Summary
ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用の分子特性の理解を深める可能性がある。
Abstract
この原稿は、ヒト気道上皮の細胞株および三次元(3D)培養における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化するために、免疫蛍光と組み合わせたその場ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)のプロトコルを提供する。この方法は、プローブの局在化によって開始されたHCRに依存することにより、ウイルスRNAの非常に特異的で敏感な視覚化を可能にする。スプリットイニシエータプローブは、蛍光標識増幅器によって信号を増幅するのに役立ち、共焦点顕微鏡ではごくわずかなバックグラウンド蛍光を生み出します。異なる蛍光色素を用いたラベリングアンプは、様々なターゲットの同時認識を促進します。これにより、組織における感染のマッピングが、単細胞レベルでのウイルス病因および複製をよりよく理解することを可能にする。この方法を免疫蛍光と結合すると、宿主エピゲノムの交わりや免疫応答経路を含む宿主とウイルスの相互作用についての理解を深めることができます。このプロトコルは、敏感で特定のHCR技術により、診断ツールとしても使用できます。また、この技術は、将来出現する可能性のある非コードRNAおよびRNAウイルスを含む任意のRNAの検出を可能にするために容易に改変される可能性があることを覚えておくことも重要です。
Introduction
SARS-CoV-2は、2019年末に出現した新しいヒトベタコロナウイルスであり、数ヶ月後に前例のないパンデミックを引き起こしました。ウイルスは科学に新しいため、その生物学の多くとその宿主細胞への影響は不明のままである。したがって、感染時のウイルス細胞および-組織トロピズムのマッピングは、その基本的な生物学的特徴および宿主への影響が理解されるべきである場合に重要である。生化学的、生物学的、物理的なアッセイを含むウイルス宿主相互作用を調べるためにいくつかの技術が使用されています。このときハイブリダイゼーションは、細胞または組織内の特定のDNAまたはRNA配列に局部的に局部化する、標識された相補DNA、RNA、または修飾核酸プローブを採用する一般的な方法である。
HCR1を介してシグナル対ノイズ比を増幅することで感度を高める改変を組み込んだ新しいRNA蛍光化法(RNA-FISH)が開発されました。HCRは単一細胞レベルでのRNAの局在の研究を可能にする。この方法は、特異性、感度、解像度が高いため、基礎科学研究だけでなく、診断などの応用プロジェクトにも有用です。最近、この方法の実現可能性は、完全に分化されたヒト気道上皮(HAE)培養2内の毛状細胞に局在するSARS-CoV-2 RNAを検出するための実証された。HAE培養は、「自然感染」微小環境3、4の文脈でウイルス感染を研究するために使用される最も先進的なツールの1つを構成する。
ヒトコロナウイルス(HCoV)に関するいくつかの報告は、SARS-CoV-2を含む、HCoV感染および病態生理学に関するエピジェネティック修飾の重要性を強調する[5]、例えば、アンジオテンシン変換酵素2(ACE-2)受容体をコードする遺伝子のメチル化パターン6、7。興味深いことに、質量分光法スクリーニングは、SARS-CoV-2プロテオーム8と相互作用するいくつかのエピジェネティック因子を同定した。より具体的には、非構造タンパク質5(NSP5)は、エピジェネティックレギュレータに結合し、ヒストンデアセチラーゼ2、および触媒的に不活性なNSP5(C145A)とtRNAメチルトランスレシナーゼ1(24)と相互作用する。さらに、NSP16メチルトランスファー酵素活性はメチルトランスファー酵素阻害剤、シネフンジン9によって遮断される。しかしながら、COVID-19におけるこれらのエピジェネティック因子の正確な役割は不明のままである。HCoVの複製は、感染した細胞の細胞質において起こり、エピジェネティック修飾10によって調節される炎症反応を引き起こす。
例えば、HCoV-229Eは核因子κBシグナル伝達を細かく調合し、特定の領域11におけるH3K36およびH4K5のアセチル化を増加させることによって宿主細胞クロマチン景観を深く再プログラムする。中東呼吸器症候群関連コロナウイルス感染は、H3K27me3のレベルを増加させ、特定のインターフェロン感受性遺伝子12のサブセットのプロモーター領域においてH3K4me3を枯渇させる。さらに、ウイルスRNAは、フラビウイルス13、レトロウイルス14、15、およびコロナウイルス16について実証されるように、細胞免疫応答を引き起こす。ウイルスRNA上のエピジェネティックマーカーは、ヒト免疫不全ウイルス-1RNA-17のm7Aメチル化に示されるように、細胞センサーによる認識に役割を果たす可能性がある。しかし、SARS-CoV-2 RNAが免疫応答に与える影響とエピジェネティックなマークは関係していますか?
