Summary
Här beskriver vi en enkel metod som kombinerar RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) med immunofluorescens för att visualisera allvarliga akut respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Detta protokoll kan öka förståelsen för de molekylära egenskaperna hos SARS-CoV-2 RNA-värd interaktioner på en cell nivå.
Abstract
Detta manuskript ger ett protokoll för in situ hybridiseringskedja reaktion (HCR) i kombination med immunofluorescens för att visualisera allvarliga akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i cellinjen och tredimensionella (3D) kulturer av mänskliga luftvägarna epitel. Metoden möjliggör mycket specifik och känslig visualisering av viralt RNA genom att förlita sig på HCR initierad av sondlokalisering. Split-initiator sonder hjälper till att förstärka signalen av fluorescerande märkta förstärkare, vilket resulterar i försumbar bakgrund fluorescens i konfokal mikroskopi. Märkning av förstärkare med olika fluorescerande färgämnen underlättar samtidig igenkänning av olika mål. Detta gör det i sin tur möjligt att kartlägga infektionen i vävnader för att bättre förstå viral patogenes och replikering på encellsnivå. Koppling av denna metod med immunofluorescens kan underlätta bättre förståelse för värd-virus interaktioner, inklusive växling av värd epigenom och immunsvar vägar. På grund av känslig och specifik HCR-teknik kan detta protokoll också användas som ett diagnostiskt verktyg. Det är också viktigt att komma ihåg att tekniken lätt kan modifieras för att möjliggöra upptäckt av alla RNA, inklusive icke-kodande RNAs och RNA-virus som kan uppstå i framtiden.
Introduction
SARS-CoV-2 är ett nytt humant betacoronavirus som uppstod i slutet av 2019 och orsakade en aldrig tidigare skådad pandemi några månader senare. Eftersom viruset är nytt för vetenskapen är mycket av dess biologi och dess inverkan på värdceller fortfarande okänd. Därför är kartläggning av viruscells- och vävnadstropismen under infektion viktig om dess grundläggande biologiska egenskaper och dess effekter på värden ska förstås. Flera tekniker används för att undersöka virus-värd samspel inklusive biokemiska, biologiska och fysiska analyser. In situ hybridisering är en vanlig metod som använder märkt kompletterande DNA, RNA eller modifierade nukleinsyra sonder, som lokaliserar till specifika DNA eller RNA sekvenser i en cell eller vävnad.
En ny RNA fluorescerande in situ hybridisering (RNA-FISH) metod har utvecklats som innehåller modifieringar för att öka känsligheten genom att förstärka signal-till-brus förhållandet via en HCR1. HCR möjliggör studier av RNA-lokalisering på en encellig nivå. På grund av dess höga specificitet, känslighet och upplösning är denna metod användbar inte bara för grundläggande vetenskapsstudier, utan också för applikatoriska projekt, t.ex. diagnostik. Nyligen visades genomförbarheten av denna metod för att upptäcka SARS-CoV-2 RNA lokaliseras till ciliated celler inom helt differentierade 3D mänskliga luftvägarna epitel (HAE) kulturer2. HAE kulturer utgör ett av de mest avancerade verktygen som används för att studera virusinfektion i samband med mikromiljön "naturlig infektion"3,4.
Flera rapporter om mänskliga coronavirus (HCoV), inklusive SARS-CoV-2, belyser vikten av epigenetiska modifieringar med avseende på HCoV-infektion och patofysiologi [granskas i 5], t.ex. metyleringsmönstret för genen som kodar för det angiotensinkonverterande enzymet 2 (ACE-2) receptor6,7. Intressant nog identifierade masspektrometrisk screening flera epigenetiska faktorer som interagerar med SARS-CoV-2 proteome8. Mer specifikt binder nonstructural protein 5 (NSP5) till den epigenetiska regulatorn, histondeacetylas 2 och katalytiskt inaktiva NSP5 (C145A) interagerar med tRNA metyltransferas 1 (24). Dessutom blockeras NSP16 metyltransferasaktivitet av metyltransferashämmaren, sinefungin9. Den exakta rollen för dessa epigenetiska faktorer i COVID-19 är dock fortfarande oklar. Replikering av HCoV sker i cytoplasman i den infekterade cellen och utlöser inflammatoriska svar som regleras av epigenetiska modifieringar10.
