Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação cirúrgica de uma janela óptica permanentemente habitante para o tórax murino, que permite imagens intravitais de alta resolução do pulmão. A permanência da janela torna-a adequada ao estudo de processos celulares dinâmicos no pulmão, especialmente aqueles que estão evoluindo lentamente, como a progressão metastática das células tumorais disseminadas.
Abstract
A metástase, responsável por ~90% da mortalidade relacionada ao câncer, envolve a disseminação sistêmica de células cancerígenas de tumores primários para locais secundários, como osso, cérebro e pulmão. Embora amplamente estudados, os detalhes mecanicistas desse processo permanecem mal compreendidos. Enquanto as modalidades de imagem comum, incluindo tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM), oferecem diferentes graus de visualização bruta, cada uma carece da resolução temporal e espacial necessária para detectar a dinâmica das células tumorais individuais. Para lidar com isso, inúmeras técnicas foram descritas para imagens intravitais de locais metastáticos comuns. Desses locais, o pulmão tem se mostrado especialmente desafiador para o acesso a imagens intravitais devido à sua delicadeza e papel crítico na manutenção da vida. Embora várias abordagens tenham sido descritas anteriormente para imagens intravitais unicelulares do pulmão intacto, todas envolvem procedimentos altamente invasivos e terminais, limitando a duração máxima possível de imagem a 6-12 h. Descrita aqui é uma técnica aprimorada para a implantação permanente de uma janela óptica torácica minimamente invasiva para imagem de alta resolução do pulmão (WHRIL). Combinada com uma abordagem adaptada à microcartografia, a inovadora janela óptica facilita a imagem intravital serial do pulmão intacto em resolução unicelular em várias sessões de imagem e abrangendo várias semanas. Dada a duração sem precedentes do tempo sobre o qual os dados de imagem podem ser coletados, o WHRIL pode facilitar a descoberta acelerada dos mecanismos dinâmicos subjacentes à progressão metastática e numerosos processos biológicos adicionais dentro do pulmão.
Introduction
Responsável por ~90% das mortes, a metástase é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer1. Entre os principais locais de metástase clinicamente observada (osso, fígado, pulmão, cérebro)2, o pulmão tem se mostrado particularmente desafiador para a imagem in vivo via microscopia intravital. Isso porque o pulmão é um órgão delicado em movimento perpétuo. O movimento contínuo dos pulmões, ainda mais agravado pelo movimento cardíaco intratorácico, representa uma barreira substancial para a imagem precisa. Portanto, devido à sua relativa inacessibilidade às modalidades de imagem óptica intravital de alta resolução, o crescimento do câncer no pulmão tem sido muitas vezes considerado um processo oculto3.
No cenário clínico, tecnologias de imagem como tomografia computadorizada (TC), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM) permitem a visualização profunda em órgãos vitais intactos, como o pulmão4. No entanto, embora essas modalidades proporcionem excelentes visões do órgão bruto (muitas vezes até mesmo revelando patologia antes do início dos sintomas clínicos), elas são de resolução inadequada para detectar células tumorais disseminadas individualmente à medida que avançam através dos estágios iniciais da metástase. Consequentemente, quando as modalidades supracitadas fornecem qualquer indicação de metástase para o pulmão, os focos metastáticos já estão bem estabelecidos e proliferando. Uma vez que o microambiente tumoral desempenha um papel fundamental na progressão do câncer e na formação de metástase5,6, há grande interesse em investigar os primeiros passos da semeadura metastática in vivo. Esse interesse é ainda mais alimentado pelo aumento da valorização que as células cancerígenas disseminam antes mesmo do tumor primário ser detectado7,8 e as evidências crescentes de que elas sobrevivem como células únicas e em um estado adormecido por anos a décadas antes de crescer em macro-metástase9.
Anteriormente, a imagem do pulmão em resolução unicelular envolveu necessariamente preparações ex vivo ou explant10,11,12,13, limitando análises a pontos de tempo único. Embora essas preparações forneçam informações úteis, elas não fornecem qualquer visão sobre a dinâmica das células tumorais dentro do órgão conectadas a um sistema circulatório intacto.