ここでは、細胞株および3D組織の免疫蛍光分析(完全分化HAE)と組み合わせた最適化されたRNA-FISH法について説明した。FISHや免疫蛍光などの細胞学的方法は広く用いられているが、この新世代のHCRに基づくこの新世代のハイブリダイゼーション法は、ウイルス検出に使用されたことがない(最近の刊行物を除く)2。一般に、免疫染色およびFISHには以下のステップが必要です: プローブまたは抗体の浸透を可能にする透過性;細胞材料が固定され、保存される固定;抗体または核酸プローブが適用される検出。そして最後に、視覚化のためのサンプルの取り付け。
既存のプロトコルはこれらの一般的な機能を共有しますが、関連するパラメータに関しては著しく異なります。ここでは、HAE培養およびベロ細胞におけるSARS-CoV-2 RNAを検出するために最適化された、単純な、免疫RNA-FISHプロトコルが記載されている。この技術は、次のステップを含む: (1) パラホルムアルデヒドを有する細胞の固定;(2) 洗浄剤またはメタノール(MeOH)での透過性(3) グレード付きの一連のMeOHソリューション(HAE培養のみ)による水分補給(4) 検出(5) HCR技術を用いた増幅により、SARS-CoV-2 RNAを検出する。(6) 免疫染色;(7)共焦点顕微鏡下でのイメージング。
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Protocol
1. バッファ準備
- 2x PHEMバッファーの500 mLの場合、 18.14 gのピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)、6.5 gの4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、エチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)、0.9gの硫酸(EGTA)を組み合わせます。蒸留水(dH2O)で体積を約400mLまで作り、攪拌し、10Mの水酸化カリウム(KOH)または水酸化ナトリウム(NaOH)を使用してpHを7.0に調整します。最終容積を500 mLまで作り、それから50 mLアリコートに分ける。必要になるまで-20°Cで保管してください。
メモ:pHが7.0に達するまでバッファはクリアされません。 - 37%w/vパラホルムアルデヒド(PFA)のストック溶液を調製します。50 mL の場合、ガラス瓶に PFA 18.5 g と dH2 Oの 35 mL を混ぜます。ボトルを加熱して磁気攪拌機の上に置きます。1 M KOH または NaOH の 900 μL を加え、溶液が明らかになるまでかき混ぜます。冷却し、50 mL円錐遠心分離管に転送することができます。dH2O で最大 50 mL を上にします。溶液は必要になるまで-20°Cで貯えることができる。
注意:ホルムアルデヒドは、保護手袋とラボコートを着用しながら、ヒュームフードで取り扱う必要があります。 - 固定バッファー (PHEM でバッファーに入れて 3.7% PFA) を準備します。50 mL の場合、5 mL の 37% PFA 溶液、2x PHEM バッファーの 25 mL、および 20 mL の dH2O を 50 mL 円錐形遠心分離管に組み合わせます。必要になるまで-20°Cで保管してください。
メモ:解凍後、バッファーは最大3ヶ月間4°Cで保存できます。 - PBST(1xリン酸緩衝生理食塩分[PBS]で0.1%トゥイーン-20)を準備します。50 mL の場合、100% Tween-20 から 50 mL の 1x PBS を 50 μL 加え、よく混ぜます。
メモ:溶液は室温(RT)で保存することができます。 - 3:1、1:1、および 1:3 の比率で MeOH/PBST を組み合わせて再水和バッファーを準備します (最終体積は 100 mL です。
注:MeOHは非常に有毒で可燃性です。視神経に損傷を与える可能性がありますので、開炎を避けるヒュームフードで処理する必要があります。MeOHとPBSTを混合すると発熱反応が発生するので、溶液を氷上で組み合わせます。 - 20x SSCの1000 mLの場合、175.3 gの塩化ナトリウム(NaCl)と88.2 gのクエン酸ナトリウムをビーカーに組み合わせ、800 mLのdH2O.を溶かすまで撹拌し、NaOHを使用してpHを7.2に調整します。dH2Oを合計体積1000mLに加え、オートクレーブまたはフィルターを0.22 μmフィルターでオートクレーブボトルに追加します。
- 5x SSCT の 50 mL の場合、20x SSC バッファーの 12.5 mL と 37.5 mL の dH2O を組み合わせ、50 μLの 100% Tween-20 を加えます。よく混ぜます。
