Summary
Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.
Abstract
Este manuscrito fornece um protocolo para reação em cadeia de hibridização in situ (HCR) juntamente com a imunofluorescência para visualizar a síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA na linha celular e culturas tridimensionais (3D) do epitélio das vias aéreas humanas. O método permite uma visualização altamente específica e sensível do RNA viral, contando com o HCR iniciado pela localização da sonda. As sondas de iniciação dividida ajudam a amplificar o sinal por amplificadores fluorescentes rotulados, resultando em fluorescência de fundo insignificante na microscopia confocal. A rotulagem de amplificadores com diferentes corantes fluorescentes facilita o reconhecimento simultâneo de vários alvos. Isso, por sua vez, permite o mapeamento da infecção nos tecidos para entender melhor a patogênese viral e a replicação no nível unicelular. Acoplamento deste método com imunofluorescência pode facilitar uma melhor compreensão das interações hospedeiro-vírus, incluindo a alternância das vias de epigenome hospedeiro e resposta imune. Devido à tecnologia de HCR sensível e específica, este protocolo também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Também é importante lembrar que a técnica pode ser modificada facilmente para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificadas e vírus RNA que possam surgir no futuro.
Introduction
SARS-CoV-2 é um novo betacoronavírus humano que surgiu no final de 2019, causando uma pandemia sem precedentes alguns meses depois. Como o vírus é novo na ciência, grande parte de sua biologia e seu impacto nas células hospedeiras permanecem desconhecidos. Portanto, mapear o tropismo de células vírus e tecidos durante a infecção é importante para que suas características biológicas básicas e seus efeitos sobre o hospedeiro sejam compreendidos. Várias técnicas são usadas para examinar a interação entre vírus, incluindo ensaios bioquímicos, biológicos e físicos. A hibridização in situ é um método comum que emprega dna complementar rotulado, RNA ou sondas de ácido nucleico modificado, que se localizam para sequências específicas de DNA ou RNA em uma célula ou tecido.
Foi desenvolvido um novo método de hibridização fluorescente de RNA (RNA-FISH) que incorpora modificações para aumentar a sensibilidade, amplificando a relação sinal-ruído através de um HCR1. O HCR permite o estudo da localização do RNA em um nível unicelular. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e resolução, este método é útil não apenas para estudos científicos básicos, mas também para projetos aplicativos, por exemplo, diagnósticos. Recentemente, foi demonstrada a viabilidade desse método para a detecção do RNA SARS-CoV-2 localizado em células ciliadas dentro de culturas de epitélio 3D (HAE) totalmente diferenciadas3D. As culturas hae constituem uma das ferramentas mais avançadas utilizadas para estudar a infecção viral no contexto do microambiente "infecção natural"3,4.
Vários relatórios sobre coronavírus humanos (HCoV), incluindo SARS-CoV-2, destacam a importância de modificações epigenéticas em relação à infecção por HCoV e à fisiopatologia [revisada em 5],por exemplo, o padrão de metilação do gene codificando o receptor de enzima conversor de angiotensina 2 (ACE-2)receptor 6,7. Curiosamente, a triagem em massa-espectrométrica identificou vários fatores epigenéticos que interagem com o proteome SARS-CoV-28. Mais especificamente, a proteína não estrutural 5 (NSP5) se liga ao regulador epigenético, histona deacetillase 2, e o catalítico inativo NSP5 (C145A) interage com o tRNA metiltransferase 1 (24). Além disso, a atividade de metiltransferase NSP16 é bloqueada pelo inibidor de metiltransferase, sinefungin9. No entanto, o papel exato desses fatores epigenéticos no COVID-19 ainda não está claro. A replicação do HCoV ocorre no citoplasma da célula infectada, e desencadeia respostas inflamatórias que são reguladas por modificações epigenéticas10.