Os recentes avanços tecnológicos na imagem permitiram a visualização intravital do pulmão intacto em resolução unicelular durante períodos de até 12 h14,15,16. Isso foi realizado em um modelo murino utilizando um protocolo que envolvia ventilação mecânica, ressecção da caixa torácica e imobilização pulmonar assistida a vácuo. No entanto, apesar de oferecer as primeiras imagens de resolução celular única do pulmão fisiologicamente intacto, a técnica é altamente invasiva e terminal, impedindo assim mais sessões de imagem além do procedimento de índice. Essa limitação, portanto, impede sua aplicação ao estudo de passos metastáticos que levam mais de 12h, como dormência e reinsício do crescimento14,15,16. Além disso, os padrões de comportamento celular observados usando essa abordagem de imagem devem ser interpretados com cautela, uma vez que os diferenciais de pressão induzidos pelo vácuo provavelmente causarão desvios no fluxo sanguíneo.
Para superar essas limitações, foi desenvolvida recentemente uma Janela minimamente invasiva para Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL), facilitando a imagem serial durante um longo período de dias a semanas, sem a necessidade de ventilação mecânica17. A técnica envolve a criação de uma "caixa torácica transparente" com cavidade torácica selada para a preservação da função pulmonar normal. O procedimento é bem tolerado, permitindo que o mouse se recupere sem alteração significativa na atividade e função da linha de base. Para localização confiável exatamente da mesma região pulmonar em cada sessão de imagem respectiva, uma técnica conhecida como microcartografia foi aplicada nesta janela18. Através desta janela, foi possível capturar imagens de células quando elas chegam ao leito vascular do pulmão, cruzam o endotélio, passam por divisão celular e crescem em micrometástas.
Aqui, o estudo apresenta uma descrição detalhada de um protocolo cirúrgico aprimorado para implantação do WHRIL, que simplifica a cirurgia ao mesmo tempo em que aumenta sua reprodutibilidade e qualidade. Embora este protocolo tenha sido projetado para permitir a investigação dos processos dinâmicos subjacentes à metástase, a técnica pode ser aplicada alternativamente a investigações de inúmeros processos de biologia pulmonar e patologia.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo aprovação prévia pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.
1. Passivation of windows
- Enxágüe as molduras ópticas das janelas(Figura Suplementar 2) com uma solução de 1% (w/v) de detergente enzimaticamente ativo.
- Dentro de um frasco de vidro, submerse as janelas ópticas em 5% (w/v) solução de hidróxido de sódio por 30 min a 70 °C.
- Remova e lave as molduras da janela com água desionizada.
- Dentro de um novo frasco de vidro, submerga as molduras ópticas da janela em 7% (w/v) solução de ácido cítrico por 10 min a 55 °C.
- Novamente, remova e lave as molduras da janela com água desionizada.
- Repetir o passo 1.2; em seguida, remova e lave as molduras das janelas com água deionizada.
2. Preparação para cirurgia
- Faça a cirurgia em um capô ou armário de fluxo laminar. Para evitar a contaminação do campo operacional, garanta áreas distintas e separadas para preparação, cirurgia e recuperação, respectivamente.
- Antes da cirurgia, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave. Se os procedimentos subsequentes forem planejados, ressarem os instrumentos usando um esterilizador de contas quentes. Para este procedimento cirúrgico, é utilizada uma técnica somente para pontas.
- Potência no conta-cirurgia aquecida e esterilizador de contas.
- Anestesiar o rato com 5% de isoflurane na câmara de anestesia.
- Para remover o cabelo, aplique generosamente creme depilatório no local de incisão do peito superior esquerdo. Depois de não mais de 20 anos, limpe firmemente o cabelo e o creme depilatório usando papel de tecido umedecido. Repita conforme necessário para remover todos os cabelos do local cirúrgico.