- 50% 5x SSCT/50% PBST の 50 mL の場合、25 mL の 5x SSCT と 25 mL の PBST を組み合わせます。
- 2x SSCの50 mLの場合、5 mLの10x SSCバッファーと45 mLのdH2Oを組み合わせて、よくミックスします。
注: すべての SSC バッファは、暗闇の中で RT に格納する必要があります。
2. ターゲット定義、プローブ、アンプ
- アンプとプローブを設計するには、製造元のWebサイトで入手可能なツールを使用します。プローブがSARS-CoV-2 N遺伝子の逆DNA鎖と相補的であることを確認する(補助図1)。
- 最適なプローブ・セット・サイズを決定します (視覚化には 20 個のプローブのセットで十分です)。
- ターゲットRNA検出に使用するアンプを設定します。
- アレクサ・フルーオール647でラベル付けされたHCRアンプB1を使用します。
注意:HCRアンプは、メタスタブルHCRヘアピンh1とh2を備えています。多重化された実験はこのプロトコルを使用して設計することができる。これが計画されている場合は、同じサンプル内で画像化される各ターゲットRNAに異なるHCR増幅器(B1、B2、..)を選択します(例えば、ターゲット1のアンプB1、ターゲット2のアンプB2、..
- アレクサ・フルーオール647でラベル付けされたHCRアンプB1を使用します。
3. 細胞培養とSARS-CoV-2感染
- 5%の胎児ウシ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地における培養ベロ(サル腎臓上皮細胞)
- 12ウェルプレートに50,000個の細胞をカバーリップ(1,15×15mm)にシードします。
- 透過性トランスウェル挿入物に18 を記載した完全に分化したHAE培養物を、膜を有する(直径= 6.5mm)と気管支上皮成長培地で完全にコンフルにまで培養する。
- ウイルス感染
- 1000x中央値組織培養でSARS-CoV-2を有する細胞を接種する感染性用量(TCID50)/mL
- 細胞を37°Cで2時間培養する。
- 細胞をPBSで2回洗浄し、非結合ウイルスを除去します。
- 48時間培養細胞。
4. SARS-CoV-2 カバースリップで培養したベロ細胞のRNA-FISH
1日目
- 細胞の固定と透過
- RTで1時間の3.7%w/v PFA溶液で感染細胞を修正します。
- 3.7%PFA溶液を吸引し、1xPBSを用いて細胞を2回洗浄した。
- 攪拌で10分間のPBST溶液で細胞を透過させます。
- PBSTを吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄する。
- 検出
- 1x PBS溶液を吸引し、RTで2倍のSSCで細胞を2回洗浄する。
- 2x SSC溶液を吸引し、プローブハイブリダイゼーションバッファーを少なくとも300 μL添加してサンプルをプレハイブリダイズします。細胞を含むウェルを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
- プローブ混合液1.2pmolをプローブハイブリダイゼーションバッファに加えてプローブ溶液を調製する。
- 1 μM プローブストックの 1.2 μL を使用して、300 μL の作業ストックを準備します。
- プレハイブリダイゼーション溶液を取り外し、カバーリップを加湿チャンバーに移します。
- ピペット30-50 μLのプローブ溶液をパラフィルム上に取り付け、個々の液滴を形成します。
- サンプルを一晩(12〜18時間)37°Cでインキュベートする。
2日目 - カバーリップを12ウェルプレートに戻し、400 μLのプローブ洗浄バッファーを37°Cで4×5分間洗浄して余分なプローブ溶液を取り除きます。
注:30~50 μlのアリコートをインキュベーション用のパラフィルムとカバーリップの下に置く代わりに、300 μLのプローブ溶液を12ウェルプレートのカバーリップに直接追加します。この手順は、より簡単ですが、試薬のかなりの量を必要とします。使用前にプローブ洗浄バッファーを37 °Cに加熱します。必要なバッファーの量を計算し、それを 15 mL 円錐形遠心分離管に移します。 - RTで5x SSCTで2 x 5分間サンプルを洗浄します。
- 5x SSCT溶液を1x PBSに交換し、サンプルを増幅するまで4°Cで保管します。
- 増幅
- 井戸から1x PBS溶液を取り出し、各ウェルに少なくとも300 μLの増幅バッファーを加えます。RTで30分間サンプルをインキュベートします。
- 各HCRヘアピン(h1とh2)を別々のチューブで所望のボリュームをスナップ冷却して準備します。