Till exempel, HCoV-229E finjustera kärnfaktor-kappa B signalering och djupgående omprogrammera värd cellulära kromatin landskap genom att öka acetylering av H3K36 och H4K5 i vissa regioner11. Mellanöstern respiratoriska syndrom-relaterade coronavirus infektion ökar nivåerna av H3K27me3 och utarmar H3K4me3 vid promotorn regioner i delmängder av specifika interferon-känsliga gener12. Dessutom utlöser viralt RNA cellimmunsvar, vilket visas för flavivirus13,retrovirus14,15och coronavirus16. Epigenetiska markörer på viralt RNA kan spela en roll i erkännande av cellulära sensorer, som visas för m7A metylering av humant immunbristvirus-1 RNA17. Frågor kvarstår dock: Vad är effekten av SARS-CoV-2 RNA på immunsvaret, och är epigenetiska märken inblandade?
Här har en optimerad RNA-FISH-metod i kombination med immunofluorescensanalys av cellinjer och 3D-vävnader (helt differentierad HAE) beskrivits. Även om cytologiska metoder, såsom FISH och immunofluorescens, används i stor utsträckning, har denna nya generation in situ hybridiseringsmetod baserad på HCR aldrig använts för virusdetektering (förutom i en ny publikation)2. I allmänhet kräver immunostaining och FISH följande steg: permeabilisering för att möjliggöra penetration av sonder eller antikroppar; Fixering där cellmaterial är fixerat och konserverat. Detektion där antikroppar eller nukleinsyrasonder appliceras. och slutligen montering av proverna för visualisering.
Även om befintliga protokoll delar dessa allmänna funktioner varierar de markant med avseende på de parametrar som är inblandade. Här har ett optimerat, enkelt, immuno-RNA-FISH-protokoll beskrivits för att upptäcka SARS-CoV-2 RNA i HAE-kulturer och Vero-celler. Tekniken omfattar följande steg: (1) fixering av celler med paraformaldehyd; 2. Permeabilisering med tvättmedel eller metanol (MeOH). (3) Rehydrering genom en graderad serie MeOH-lösningar (endast HAE-kulturer). 4. Detektion. (5) Förstärkning med HCR-teknik för att detektera SARS-CoV-2 RNA. 6. Immunostaining. och (7) avbildning under ett konfokalt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffertberedning
- För 500 ml 2x PHEM-buffert, kombinera 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-etanesulfonsyra) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyetyl)-1- piperazinetanekotanesulfonsyra (HEPES), 3,8 g etylenglykoltetraättika (EGTA) och 0,99 g magnesiumsulfat (MgSO4). Gör volymen upp till ~400 ml med destillerat vatten (dH2O), rör om och justera pH till 7,0 med 10 M kaliumhydroxid (KOH) eller natriumhydroxid (NaOH). Gör den slutliga volymen upp till 500 ml och dela sedan upp i 50 ml alikvoter. Förvara vid -20 °C tills det behövs.
OBS: Bufferten kommer inte att vara klar förrän pH når 7,0. - Förbered en stamlösning på 37% w/v paraformaldehyd (PFA). För 50 ml, blanda 18,5 g PFA och 35 ml dH2O i en glasflaska. Placera flaskan på en magnetomrörare med uppvärmning. Tillsätt 900 μL 1 M KOH eller NaOH och rör om tills lösningen blir klar. Låt svalna och överföra till ett 50 ml koniskt centrifugeringsrör; upp till 50 ml med dH2O. Lösningen kan förvaras vid -20 °C tills det behövs.
OBS: Formaldehyd ska hanteras i en rökhuva medan du bär skyddshandskar och labbrock. - Förbered fixeringsbuffert (3,7 % PFA buffrat med PHEM). För 50 ml, kombinera 5 ml 37% PFA-lösning, 25 ml 2x PHEM-buffert och 20 ml dH2O i ett 50 ml koniskt centrifugeringsrör. Förvara vid -20 °C tills det behövs.
OBS: Efter upptining kan bufferten förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader. - Förbered PBST (0,1% interpolering-20 i 1x fosfatbuffrad saltlösning [PBS]). För 50 ml, tillsätt 50 μL 100% interpolering-20 till 50 ml 1x PBS och blanda väl.
OBS: Lösningen kan förvaras i rumstemperatur (RT). - Förbered rehydreringsbuffertar genom att kombinera MeOH/PBST i förhållanden på 3:1, 1:1 och 1:3 (slutlig volym på 100 ml av varje; se tabell 1).
OBS: MeOH är mycket giftigt och brandfarligt. Eftersom det kan skada synnerven bör den hanteras i en rökhuv och undvika öppna lågor. Eftersom blandning av MeOH och PBST genererar en exoterm reaktion, kombinera lösningarna på is. - För 1000 ml 20x SSC, kombinera 175,3 g natriumklorid (NaCl) och 88,2 g natriumcitrat i en bägare och fyll på med 800 ml dH2O. Rör om tills det är upplöst och justera pH-värdeh:n till 7,2 med NaOH. Tillsätt dH2O till en total volym på 1000 ml och autoklav eller filtrera genom ett 0,22 μm-filter i en autoklaverad flaska.