- Usando sutura de seda 2-0, amarre um nó na base de um cateter de 22 G, deixando caudas de 2 polegadas de comprimento (ver Figura 1A).
3. Cirurgia na janela pulmonar
- Lave as mãos usando sabão antisséptico.
- Antes de cada nova cirurgia, não faça novas luvas estéreis.
- Para evitar a secagem da córnea e danos aos olhos do camundongo, aplique pomada oftalmica em ambos os olhos.
- Diluir 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina em 90 μL de PBS estéril e, em seguida, injetar subcutânea para garantir a analgesia pré-operatória.
- Entubar o rato com o cateter de seda amarrado 22 G15. Usando uma lâmpada de inflação, confirme a intubação bem sucedida ao notar o aumento bilateral do peito sobre o aperto da lâmpada.
- Fixar o cateter de intubação amarrando a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato (ver Figura 1B).
- Coloque o mouse sobre o suporte cirúrgico aquecido e posicione-o no decúbito lateral direito para expor o tórax esquerdo.
- Conecte o ventilador ao cateter de intubação.
- Certifique-se de ventilação controlada e estável no ventilador e, em seguida, reduza o isofluorano para 3%. No início do procedimento e periodicamente durante toda a duração do procedimento, avalie a adequação da anestesia realizando um teste de beliscão do dedo do pé.
- Utilizando fita adesiva, cranialmente e caudally fixar os membros dianteiros e traseiros, respectivamente, ao estágio cirúrgico aquecido. Coloque outro pedaço de fita ao longo do comprimento das costas do mouse para maximizar a exposição ao campo cirúrgico (ver Figura 1C).
- Abra todos os instrumentos cirúrgicos sob o capô para a preservação da esterilidade.
- Esterilize o local cirúrgico por uma generosa aplicação de antisséptico na pele do rato.
- Usando fórceps, levante a pele e faça uma incisão circular de ~10 mm, ~7 mm à esquerda do esterno e ~7 mm superior à margem subcostal(Figura 1D).
- Identifique cuidadosamente quaisquer naves principais. Se a divisão dos vasos for necessária, cauterize em ambas as extremidades com a caneta eletrocauteria para manter a hemostase.
- Extireta o tecido mole sobrevoando as costelas.
- Eleve acostela 6ou 7 com fórceps. Utilizando uma única lâmina da tesoura de micro-dissecação contundente, o lado arredondado em direção ao pulmão, perfura cuidadosamente o músculo intercostal entre ascostelas 6 e 7 para entrar no espaço intratorácico(Figura 1E).
- Descarga delicadamente de recipiente de ar comprimido no defeito para colapsar o pulmão e separá-lo da parede torácica. Dispare o ar comprimido em rajadas curtas para evitar lesões pulmonares iatrogênicas.
- Coloque o soco da biópsia sobre a ferramenta de corte(Figura Suplementar 1) e manoque cuidadosamente a base da ferramenta de corte através da incisão intercostal(Figura 1F).
- Oriente a base da ferramenta de corte de tal forma que seja paralela à parede do peito. Perfurar um orifício circular de 5 mm através da caixa torácica(Figura 1G).
NOTA: Certifique-se de que o tecido pulmonar exposto é rosa, sem sinais de danos. - Usando a sutura de seda 5-0, crie um ponto de corda de bolsa ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando com as costelas(Figura 1H).
- Posicione a estrutura da janela de tal forma que as bordas do defeito circular se alinhem dentro da ranhura da janela (ver Figura 1I).
- Bloqueie firmemente a janela implantada amarrando firmemente a sutura de seda 5-0.
- Carregue 100 μL de adesivo de gel cianoacrilato na seringa de 1 mL.
- Seque o pulmão aplicando um fluxo suave de ar comprimido para ~10-20 s(Figura 1J).
- Usando fórceps para segurar a estrutura da janela pela borda externa, levante suavemente para garantir a separação do pulmão da superfície inferior da estrutura da janela.