Por exemplo, hCoV-229E afina a sinalização fator nuclear-kappa B e reprograma profundamente a paisagem de cromatina celular hospedeira aumentando a acetilação de H3K36 e H4K5 em certas regiões11. A infecção por coronavírus relacionada à síndrome respiratória do Oriente Médio aumenta os níveis de H3K27me3 e esgota o H3K4me3 nas regiões promotoras de subconjuntos de genes sensíveis a interferon específicos12. Além disso, o RNA viral desencadeia respostas imunes celulares, como demonstrado para os flavivírus13, retrovírus14,15e coronavírus16. Os marcadores epigenéticos no RNA viral podem desempenhar um papel no reconhecimento pelos sensores celulares, como mostrado para a metilação m7A do vírus da imunodeficiência humana-1 RNA17. No entanto, permanecem as perguntas: Qual é o impacto do RNA SARS-CoV-2 na resposta imune, e são marcas epigenéticas envolvidas?
Aqui, foi descrito um método RNA-FISH otimizado, juntamente com a análise de imunofluorescência de linhas celulares e tecidos 3D (HAE totalmente diferenciado). Embora métodos citológicos, como FISH e imunofluorescência, sejam amplamente utilizados, este método de hibridização in situ de nova geração baseado no HCR nunca foi utilizado para detecção de vírus (exceto em uma publicação recente)2. Em geral, imunostenções e PEIXEs requerem as seguintes etapas: permeabilização para permitir a penetração de sondas ou anticorpos; fixação em que o material celular é fixo e preservado; detecção em que anticorpos ou sondas de ácido nucleico são aplicadas; e, finalmente, montagem das amostras para visualização.
Embora os protocolos existentes compartilhem essas características gerais, elas variam significativamente em relação aos parâmetros envolvidos. Aqui, um protocolo otimizado, simples e imuno-RNA-FISH foi descrito para detectar RNA SARS-CoV-2 em culturas HAE e células Vero. A técnica compreende as seguintes etapas: (1) fixação de células com paraformaldeído; (2) permeabilização com detergente ou metanol (MeOH); (3) reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH (apenas culturas HAE); (4) detecção; (5) amplificação utilizando a tecnologia HCR para detectar RNA SARS-CoV-2; (6) imunostaining; e (7) imagens sob um microscópio confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação do buffer
- Para 500 mL de tampão PHEM 2x, combinar 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(2-ácido elfônico) (PIPES), 6,5 g de 4-(2-hidroxitila)-1-piper Ácido esulfônico de eazina (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético etileno glicol (EGTA) e 0,99 g de sulfato de magnésio (MgSO4). Faça o volume até ~400 mL com água destilada (dH2O), mexa e ajuste o pH para 7,0 usando hidróxido de potássio de 10 M (KOH) ou hidróxido de sódio (NaOH). Faça o volume final até 500 mL e, em seguida, divida em alíquotas de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário.
NOTA: O buffer não estará claro até que o pH atinja 7,0. - Prepare uma solução de estoque de 37% de paraformaldeído (PFA). Para 50 mL, misture 18,5 g de PFA e 35 mL de dH2O em uma garrafa de vidro. Coloque a garrafa em um agitador magnético com aquecimento. Adicione 900 μL de 1 M KOH ou NaOH, e mexa até que a solução fique clara. Deixe esfriar e transferir para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL; topo até 50 mL com dH2O. A solução pode ser armazenada a -20 °C até que seja necessária.
NOTA: O formaldeído deve ser tratado em um capuz de fumaça enquanto usa luvas de proteção e um jaleco. - Prepare o buffer de fixação (3,7% PFA tamponado com PHEM). Para 50 mL, combine 5 mL de solução PFA de 37%, 25 mL de tampão PHEM 2x e 20 mL de dH2O em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário.
NOTA: Após o descongelamento, o buffer pode ser armazenado a 4 °C por até 3 meses. - Preparar PBST (0,1% Tween-20 em 1x salina tamponada com fosfato [PBS]). Para 50 mL, adicione 50 μL de 100% Tween-20 a 50 mL de 1x PBS e misture bem.
NOTA: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT). - Prepare buffers de reidratação combinando MeOH/PBST em proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 (volume final de 100 mL de cada; ver Tabela 1).