- 300 μL の増幅溶液を調製するには、各ヘアピンを 18 pmol(例えば 300 μL の場合は、3 μM ストックヘアピン溶液 6 μL を使用) します。
- ヘアピン溶液をチューブに移します。
- 90 sの95°Cでインキュベート。
- 暗闇の中で30分間RTに冷却します。
- スナップ冷却された「h1」および「h2」ヘアピンを増幅バッファーに追加して、ヘアピンの混合物を準備します。
- 30~50 μLのヘアピン混合物をパラフィルムにドロップします。
- RTで暗闇の中で一晩(12-18時間)サンプルをインキュベートする。
3日目 - カバースリップを12ウェルプレートに戻し、5 x 5分間RTで5x SSCTで攪拌して洗浄して余分なヘアピンを取り除きます。
- 5x SSCTバッファーを吸引し、1x PBSに交換します。
注:必要に応じて、RNA-FISHサンプルを標準的な免疫蛍光アッセイで使用し、続いて核を染色します(セクション5参照)。
- 核染色およびスライド取付け
- 1x PBS溶液を吸引し、1x PBS溶液で4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI,0.2 μg/mL)に交換してください。
- 暗闇の中でRTで10分間サンプルをインキュベートします。
- DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄した。
- 取り付け媒体のそれぞれ10 μLの2滴を置く;1 つのスライドに 2 つのカバーリップを配置できるように、ドロップが十分に分離されていることを確認します。
- きれいなタオルのカバースリップをタップして余分な液体を取り除き、細胞を下に向けたアンチフェードマウントメディアに入れます。
- 取り付けられたサンプルを暗闇の中の乾燥した平らな表面に置き、それらを治させます。
- 硬化後、カバーリップの端をVALAPシーラントまたはマニキュアで密封し、サンプルが乾燥するのを防ぎます。
5. HAE培養におけるSARS-CoV-2 RNA-FISH
1日目
- HAE培養の固定と透過
- 培地を吸引し、RTで1時間3.7%PFA溶液を用いて感染細胞を固定する。
- 3.7%PFA溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄した。
- トランスウェル挿入物の下で3.7%のPFA溶液を1x PBSに交換してください。
- PBSを廃棄し、100%MeOHを-20°Cにプレチルして2 x 5分のウレンを使用してサンプルを脱水した。
- 2回目の洗浄後、トランスウェル挿入物の下で透過性を与えるために、バッファーを新鮮な冷蔵MeOHに交換します。-20°Cで一晩保管してください。
2日目
- 水分 補給
氷上のMeOH/PBST溶液の等級シリーズ(それぞれ5分間)を通してサンプルを水分補給:75%MeOH/ 25%PBST、50%MeOH/ 50%PBST、25%MeOH/ 75%PBTS、100%PBST(2回)。- 50%5x SSCT/50%PBSTで5分間氷上で細胞を洗浄します。
- 5倍のSSCTで5分間氷の上で細胞を洗浄します。
- 5x SSCT バッファを 1x PBS に置き換えます。
- 検出
- 100 μLのプローブハイブリダイゼーションバッファーで氷上で5分間、細胞(トランスウェルインサート内)をインキュベートします。次に、プレートを37°Cで30分間インキュベーターに移した(プレハイブリダイゼーション)。
注:プローブハイブリダイゼーションバッファは、使用前に37°Cに予熱する必要があります。必要なボリュームを計算:1つのトランスウェル挿入に100 μLが必要です。 - プローブソリューションを準備します。1 mLのプローブ溶液には4pmolのプローブが必要なため、プローブハイブリダイゼーションバッファの1 mLに4μLのプローブストック溶液を加え、よく混ぜます。
注:RNA検出には、トランスウェルインサートごとに100μLのプローブ溶液を使用してください。プレハイブリダイゼーションステップの終わりまで、プローブ溶液を氷の上に置いておきます。 - プレハイブリダイゼーション溶液を取り外し、プローブ溶液を追加します。
- 細胞を一晩(12〜18時間)37°Cでインキュベートする。
3日目 - 37°Cで100μLのプローブ洗浄バッファーで4 x 15分間洗浄して余分なプローブを除去します。
- RTで5倍のSSCTで2 x 5分間サンプルを洗います。
- 5x SSCTを1x PBSに交換し、サンプルを増幅するまで4°Cで保管してください。
- 100 μLのプローブハイブリダイゼーションバッファーで氷上で5分間、細胞(トランスウェルインサート内)をインキュベートします。次に、プレートを37°Cで30分間インキュベーターに移した(プレハイブリダイゼーション)。
