Summary
在这里，我们提出了一种用于为小鼠胸部手术植入永久留置光学窗口的方案，该方案可实现高分辨率的肺活体成像。窗口的持久性使其非常适合研究肺部的动态细胞过程，特别是那些缓慢进化的过程，例如播散性肿瘤细胞的转移性进展。
Abstract
转移占癌症相关死亡率的约90%，涉及癌细胞从原发性肿瘤到继发部位（如骨骼，大脑和肺）的全身扩散。尽管经过了广泛的研究，但这一过程的机制细节仍然知之甚少。虽然常见的成像方式，包括计算机断层扫描（CT），正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI），提供不同程度的粗略可视化，但每种方式都缺乏检测单个肿瘤细胞动力学所需的时间和空间分辨率。为了解决这个问题，已经描述了许多技术用于常见转移部位的活体成像。在这些部位中，肺已被证明特别难以进入活体成像，因为它的细腻性和维持生命的关键作用。虽然之前已经描述了几种用于完整肺的单细胞活体内成像的方法，但所有方法都涉及高度侵入性和终末期手术，将最大可能的成像持续时间限制在6-12小时。这里描述的是一种改进的技术，用于永久植入用于肺部高分辨率成像（WHRIL）的微创胸腔光学窗口。结合经过调整的显微血管造影方法，创新的光学窗口有助于在多个成像会话和数周内以单细胞分辨率对完整肺进行连续活体成像。鉴于可以收集成像数据的前所未有的时间，WHRIL可以促进加速发现转移进展的动态机制和肺部许多其他生物过程。
Introduction
造成~90%的死亡，转移是癌症相关死亡的主要原因1。在临床观察到的转移的主要部位（骨，肝，肺，脑）2中，肺已被证明对通过活体显微镜进行体内成像特别具有挑战性。这是因为肺是永动机中一个微妙的器官。肺部的连续运动，进一步由胸内心脏运动加剧，是准确成像的重要障碍。因此，由于其相对难以获得高分辨率活体内光学成像的模式，肺内的癌症生长通常被认为是一个隐匿的过程3。
在临床环境中，计算机断层扫描（CT），正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI）等成像技术可以在完整的重要器官（如肺）深处进行可视化4。然而，虽然这些模式提供了对大器官的良好观察（通常甚至在临床症状发作之前揭示病理学），但它们的分辨率不足以检测单个播散的肿瘤细胞，因为它们在转移的早期阶段进展。因此，当上述方式提供任何肺转移迹象时，转移灶已经建立并增殖。由于肿瘤微环境在癌症进展和转移形成5、6中起着举足轻重的作用，因此对研究体内转移性播种的最早步骤有很大的兴趣。这种兴趣进一步被进一步激发了人们的意识，即癌细胞甚至在检测到原发性肿瘤之前传播7，8，并且越来越多的证据表明它们作为单个细胞存活并且处于休眠状态数年到数十年，然后才生长成宏观转移9。
以前，单细胞分辨率下的肺成像必然涉及离体或外植体制剂10，11，12，13，将分析限制在单个时间点。虽然这些制剂确实提供了有用的信息，但它们并没有提供任何关于连接到完整循环系统的器官内肿瘤细胞动力学的见解。
最近在成像方面的技术进步使得在长达12小时14，15，16的时间内以单细胞分辨率对完整肺进行活体内可视化。这是在小鼠模型中完成的，使用涉及机械通气，胸腔切除术和真空辅助肺固定的方案。然而，尽管提供了生理完整肺的第一个单细胞分辨率图像，但该技术具有高度侵入性和终末性，从而排除了索引程序之外的进一步成像过程。因此，这种限制阻止了其应用于研究需要超过12小时的转移步骤，例如休眠和生长的重新启动14，15，16。此外，使用这种成像方法观察到的细胞行为模式必须谨慎解释，因为真空诱导的压差可能导致血流转移。
为了克服这些限制，最近开发了一种用于肺部高分辨率成像的微创窗口（WHRIL），便于在数天至数周的延长时间内进行连续成像，而无需机械通气17。该技术需要创建一个具有密封胸腔的"透明胸腔"，以保持正常的肺功能。该过程具有良好的耐受性，允许小鼠恢复而不会对基线活动和功能进行有意义的改变。为了在每次相应的成像过程中可靠地定位完全相同的肺区域，将一种称为显微刻图的技术应用于该窗口18。通过这个窗口，可以捕获细胞到达肺血管床，穿过内皮，经历细胞分裂并生长成微转移的图像。