NOTA: MeOH é muito tóxico e inflamável. Como pode danificar o nervo óptico, deve ser manuseado em um capô de fumaça evitando qualquer chama aberta. Como a mistura de MeOH e PBST gera uma reação extermática, combine as soluções no gelo. - Para 1000 mL de 20x SSC, combine 175,3 g de cloreto de sódio (NaCl) e 88,2 g de citrato de sódio em um béquer, e encha com 800 mL de dH2O. Mexa até dissolver, e ajuste o pH para 7,2 usando NaOH. Adicione dH2O a um volume total de 1000 mL, e autoclave ou filtro através de um filtro de 0,22 μm em uma garrafa autoclaved.
- Para 50 mL de 5x SSCT, combine 12,5 mL de tampão SSC de 20x com 37,5 mL de dH2O e adicione 50 μL de 100% Tween-20. Misture bem.
- Para 50 mL de 50% 5x SSCT/50% PBST, combine 25 mL de 5x SSCT com 25 mL de PBST.
- Para 50 mL de 2x SSC, misture 5 mL de tampão SSC de 10x com 45 mL de dH2O. Misture bem.
NOTA: Todos os buffers SSC devem ser armazenados em RT no escuro.
2. Definição de alvo, sondas e amplificadores
- Use as ferramentas disponíveis no site do fabricante para projetar amplificadores e sondas. Certifique-se de que as sondas são complementares à cadeia de DNA reversa do gene SARS-CoV-2 N(Figura Suplementar 1).
- Determine o melhor tamanho do conjunto da sonda (um conjunto de 20 sondas é suficiente para visualização).
- Defina os amplificadores usados para detecção de RNA de destino.
- Use o amplificador HCR B1 rotulado com Alexa Fluor 647.
NOTA: Um amplificador HCR compreende pinos de cabelo HCR metastáveis h1 e h2. Experimentos multiplexados podem ser projetados usando este protocolo. Se isso for planejado, escolha um amplificador HCR diferente (B1, B2, ...) para que cada RNA alvo seja imagedo dentro da mesma amostra (por exemplo, amplificador B1 para o alvo 1, amplificador B2 para o alvo 2, ...).
- Use o amplificador HCR B1 rotulado com Alexa Fluor 647.
3. Cultura celular e infecção com SARS-CoV-2
- Cultura Vero (células epiteliais renais de macaco) no meio de Águia modificado de Dulbecco contendo 5% de soro bovino fetal.
- Sementes 50.000 células em tampas (nº 1, 15 × 15 mm) em uma placa de 12 poços.
- Prepare culturas HAE totalmente diferenciadas como descrito18 em suportes permeáveis de inserção transwell com uma membrana (diâmetro = 6,5 mm) e cultura em meio de crescimento epitelial brônquico até totalmente confluente.
- Infecção por vírus
- Células inoculadas com SARS-CoV-2 a 1000x dose infecciosa da cultura tecidual mediana (TCID50) por mL
- Incubar células por 2 h a 37 °C.
- Lave as células duas vezes com PBS para remover o vírus não ligado.
- Células de cultura por 48 h.
4. SARS-CoV-2 RNA-FISH em células Vero cultivadas em deslizamentos de cobertura
DIA 1º
- Fixação e permeabilização de células
- Corrija células infectadas com solução PFA de 3,7% por 1 h no RT.
- Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes usando 1x PBS.
- Permeabilize as células com solução PBST por 10 min em RT com agitação.
- Aspire o PBST e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- detecção
- Aspire a solução 1x PBS e lave as células duas vezes com 2x SSC na RT.
- Aspire a solução 2x SSC e pré-hibridize as amostras adicionando pelo menos 300 μL de buffer de hibridização da sonda. Cubra os poços que contêm as células e incubar a 37 °C por 30 min.
- Prepare a solução da sonda adicionando 1,2 pmol de mistura de sonda ao buffer de hibridização da sonda.
- Use 1,2 μL do estoque da sonda de 1 μM para preparar 300 μL de estoque de trabalho.
- Remova a solução de pré-lubrificação e transfira as tampas para uma câmara umidificada.
- Pipeta 30-50 μL de solução de sonda em parafilm para formar gotículas individuais.
- Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) a 37 °C.
