट।
    5. रात भर (12-18 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।

      दूसरा दिन
    6. कवरस्लिप को 12-वेल प्लेट में वापस स्थानांतरित करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच वॉश बफर के 400 माइक्रोन के साथ 4 x 5 मिनट के लिए धोकर अतिरिक्त जांच समाधान निकालें।
      नोट: पैराफिल्म पर 30-50 माइक्रोन एलिकोट्स रखने और इनक्यूबेशन के लिए कवरस्लिप के तहत एक विकल्प के रूप में, 12-अच्छी प्लेट में कवरस्लिप के लिए सीधे जांच समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें। यह प्रक्रिया सरल है, लेकिन इसके लिए पर्याप्त मात्रा में अभिकर् णों की आवश्यकता होती है। जांच वॉश बफर को उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। आवश्यक बफर की मात्रा की गणना करें, और इसे 15 एमएल शंकुकेंद्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. आरटी में 5x एसएससीटी के साथ 2 x 5 मिनट के लिए नमूने धोएं।
    8. 5x SSCT समाधान को 1x पीबीएस के साथ बदलें, और प्रवर्धन तक नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. विस्तारण
    1. कुओं से 1x पीबीएस समाधान निकालें, और प्रत्येक अच्छी तरह से कम से कम 300 माइक्रोन प्रवर्धन बफर जोड़ें। आरटी में 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
    2. अलग-अलग ट्यूब में वांछित मात्रा को स्नैप-कूलिंग करके प्रत्येक एचसीआर हेयरपिन (एच1 और एच2) तैयार करें।
      1. प्रवर्धन समाधान के 300 माइक्रोन तैयार करने के लिए, प्रत्येक हेयरपिन के 18 मोल का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, 300 माइक्रोन के लिए, 3 माइक्रोन स्टॉक हेयरपिन समाधान के 6 माइक्रोल का उपयोग करें)।
      2. हेयरपिन के घोल को ट्यूब में ट्रांसफर करें।
      3. 90 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      4. अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी को ठंडा करें।
    3. प्रवर्धन बफर के लिए स्नैप-कूल्ड "एच1" और "एच2" हेयरपिन जोड़कर हेयरपिन मिश्रण तैयार करें।
    4. पैराफिल्म पर हेयरपिन मिश्रण के 30-50 माइक्रोन की बूंदों को रखें।
    5. आरटी में अंधेरे में रात भर (12-18 घंटे) नमूनों को इनक्यूबेट करें।

      तीसरा दिन
    6. कवरस्लिप को 12 अच्छी तरह से प्लेट में वापस स्थानांतरित करें, और आंदोलन के साथ आरटी में 5x एसएससीटी के साथ 5 x 5 मिनट के लिए धोकर अतिरिक्त हेयरपिन हटा दें।
    7. 5x एसएससीटी बफर को एस्पिरेट करें, और इसे 1x पीबीएस के साथ बदलें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो आरएनए-मछली के नमूनों का उपयोग एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख में करें, इसके बाद नाभिक का धुंधला होना (धारा 5 देखें)।
  4. परमाणु धुंधला और स्लाइड बढ़ते
    1. 1x पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें, और इसे 1x पीबीएस समाधान में 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडलोल (DAPI, 0.2 μg/l) के साथ बदलें।
    2. अंधेरे में आरटी में 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
    3. DAPI समाधान को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    4. बढ़ते माध्यम में से प्रत्येक 10 μL की दो बूंदों रखें; सुनिश्चित करें कि बूंदों को पर्याप्त रूप से अलग किया जाता है ताकि एक ही स्लाइड पर दो कवरस्लिप को रखा जा सके।
    5. एक साफ तौलिया पर कवरस्लिप को टैप करके अतिरिक्त तरल निकालें, और फिर उन्हें नीचे की कोशिकाओं के साथ एंटीफेड बढ़ते माध्यम में रखें।
    6. अंधेरे में एक सूखी, सपाट सतह पर घुड़सवार नमूनों को रखें और उन्हें इलाज करने दें।
    7. इलाज के बाद, नमूनों को सूखने से रोकने के लिए VALAP सीलेंट या नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें।