- Dispense uma fina camada de adesivo de cianoacrilato ao longo da superfície inferior do quadro óptico da janela(Figura 1K).
- Aumente a pressão final positiva (PEEP) no ventilador para inflar o pulmão.
- Segurando por 10-20 s, aplique pressão suave, mas firme para fixar a estrutura óptica da janela no tecido pulmonar(Figura 1L).
- Dispense uma gota de 5 mm do adesivo de gel cianoacrilato restante em um deslizamento de tampa retangular.
- Pegue a tampa de 5 mm usando captadores de vácuo. Mergulhe a superfície inferior da tampa no adesivo e, em seguida, raspe o excesso de adesivo três vezes contra o lado da mancha retangular, de talão de talão muito fina(Figura 1M).
- Posicione cuidadosamente a mancha de cobertura para caber dentro do recesso no centro da estrutura óptica da janela e é mantida acima do tecido pulmonar em um ângulo. Fixar brevemente o ventilador para gerar pressão positiva, hiper-inflando o pulmão. Usando um movimento rotativo, oriente a mancha de cobertura paralela ao tecido pulmonar para criar uma apposição direta entre a superfície do pulmão e a superfície inferior da mancha de cobertura. Mantenha a pressão suave, permitindo que o adesivo de cianoacrilato seja definido (~25 s).
- Use os fórceps para separar o deslizamento das captações de vácuo(Figura 1N).
- Usando sutura de seda 5-0, crie novamente um ponto de corda de bolsa, desta vez <1 mm circunferencialmente a partir da borda cortada da incisão da pele. Coloque qualquer excesso de pele sob a borda externa da moldura da janela antes de amarrá-la firmemente com nós de bloqueio.
- Para garantir um vedação a ar-apertado entre o deslizamento de tampa e a moldura da janela, dispense uma pequena quantidade de cianoacrilato líquido na interface metal-vidro (ver Figura 1O).
- Coloque uma agulha estéril em uma seringa de insulina de 1 mL. Insira a agulha abaixo do processo xifoide, avançando em direção ao ombro esquerdo, entrando na cavidade torácica através do diafragma. Puxe suavemente para trás na seringa para remover qualquer ar residual da cavidade torácica (ver Figura 1P).
- Remova a fita do mouse.
- Desligue isoflurane.
- Continue a ventilação com 100% de oxigênio até que o mouse pareça pronto para acordar.
- Corte cuidadosamente a sutura de seda 2-0 ao redor do focinho do rato e extuba o rato.
- Transfira o mouse para uma gaiola limpa e monitore até que esteja totalmente recuperado. Eutanize o rato se houver sinais de dificuldade em respirar.
- Forneça analgesia pós-operatória injetando subcutâneamente 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluída em 90 μL de solução tamponada fosfato estéril (PBS).
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Representative Results
As etapas do procedimento cirúrgico descrito neste protocolo são resumidas e ilustradas na Figura 1. Resumidamente, antes da cirurgia, os camundongos são anestesiados e o cabelo sobre o tórax esquerdo é removido. Os camundongos são entubados e mecanicamente ventilados para permitir a sobrevivência após o rompimento da cavidade torácica. O tecido mole que sobrevoa as costelas é extirpado, e um pequeno defeito circular é criado, abrangendo ascostelas 6 e 7. O quadro óptico da janela é inserido no defeito e seu lado inferior (fora da abertura clara) é aderido ao tecido pulmonar. A estrutura da janela é então fixada com uma combinação de suturas e adesivos, ressumatando a cavidade torácica e permitindo a retomada da respiração normal após a extubação. Quando implantado com sucesso, o pulmão aderirá à janela óptica (que é incorporada como parte da parede torácica), com gradientes de pressão intratorácica preservados. Isso permite uma sobrevivência confortável do mouse, permitindo imagens diárias até o subsídio de protocolo (2 semanas). A imagem intravital pode então ser realizada através da janela, como descrito anteriormente para outras janelas15,19,20.