- För 50 ml 5x SSCT, kombinera 12,5 ml 20x SSC-buffert med 37,5 ml dH2O och tillsätt 50 μL 100% interpolering-20. Blanda väl.
- För 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, kombinera 25 ml 5x SSCT med 25 ml PBST.
- För 50 ml 2x SSC, kombinera 5 ml 10x SSC-buffert med 45 ml dH2O. Blanda väl.
OBS: Alla SSC-buffertar ska lagras på RT i mörker.
2. Måldefinition, sonder och förstärkare
- Använd de verktyg som finns tillgängliga på tillverkarens webbplats för att designa förstärkare och sonder. Se till att sonderna kompletterar den omvända DNA-strängen i genen SARS-CoV-2 N (kompletterande figur 1).
- Bestäm den bästa avsöknings uppsättningens storlek (en uppsättning med 20 avsökningar är tillräcklig för visualisering).
- Ställ in förstärkarna som används för RNA-detektering av mål.
- Använd HCR-förstärkaren B1 märkt med Alexa Fluor 647.
OBS: En HCR-förstärkare består av metastaserbara HCR-hårnålar h1 och h2. Multiplexerade experiment kan utformas med det här protokollet. Om detta planeras väljer du en annan HCR-förstärkare (B1, B2, ...) för varje mål-RNA som ska avbildas inom samma prov (t.ex. förstärkare B1 för mål 1, förstärkare B2 för mål 2, ...).
- Använd HCR-förstärkaren B1 märkt med Alexa Fluor 647.
3. Cellkultur och infektion med SARS-CoV-2
- Kultur Vero (ap njure epitelceller) celler i Dulbeccos modifierade Eagle medium som innehåller 5% fetala nötkreatur serum.
- Kärna ur 50 000 celler på täcken (nr 1, 15 × 15 mm) i en 12-brunnsplatta.
- Förbered helt differentierade HAE-kulturer enligtbeskrivningen 18 på genomsläppliga Transwell-skärstöd med ett membran (diameter = 6,5 mm) och kultur i bronkial epiteltillväxtmedium tills de är helt konfluenta.
- Virusinfektion
- Inokulera celler med SARS-CoV-2 vid 1000x medianvävnadskultur infektiös dos (TCID50)per ml
- Inkubera celler i 2 timmar vid 37 °C.
- Tvätta celler två gånger med PBS för att ta bort obundet virus.
- Kulturceller i 48 h.
4. SARS-CoV-2 RNA-FISH i Vero-celler odlade på täcklips
DAG 1
- Fixering och permeabiliserande celler
- Fixa infekterade celler med 3,7% w/v PFA-lösning i 1 timme på RT.
- Aspirera 3,7% PFA-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Permeabilisera cellerna med PBST-lösning i 10 minuter på RT med agitation.
- Aspirera PBST och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- upptäckt
- Aspirera 1x PBS-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 2x SSC på RT.
- Aspirera 2x SSC-lösningen och förhybridisera proverna genom att tillsätta minst 300 μL sondhybridiseringsbuffert. Täck brunnarna som innehåller cellerna och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Förbered sondlösningen genom att tillsätta 13:2 pmol sondblandning till sondhybridiseringsbufferten.
- Använd 1,2 μL av 1 μM sondlager för att förbereda 300 μL arbetslager.
- Ta bort förhybridiseringslösningen och överför täckena till en fuktad kammare.
- Pipett 30-50 μL sondlösning på parafilm för att bilda enskilda droppar.
- Inkubera proverna över natten (12-18 h) vid 37 °C.
DAG 2 - Överför täckglasen tillbaka till en 12-brunnsplatta och ta bort överflödig sondlösning genom att tvätta i 4 x 5 min med 400 μL sondtvättbuffert vid 37 °C.
OBS: Som ett alternativ till att placera 30-50 μl alikvoter på parafilm och under täcken för inkubation, tillsätt 300 μL sondlösning direkt till täcklips i en 12-brunnsplatta. Detta förfarande är enklare, men kräver betydande mängder reagenser. Värm sondens tvättbuffert till 37 °C före användning. Beräkna mängden buffert som behövs och överför den till ett koniskt centrifugeringsrör på 15 ml. - Tvätta proverna i 2 x 5 min med 5x SSCT på RT.