DIA 2. - Transfira as tampas de volta para uma placa de 12 poços e remova a solução de sonda em excesso lavando por 4 x 5 min com 400 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
NOTA: Como alternativa para colocar alíquotas de 30-50 μl no parafilme e sob deslizamentos de cobertura para incubação, adicione 300 μL de solução de sonda diretamente para tampas em uma placa de 12 poços. Este procedimento é mais simples, mas requer quantidades substanciais de reagentes. Aqueça o tampão de lavagem da sonda a 37 °C antes de usar. Calcule a quantidade de tampão necessária e transfira-a para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. - Lave amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT na RT.
- Substitua a solução SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.
- amplificação
- Remova a solução 1x PBS dos poços e adicione pelo menos 300 μL de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras por 30 minutos na RT.
- Prepare cada grampo de cabelo HCR (h1 e h2) resfriando o volume desejado em tubos separados.
- Para preparar 300 μL de solução de amplificação, utilize 18 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 300 μL, use 6 μL de uma solução de grampo de estoque de 3 μM).
- Transfira a solução do grampo de cabelo para tubos.
- Incubar a 95 °C para 90 s.
- Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.
- Prepare uma mistura de grampos adicionando os grampos "h1" e "h2" refrigerados a snap ao tampão de amplificação.
- Coloque gotas de 30-50 μL de mistura de grampo de cabelo no parafilme.
- Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no escuro em RT.
DIA 3. - Transfira as tampas de volta para a placa de 12 poços e remova o excesso de grampos lavando por 5 x 5 min com 5x SSCT no RT com agitação.
- Aspire o buffer SSCT 5x e substitua-o por 1x PBS.
NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração de núcleos (ver seção 5).
- Coloração nuclear e montagem de slides
- Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por 4′,6-diamidino-2-fenilômola (DAPI, 0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
- Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
- Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- Coloque duas gotas de 10 μL cada de meio de montagem; garantir que as gotas sejam separadas o suficiente para permitir que duas tampas sejam colocadas em um único slide.
- Remova o excesso de líquido tocando as tampas em uma toalha limpa e, em seguida, coloque-as em meio de montagem antifade com as células voltadas para baixo.
- Coloque as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro e deixe-as curar.
- Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.
5. SARS-CoV-2 RNA-FISH em culturas HAE
DIA 1º
- Fixação e permeabilização da cultura HAE
- Aspire o meio e corrija as células infectadas usando solução PFA de 3,7% por 1h no RT.
- Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- Substitua a solução PFA de 3,7% por 1x PBS sob uma inserção Transwell.
- Descarte o PBS e desidrate as amostras usando lavagens de 2 x 5 min com 100% de MeOH pré-100% pré-20 °C.
- Após a segunda lavagem, substitua o tampão por MeOH fresco e refrigerado para permeabilização sob a pastilha Transwell. Armazene durante a noite a -20 °C.
DIA 2.
- reidratação
Reidratar as amostras através de uma série classificada de soluções MeOH/PBST (cada uma por 5 min) no gelo: 75% MEOH/25% PBST, 50% MEOH/50% PBST, 25% MEOH/75% PBTS e 100% PBST (duas vezes).- Lave as células por 5 minutos no gelo com 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Lave as células por 5 minutos no gelo com 5x SSCT.
- Substitua o buffer SSCT 5x por 1x PBS.
- detecção
- Incubar as células (dentro da pastilha Transwell) por 5 minutos no gelo com 100 μL de tampão de hibridização da sonda. Em seguida, transfira a placa para incubadora por 30 min a 37 °C (pré-lubrificação).
NOTA: O tampão de hibridização da sonda deve ser pré-aquecido a 37 °C antes de usar. Calcule o volume necessário: 100 μL é necessário para uma única inserção Transwell. - Prepare a solução da sonda. Como 1 mL de solução de sonda requer 4 pmol de sonda, adicione 4 μL de solução de estoque de sonda de 1 μM a 1 mL de tampão de hibridização da sonda e misture bem.
NOTA: Para detecção de RNA, use 100 μL de solução de teste por inserção Transwell. Deixe a solução da sonda no gelo até o final da etapa de pré-lubrificação. - Remova a solução de pré-lubrificação e adicione a solução da sonda.
- Incubar as células durante a noite (12-18 h) a 37 °C.
DIA 3. - Remova o excesso de sonda lavando por 4 x 15 min com 100 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
- Lave as amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT no RT.
- Substitua o SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.