Para visualização de vários tipos de células, estruturas biológicas ou estados funcionais celulares, o procedimento aqui apresentado pode ser realizado em uma ampla gama de camundongos que foram geneticamente manipulados para expressar proteínas fluorescentes21 ou injetados com corantes22. A natureza permanente da janela torna-a compatível com técnicas de relocalização de campos de visão como fotoconversão23,24 ou microcartografia17,18. A microcartografia é uma técnica de triangulação baseada no uso de transformações computadas de coordenadas de marcas fiduciárias fixas entre sessões de imagem, a fim de prever e reestocar uma região de interesse. Na janela criada como descrito acima, essas marcas fiduciárias são arranhões leves gravados na estrutura da janela(Figura Suplementar 2) que são facilmente identificáveis sob o microscópio. Isso torna possível encontrar o mesmo campo de visão várias vezes, mesmo em tecido não marcado. A Figura 2 demonstra o resultado dessas técnicas em um camundongo onde a vasculatura pulmonar foi rotulada pela injeção de um dextran de alto peso molecular rotulado por corante (tetrametilrhodamina 155 kD dextran) e a mesma micro-vasculatura re-localizada ao longo de 3 dias.
Este dextran mostrou-se extremamente útil na avaliação de aberturas vasculares transitórias que são induzidas durante períodos de intravasão de células tumorais25,26,27. De fato, tem-se demonstrado que, nos tumores primários de mama, este dextran de alto peso molecular é efetivamente sequestrado à vasculatura e não vaza para o interstício25. Isso contrasta com os dextrans de menor peso molecular (como 10 kD ou 70 kD), que têm sido mostrados para vazar de vasos neoangiogênicos passivamente28,29. Enquanto isso, a vasculatura pulmonar saudável tem sido observada como mais resistente ao vazamento, com dextrans >10 kD apenas escapando para o interstício após insulto ao órgão, como na exposição a exossomos30 ou vírus31. Uma variedade de agentes de contraste também existem para medir outros parâmetros no pulmão (por exemplo, marcadores nucleares, indicadores vivos/mortos, repórteres de estresse oxidativo, rastreadores de velocidade de fluxo sanguíneo) além da permeabilidade vascular. Um excelente recurso catalogando-os pode ser encontrado no protocolo por Ueki et al.22.
O WHRIL é uma técnica muito adequada para investigar a dinâmica do fluxo sanguíneo no pulmão. Isso pode ser feito de várias maneiras. Primeiro, quando imagens usando taxas de quadros relativamente lentas (~1-10 quadros por segundo, fps) as velocidades de fluxo sanguíneo podem ser determinadas pelas sombras que os eritrócitos não rotulados fazem ao fluir em vasos maiores. Em fps baixos, essas sombras formam linhas cujo ângulo em relação ao vaso pode ser usado para calcular as taxas de fluxo eritrócito32 (Figura 2, linhas amarelas). Em segundo lugar, as sombras também podem ser rastreadas em microscópios fps baixos, alinhando os vasos com o eixo de varredura rápida do microscópio e adquirindo kymógrafos usando a varredura rápida da linha33,34,35. Finalmente, quando imagens em altas taxas de quadros (>10 fps) em um microscópio capaz de integrar o sinal ao longo do tempo (por exemplo, um disco giratório confocal equipado com um detector de dispositivos acoplados por carga (CCD), partículas individuais podem ser rastreadasdiretamente 16,17. Nesta situação, objetos estacionários aparecem como pontos brilhantes, e objetos fluindo traçam faixas através da circulação. As velocidades das células podem ser quantificadas medindo o comprimento das faixas e dividindo-se pelo tempo de aquisição do quadro. Um exemplo disso é dado na Figura 3 e no Filme Suplementar 1,onde microesferas fluorescentes de 2 μm foram injetadas intravascularmente no camundongo antes da imagem.