- Byt ut 5x SSCT-lösningen mot 1x PBS och förvara proverna vid 4 °C tills de förstärks.
- förstärkning
- Ta bort 1x PBS-lösningen från brunnarna och tillsätt minst 300 μL förstärkarbuffert till varje brunn. Inkubera proverna i 30 minuter på RT.
- Förbered varje HCR-hårnål (h1 och h2) genom att snäppa ner önskad volym i separata rör.
- För att förbereda 300 μL förstärkarlösning, använd 18 pmol av varje hårnål (t.ex. för 300 μL, använd 6 μL av en hårnålslösning på 3 μM).
- Överför hårnålslösningen till rör.
- Inkubera vid 95 °C i 90 s.
- Kyl till RT i 30 min i mörkret.
- Förbered en hårnålsblandning genom att tillsätta de snäppkylda hårnålarna "h1" och "h2" i förstärkningsbufferten.
- Placera droppar på 30-50 μL hårnålsblandning på parafilm.
- Inkubera proverna över natten (12-18 h) i mörkret på RT.
DAG 3 - Överför täckena tillbaka till 12 brunnsplattan och ta bort överflödiga hårnålar genom att tvätta i 5 x 5 min med 5x SSCT vid RT med agitation.
- Aspirera 5x SSCT-bufferten och ersätt den med 1x PBS.
OBS: Använd vid behov RNA-FISH-proverna i en standardanalys av immunofluorescens, följt av färgning av atomkärnor (se avsnitt 5).
- Kärnfärgning och glidmontering
- Aspirera 1x PBS-lösningen och ersätt den med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,2 μg/ml) i 1x PBS-lösning.
- Inkubera proverna i 10 minuter på RT i mörkret.
- Aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Placera två droppar på 10 μL vardera av monteringsmediet; se till att dropparna separeras tillräckligt för att två täckslips ska kunna placeras på en enda bild.
- Ta bort överflödig vätska genom att knacka täcken på en ren handduk och placera dem sedan i antifademonteringsmedium med cellerna vända nedåt.
- Placera de monterade proverna på en torr, plan yta i mörkret och låt dem härda.
- Efter härdning, försegla kanterna på täckena med VALAP-tätningsmedel eller nagellack för att förhindra att proverna torkar ut.
5. SARS-CoV-2 RNA-FISH i HAE-kulturer
DAG 1
- Fixering och genommträngning av HAE-kulturen
- Aspirera mediet och fixa de infekterade cellerna med 3,7% PFA-lösning i 1 timme på RT.
- Aspirera 3,7% PFA-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Byt ut 3,7% PFA-lösningen mot 1x PBS under en Transwell-insats.
- Kassera PBS och torka av proverna med 2 x 5 min tvättar med 100% MeOH prechilled till -20 °C.
- Efter den andra tvätten, byt ut bufferten mot färsk, kyld MeOH för permeabilisering under Transwell-insatsen. Förvara över natten vid -20 °C.
DAG 2
- Rehydrering
Återfukta proverna genom en graderad serie MeOH/PBST-lösningar (var och en i 5 minuter) på is: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS och 100% PBST (två gånger).- Tvätta cellerna i 5 min på is med 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Tvätta cellerna i 5 minuter på is med 5x SSCT.
- Byt ut 5x SSCT-bufferten mot 1x PBS.
- upptäckt
- Inkubera cellerna (inuti Transwell-insatsen) i 5 minuter på is med 100 μL sondhybridiseringsbuffert. Överför sedan plattan till inkubatorn i 30 min vid 37 °C (förhybridisering).
OBS: Sondhybridiseringsbufferten måste förvärmas till 37 °C före användning. Beräkna önskad volym: 100 μL behövs för en enda Transwell-insats. - Förbered sondlösningen. Eftersom 1 ml sondlösning kräver 4 pmol sond, tillsätt 4 μL 1 μM sondlagerlösning till 1 ml sondhybridiseringsbuffert och blanda väl.
OBS: För RNA-detektion, använd 100 μL sondlösning per Transwell-skär. Låt sondlösningen vara på is tills förhybridiseringssteget är. - Ta bort prehybridiseringslösningen och tillsätt sondlösningen.
- Inkubera cellerna över natten (12-18 h) vid 37 °C.
DAG 3 - Ta bort överflödig sond genom att tvätta i 4 x 15 min med 100 μL sondtvättbuffert vid 37 °C.
- Tvätta proverna i 2 x 5 min med 5x SSCT på RT.
- Byt ut 5x SSCT mot 1x PBS och förvara proverna vid 4 °C tills de förstärk.