- Incubar as células (dentro da pastilha Transwell) por 5 minutos no gelo com 100 μL de tampão de hibridização da sonda. Em seguida, transfira a placa para incubadora por 30 min a 37 °C (pré-lubrificação).
- amplificação
- Preamplifice as amostras incubando-as com tampão de amplificação por 30 minutos no RT.
- Prepare cada grampo de cabelo resfriando os volumes desejados em tubos separados.
- Para preparar 500 μL de solução de amplificação, utilize 30 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 500 μL, use 10 μL de solução de grampo de estoque de 3 μM).
- Transfira a solução do grampo para os tubos.
- Incubar a 95 °C para 90 s.
- Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.
- Prepare a solução de grampo de cabelo adicionando todos os grampos refrigerados a 500 μL de tampão de amplificação no RT.
- Remova a solução de pré-amplificação e adicione a solução completa do grampo.
- Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no RT no escuro.
- Remova o excesso de grampos lavando com 5x SSCT no RT da seguinte forma: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
- Substitua a solução SSCT 5x por 1x PBS e armazene a 4 °C por não mais de 2-3 dias ou prossiga diretamente para a coloração nuclear.
NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração nuclear (ver seção 6).
- Coloração nuclear e montagem de slides
- Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por solução DAPI (0,2 μg/mL) em PBS 1x.
- Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
- Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- Coloque a membrana de corte das pastilhas Transwell em 10 μL de meio de montagem antifado com as células voltadas para cima e adicione meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
- Cubra as membranas com tampas.
- Cure as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro.
- Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.
6. Análise de imunofluorescência de células Vero e culturas HAE
NOTA: Realize o ensaio de imunofluorescência no dia 3 para linhas celulares ou dia 4 para culturas HAE. Use uma abordagem diferente para cada modelo. Todas as diferenças são indicadas claramente.
- Aspire a solução 1x PBS dos poços.
- Bloqueie as amostras por incubação com 1% de g/v de gânbio bovino em solução PBST por 30 min a 37 °C.
- Prepare os anticorpos primários preparando diluições apropriadas na solução de bloqueio e incubar.
- Para células Vero em tampas:
- Coloque gotas (30-50 μL) de solução de anticorpos em parafilme em uma câmara de umidade.
- Coloque manchas nas gotas de anticorpos com as células viradas para baixo.
- Para HAE, substitua o agente de bloqueio nas pastilhas por solução de anticorpos (100 μL) e incuba as amostras em uma câmara umidificada.
NOTA: Ajuste a hora e a temperatura de cada incubação com anticorpo primário. Os parâmetros típicos são 2 h em RT ou durante a noite a 4 °C.
- Para células Vero em tampas:
- Lave as amostras por 3 x 5 min com PBST.
- Para células em tampas, transfira para uma placa de 12 poços e adicione a solução PBST.
- Para culturas HAE, substitua a solução de anticorpos por solução PBST.
- Verifique as fontes de luz e filtros disponíveis para o microscópio confocal.
- Escolha anticorpos secundários de acordo com a espécie hospedeira. Escolha os parâmetros fluoróforos (comprimentos de onda de excitação e emissão, largura de espectro e eficiência de excitação de acordo com a fonte de luz disponível).
NOTA: Os parâmetros espectrais podem ser modelados utilizando ferramentas online (ver Tabela de Materiais). - Prepare soluções secundárias de anticorpos adequadas diluindo-as com a solução de bloqueio.
- Incubar com anticorpos secundários (como em 6,3), mas incubar por 1h a 37 °C.
- Lave as amostras como na etapa 6.4.
- Coloração nuclear e montagem de slides
- Para células em tampas
- Aspire o PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
- Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
- Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- Coloque as tampas em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para baixo.
- Sele as tampas com esmalte.
- Para culturas HAE
- Aspire o 1x PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.
- Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.
- Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
- Coloque as membranas recortados em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para cima e adicione um meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
- Cubra as membranas com tampas.
- Sele as tampas com esmalte.
- Para células em tampas
7. Microscopia confocal
- Defina as faixas especificando os fluoroforos utilizados.
- Escolha o modo de digitalização e a velocidade.