Com a capacidade de retornar repetida e consistentemente ao mesmo campo de visão, a visualização de processos que evoluem ao longo de vários dias agora é possível. Como demonstração desta aplicação, o WHRIL foi utilizado para visualizar a progressão metastática das células cancerígenas de mama dentro dos pulmões17,21: ou seja, para rastrear ao longo do tempo o destino das células tumorais individuais que chegam à vasculatura pulmonar. Este conceito é retratado na Figura 4A,onde uma única célula tumoral disseminada é visualizada logo após a hospedagem em um segmento de micro-vasculatura pulmonar. Voltar a esse mesmo local nos dias seguintes revela o destino da célula tumoral (por exemplo, recirculação, extravasação, etc.). Aplicado à investigação das etapas culminantes da progressão metastática no pulmão, foi possível narrar visualmente processos dinâmicos, incluindo chegada de células tumorais(Figura 4B),extravasação(Figura 4C),e proliferação para formar macro-metástase(Figura 4D).
Figura 1: Resumo da cirurgia para implantação da Janela de Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A microcartografia permite a relocalização de posições fixas dentro da janela óptica. Imagens intravitais multifotonas de uma única região do pulmão sob o deslizamento de cobertura opticamente transparente mostram microvasculatura realocada ao longo de 3 dias consecutivos usando microcartografia. Setas amarelas indicam um ponto de ramificação claramente definível de um único navio identificado a cada dia consecutivo. Linhas amarelas destacam sombras que os eritrócitos não rotulados fazem ao fluir em vasos maiores. O ângulo dessas linhas em relação ao vaso pode ser usado para calcular as taxas de fluxo de eritrócitos. Vermelho = tdTomato rotulado células endoteliais e 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran dextran rotulado soro sanguíneo, Verde = GFP células tumorais rotuladas, Azul = segunda geração harmônica. Barra de escala = 15 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização da taxa de fluxo sanguíneo. As taxas de fluxo sanguíneo podem ser visualizadas injetando microesferas fluorescentes de 2 μm de diâmetro retro-orbitalmente e visualizando sua passagem pelos vasos sanguíneos. Quando imagens em um microscópio capaz de integrar o sinal ao longo do tempo (por exemplo, um disco giratório confocal equipado com um detector CCD), microesferas estacionárias aparecem como pontos brilhantes (setas) e esferas fluindo traçam faixas através da circulação (linhas com suporte). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O WHRIL pode capturar cada passo da cascata metastática dentro do pulmão, visualizando diretamente o destino das células tumorais disseminadas. (A) O acompanhamento do destino das células tumorais disseminadas (verde) é alcançável com imagens seriais, ao longo de vários dias, através do WHRIL. No primeiro dia, observa-se que uma célula tumoral chegou e se alojou na vasculatura pulmonar. No dia 2 e dia 3 a célula não está mais presente na vasculatura pulmonar, tendo recirculado ou morrido. Barra de escala = 15 μm. (B-D) Visualização de cada um dos estágios da metástase celular tumoral no pulmão. (B) Uma célula tumoral disseminada intravascular (verde) alojada na vasculatura pulmonar após a chegada. (C) Célula tumoral disseminada (verde) após extravasação no parenchyma pulmonar. (D) Células tumorais que proliferaram e cresceram em micro-metástases. Vermelho = tdTomato rotulado células endoteliais e 155 kDa Tetramethylrhodamine dextran dextran rotulado soro sanguíneo, Verde = GFP células tumorais rotuladas, Azul = segunda geração harmônica. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme suplementar 1: Vídeo correspondente à Figura 3 mostrando a vasculatura pulmonar com microesferas circulantes de 2 μm. Clique aqui para baixar este Filme.
Figura suplementar 1: Desenhos de design mecânico para aferramenta de corte de aço sem manchas usada para guiar o soco da biópsia de 5 mm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Desenhos de design mecânico para a estrutura da janela de aço inoxidável. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 3: Desenhos de desenho mecânico para a ferramenta do porta-janelas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Em locais de metástase distante, como o pulmão, imagens ópticas de alta resolução fornecem uma visão da dinâmica elaborada da metástase celular tumoral. Ao permitir a visualização in vivo de células cancerígenas únicas e suas interações com o tecido hospedeiro, a imagem intravital de alta resolução tem se mostrado fundamental para entender os mecanismos subjacentes à metástase.