- 増幅
- RTで30分間増幅バッファーでサンプルをインキュベートしてサンプルをプリアンプします。
- 目的のボリュームを別々のチューブでスナップ冷却して、各ヘアピンを準備します。
- 500 μL の増幅溶液を調製するには、各ヘアピンの 30 pmol を使用します(例えば、500 μL の場合は、3 μM ストックヘアピン溶液の 10 μL を使用します)。
- ヘアピン溶液をチューブに移します。
- 90 sの95°Cでインキュベート。
- 暗闇の中で30分間RTに冷却します。
- RTで500 μLの増幅バッファーにすべてのスナップ冷却ヘアピンを加えてヘアピン溶液を準備します。
- プリアンプソリューションを取り除き、ヘアピン溶液全体を追加します。
- 暗闇の中で一晩(12-18時間)、RTでサンプルをインキュベートします。
- RTで5x SSCTで洗って余分なヘアピンを取り除きます:2 x 5分、2 x 15分、1 x 5分。
- 5x SSCT溶液を1x PBSに交換し、4°Cで2〜3日以上保管するか、直接核染色に進みます。
注:必要に応じて、RNA-FISHサンプルを標準的な免疫蛍光アッセイで使用し、続いて核染色を行います(セクション6を参照)。
- 核染色およびスライド取付け
- 1x PBS溶液を吸引し、1x PBSでDAPI溶液(0.2 μg/mL)に交換します。
- 暗闇の中でRTで10分間サンプルをインキュベートします。
- DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄した。
- トランスウェルインサートの切り抜き膜を、細胞を上に向けたアンチフェード実装媒体の10 μLに置き、膜に追加の取り付け媒体(5 μL)を加えます。
- 膜をカバースリップで覆います。
- 暗い状態で乾燥した平らな表面に取り付けられたサンプルを治してください。
- 硬化後、カバーリップの端をVALAPシーラントまたはマニキュアで密封し、サンプルが乾燥するのを防ぎます。
ベロ細胞とHAE培養の免疫蛍光分析
注:細胞株の場合は3日目、またはHAE培養の場合は4日目に免疫蛍光アッセイを行います。モデルごとに異なるアプローチを使用します。すべての違いは明確に示されます。
- 井戸から1x PBS溶液を吸引する。
- PBST溶液中の1%w/vウシ血清アルブミンを37°Cで30分間インキュベーションしてサンプルをブロックします。
- ブロッキング溶液中で適切な希釈液を調製し、インキュベートすることにより、一次抗体を調製する。
- カバーリップ上のベロセルの場合:
- 湿気チャンバ内のパラフィルムに、溶液の滴(30~50μL)を入れます。
- 細胞を下に向けて抗体ドロップの上にカバースリップを置きます。
- HAEの場合、インサート内のブロッキング剤を抗体溶液(100μL)に交換し、加湿チャンバ内でサンプルをインキュベートします。
注:一次抗体を使用して各インキュベーションの時間と温度を調整します。典型的なパラメータは、RTで2時間または4°Cで一晩である。
- カバーリップ上のベロセルの場合:
- PBSTで3×5分間サンプルを洗います。
- カバーリップ上の細胞の場合は、12ウェルプレートに移し、PBST溶液を追加します。
- HAE培養の場合は、抗体溶液をPBST溶液に交換してください。
- 共焦点顕微鏡で利用可能な光源とフィルターを確認します。
- 宿主種に応じて二次抗体を選択する。蛍光色素パラメータ(励起波長と発光波長、スペクトル幅、および使用可能な光源に応じた励起効率)を選択します。
注: スペクトル パラメータは、オンライン ツールを使用してモデリングできます(「 材料表」を参照)。 - ブロッキング溶液で希釈することにより、適切な二次抗体溶液を調製します。
- 二次抗体(6.3のように)でインキュベートするが、37°Cで1時間インキュベートする。
- ステップ6.4のようにサンプルを洗います。
- 核染色およびスライド取付け
- カバーリップ上のセルの場合
- PBSTを吸引し、1x PBS溶液中のDAPI(0.2 μg/mL)に交換してください。
- 暗闇の中でRTで10分間サンプルをインキュベートします。
- DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄した。
- カバースリップを、細胞を下に向けた10μLの取り付け媒体の滴の上に置きます。
- カバーリップをマニキュアで密封します。
- HAE文化のために
- 1x PBSTを吸引し、1x PBS溶液中のDAPI(0.2 μg/mL)に交換してください。
- 暗闇の中でRTで10分間サンプルをインキュベートします。
- DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄した。