在这里，该研究详细介绍了用于植入WHRIL的改进手术方案，该方案简化了手术，同时提高了其可重复性和质量。虽然该协议旨在能够研究转移背后的动态过程，但该技术可以替代地应用于肺生物学和病理学的众多过程的研究。
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Protocol
本议定书中描述的所有程序均按照脊椎动物使用的指南和法规进行，包括阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的事先批准。
1. 窗户钝化
- 用1%（w / v）酶活性洗涤剂溶液冲洗光学窗框（补充图2）。
- 在玻璃罐内，将光学窗框浸没在5%（w / v）氢氧化钠溶液中，在70°C下30分钟。
- 取下并用去离子水清洗窗框。
- 在新的玻璃罐内，将光学窗框浸没在7%（w / v）柠檬酸溶液中，在55°C下10分钟。
- 同样，取下并用去离子水清洗窗框。
- 重复步骤1.2;然后，取下并用去离子水清洗窗框。
2. 手术准备
- 在罩式或层流柜中进行手术。为避免手术区域受到污染，请分别确保不同的、分开的准备、手术和恢复区域。
- 在手术前，在高压灭菌器中对所有手术器械进行消毒。如果计划后续程序，请使用热珠灭菌器对器械进行重新灭菌。对于这种外科手术，使用仅提示技术。
- 打开加热的手术珠和磁珠灭菌器的电源。
- 在麻醉室中用5%异氟醚麻醉小鼠。
- 要去除头发，请慷慨地将脱毛膏涂抹在左上胸部切口部位。不超过20秒后，使用湿纸巾牢牢擦去头发和脱毛膏。根据需要重复上述步骤，以去除手术部位的所有毛发。
- 使用2-0丝线，在22 G导管的底部打结，留下2英寸长的尾巴（见图1A）。
3. 肺窗手术
- 用抗菌肥皂洗手。
- 在每次新手术之前，戴上新的无菌手套。
- 为了防止角膜干燥和对小鼠眼睛的损害，请在双眼上涂抹眼药膏。
- 将10μL（0.1mg / kg）丁丙诺啡稀释在90μL无菌PBS中，然后皮下注射以确保术前镇痛。
- 用丝线缝合的22 G导管15插入小鼠。使用充气灯泡，通过注意灯泡挤压时双侧胸部上升来确认插管成功。
- 通过将2-0的丝线缝合线绑在小鼠的鼻子周围来固定插管导管（见图1B）。
- 将鼠标放在加热的手术支架上，并将其放置在右侧外侧卧位以暴露左胸部。
- 将呼吸机连接到插管导管。
- 确保呼吸机上受控、稳定的通风，然后将异氟烷降低到3%。在手术开始时，在整个手术过程中定期进行，通过进行脚趾捏合测试来评估麻醉的充分性。
- 使用纸胶带，颅骨和尾部分别将前肢和后肢固定到加热的手术阶段。沿着小鼠背部的长度放置另一块胶带，以最大限度地暴露于手术区域（见图1C）。
- 打开罩子下的所有手术器械，以保持无菌。
- 通过在小鼠皮肤上大量施用防腐剂对手术部位进行消毒。
- 使用镊子，抬起皮肤并做一个~10毫米的圆形切口，胸骨左侧约7毫米，比肋下缘高出约7毫米（图1D）。
- 仔细识别任何主要船只。如果需要分割血管，用电烙笔在两端烧灼以保持止血。
- 切除肋骨上方的软组织。
- 使用镊子抬高第6或第7肋。使用钝性微解剖剪刀的单刃，将圆润的一面朝向肺部，小心地刺穿第6和第7肋骨之间的肋间肌以进入胸内空间（图1E）。
- 在缺损处小心地排出压缩空气罐，使肺塌陷并将其与胸壁分开。在短时间内发射压缩空气，以防止医源性肺损伤。
- 将活检孔放在切割工具上（补充图1），并通过肋间切口小心地操纵切割工具的底座（图1F）。
- 调整切削刀具底座的方向，使其与胸壁平行。在肋骨保持架上打一个5毫米的圆孔（图1G）。
注意：确保暴露的肺组织是粉红色的，没有损伤的迹象。 - 使用5-0丝绸缝合线，从孔处创建一个钱包线约1毫米，圆周，与肋骨交错（图1H）。
- 定位窗框，使圆形缺陷的边缘在窗口的凹槽内对齐（见图1I）。
- 通过紧紧绑住5-0丝绸缝合线来牢固地锁定植入的窗户。
- 将100μL氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂加载到1mL注射器中。