Descrito aqui é um protocolo cirúrgico melhorado para a implantação torácica permanente de uma janela óptica projetada para permitir imagens seriais do pulmão murino através de microscopia multifotícula de alta resolução. A janela criada usando este protocolo é bem tolerada e, dada a sua capacidade de ressarar com sucesso a cavidade torácica, é capaz de manter os gradientes de pressão intratorácica necessários para ventilação espontânea (ao contrário de qualquer outra janela previamente descrita para imagem do pulmão murino14,15,16,36,37 ). Isso permite que o rato desperte da anestesia, respire independentemente e sobreviva confortavelmente com a caixa torácica transparente por um longo período de tempo que abrange várias semanas.
Usando essa janela, foi possível visualizar, com resolução unicelular, todas as etapas da metástase, incluindo chegada, extravasão e crescimento em micrometastases.
Embora o protocolo exija alguma proficiência técnica, com prática e atenção cuidadosa a várias etapas fundamentais, o procedimento pode ser realizado com uma alta taxa de sucesso. Primeiro, ao remover o cabelo antes da cirurgia, é fundamental proteger a pele do camundongo removendo o creme depilatório com um tecido umedecido após não mais de 20 s de contato. Durante a cirurgia, deve-se prestar extrema cautela para evitar o corte de vasos. O sangramento excessivo, mais comumente encontrado devido à divisão das artérias mamárias braquiais ou internas durante a remoção da almofada de gordura mamária, pode obscurecer a visualização no campo cirúrgico ou levar à morte através da exsanguinação. Recentemente descrito neste protocolo está a utilização de uma ferramenta de perfuração e corte de biópsia(Figura Suplementar 1),que apressa consideravelmente e simplifica a criação do defeito circular através da caixa torácica, e uma ferramenta de porta-janelas facilitando a implantação. A implementação desses avanços melhora significativamente a taxa de sucesso do procedimento e reduz o nível necessário de habilidade cirúrgica prévia. Laboratórios individuais podem usar os desenhos nas figuras suplementares para fabricar essas ferramentas com lojas de máquinas interna ou comercial. Uma busca na internet por "sites de licitação de oficinas de máquinas" produzirá vários aplicativos online que ajudarão a encontrar lojas de máquinas comerciais locais.
Finalmente, é crucial garantir que o tecido pulmonar permaneça seco antes da aplicação do adesivo. A armadilha mais comum resultante do apego de deslizamento de cobertura mal sucedido é a falha em garantir a remoção completa da umidade da superfície pulmonar antes da aposição com a estrutura ou o vidro de cobertura. Além disso, para garantir imagens de qualidade, uma camada extremamente fina de cola (<10 μm) deve ser aplicada. O excesso de cola deve ser raspado antes da colocação do vidro de cobertura.
A principal limitação do IVI através do WHRIL é a profundidade relativamente limitada de penetração alcançável. Portanto, a patologia que ocorre profundamente dentro do pulmão é inacessível. Apesar dessa limitação, a técnica ainda pode produzir uma abundância de informações clinicamente relevantes, especialmente em investigações oncológicas, dada a propensão descrita para metástases pulmonares periféricamente localizadas38,39,40,41. Em última análise, essa abordagem de imagem fornece uma vantagem considerável sobre os ensaios padrão ex vivo e outros métodos para imagens in vivo, que ou desconectam tecido de processos fisiológicos vitais10,11,12,13, ou limitam a análise longitudinal a uma duração máxima de 12 h14,15,16,37,42, respectivamente.