5. SARS-CoV-2 आरएनए-मछली HAE संस्कृतियों में

पहला दिन

  1. फिक्सिंग और HAE संस्कृति पार
    1. माध्यम को एस्पिरेट करें, और आर टी में 1 एच के लिए 3.7% पीएफए समाधान का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं को ठीक करें।
    2. 3.7% पीएफए समाधान को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
      1. ट्रांसवेल डालने के तहत 3.7% पीएफए समाधान को 1x पीबीएस के साथ बदलें।
    3. पीबीएस को त्यागें, और 100% MeOH के साथ 2 x 5 मिनट वॉश का उपयोग करके नमूनों को निर्जलित करें - 20 डिग्री सेल्सियस तक।
    4. दूसरे धोने के बाद, ट्रांसवेल डालने के तहत परमीलाइजेशन के लिए बफर को ताजा, ठंडा मेओएच के साथ बदलें। -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।

दूसरा दिन

  1. रिहाइड्रेशन
    बर्फ पर MeOH/PBST समाधान (5 मिनट के लिए प्रत्येक) की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से नमूनों को फिर से हाइड्रेट करें: ७५% MeOH/25% PBST, ५०% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/७५% PBTS, और १००% पीएसटी (दो बार) ।
    1. 50% 5x SSCT/50% PBST के साथ बर्फ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धो लें।
    2. 5x SSCT के साथ बर्फ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोएं।
    3. 5x एसएससीटी बफर को 1x पीबीएस के साथ बदलें।
  2. खोज
    1. जांच संकरण बफर के 100 माइक्रोन के साथ बर्फ पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं (ट्रांसवेल डालने के अंदर) को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस (प्रीहाइब्रिडाइजेशन) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: जांच संकरण बफर उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म होना चाहिए। आवश्यक मात्रा की गणना करें: सिंगल ट्रांसवेल डालने के लिए 100 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
    2. जांच समाधान तैयार करें। चूंकि जांच समाधान के 1 एमसीएल को जांच के 4 पीएमओएल की आवश्यकता होती है, इसलिए जांच संकरण बफर के 1 मिलियन में 1 माइक्रोन प्रोब स्टॉक समाधान जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: आरएनए डिटेक्शन के लिए, ट्रांसवेल डालने के प्रति जांच समाधान के 100 माइक्रोन का उपयोग करें। प्रीहाइब्रिडाइजेशन चरण के अंत तक बर्फ पर जांच समाधान छोड़ दें।
    3. प्रीहाइब्रिडाइजेशन समाधान निकालें, और जांच समाधान जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को रात भर (12-18 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