- Inkubera cellerna (inuti Transwell-insatsen) i 5 minuter på is med 100 μL sondhybridiseringsbuffert. Överför sedan plattan till inkubatorn i 30 min vid 37 °C (förhybridisering).
- förstärkning
- Förförstärkning av proverna genom att inkubera dem med förstärkningsbuffert i 30 minuter på RT.
- Förbered varje hårnål genom att snäppa ner önskade volymer i separata rör.
- För att förbereda 500 μL förstärkningslösning, använd 30 pmol av varje hårnål (t.ex. för 500 μL, använd 10 μL 3 μM hårnålslösning).
- Överför hårnålslösningen till rören.
- Inkubera vid 95 °C i 90 s.
- Kyl till RT i 30 min i mörkret.
- Förbered hårnålslösningen genom att tillsätta alla snäppkylda hårnålar till 500 μL förstärkarbuffert vid RT.
- Ta bort förförstärkningslösningen och tillsätt hela hårnålslösningen.
- Inkubera proverna över natten (12-18 h) på RT i mörkret.
- Ta bort överflödiga hårnålar genom att tvätta med 5x SSCT på RT enligt följande: 2 x 5 min, 2 x 15 min och 1 x 5 min.
- Byt ut 5x SSCT-lösningen mot 1x PBS och förvara den vid 4 °C i högst 2-3 dagar eller fortsätt direkt till kärnfärgning.
OBS: Använd vid behov RNA-FISH-proverna i en standardanalys av immunofluorescens, följt av nukleär färgning (se avsnitt 6).
- Kärnfärgning och glidmontering
- Aspirera 1x PBS-lösningen och ersätt den med DAPI-lösning (0,2 μg/ml) i 1x PBS.
- Inkubera proverna i 10 minuter på RT i mörkret.
- Aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Placera utskärningsmembranet från Transwell-skären på 10 μL antifademonteringsmedium med cellerna uppåt och tillsätt extra monteringsmedium (5 μL) till membranet.
- Täck membranen med täcken.
- Härda de monterade proverna på en torr, plan yta i mörkret.
- Efter härdning, försegla kanterna på täckena med VALAP-tätningsmedel eller nagellack för att förhindra att proverna torkar ut.
6. Immunofluorescensanalys av Vero-celler och HAE-kulturer
OBS: Utför immunofluorescensanalysen dag 3 för cellinjer eller dag 4 för HAE-kulturer. Använd en annan metod för varje modell. Alla skillnader anges tydligt.
- Aspirera 1x PBS-lösningen från brunnarna.
- Blockera proverna genom inkubation med 1% w/v bovint serumalbumin i PBST-lösning i 30 min vid 37 °C.
- Förbered primära antikroppar genom att förbereda lämpliga utspädningar i blockeringslösningen och inkubera.
- För Vero-celler på täckskydd:
- Placera droppar (30-50 μL) antikroppslösning på parafilm i en fuktighetskammare.
- Placera täcken på antikroppsdroppar med cellerna vända nedåt.
- För HAE, byt ut blockeringsmedlet i skären mot antikroppslösning (100 μL) och inkubera proverna i en fuktad kammare.
OBS: Justera tid och temperatur för varje inkubation med primär antikropp. Typiska parametrar är 2 h vid RT eller över natten vid 4 °C.
- För Vero-celler på täckskydd:
- Tvätta proverna i 3 x 5 min med PBST.
- För celler på täcklips, överför till en 12-brunnsplatta och tillsätt PBST-lösning.
- För HAE-kulturer, byt ut antikroppslösningen mot PBST-lösning.
- Kontrollera de ljuskällor och filter som finns tillgängliga för det konfokala mikroskopet.
- Välj sekundära antikroppar enligt värdarten. Välj fluorforparametrarna (excitations- och emissionsvåglängder, spektrumbredd och excitationseffektivitet enligt tillgänglig ljuskälla).
OBS: Spektralparametrar kan modelleras med hjälp av onlineverktyg (se Materialförteckning). - Förbered lämpliga sekundära antikroppslösningar genom att späda ut dem med blockeringslösning.
- Inkubera med sekundära antikroppar (som i 6,3), men inkubera i 1 timme vid 37 °C.
- Tvätta proverna enligt steg 6.4.
- Kärnfärgning och glidmontering
- För celler på omslagslips
- Aspirera PBST och ersätt den med DAPI (0,2 μg/ml) i 1x PBS-lösning.
- Inkubera proverna i 10 minuter på RT i mörkret.
- Aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Placera täckena på droppar på 10 μL monteringsmedium med cellerna vända nedåt.