Para imagens repetidas durante esse período de tempo, vários desafios ainda devem ser superados. Em primeiro lugar, é importante manter a saúde da pele ao redor da janela implantada, pois, enquanto o tecido ferido não está exposto, a pele ao redor ainda pode ficar inflamada ou infectada. A aplicação rotineira de uma pomada antibiótica ajudará a prevenir isso. Em segundo lugar, com o tempo, exsudação da pele cortada pode congestionar sob a moldura da janela e impedir a colocação da placa de fixação usada para imobilizar o mouse no estágio do microscópio. Colocar um tecido molhado sobre o WHRIL por 10-15 min irá suavizar este exudate e permitir a colocação da moldura da janela. Em terceiro lugar, um dos mecanismos do corpo para excretar o excesso de água e manter a homeostase é através da expiração de vapor. Assim, a ingestão excessiva de fluidos (principalmente como resultado da injeção de agentes de contraste ou suspensões de células tumorais) fará com que a superfície pulmonar excrete esse excesso de água e resultará na desvinculação do tecido pulmonar do WHRIL. Isso pode ser evitado limitando o volume de injeções a um máximo de 50 μL por vez. Finalmente, mesmo com o melhor cuidado, o tecido pulmonar pode ocasionalmente se desprender do WHRIL devido ao rato ingerir um grande volume de água ou devido ao excesso de exercção do rato. Quando isso ocorre, o descolamento do tecido pulmonar do WHRIL normalmente ocorre lentamente, começando na borda externa. Assim, pode ser impossível seguir alguns campos de visão localizados no primeiro dia de imagem durante toda a duração da janela. Verificou-se que os melhores resultados de imagem serão obtidos nos primeiros dias e que o uso de técnicas de mosaico, como a imagem intravital de alta resolução de grande volume21, pode minimizar o impacto dessa limitação.
Dado que o WHRIL é integrado na parede torácica do mouse, a deriva durante a imagem geralmente não é um problema significativo, desde que o cuidado seja pago para garantir que o acessório entre a janela e o microscópio seja firme. Ainda assim, uma pequena quantidade de deriva pode ser observada durante o tempo imediatamente após a colocação do mouse no estágio do microscópio. Isso pode vir do relaxamento do corpo do mouse ou da expansão térmica dos componentes do microscópio (placa de palco, estágio XY, lente objetiva) devido à câmara ambiental. Esta deriva pode ser evitada alocando ~30 min para equilíbrio antes de iniciar o procedimento de imagem. Esse período de tempo permite que a fisiologia do camundongo se estabilize sob a anestesia e permite que todos os componentes cheguem ao equilíbrio térmico. Qualquer pequena quantidade de deriva residual pode ser facilmente manipulada por algoritmos computacionais como StackReg43 ou HyperStackReg44.
Finalmente, este protocolo é uma melhoria em relação à versão escrita anterior por duas razões. Primeiro, o formato visual permite uma melhor conceituação do protocolo cirúrgico. Isso é particularmente útil para os passos cruciais onde 1) o pulmão é seco aplicando um fluxo suave constante de ar comprimido (passo 3.24, Figura 1J), 2) o deslizamento de tampa é anexado ao furo central da estrutura da janela de forma a evitar a fixação de bolhas (passo 3.31), e 3) uma pequena quantidade de cianoacrilato líquido é adicionada na interface metal-vidro para garantir um vedação a ar-apertado entre o vidro de cobertura e a moldura da janela (passo 3.34, Figura 1O).
Em conclusão, com o advento do WHRIL, dada a sua comodidade à visualização subcelular do mesmo tecido pulmonar durante um longo período, os investigadores são recentemente capacitados a responder a muitas perguntas sem resposta. Especificamente, o protocolo aqui descrito permite a exploração fundamental dos processos dinâmicos subjacentes a inúmeras patologias, incluindo a progressão da metástase do câncer.
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Disclosures
Os autores não revelam conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561, METAvivor Early Career Award, Gruss-Lipper Biophotonics Center e seu Programa Integrado de Imagem, e Jane A. e Myles P. Dempsey. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagem Analítica (AIF) da Faculdade de Medicina einstein pelo apoio à imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
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