      तीसरा दिन
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच वॉश बफर के 100 माइक्रोन के साथ 4 x 15 मिनट के लिए धोने के द्वारा अतिरिक्त जांच हटाएं।
    6. आरटी में 5x SSCT के साथ 2 x 5 मिनट के लिए नमूनों को धोएं ।
    7. 5x SSCT को 1x पीबीएस के साथ बदलें, और प्रवर्धन तक नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. विस्तारण
    1. आरटी में 30 मिनट के लिए प्रवर्धन बफर के साथ उन्हें इनक्यूबेटिंग करके नमूनों को प्रीमप्लेलिफाई करें ।
    2. अलग-अलग ट्यूब में वांछित वॉल्यूम को स्नैप-कूलिंग करके प्रत्येक हेयरपिन तैयार करें।
      1. प्रवर्धन समाधान के 500 माइक्रोन तैयार करने के लिए, प्रत्येक हेयरपिन के 30 μl का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, 500 माइक्रोन के लिए, 3 माइक्रोन स्टॉक हेयरपिन समाधान के 10 माइक्रोल का उपयोग करें)।
      2. ट्यूबों के लिए हेयरपिन समाधान स्थानांतरित करें।
      3. 90 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      4. अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी को ठंडा करें।
    3. आरटी में प्रवर्धन बफर के 500 माइक्रोन में सभी स्नैप-कूल्ड हेयरपिन जोड़कर हेयरपिन घोल तैयार करें।
    4. प्रीमिपलिफिकेशन सॉल्यूशन निकालें, और पूरा हेयरपिन सॉल्यूशन जोड़ें।
    5. अंधेरे में आरटी में रात भर (12-18 घंटे) नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    6. आरटी में 5x एसएससीटी के साथ धोने से अतिरिक्त हेयरपिन निकालें इस प्रकार: 2 x 5 मिनट, 2 x 15 मिनट, और 1 x 5 मिनट।
    7. 5x SSCT समाधान को 1x पीबीएस के साथ बदलें, और 2-3 दिनों से अधिक नहीं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे परमाणु धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो आरएनए-मछली के नमूनों का उपयोग एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख में करें, इसके बाद परमाणु धुंधला (धारा 6 देखें)।
  4. परमाणु धुंधला और स्लाइड बढ़ते
    1. 1x पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें, और इसे 1x पीबीएस में DAPI समाधान (0.2 μg/mL) के साथ बदलें।
    2. अंधेरे में आरटी में 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
    3. DAPI समाधान को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    4. ट्रांसवेल आवेषण से कट-आउट झिल्ली को एंटीफैड बढ़ते माध्यम के 10 माइक्रोन पर रखें, जिसमें कोशिकाओं का सामना करना पड़ रहा है, और झिल्ली में अतिरिक्त बढ़ते माध्यम (5 माइक्रोन) जोड़ें।
    5. झिल्ली को कवर्लिप्स से ढक दें।
    6. अंधेरे में एक सूखी, सपाट सतह पर घुड़सवार नमूनों का इलाज करें।
    7. इलाज के बाद, नमूनों को सूखने से रोकने के लिए VALAP सीलेंट या नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें।

6. वेरो कोशिकाओं और हाई संस्कृतियों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

नोट: सेल लाइनों या HAE संस्कृतियों के लिए 4 दिन के लिए 3 दिन पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख प्रदर्शन करते हैं । प्रत्येक मॉडल के लिए एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग करें। सभी मतभेद स्पष्ट रूप से संकेत दिए गए हैं ।

  1. कुओं से 1x पीबीएस समाधान को एस्पिरेट करें।
  2. पीबीस्ट समाधान में 1% डब्ल्यू/वी गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ इनक्यूबेशन द्वारा नमूनों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक करें।
  3. समाधान को अवरुद्ध करने और इनक्यूबेट में उचित कमजोर पड़ने की तैयारी करके प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें।
    1. कवरस्लिप पर वेरो कोशिकाओं के लिए:
      1. आर्द्रता कक्ष में पैराफिल्म पर एंटीबॉडी समाधान की बूंदों (30-50 माइक्रोन) को रखें।
      2. नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी बूंदों पर कवरस्लिप रखें।
    2. एचएई के लिए, आवेषण में अवरुद्ध एजेंट को एंटीबॉडी समाधान (100 माइक्रोन) के साथ बदलें, और नमूनों को आर्द्रीकृत कक्ष में इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक इनक्यूबेशन के लिए समय और तापमान समायोजित करें। विशिष्ट पैरामीटर आरटी में 2 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर होते हैं।
  4. पीबीएएसटी के साथ 3 x 5 मिनट के लिए नमूनों को धोएं।
    1. कवर्लिप्स पर कोशिकाओं के लिए, 12-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और पीबीएसटी समाधान जोड़ें।
    2. एचएई संस्कृतियों के लिए, एंटीबॉडी समाधान को पीबीएएसटी समाधान के साथ बदलें।
  5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपलब्ध प्रकाश स्रोतों और फिल्टर की जांच करें।
  6. मेजबान प्रजातियों के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी चुनें। उपलब्ध प्रकाश स्रोत के अनुसार फ्लोरोफोर पैरामीटर (उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य, स्पेक्ट्रम चौड़ाई, और उत्तेजन दक्षता) चुनें।
    नोट: स्पेक्ट्रल पैरामीटर ऑनलाइन टूल का उपयोग करके मॉडलिंग की जा सकती है (सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. उन्हें अवरुद्ध समाधान के साथ कमजोर करके उचित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी (6.3 के रूप में) के साथ इनक्यूबेट, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  9. नमूनों को चरण 6.4 में धोएं।
  10. परमाणु धुंधला और स्लाइड बढ़ते
    1. कवर्लिप्स पर कोशिकाओं के लिए
      1. पीबीएसटी को एस्पिरेट करें, और इसे 1x पीबीएस समाधान में DAPI (0.2 μg/mL) से बदलें।
      2. अंधेरे में आरटी में 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
      3. DAPI समाधान को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
      4. कवरस्लिप को नीचे की कोशिकाओं के साथ बढ़ते माध्यम के 10 माइक्रोल की बूंदों पर रखें।
      5. नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।
    2. HAE संस्कृतियों के लिए
      1. 1x पीबीएसटी को एस्पिरेट करें, और इसे 1x पीबीएस समाधान में DAPI (0.2 μg/mL) के साथ बदलें।
      2. अंधेरे में आरटी में 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें ।
      3. DAPI समाधान को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
      4. कट-आउट झिल्ली को बढ़ते माध्यम के 10 माइक्रोन की बूंदों पर रखें, जिसमें कोशिकाओं का सामना करना पड़ रहा है, और झिल्ली में अतिरिक्त (5 माइक्रोल) बढ़ते माध्यम जोड़ें।
      5. झिल्ली को कवर्लिप्स से ढक दें।
      6. नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।

7. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. उपयोग किए गए फ्लोरोफोरस को निर्दिष्ट करके पटरियों को परिभाषित करें।
  2. स्कैनिंग मोड और गति चुनें।
  3. वायरस, नकली संक्रमित कोशिकाओं के लिए: प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए लेजर शक्ति, लाभ और ऑफसेट मूल्यों को संबंधित नकारात्मक नियंत्रणों के साथ समायोजित करें; सेलुलर प्रोटीन के लिए, एक उपयुक्त मेजबान से आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग नमूने।
  4. 3D इमेज हासिल करने के लिए, जेड-स्टैक मोड को सक्रिय करें, और ऊपर और नीचे की सीमाएं निर्धारित करें। स्टेप साइज/नंबर सेट करें।
    नोट: कोरोनावायरस इमेजिंग पर अधिक जानकारी के लिए,19देखें ।

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Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल दो सेलुलर प्रणालियों का उपयोग करके किया गया था: एक वेरो सेल लाइन और एक 3 डी एचएई संस्कृति। दोनों सेलुलर मॉडलों के लिए प्रमुख कदम तालिका 2में दिखाए गए हैं। एचएई संस्कृतियों में सार्स-सीओवी-2 के दृश्य के लिए आरएनए-फिश प्रोटोकॉल में ऐसे कदम शामिल हैं जो ऊतक के नमूनों के लिए विशिष्ट हैं, यानी, MeOH-PBS और 0.1% ट्वीन समाधानों की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से 100% MeOH और रिहाइड्रेशन के साथ पारमेबिलाइजेशन। आरएनए-मछली के पूरा होने के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस किया गया । ज़स्टैक छवियों का अधिग्रहण और संसाधित किया गया था।

चित्रा 1 मॉक-टीकाकरण नियंत्रण वेरो कोशिकाओं या सार्स-सीओवी-2 से संक्रमित कोशिकाओं में इम्यूनो आरएनए मछली दिखाता है। चित्रा 2 नकली टीका नियंत्रण HAE संस्कृतियों या सार्स-CoV-2 से संक्रमित संस्कृतियों में इम्यूनो आरएनए मछली से पता चलता है । चित्रा 3 वेरो कोशिकाओं में पारमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल का अनुकूलन दिखाता है: आर टी में 5 मिनट के लिए पीबीएस में -20 डिग्री सेल्सियस या 0.1% ट्वीन-20 पर रात भर 70% इथेनॉल।