- 切り抜き膜を、細胞を上に向けた10μLの取り付け媒体の滴の上に置き、膜に追加の(5 μL)実装媒体を加えます。
- 膜をカバースリップで覆います。
- カバーリップをマニキュアで密封します。
- カバーリップ上のセルの場合
7. 共焦点顕微鏡
- 使用するフルオロフォアを指定して、トラックを定義します。
- スキャンモードと速度を選択します。
- 各フルオロフォアのレーザーパワー、ゲイン、オフセット値を、それぞれ負のコントロールと比較して調整します: ウイルス、モック感染細胞の場合。細胞タンパク質に対しては、適切な宿主由来のアイソタイプ対照抗体で染色されたサンプル。
- 3D イメージを取得するには、z スタック モードをアクティブにし、上下の制限を設定します。ステップサイズ/番号を設定します。
メモ: コロナウイルスイメージングの詳細については、19を参照してください。
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Representative Results
この原稿に記載された免疫RNA-FISHプロトコルは、2つの細胞系を用いて行った:Vero細胞株と3D HAE培養。両方のセルラー モデルの主要な手順を 表 2に示します。HAE培養におけるSARS-CoV-2の可視化のためのRNA-FISHプロトコルには、組織サンプルに典型的なステップ、すなわち、100%MeOHによる透過性およびMeOH-PBSおよび0.1%のトゥイーン溶液の段階的なシリーズによる水分補給が含まれています。免疫蛍光は、RNA-FISHが完了した後に行った。Zstack 画像は取得され、処理されました。
図1 は、SARS-CoV-2に感染したMock-接種対照ベロ細胞または細胞における免疫RNA FISHを示す。 図2 は、SARS-CoV-2に感染したMOCK-接種対照HAE培養物または培養物における免疫RNA FISHを示す。 図3 は、Vero細胞における透過性プロトコルの最適化を示しています:70%エタノールは-20°Cで-20°Cまたは0.1%Tween-20で-RTで5分間、洗浄剤による透過化はSARS-CoV-2サブジェノミックRNAに対する明確で特異的なシグナルをもたらし、一方、エタノールを使用するとぼやけた焦点のない画像で結果が得られます。
図1:セロ細胞におけるSARS-CoV-2 RNAおよびβチューブリンを検出する免疫RNA-FISH SARS-CoV-2 サブゲノム RNA の局在化 (A) 感染および (B) モック接種ベロ細胞ウイルスRNAはFISH(赤色)により可視化した。βチューブリンは、マウスβ5tubulin(1:100、4°Cで一晩インキュベート)に対する抗体と、Alexaフルオロフォア488結合二次抗体(RTで1:400、1時間のインキュベーション)で染色されます。核はDAPI(青色)で染色した。各イメージは単一の共焦点平面です。スケールバー= 20 μm略語: SARS-CoV-2 = 重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SARS-CoV-2に感染したヒト気道上皮細胞 SARS-CoV-2 サブゲノムRNAの局在化 (A) 感染および (B) MOCK-接種 HAE 培養物ウイルスRNAはFISH(赤色)により可視化した。毛状細胞は、マウスβ5-チューブリン(1:100、4°Cで一晩インキュベーション)に対する抗体と、Alexaフルオロフォア488結合二次抗体(RTで1:400、1hインキュベーション)を用いて可視化される。核はDAPI(青色)で染色した。各画像は、共焦点イメージスタックから再構成された最大投影法(厚さ= 3 μm)を表します。スケールバー= 10 μm略語: SARS-CoV-2 = 重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;HAE = ヒト気道上皮;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ベロ細胞の透過性条件の最適化 PBSで0.1%Tween-20を有する(A)70%エタノールと(B)を有するベロ細胞の透過化。洗浄剤による透過性は、SARS-CoV-2サブゲノムRNAに対して明確な特異的シグナルをもたらし、エタノールはぼやけた画像をもたらす。ウイルスRNAは赤色で示されている。核はDAPI(青色)で染色した。各画像は、共焦点イメージスタックから再構成された最大投影法(厚さ= 3 μm)を表します。スケールバー= 10 μm略語: SARS-CoV-2 = 重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;PBS = リン酸緩衝生理食塩分;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1: SARS-CoV-2 N遺伝子配列(5'-3') このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| バッファ | メタノールの容積 [mL] | PBST [mL] の体積 |