- Försegla täckena med nagellack.
- För HAE kulturer
- Aspirera 1x PBST och ersätt den med DAPI (0,2 μg/mL) i 1x PBS-lösning.
- Inkubera proverna i 10 minuter på RT i mörkret.
- Aspirera DAPI-lösningen och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.
- Placera utskurna membran på droppar på 10 μL monteringsmedium med cellerna uppåt och tillsätt extra (5 μL) monteringsmedium till membranet.
- Täck membranen med täcken.
- Försegla täckena med nagellack.
- För celler på omslagslips
7. Konfokal mikroskopi
- Definiera spåren genom att ange de fluorforer som används.
- Välj skanningsläge och hastighet.
- Justera lasereffekten, förstärkningen och förskjutningsvärdena för varje fluorfor genom att jämföra dem med respektive negativa kontroller: för virus, mockinfekterade celler; För cellulära proteiner, prover färgade med isotypkontrollantikroppar från en lämplig värd.
- Om du vill hämta en 3D-bild aktiverar du z-stackläget och anger de övre och nedre gränserna. Ange stegstorlek/tal.
OBS: För mer information om coronavirusbilder, se19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immuno-RNA-FISH protokollet som beskrivs i detta manuskript utfördes med hjälp av två cellulära system: en Vero cellinje och en 3D HAE kultur. De viktigaste stegen för båda cellulära modellerna visas i tabell 2. RNA-FISH-protokollet för visualisering av SARS-CoV-2 i HAE-kulturer innehåller steg som är typiska för vävnadsprover, dvs permeabilisering med 100% MeOH och rehydrering genom en graderad serie MeOH-PBS och 0,1% Interpoleringslösningar. Immunofluorescens utfördes efter RNA-FISH var klar. Zstack bilder förvärvades och bearbetades.
Figur 1 visar immun RNA FISH i mock-inoculated kontroll Vero celler eller celler infekterade med SARS-CoV-2. Figur 2 visar immuno RNA FISH i mock-inoculated kontroll HAE kulturer eller kulturer infekterade med SARS-CoV-2. Figur 3 visar optimering av permeabiliseringsprotokollet i Vero-celler: 70% etanol över natten vid -20 °C eller 0,1% Tween-20 i PBS i 5 min vid RT. Permeabilisering med tvättmedel resulterar i en tydlig, specifik signal för SARS-CoV-2 subgenomiskt RNA, medan användning av etanol resulterar i en suddig ofokuserad bild.
Figur 1:Immuno-RNA-FISH för att detektera SARS-CoV-2 RNA och β-tubulin i Vero-celler. Lokalisering av SARS-CoV-2 subgenomiskt RNA i (A) infekterade och (B) mock-inoculated Vero celler. Viralt RNA visualiserades av FISH (röd). β-tubulin är färgat med antikroppar mot musen β5tubulin (1:100, över natten inkubation vid 4 °C) och med Alexa fluorofor 488-konjugerade sekundära antikroppar (1:400, 1 h inkubation vid RT). Atomkärnor var färgade med DAPI (blå). Varje bild är ett enda konfokalt plan. Skalstång = 20 μm. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Humana luftvägsepitela celler infekterade med SARS-CoV-2. Lokalisering av SARS-CoV-2 subgenomic RNA i (A) infekterade och (B) mock-inoculated HAE kulturer. Viralt RNA visualiserades av FISH (röd). Ciliated celler visualiseras med antikroppar mot mus β5-tubulin (1:100, övernattning inkubation vid 4 °C) och med Alexa fluorophore 488-konjugerade sekundära antikroppar (1:400, 1 h inkubation vid RT). Atomkärnor var färgade med DAPI (blå). Varje bild representerar en maximal projektion rekonstruerad från konfokala bildstaplar (tjocklek = 3 μm). Skalstång = 10 μm. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; HAE = humant luftvägsepitetel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Optimering av permeabiliseringsförhållanden för Veroceller. Permeabilisering av Vero-celler med (A) 70% etanol och (B) med 0,1% interpolering-20 i PBS. Permeabilisering med tvättmedel resulterar i en tydlig specifik signal för SARS-CoV-2 subgenomiskt RNA, medan etanol resulterar i en suddig bild. Viralt RNA visas i rött. Atomkärnor var färgade med DAPI (blå). Varje bild representerar en maximal projektion rekonstruerad från konfokala bildstaplar (tjocklek = 3 μm). Skalstång = 10 μm. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: gensekvensen SARS-CoV-2 N (5'-3') Klicka här för att ladda ner den här filen.