Figure 1
चित्रा 1:इम्यूनो-आरएनए-मछली सार्स-CoV-2 आरएनए और वेरो कोशिकाओं में β-ट्यूबलिन का पता लगाने के लिए । सार्स-सीओवी-2 उपजनोमिक आरएनए का स्थानीयकरण(ए)संक्रमित और(बी)मॉक-टीकाकरण वेरो कोशिकाओं में। वायरल आरएनए मछली (लाल) द्वारा कल्पना की गई थी । β-ट्यूबलिन माउस के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग है 5tubulin (1:100, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन) और एलेक्सा फ्लोरोफोर 488-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400, 1 एच इनक्यूबेशन आरटी में) के साथ। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। प्रत्येक छवि एक एकल कॉन्फोकल प्लेन है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; मछली = सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सार्स-सीओवी-2 से संक्रमित मानव वायुमार्ग एपिथेलियल कोशिकाएं। सार्स-सीओवी-2 उपजन्मिक आरएनए का स्थानीयकरण(ए)संक्रमित और(बी)मॉक-टीका एचएई संस्कृतियों में। वायरल आरएनए मछली (लाल) द्वारा कल्पना की गई थी । सिलिएटेड कोशिकाओं को माउस के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की जाती है 5-ट्यूबलिन (1:100, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन) और एलेक्सा फ्लोरोफोर 488-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400, आरटी में 1 एच इनक्यूबेशन)। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। प्रत्येक छवि कॉन्फोकल इमेज स्टैक (मोटाई = 3 माइक्रोन) से पुनर्निर्मित एक अधिकतम प्रक्षेपण का प्रतिनिधित्व करती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; मछली = सीटू संकरण में फ्लोरेसेंस; HAE = मानव वायुमार्ग एपिथेलियम; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:वेरो कोशिकाओं के लिए पारमेबिलाइजेशन शर्तों का अनुकूलन। पीबीएस में 0.1% ट्वीन-20 के साथ(ए)70% इथेनॉल और(बी)के साथ वेरो कोशिकाओं का परिव्ययीकरण। डिटर्जेंट के साथ परिव्ययीकरण के परिणामस्वरूप सार्स-सीओवी-2 उपजनोमिक आरएनए के लिए एक स्पष्ट विशिष्ट संकेत होता है, जबकि इथेनॉल के परिणामस्वरूप धुंधली छवि होती है। वायरल आरएनए लाल रंग में दिखाया गया है। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। प्रत्येक छवि कॉन्फोकल इमेज स्टैक (मोटाई = 3 माइक्रोन) से पुनर्निर्मित एक अधिकतम प्रक्षेपण का प्रतिनिधित्व करती है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर नमकीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1:सार्स-CoV-2 N जीन अनुक्रम (5'-3')   इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

बफ़र मेथनॉल की मात्रा [एमएल] पीबीएसएल की मात्रा [एमएल]
75% MeOH/25% पीएसटी 75 25
50% MeOH/50% पीएसटी 50 50
25% MeOH/75% पीएसटी 25 75
100% पीबीस्ट 0 100
कुल 100 एमएल

तालिका 1: रिहाइड्रेशन के लिए ढाल मेथनॉल/पीबीएसटी समाधान तैयार करना। पूर्ण मेथनॉल (MeOH) में रात भर इनक्यूबेशन के बाद मानव वायुमार्ग एपिथेलियम नमूनों को फिर से हाइड्रेट करने के लिए, पर्यावरण का एक धीमा आदान-प्रदान आवश्यक है। ऐसा करने के लिए, बफर के साथ इनक्यूबेटिंग करके धीमी गति से विनिमय होना चाहिए जिसमें 1x फॉस्फेट-बफर खारा में MeOH और PBST (0.1% ट्वीन-20) का अनुपात धीरे-धीरे बदलता है। प्रत्येक समाधान के 100 एमएल तैयार करने के लिए पर्याप्त रीएजेंट वॉल्यूम, कई प्रयोग करने के लिए पर्याप्त, सूचीबद्ध हैं।