- Ajuste a potência do laser, ganho e valores de compensação para cada fluoróforo, comparando-os com os respectivos controles negativos: para vírus, células infectadas por simulação; para proteínas celulares, amostras manchadas com anticorpos de controle de isótipo de um hospedeiro apropriado.
- Para adquirir uma imagem 3D, ative o modo z-stack e defina os limites superior e inferior. Defina o tamanho/número da etapa.
NOTA: Para obter mais detalhes sobre a imagem do coronavírus, consulte19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo imuno-RNA-FISH descrito neste manuscrito foi realizado utilizando dois sistemas celulares: uma linha celular Vero e uma cultura 3D HAE. Os principais passos para ambos os modelos celulares são mostrados na Tabela 2. O protocolo RNA-FISH para visualização de SARS-CoV-2 nas culturas HAE inclui etapas típicas para amostras de tecido, ou seja, permeabilização com 100% meOH e reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH-PBS e 0,1% Tween. A imunofluorescência foi realizada após a conclusão do RNA-FISH. As imagens zstack foram adquiridas e processadas.
A Figura 1 mostra o imuno RNA FISH em células vero de controle simulado ou células infectadas com SARS-CoV-2. A Figura 2 mostra o imuno RNA FISH em culturas ou culturas hae de controle simulado e inoculadas infectadas com SARS-CoV-2. A Figura 3 mostra otimização do protocolo de permeabilização em células Vero: 70% de etanol durante a noite a -20 °C ou 0,1% Tween-20 em PBS por 5 min na RT. A permeabilização com detergente resulta em um sinal claro e específico para o RNA subgenômico SARS-CoV-2, enquanto o uso de etanol resulta em uma imagem desfocada e desfocada.
Figura 1: Immuno-RNA-FISH para detectar SARS-CoV-2 RNA e β-tubulina em células Vero. Localização de RNA subgenômica SARS-CoV-2 em (A) infectadas e (B) células vero simuladas. O RNA viral foi visualizado por FISH (vermelho). β-tubulina é manchada com anticorpos contra β5tubulina de camundongos (1:100, incubação noturna a 4 °C) e com fluoróforo alexa 488 anticorpos secundários conjugados (1:400, 1 h de incubação na RT). Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Cada imagem é um único plano confocal. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; PEIXE = fluorescência na hibridização situ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Células epiteliais das vias aéreas humanas infectadas com SARS-CoV-2. Localização do RNA subgenômico SARS-CoV-2 em (A) culturas HAE infectadas e (B) simuladas. O RNA viral foi visualizado por FISH (vermelho). As células ciliadas são visualizadas usando anticorpos contra β5-tubulina do rato (1:100, incubação noturna a 4 °C) e com anticorpos secundários conjugados alexa 488 (1:400, 1 h de incubação na RT). Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Cada imagem representa uma projeção máxima reconstruída a partir de pilhas de imagens confocal (espessura = 3 μm). Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; PEIXE = fluorescência na hibridização situ; HAE = epitélio das vias aéreas humanas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Otimização das condições de permeabilização para células Vero. Permeabilização de células Vero com (A) 70% etanol e (B) com 0,1% Tween-20 em PBS. A permeabilização com detergente resulta em um sinal específico claro para o RNA subgenômico SARS-CoV-2, enquanto o etanol resulta em uma imagem embaçada. O RNA viral é mostrado em vermelho. Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Cada imagem representa uma projeção máxima reconstruída a partir de pilhas de imagens confocal (espessura = 3 μm). Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: sequência genética SARS-CoV-2 N (5'-3') Clique aqui para baixar este arquivo.
| buffer | Volume de metanol [mL] | Volume de PBST [mL] |
| 75% MEOH/25% PBST | 75 | 25 |
| 50% meoh/50% PBST | 50 | 50 |
| 25% MEOH/75% PBST | 25 | 75 |
| 100% PBST | 0 | 100 |
| total | 100 mL | |
Tabela 1: Preparação de soluções de metanol gradiente/PBST para reidratação. Para reidratar amostras de epitélio das vias aéreas humanas após a incubação durante a noite em metanol absoluto (MeOH), é necessária uma troca lenta do ambiente. Para isso, a troca lenta deve ocorrer incubando com buffers nos quais as proporções de MeOH e PBST (0,1% Tween-20 em 1x salina tamponada com fosfato) mudam gradualmente. Volumes de reagentes suficientes para preparar 100 mL de cada solução, o suficiente para realizar vários experimentos, são listados.