- 通过施加稳定温和的压缩空气流约10-20秒来干燥肺部（图1J）。
- 使用镊子抓住窗框的外缘，轻轻抬起以确保肺部与窗框的下表面分离。
- 沿着光学窗框的底面分配一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂（图1K）。
- 增加呼吸机上的呼气末正压 （PEEP） 以给肺部充气。
- 保持10-20秒，施加轻柔但牢固的压力，将光学窗框连接到肺组织上（图1L）。
- 将剩余的氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂的5毫米滴剂滴到矩形盖玻片上。
- 使用真空拾音器拾取 5 mm 盖玻片。将盖玻片的底面浸入粘合剂中，然后在矩形盖玻片的侧面刮掉多余的粘合剂三次，使得只剩下非常薄的一层（图1M）。
- 小心地将盖玻片放置在光学窗框中心的凹槽内，并以一定角度保持在肺组织上方。短暂夹住呼吸机以产生正压，使肺部过度充气。使用旋转运动，将盖玻片与肺组织平行的方向，以在肺表面和盖玻片的下表面之间产生直接的叠加。保持轻柔的压力，使氰基丙烯酸酯粘合剂凝固（~25 s）。
- 使用镊子将盖玻片与真空拾音器分离（图1N）。
- 使用5-0丝线缝合线，再次创建钱包线，这次从皮肤切口的切缘圆周<1毫米。将多余的皮肤塞入窗框外缘下方，然后用锁结将其紧紧地绑住。
- 为确保盖玻片和窗框之间的气密密封，请在金属玻璃界面处分配少量的液体氰基丙烯酸酯（见图1O）。
- 将无菌针头连接到1 mL胰岛素注射器上。将针插入xiphoid突下方，向左肩推进，通过横膈膜进入胸腔。轻轻地拉回注射器，以从胸腔中除去任何残留的空气（见图1P）。
- 从鼠标上取下磁带。
- 关闭异氟醚。
- 继续用100%氧气通气，直到鼠标准备好醒来。
- 小心地将2-0丝线缝合线切在小鼠的鼻子周围，并拔管鼠标。
- 将鼠标转移到干净的笼子中并进行监控，直到完全恢复。如果存在呼吸困难的迹象，对小鼠实施安乐死。
- 通过皮下注射10μL（0.1mg / kg）丁丙诺啡稀释在90μL无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）中来提供术后镇痛。
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Representative Results
图1总结了本方案中描述的外科手术步骤并进行了说明。简而言之，在手术前，麻醉小鼠并去除左胸部的毛发。对小鼠进行插管和机械通气，以便在胸腔破裂后存活。切除覆盖肋骨的软组织，并产生一个小的圆形缺陷，横跨第6和第7肋骨。将光学窗框插入缺陷中，其底部（透明孔外）粘附在肺组织上。然后用缝合线和粘合剂的组合固定窗框，重新密封胸腔，并允许在拔管后恢复正常呼吸。成功植入后，肺将粘附在光学窗口（作为胸壁的一部分结合），并保留胸内压力梯度。这允许小鼠舒适地存活，使每日成像达到方案允许（2周）。然后可以通过窗口执行活体成像，如前所述，对于其他窗口15，19，20。
为了可视化各种细胞类型，生物结构或细胞功能状态，这里介绍的程序可以在各种小鼠上进行，这些小鼠要么经过遗传操作以表达荧光蛋白21，要么注射染料22。窗户的永久性质使其与视场重新定位的技术兼容，例如光转换23，24或微刻17，18。微刻图是一种三角测量技术，基于在成像会话之间使用固定基准标记坐标的计算变换，以预测和重新定位感兴趣的区域。在如上所述创建的窗口中，这些基准标记是蚀刻在窗框上的轻微划痕（补充图2），在显微镜下很容易识别。这使得可以多次找到相同的视野，即使在其他未标记的组织中也是如此。图2显示了这些技术在小鼠中的结果，其中肺脉管系统已通过注射标记的染料标记的高分子量葡聚糖（四甲基罗丹明155 kD葡聚糖）和相同的微脉管系统在3天内重新定位来标记。