| 75% MeOH/25% PBST | 75 | 25 |
| 50% MeOH/50% PBST | 50 | 50 |
| 25% MeOH/75% PBST | 25 | 75 |
| 100% PBST | 0 | 100 |
| トータル | 100 mL | |
表1:再水和のためのグラジエントメタノール/PBST溶液の調製 絶対メタノール(MeOH)で一晩インキュベーションした後、ヒトの気道上皮サンプルを再水和するには、環境のゆっくりとした交換が必要である。これを行うには、MeOHとPBST(1xリン酸緩衝生理食塩基中0.1%Tween-20)の割合が徐々に変化するバッファーとのインキュベートによって遅い交換が起こる必要があります。各溶液の100mLを調製するのに十分な試薬量が、いくつかの実験を行うのに十分な、リストされている。
| モジュール | 歩 | ベロセル | HAE文化 |
| その場合のRNA蛍光ハイブリダイゼーション(RNA FISH) | 固定 | (3.7% PFA) 室温または室温で一晩で10-40分 | |
| 透過性 | (PBST: 1x PBS で 0.1% Tween-20) 室温で 10 分 | (1x PBSで0.1%トゥイーン-20) 室温で2×5分 | |
| (100%MeOH)-20°Cで一晩 | |||
| 水分 補給 | (グレードメタノール(MeOH)/PBST) 5 x 5分、50% 5x SSCT/PBST洗浄5分、5倍SSCT洗浄5分 | ||
| 検出(プレハイブリダイゼーション) | (プローブハイブリダイゼーションバッファー) 30分 37 °C、200-300 μL | (プローブハイブリダイゼーションバッファー)氷上5分、37°Cで30分、100μL | |
| 検出 | (プローブ溶液) 37°Cで12-18時間、30-50 μL | (プローブ溶液) 37°Cで12-18時間、100 μL | |
| プローブ洗浄 | (プローブ洗浄バッファ) 4 x 5分 | (プローブ洗浄バッファ) 4 x 15分 | |
| (5 × SSCT) 2 x 5 分 | |||
| 増幅(プリ増幅) | (増幅バッファー) 室温で30分、200-300 μL | (増幅バッファー) 室温で30分、100 μL | |
| 増幅 | (アンプ溶液) 暗い場所で室温で12-18時間、30-50 μL | (アンプ溶液) 暗い場所で室温で12-18時間、100 μL | |
| アンプ洗浄 | (5x SSCT) 5 x 5分 | (5x SSCT) 2 x 5 分、 2 x 15 分 1 x 5 分 | |
| 免疫蛍光(IF) | ブロッキング | (PBSTで1%BSA) 37°Cで30分 | |
| 一次抗体インキュベーション | (ブロッキング溶液中のアプロプリ素濃度の抗体溶液)室温で2時間/4°Cで一晩、30〜50μL | (ブロッキング溶液中のアプロプリ素濃度の抗体溶液)室温で2h/4°Cで一晩、100μL | |
| 一次抗体洗浄 | (PBST) 室温で3×5分 | ||
| 二次抗体インキュベーション | (ブロッキング溶液中のアプロプリ素濃度の抗体溶液)37°Cで1h、30〜50μL | (ブロッキング溶液中の適切な濃度の抗体溶液)37°Cで1時間、100μL | |
| 二次抗体洗浄 | (PBST) 室温で3×5分 | ||
| 核染色 | (DAPI溶液)室温で10分、1x PBSで2×5分 | ||
表2:細胞株およびHAE培養における免疫RNA-FISHプロトコルのワークフロー 免疫RNA-FISHは両方の細胞モデルで実現可能であるが、異なるアプローチを必要とする。主なステップは、使用されるバッファー(括弧内)と共に示され、続いてインキュベーションの持続時間と温度が続きます。いくつかのステップでは、サンプル当たりのインキュベーション試薬の量に重大な違いが与えられ、計算が簡単になります。ボリュームが指定されていない場合は、任意に選択され、撹拌でサンプル(通常は200 μL)を完全に覆います。略語: FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;HAE = ヒト気道上皮;PFA = パラホルムアルデヒド;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;BSA = ウシ血清アルブミン;PBS = リン酸緩衝生理食塩分;MeOH = メタノール。