| módulo | passo | Células vero | Culturas HAE |
| Fluorescência de RNA in situ (RNA FISH) | fixação | (3,7% PFA) 10-40 min em temperatura ambiente ou durante a noite à temperatura ambiente | |
| Permeabilização | (PBST: 0,1% Tween-20 em 1x PBS) 10 min à temperatura ambiente | (0,1% Tween-20 em 1x PBS) 2 × 5 min à temperatura ambiente | |
| (100% MeOH) durante a noite a -20 °C | |||
| reidratação | (Metanol classificado (MeOH)/PBST) 5 x 5 min, 50% 5x SSCT/PBST lavagem 5 min, 5x SSCT lavar 5 min no gelo | ||
| Detecção (pré-hibridização) | (Tampão de hibridização da sonda) 30 min a 37 °C, 200-300 μL | (Tampão de hibridização da sonda) 5 min no gelo, depois 30 min a 37 °C, 100 μL | |
| detecção | (Solução da sonda) 12-18 h a 37 °C, 30 - 50 μL | (Solução da sonda) 12-18 h a 37 °C, 100 μL | |
| Lavagem de sonda | (Tampão de lavagem da sonda) 4 x 5 min | (Tampão de lavagem da sonda) 4 x 15 min | |
| (5 × SSCT) 2 x 5 min | |||
| Amplificação (pré-amplificação) | (Tampão de amplificação) 30 min à temperatura ambiente, 200-300 μL | (Tampão de amplificação) 30 min à temperatura ambiente, 100 μL | |
| amplificação | (Solução de amplificadores) 12-18 h à temperatura ambiente em local escuro, 30-50 μL | (Solução de amplificadores) 12-18 h à temperatura ambiente em local escuro, 100 μL | |
| Lavagem de amplificadores | (5x SSCT) 5 x 5 min | (5x SSCT) 2 x 5 min, 2 x 15 min, 1 x 5 min | |
| Imunofluorescência (IF) | Bloqueio | (1% BSA em PBST) 30 min a 37 °C | |
| Incubação primária de anticorpos | (Solução de anticorpos de concentração apropriada na solução de bloqueio) 2 h à temperatura ambiente / durante a noite a 4 °C, 30-50 μL | (Solução de anticorpos de concentração apropriada na solução de bloqueio) 2 h à temperatura ambiente / durante a noite a 4 °C, 100 μL | |
| Lavagem primária de anticorpos | (PBST) 3 x 5 min em temperatura ambiente | ||
| Incubação de anticorpos secundários | (Solução de anticorpos de concentração apropriada na solução de bloqueio) 1 h a 37 °C, 30-50 μL | (Solução de anticorpos de concentração adequada na solução de bloqueio) 1 h a 37 °C, 100 μL | |
| Lavagem de anticorpos secundários | (PBST) 3 x 5 min em temperatura ambiente | ||
| Coloração nuclear | (solução DAPI) 10 min em temperatura ambiente, depois 2 x 5 min com 1x PBS | ||
Tabela 2: Fluxo de trabalho do protocolo Imuno-RNA-FISH em linhas celulares e culturas HAE. O imuno-RNA-FISH é viável em ambos os modelos celulares, mas requer abordagens diferentes. Os principais passos são mostrados, juntamente com os tampões utilizados (entre parênteses), seguidos pela duração e temperatura da incubação. Em várias etapas, são dadas diferenças críticas no volume de reagente de incubação por amostra para simplificar os cálculos. Se o volume não for especificado, ele será selecionado arbitrariamente para que cubra completamente a amostra (geralmente 200 μL) com agitação. Abreviaturas: PEIXE = fluorescência na hibridização in situ; HAE = epitélio das vias aéreas humanas; PFA = paraformaldeído; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; BSA = albumina de soro bovino; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; Meoh = metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O Imuno-RNA-FISH é um método confiável para coloração dupla de RNA e proteínas celulares. Aqui, foi descrito um protocolo modificado de imuno-RNA-FISH que permite a detecção de RNA SARS-CoV-2 e proteínas celulares em linhas celulares e culturas HAE. Este protocolo pode ser adaptado para uso em diferentes modelos celulares, incluindo monocamadas celulares ou tecidos específicos. O método se baseia no conceito de um HCR iniciado pela localização adequada da sonda. Em seguida, o uso de sondas de iniciação dividida para iniciar a amplificação do sinal por amplificadores fluorescentes rotulados resulta em fluorescência de fundo mínima a nenhuma quando observado usando um microscópio confocal. Os amplificadores podem ser rotulados com diferentes corantes fluorescentes e são compatíveis com diferentes sondas projetadas para reconhecer vários alvos; portanto, eles podem ser usados simultaneamente. Os procedimentos descritos neste protocolo são simples, mas demorados (3-4 dias). No entanto, os resultados são caracterizados por uma baixa relação ruído-sinal, ao contrário de outros protocolos que usam sondas fluorescentes diretamente rotuladas.