这种葡聚糖被发现在评估在肿瘤细胞侵入期间诱导的短暂血管开口方面非常有用25，26，27。实际上，已经表明，在原发性乳腺肿瘤中，这种高分子量葡聚糖被有效地隔离到脉管系统中，并且不会泄漏到间质25中 。这与较低分子量的葡聚糖（如10 kD或70 kD）相反，后者已被证明被动地从新血管中泄漏28，29。同时，已经观察到健康的肺脉管系统对泄漏的抵抗力更强，>10 kD的葡聚糖仅在器官受到损伤时才逃逸到间质中，例如暴露于外泌体30或病毒31时。除了血管通透性外，还存在各种造影剂来测量肺部的其他参数（例如，核标志物，活/死指示器，氧化应激报告器，血流速度跟踪器）。在Ueki等人的协议中可以找到对它们进行分类的优秀资源22。
WHRIL是一种非常适合研究肺部血流动力学的技术。这可以通过多种方式实现。首先，当使用相对较慢的帧速率（约1-10帧/秒，fps）成像时，血流速度可以通过未标记的红细胞在较大血管中流动时产生的阴影来确定。在低fps下，这些阴影形成线，其相对于血管的角度可用于计算红细胞流速32（图2，黄线）。其次，也可以在低fps显微镜上跟踪阴影，方法是将血管与显微镜的快速扫描轴对齐，并使用快速线扫描33，34，35获取运动记录仪。最后，当在能够随时间集成信号的显微镜（例如，配备电荷耦合器件（CCD）探测器的旋转盘共聚焦）上以高帧速率（>10 fps）成像时，可以直接追踪单个粒子16，17。在这种情况下，静止的物体表现为亮点，流动的物体沿着循环的轨迹延伸。可以通过测量轨道的长度并除以帧采集时间来量化单元速度。图3和补充影片1给出了一个例子，其中2μm荧光微球在成像前被血管内注射到小鼠体内。
由于能够反复且一致地返回同一视野，现在可以对在多天内演变的过程进行可视化。作为该应用的演示，WHRIL用于可视化肺内乳腺癌细胞的转移进展17，21：也就是说，随着时间的推移，跟踪到达肺血管系统的单个肿瘤细胞的命运。这个概念在图4A中有所描述，其中单个播散的肿瘤细胞在倒伏在肺微血管系统的一段后不久就被可视化了。在随后的几天返回同一位置揭示了肿瘤细胞的命运（例如，再循环，外渗等）。应用于肺部转移进展的高潮步骤的研究，可以直观地记录动态过程，包括肿瘤细胞到达（图4B），外渗（图4C）和增殖以形成宏观转移（图4D）。
图1：植入肺高分辨率成像窗口（WHRIL）的手术摘要。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：显微刻版图能够重新定位光学窗口内的固定位置。 在光学透明盖玻片下对肺部单个区域进行多光子活体内成像，显示使用显微血管造影连续3天重新定位的微血管。黄色箭头表示每天从单个容器中识别出一个清晰可定义的分支点。黄色线条突出显示未标记的红细胞在较大血管中流动时产生的阴影。这些管线相对于血管的角度可用于计算红细胞流速。红色=tdTomato标记的内皮细胞和155 kDa的四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清，绿色=GFP标记的肿瘤细胞，蓝色=二次谐波生成。比例尺 = 15 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图3：血流速的可视化。 通过逆向轨道注射2μm直径的荧光微球并成像它们通过血管的通道，可以可视化血流速。当在能够随时间整合信号的显微镜（例如，配备CCD探测器的旋转圆盘共聚焦）上成像时，静止的微球显示为亮点（箭头），流动的球体通过循环（括号线）追踪轨迹。比例尺 = 50 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 4.WHRIL可以通过直接可视化播散性肿瘤细胞的命运来捕获肺内转移级联反应的每个步骤。（A）通过WHRIL在几天内进行连续成像，可以跟踪播散性肿瘤细胞（绿色）的命运。在第1天，观察到肿瘤细胞已经到达并停留在肺血管系统中。在第2天和第3天，细胞不再存在于肺血管系统中，已经再循环或死亡。比例尺= 15μm.（B-D）可视化肺中肿瘤细胞转移的每个阶段。（B）到达后滞留在肺血管系统的血管内弥散性肿瘤细胞（绿色）。（C）扩散到肺实质后播散的肿瘤细胞（绿色）。（D）已经增殖并生长成微转移的肿瘤细胞。红色=tdTomato标记的内皮细胞和155 kDa的四甲基罗丹明葡聚糖标记的血清，绿色=GFP标记的肿瘤细胞，蓝色=二次谐波生成。比例尺 = 20 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