मॉड्यूल कहीं जाना वेरो कोशिकाएं हाई संस्कृतियां
सीटू संकरण (आरएनए फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस ग्रस्तता (3.7% पीएफए) कमरे के तापमान पर या कमरे के तापमान पर रात भर 10-40 मिनट
पर्मेबिलाइजेशन (PBST: 1x PBS में ०.१% ट्वीन-20) कमरे के तापमान पर 10 मिनट (1x PBS में 0.1% ट्वीन-20) 2 × कमरे के तापमान पर 5 मिनट
(100% MeOH) रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर
रिहाइड्रेशन (ग्रेडेड मेथनॉल (MeOH)/PBST) 5 x 5 मिनट, 50% 5x SSCT/PBST धोने 5 मिनट, 5x SSCT धोने बर्फ पर 5 मिनट
डिटेक्शन (पूर्व संकरण) (प्रोब हाइब्रिडाइजेशन बफर) 30 मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस, 200-300 माइक्रोन (जांच संकरण बफर) बर्फ पर 5 मिनट, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, 100 माइक्रोन
खोज (जांच समाधान) 12-18 घंटे पर 37 डिग्री सेल्सियस, 30 - 50 माइक्रोन (जांच समाधान) 12-18 घंटे पर 37 डिग्री सेल्सियस, 100 माइक्रोन
जांच धुलाई (प्रोब वॉश बफर) 4 x 5 मिनट (प्रोब वॉश बफर) 4 x 15 मिनट
(5 × एसएससीटी) 2 x 5 मिनट
प्रवर्धन (पूर्व-प्रवर्धन) (प्रवर्धन बफर) कमरे के तापमान पर 30 मिनट, 200-300 μL (प्रवर्धन बफर) कमरे के तापमान पर 30 मिनट, 100 माइक्रोन
विस्तारण (एम्पलीफायर समाधान) अंधेरे जगह में कमरे के तापमान पर 12-18 घंटे, 30-50 माइक्रोन (एम्पलीफायर समाधान) अंधेरे जगह में कमरे के तापमान पर 12-18 घंटे, १०० μL
एम्पलीफायर धोने (5x SSCT) 5 x 5 मिनट (5x SSCT) 2 x 5 मिनट, 2 x 15 मिनट, 1 x 5 मिनट
इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) अवरुद्ध (पीबीएसएटी में 1% बीएसए) 30 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर
प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (समाधान को अवरुद्ध करने में एक्रोप्रिएट एकाग्रता का एंटीबॉडी समाधान) कमरे के तापमान पर 2 घंटे/ (समाधान अवरुद्ध करने में एक्रोप्रिएट एकाग्रता का एंटीबॉडी समाधान) कमरे के तापमान पर 2 घंटे/
प्राथमिक एंटीबॉडी धोने (PBST) कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट
माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (अवरुद्ध समाधान में एक्रोनेट एकाग्रता का एंटीबॉडी समाधान) 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, 30-50 माइक्रोन (समाधान को अवरुद्ध करने में उचित एकाग्रता का एंटीबॉडी समाधान) 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे, 100 माइक्रोल
माध्यमिक एंटीबॉडी धोने (PBST) कमरे के तापमान पर 3 x 5 मिनट
परमाणु धुंधला (DAPI समाधान) कमरे के तापमान पर 10 मिनट, तो 1x PBS के साथ 2 x 5 मिनट

तालिका 2: सेल लाइनों और एचएई संस्कृतियों में इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल का वर्कफ्लो। इम्यूनो-आरएनए-मछली दोनों सेलुलर मॉडलों में संभव है, लेकिन विभिन्न दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है। मुख्य चरणों को दिखाया गया है, साथ ही इस्तेमाल किए गए बफ़र्स (कोष्ठक में), इसके बाद इनक्यूबेशन की अवधि और तापमान। कई चरणों में, गणना को सरल बनाने के लिए प्रति नमूने इनक्यूबेशन अभिकर्मक की मात्रा में महत्वपूर्ण अंतर दिए जाते हैं। यदि मात्रा निर्दिष्ट नहीं है, तो इसे मनमाने ढंग से चुना जाता है ताकि यह आंदोलन के साथ नमूना (आमतौर पर 200 माइक्रोन) को पूरी तरह से कवर करे। संक्षिप्त रूप: सीटू संकरण में मछली = फ्लोरेसेंस; HAE = मानव वायुमार्ग एपिथेलियम; पीएफए = पैराफॉर्मल्डिहाइड; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर नमकीन; MeOH = मेथनॉल।