| buffert | Volym metanol [ml] | Volym pbst [ml] |
| 75% MeOH/25% PBST | 75 | 25 |
| 50% MeOH/50% PBST | 50 | 50 |
| 25% MeOH/75% PBST | 25 | 75 |
| 100% PBST | 0 | 100 |
| total | 100 ml | |
Tabell 1: Beredning av gradientmetanol/PBST-lösningar för rehydrering. För att återfukta humana luftvägsepitelampprover efter inkubation över natten i absolut metanol (MeOH) är ett långsamt utbyte av miljön nödvändigt. För att göra detta måste långsamt utbyte ske genom att inkubera med buffertar där proportionerna meoh och PBST (0,1% interpolering-20 i 1x fosfatbuffrad saltlösning) ändras gradvis. Reagensvolymer som är tillräckliga för att förbereda 100 ml av varje lösning, tillräckligt för att utföra flera experiment, listas.
| modul | steg | Vero celler | HAE kulturer |
| RNA Fluorescens in situ hybridisering (RNA FISH) | fixering | (3,7% PFA) 10-40 min vid rumstemperatur eller över natten vid rumstemperatur | |
| Permeabilisering | (PBST: 0.1% Interpolering-20 i 1x PBS) 10 min vid rumstemperatur | (0,1% Interpolering-20 i 1x PBS) 2 × 5 min vid rumstemperatur | |
| (100% MeOH) över natten vid -20 °C | |||
| Rehydrering | (Graderad metanol (MeOH)/PBST) 5 x 5 min, 50% 5x SSCT/PBST tvätt 5 min, 5x SSCT tvätta 5 min på is | ||
| Identifiering (förhybridisering) | (Sondhybridiseringsbuffert) 30 min vid 37 °C, 200-300 μL | (Sondhybridiseringsbuffert) 5 min på is, sedan 30 min vid 37 °C, 100 μL | |
| upptäckt | (Sondlösning) 12-18 h vid 37 °C, 30 - 50 μL | (Sondlösning) 12-18 h vid 37 °C, 100 μL | |
| Sondtvättar | (Sondtvättbuffert) 4 x 5 min | (Sondtvättbuffert) 4 x 15 min | |
| (5 × SSCT) 2 x 5 min | |||
| Förstärkning (förförstärkning) | (Förstärkningsbuffert) 30 min vid rumstemperatur, 200-300 μL | (Förstärkningsbuffert) 30 min vid rumstemperatur, 100 μL | |
| förstärkning | (Förstärkarlösning) 12-18 timmar vid rumstemperatur på mörk plats, 30-50 μL | (Förstärkarlösning) 12-18 timmar vid rumstemperatur på mörk plats, 100 μL | |
| Förstärkare tvättar | (5x SSCT) 5 x 5 min | (5x SSCT) 2 x 5 min, 2 x 15 min, 1 x 5 min | |
| ImmunoFluorescence (IF) | blockering | (1% BSA i PBST) 30 min vid 37 °C | |
| Primär antikroppsinkubation | (Antikroppslösning av apropriatkoncentration i blockeringslösning) 2 timmar vid rumstemperatur / över natten vid 4 °C, 30-50 μL | (Antikroppslösning av apropriatkoncentration i blockeringslösning) 2 timmar vid rumstemperatur / över natten vid 4 °C, 100 μL | |
| Primär antikroppstvätt | (PBST) 3 x 5 min vid rumstemperatur | ||
| Sekundär antikroppsinkubation | (Antikroppslösning av apropriatkoncentration i blockeringslösning) 1 tim vid 37 °C, 30-50 μL | (Antikroppslösning med lämplig koncentration i blockeringslösning) 1 tim vid 37 °C, 100 μL | |
| Sekundär antikroppstvätt | (PBST) 3 x 5 min vid rumstemperatur | ||
| Kärnfärgning | (DAPI-lösning) 10 min vid rumstemperatur, sedan 2 x 5 min med 1x PBS | ||
Tabell 2: Arbetsflöde för Immuno-RNA-FISH-protokollet i cellinjer och HAE-kulturer. Immuno-RNA-FISH är genomförbart i båda cellulära modellerna, men kräver olika tillvägagångssätt. Huvudstegen visas, tillsammans med de buffertar som används (inom parentes), följt av inkubationens varaktighet och temperatur. I flera steg ges kritiska skillnader i volymen av inkubationsreagens per prov för att förenkla beräkningarna. Om volymen inte anges väljs den godtyckligt så att den helt täcker provet (vanligtvis 200 μL) med agitation. Förkortningar: FISH = fluorescens in situ hybridisering; HAE = humant luftvägsepitetel; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; BSA = bovint serumalbumin; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. MeOH = metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-RNA-FISH är en pålitlig metod för dubbelfärgning av RNA och cellulära proteiner. Här har ett modifierat immuno-RNA-FISH-protokoll beskrivits som möjliggör detektion av SARS-CoV-2 RNA och cellulära proteiner i cellinjer och HAE-kulturer. Detta protokoll kan anpassas för användning i olika cellmodeller inklusive cellmonalayers eller specifika vävnader. Metoden bygger på konceptet med en HCR som initieras av lämplig sondlokalisering. Därefter resulterar användningen av split-initiator sonder för att börja förstärka signalen med fluorescerande märkta förstärkare i minimal-till-ingen bakgrund fluorescens när de observeras med hjälp av ett konfokalt mikroskop. Förstärkare kan märkas med olika fluorescerande färgämnen och är kompatibla med olika sonder som är utformade för att känna igen olika mål; Därför kan de användas samtidigt. De procedurer som beskrivs i detta protokoll är enkla, men tidskrävande (3-4 dagar). Ändå kännetecknas resultaten av ett lågt brus-till-signal-förhållande, till skillnad från andra protokoll som använder direkt märkta fluorescerande sonder.