Células vero e culturas HAE foram usadas aqui. Diferentes protocolos são necessários para células em um deslizamento de cobertura e células na cultura tecidual. A maioria das diferenças são encontradas ao manusear as células (seja em deslizamento de tampa ou membrana) e nas quantidades de material utilizado. Os protocolos gerais de RNA-FISH exigem permeabilização usando soluções de etanol ou metanol, bem como uma incubação noturna a -20 °C. É importante ressaltar que o uso de detergente para permeabilização é mais benéfico para a imunofluorescência, encurta o procedimento em 1 dia e permite um planejamento mais eficiente do experimento. A abordagem principal foi seguir protocolos gerais envolvendo permeabilização com álcool ou detergente para ver se algum efeito indesejável era perceptível. É importante ressaltar que a permeabilização noturna das células Vero com solução de 70% de etanol resultou em um sinal inespecífico e desfocado; em contrapartida, a permeabilização com o Tween20 permitiu visualização clara e específica do RNA SARS-CoV-2 e encurtou o protocolo em 1 dia(Figura 3).
A mesma abordagem foi testada nas culturas hae após a incubação noturna com metanol absoluto a -20 °C (de acordo com protocolos gerais de RNA-FISH para amostras de tecido) e 0,1% Tween20 por 5 min na RT. A incubação com Tween20 resultou em um sinal não específico, o que desqualifica esse reagente (dados não mostrados). A incubação noturna com metanol levou a um sinal altamente específico sem artefatos. É importante ressaltar que o descolamento da membrana Transwell foi observado porque o metanol dissolveu a cola. Este problema foi tratado pela desvinculação da membrana e procedendo com o protocolo de deslizamento de tampas. Os procedimentos clássicos de RNA-FISH usam proteinase K para melhorar a sensibilidade, pois isso remove proteínas e limpa complexos de proteínas RNA, tornando as células penetráveis por produtos químicos e corantes. O presente protocolo omitiu esta etapa, pois a proteinase K previne a coloração de proteínas. Não foram observadas diferenças na sensibilidade do RNA-FISH quando a proteinase K estava ausente (dados não apresentados).
A realização de ensaios de imunofluorescência após o RNA-FISH não afetou o sinal de RNA e resultou em uma combinação bem sucedida de ambos os métodos. Portanto, o protocolo completo representa uma maneira conveniente de visualizar o RNA e suas interações com proteínas no nível unicelular. Note-se que a fixação de células (necessárias para imuno-RNA-FISH) não permite que experimentos com lapso de tempo examinem eventos dinâmicos no nível de célula única. A visualização do RNA SARS-CoV-2 permite a análise da replicação SARS-CoV-2 dentro de uma célula e, quando juntamente com a imunofluorescência, permite o estudo de interações proteicas intracelulares SARS-CoV-2/hospedeiro, incluindo interação com o epigenome. Finalmente, este protocolo tem uma grande variedade de aplicações, incluindo a detecção de SARS-CoV-2 e outros vírus emergentes em resolução unicelular. Graças à tecnologia HCR sensível e específica, também pode ser usada como ferramenta de diagnóstico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior para pesquisa sobre SARS-CoV-2, e por bolsas do Centro Nacional de Ciência (bolsas UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