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Discussion

इम्यूनो-आरएनए-फिश आरएनए और सेलुलर प्रोटीन के डबल-स्टेनिंग के लिए एक विश्वसनीय तरीका है। यहां, एक संशोधित इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो कोशिका लाइनों और एचएई संस्कृतियों में सार्स-सीओवी-2 आरएनए और सेलुलर प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को सेल मोनोलेयर या विशिष्ट ऊतकों सहित विभिन्न सेल मॉडल में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विधि उचित जांच स्थानीयकरण द्वारा शुरू की गई एचसीआर की अवधारणा पर निर्भर करती है। इसके बाद, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एम्पलीफायरों द्वारा सिग्नल का प्रवर्धन शुरू करने के लिए स्प्लिट-सर्जक प्रोब का उपयोग एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखे जाने पर न्यूनतम-से-नो-बैकग्राउंड फ्लोरेसेंस में परिणाम होता है। एम्पलीफायरों को विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है और विभिन्न लक्ष्यों को पहचानने के लिए डिज़ाइन किए गए विभिन्न जांचों के साथ संगत हैं; इसलिए, उनका उपयोग एक साथ किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाएं सरल हैं, लेकिन समय लेने वाली (3-4 दिन)। फिर भी, परिणामों को कम शोर-से-सिग्नल अनुपात की विशेषता होती है, अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत जो सीधे फ्लोरोसेंट जांच लेबल का उपयोग करते हैं।

वेरो कोशिकाओं और HAE संस्कृतियों यहां इस्तेमाल किया गया । ऊतक संस्कृति में एक कवरस्लिप और कोशिकाओं पर कोशिकाओं के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को संभालते समय अधिकांश मतभेदों का सामना करना पड़ता है (चाहे कवरलिप या झिल्ली पर) और उपयोग की जाने वाली सामग्री की मात्रा। सामान्य आरएनए-फिश प्रोटोकॉल को इथेनॉल या मेथनॉल समाधानों के साथ-साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन का उपयोग करके पारमेबिलाइजेशन की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण बात, परमीलता के लिए डिटर्जेंट का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अधिक फायदेमंद है, प्रक्रिया को 1 दिन तक छोटा करता है, और प्रयोग की अधिक कुशल योजना की अनुमति देता है। प्राथमिक दृष्टिकोण यह देखने के लिए कि क्या कोई अवांछनीय प्रभाव ध्यान देने योग्य थे, शराब या डिटर्जेंट के साथ पारयीकरण से जुड़े सामान्य प्रोटोकॉल का पालन करना था। महत्वपूर्ण बात यह है कि 70% इथेनॉल समाधान के साथ वेरो कोशिकाओं के रातोंरात पारीकरण के परिणामस्वरूप एक अविशिष्ट, धुंधला संकेत हुआ; इसके विपरीत, Tween20 के साथ पारशीलीकरण सार्स-CoV-2 आरएनए के स्पष्ट और विशिष्ट दृश्य की अनुमति दी और 1 दिन(चित्रा 3)द्वारा प्रोटोकॉल छोटा ।

इसी दृष्टिकोण का परीक्षण रात भर इनक्यूबेशन पूर्ण मेथनॉल के साथ -20 डिग्री सेल्सियस (ऊतक नमूनों के लिए सामान्य आरएनए-फिश प्रोटोकॉल के अनुसार) और आरटी में 5 मिनट के लिए 0.1% Tween20 के बाद HAE संस्कृतियों पर परीक्षण किया गया था। Tween20 के साथ इनक्यूबेशन एक गैर-विशिष्ट संकेत है, जो इस अभिवाची (डेटा नहीं दिखाया गया) अयोग्य ठहराता है। मेथनॉल के साथ रातोंरात इनक्यूबेशन कोई कलाकृतियों के साथ एक अत्यधिक विशिष्ट संकेत के लिए नेतृत्व किया । महत्वपूर्ण बात यह है कि ट्रांसवेल झिल्ली की टुकड़ी देखी गई क्योंकि मेथनॉल ने गोंद को भंग कर दिया। झिल्ली को अलग करके और कवरस्लिप प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से इस समस्या को संभाला गया था। शास्त्रीय आरएनए-मछली प्रक्रियाएं संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए प्रोटीन का उपयोग करती हैं क्योंकि यह प्रोटीन को हटा देती है और आरएनए-प्रोटीन परिसरों को साफ करती है, जिससे कोशिकाएं रसायनों और रंगों द्वारा पेनेट्रेबल हो जाती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल ने इस कदम को छोड़ दिया क्योंकि प्रोटीन के प्रोटीन धुंधला होने से रोकता है। आरएनए-फिश की संवेदनशीलता में कोई अंतर नहीं देखा गया जब प्रोटीनेज कश्मीर अनुपस्थित था (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