Veroceller och HAE-kulturer användes här. Olika protokoll krävs för celler på ett täckglas och celler i vävnadskulturen. De flesta skillnaderna uppstår vid hantering av cellerna (oavsett om det är på täckslip eller ett membran) och mängden material som används. Allmänna RNA-FISH-protokoll kräver permeabilisering med etanol- eller metanollösningar samt en inkubation över natten vid -20 °C. Viktigt, att använda tvättmedel för permeabilisering är mer fördelaktigt för immunofluorescens, förkortar proceduren med 1 dag och möjliggör effektivare planering av experimentet. Det primära tillvägagångssättet var att följa allmänna protokoll som omfattar permeabilisering med alkohol eller tvättmedel för att se om några oönskade effekter var märkbara. Viktigt, över natten permeabilisering av Vero celler med 70% etanol lösning resulterade i en ospecificerad, suddig signal; Däremot tillät permeabilisering med Tween20 tydlig och specifik visualisering av SARS-CoV-2 RNA och förkortade protokollet med 1 dag (figur 3).
Samma tillvägagångssätt testades på HAE-kulturer efter inkubation över natten med absolut metanol vid -20 °C (enligt allmänna RNA-FISH-protokoll för vävnadsprover) och 0,1% Tween20 i 5 min vid RT. Inkubation med Tween20 resulterade i en icke-specifik signal, som diskvalificerar detta reagens (data som inte visas). Inkubation över natten med metanol ledde till en mycket specifik signal utan artefakter. Viktigt, avlossning av Transwell membranet observerades eftersom metanol löste upp limet. Detta problem hanterades genom att lossa membranet och fortsätta med coverlip protokollet. Klassiska RNA-FISH-procedurer använder proteinas K för att förbättra känsligheten eftersom detta tar bort proteiner och rensar RNA-proteinkomplex, vilket gör celler genomträngande av kemikalier och färgämnen. Det nuvarande protokollet utelämnade detta steg eftersom proteinas K förhindrar proteinfärgning. Inga skillnader observerades i känsligheten hos RNA-FISH när proteinas K var frånvarande (data visades inte).
Utför immunofluorescence analyser efter RNA-FISH påverkade inte RNA signalen och resulterade i framgångsrik kombination av båda metoderna. Därför representerar det kompletta protokollet ett bekvämt sätt att visualisera RNA och dess interaktioner med proteiner på encellsnivå. Observera att fixering av celler (krävs för immuno-RNA-FISH) inte tillåter tidsfördröjningsexperiment att undersöka dynamiska händelser på encellsnivå. Visualisering av SARS-CoV-2 RNA möjliggör analys av SARS-CoV-2 replikation inom en cell och, i kombination med immunofluorescens, möjliggör studier av intracellulära SARS-CoV-2 RNA/host protein interaktioner inklusive samspel med epigenomet. Slutligen har detta protokoll en mängd olika applikationer, inklusive identifiering av SARS-CoV-2 och andra framväxande virus med encellsupplösning. Tack vare känslig och specifik HCR-teknik kan den också användas som ett diagnostiskt verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och högre utbildning för forskning om SARS-CoV-2, och av bidrag från National Science Center (beviljar UMO2017/27/B/NZ6/02488 till K.P. och UMO-2018/30/E/NZ1/00874 till A.K.-P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