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Discussion
免疫RNA-FISHはRNAおよび細胞タンパク質の二重染色のための信頼できる方法である。ここでは、細胞株およびHAE培養におけるSARS-CoV-2 RNAおよび細胞タンパク質の検出を可能にする修飾免疫RNA-FISHプロトコルが記載されている。このプロトコルは、細胞単層または特定の組織を含む異なる細胞モデルでの使用に適応することができる。この方法は、適切なプローブローカリゼーションによって開始されるHCRの概念に依存しています。次に、スプリットイニシエータプローブを用いて蛍光標識増幅器によるシグナルの増幅を開始すると、共焦点顕微鏡を用いて観察した場合、蛍光を最小から全く背景にすることが可能になります。アンプは、異なる蛍光色素で標識することができ、さまざまなターゲットを認識するように設計された異なるプローブと互換性があります。したがって、同時に使用することができます。このプロトコルで説明する手順は簡単ですが、時間がかかります(3~4日)。それにもかかわらず、結果は、直接標識された蛍光プローブを使用する他のプロトコルとは異なり、低ノイズ対信号比によって特徴付けられます。
ここでベロ細胞およびHAE培養物を用いた。カバースリップ上の細胞と組織培養中の細胞には、異なるプロトコルが必要です。ほとんどの違いは、細胞(カバースリップまたは膜上にある)と使用される材料の量を処理するときに遭遇します。一般的なRNA-FISHプロトコルは、エタノールまたはメタノール溶液を使用したパーメアビレーション、および-20°Cでの夜間インキュベーションを必要とします。 重要なことに、透過性に洗浄剤を使用することは、免疫蛍光に対してより有益であり、手順を1日短縮し、実験のより効率的な計画を可能にする。主なアプローチは、アルコールまたは洗剤による透過性を伴う一般的なプロトコルに従って、望ましくない影響が顕著であるかどうかを確認することであった。重要なことに、70%エタノール溶液を含むベロ細胞の一晩の透過化は、非特異的な、ぼやけた信号をもたらした。対照的に、Tween20による透過性はSARS-CoV-2 RNAの明確で特異的な可視化を可能にし、プロトコルを1日短縮した(図3)。
同じアプローチは、-20 °Cで絶対メタノールで一晩インキュベーションした後のHAE培養でテストされ(組織サンプルの一般的なRNA-FISHプロトコルに従って)、RTで5分間0.1%Tween20を行った。メタノールによる一晩のインキュベーションは、アーティファクトのない非常に特異的なシグナルにつながった。重要なことに、メタノールが接着剤を溶解したため、トランスウェル膜の剥離が観察された。この問題は、膜を取り外し、カバースリッププロトコルを続行することによって処理されました。従来のRNA-FISH手順では、タンパク質を除去し、RNAタンパク質複合体を除去し、細胞を化学物質や色素によって浸透させるため、感度を向上させるためにプロテナーゼKを使用します。本プロトコルは、プロテアーゼKがタンパク質染色を防止するので、この工程を省略した。プロテイナーゼKが存在しなかった場合のRNA-FISHの感度に違いは認められない(データは示さなかった)。
RNA-FISHに続く免疫蛍光アッセイを行うことは、RNAシグナルに影響を与えなく、両方の方法の組み合わせが成功した。したがって、完全なプロトコルは、RNAと単一細胞レベルでのタンパク質との相互作用を視覚化する便利な方法を表します。注目すべきは、細胞の固定(免疫RNA-FISHに必要)は、単一細胞レベルでの動的事象を調べるタイムラプス実験を許可しない。SARS-CoV-2 RNAの可視化により、細胞内のSARS-CoV-2複製の解析が可能となり、免疫蛍光と結合すると、エピゲノムとの相互作用を含む細胞内SARS-CoV-2 RNA/宿主タンパク質相互作用の研究が可能になります。最後に、このプロトコルは、SARS-CoV-2および単一細胞分解能での他の新たなウイルスの検出を含む多種多様なアプリケーションを有する。敏感で特定のHCR技術のおかげで、それはまた診断ツールとして使用することができる。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、SARS-CoV-2に関する研究のための科学高等教育省と国立科学センターからの助成金(K.P.とUMO-2018/30/E/NZ1/00874にUMO2017/27/B/NZ6/02488を付与)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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