आरएनए-फिश के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन आरएनए सिग्नल को प्रभावित नहीं करता था और इसके परिणामस्वरूप दोनों तरीकों का सफल संयोजन होता है। इसलिए, पूरा प्रोटोकॉल आरएनए की कल्पना करने और एकल कोशिका स्तर पर प्रोटीन के साथ इसकी बातचीत का एक सुविधाजनक तरीका दर्शाता है। ध्यान दें, कोशिकाओं का निर्धारण (इम्यूनो-आरएनए-मछली के लिए आवश्यक) एकल-कोशिका स्तर पर गतिशील घटनाओं की जांच करने के लिए समय-चूक प्रयोगों की अनुमति नहीं देता है। सार्स-सीओवी-2 आरएनए का दृश्य एक कोशिका के भीतर सार्स-सीओवी-2 प्रतिकृति के विश्लेषण की अनुमति देता है और जब इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ मिलकर, एपिजेनोम के साथ इंटरप्ले सहित इंट्रासेलुलर सार्स-सीओवी-2 आरएनए/होस्ट प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देता है । अंत में, इस प्रोटोकॉल में सार्स-सीओवी-2 और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर अन्य उभरते वायरसों का पता लगाने सहित विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोग हैं। संवेदनशील और विशिष्ट एचसीआर तकनीक के लिए धन्यवाद, इसे नैदानिक उपकरण के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को सार्स-CoV-2 पर अनुसंधान के लिए विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान UMO2017/27/B/NZ6/02488 के लिए K.P. और UMO-2018/30/E/NZ1/00874 से एके-पी. को अनुदान) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880 ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker Fisher Scientific 12965501
Incubator Galaxy170R New Brunswick CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort Eppendorf 5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips LabSolute 7695022
1.5 mL tubes FL-MEDICAL 5.350.023.053
12-well plate TTP 92412
Conical centrifuge tube Sarstedt 5.332.547.254
parafilm Sigma P7793-1EA
serological pipets VWR Collection 612-5523P, 612-5827P
slide glass PTH CHEMLAND 04-296.202.03
Transwell ThinCerts Grainer bio-one 665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPI Thermo Scientific D1306
Disodium phosphate Sigma S51136-500G
EGTA BioShop EGT101.25
HCR Amplification Buffer Molecular Instruments, Inc. BAM01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S012522
HCR Probe Hybridization Buffer Molecular Instruments, Inc. BPH03821 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid Molecular Instruments, Inc. PRE134
HCR Probe Wash Buffer Molecular Instruments, Inc. BPW01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES BioShop HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 63138-250G
Methanol Sigma 32213-1L-M
Monopotassium phosphate Sigma P5655-100G
Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG
PIPES BioShop PIP666.100
Potassium Chloride Sigma P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium Invitrogen P36970
Sodium Chloride BioShop SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate POCH 6132-04-3
Tween-20 BioShop TWN580.500
Software
Fluorescence Spectraviewer Modeling spectral parameters
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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 166 सार्स-सीओवी-2 आरएनए-फिश हाइब्रिडीकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया इम्यूनोफ्लोरेसेंस ह्यूमन एयरवे एपिथेलियम (एचएई) परमीलाइजेशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
सीटू संकरण में इम्यूनो आरएनए-फ्लोरेसेंस का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का दृश्य
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