补充影片1：对应于图3的视频显示了循环2μm微球的肺脉管系统。请按此下载短片。
补充图 1：用于引导 5 mm 活检打孔的不锈钢切割工具的机械设计图纸。请单击此处下载此文件。
补充图2：不锈钢窗框的机械设计图纸。请点击此处下载此文件。
补充图3：窗架工具的机械设计图纸。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在肺等远处转移部位，高分辨率光学成像可以深入了解肿瘤细胞转移的复杂动力学。通过实现单个癌细胞及其与宿主组织的相互作用的 体内 可视化，高分辨率的活体成像已被证明有助于理解转移的潜在机制。
这里描述的是一种改进的手术方案，用于永久胸腔植入光学窗口，旨在通过高分辨率多光子显微镜对小鼠肺进行连续成像。使用该协议创建的窗口具有良好的耐受性，并且鉴于其成功重新密封胸腔的能力，能够维持自发通气所需的胸内压力梯度（与先前描述的任何其他用于小鼠肺成像的窗口相反14，15，16，36，37).这允许小鼠从麻醉中醒来，独立呼吸，并在透明的胸腔中舒适地存活数周。
使用这个窗口，可以用单细胞分辨率可视化转移的所有步骤，包括到达，外渗和生长成微转移酶。
尽管该协议需要一定的技术熟练程度，但通过练习并仔细注意几个关键步骤，该程序可以以很高的成功率执行。首先，在手术前去除毛发时，通过在不超过20秒的接触后用湿润的组织去除脱毛膏来保护小鼠的皮肤至关重要。在手术过程中，应格外小心，以避免切割血管。过度出血，最常见的是由于在切除乳腺脂肪垫期间肱动脉或乳腺内动脉的分裂而遇到的，可以模糊手术区域的可视化或通过血化导致死亡。该协议中新描述的是使用活检冲头和切割工具（补充图1），这大大加快并简化了通过肋骨保持架的圆形缺陷的产生，以及使植入更容易的窗口支架工具。这些进展的实施显着提高了手术的成功率，并降低了先前手术技能所需的水平。各个实验室可以使用补充图中的图纸与内部或商业机械车间一起制造这些工具。在互联网上搜索"机械车间投标网站"将产生几个在线应用程序，这些应用程序将有助于找到当地的商业机械商店。
最后，在粘合之前确保肺组织保持干燥至关重要。导致盖玻片附着不成功的最常见缺陷是未能确保在与框架或盖玻片一起放置之前完全去除肺部表面的水分。此外，为了确保高质量的图像，应涂上极薄的胶层（<10μm）。在放置盖玻片之前，应刮掉多余的胶水。
IVI通过WHRIL的主要限制是可实现的穿透深度相对有限。因此，肺部深处发生的病理是无法进入的。尽管有这种局限性，但该技术仍然可以产生丰富的临床相关信息，特别是在肿瘤学研究中，鉴于所描述的外周局部肺转移倾向38，39，40，41。最终，这种成像方法比标准离体测定和其他体内成像方法具有相当大的优势，这些方法要么断开组织与重要生理过程的分离10，11，12，13，要么将纵向分析限制在12小时14，15，16，37，42，分别。
对于在此时间段内的重复成像，仍必须克服一些挑战。首先，重要的是要保持植入窗口周围皮肤的健康，因为当受伤的组织没有暴露时，周围的皮肤仍然可能发炎或感染。常规应用抗生素软膏将有助于预防这种情况。其次，随着时间的推移，从切开的皮肤渗出物可能会在窗框下凝结并阻止放置用于固定小鼠的固定板在显微镜载物台中。将湿纸巾放在WHRIL上10-15分钟将软化这种渗出物并允许放置窗框。第三，身体排泄多余水分和维持体内平衡的机制之一是通过呼出蒸汽。因此，摄入过多的液体（主要是由于注射造影剂或肿瘤细胞悬浮液）会导致肺表面排泄多余的水分，并导致肺组织与WHRIL分离。这可以通过将注射量限制为一次最大50μL来避免。最后，即使采取了最好的护理，由于小鼠摄入大量水或由于小鼠过度劳累，肺组织也可能偶尔从WHRIL中脱落。当发生这种情况时，肺组织从WHRIL的脱离通常缓慢发生，从外缘开始。因此，在整个窗口期间，可能无法跟踪位于成像第一天的某些视场。研究发现，在最初的几天内将获得最佳成像结果，并且采用镶嵌技术（例如先前发布的大容量高分辨率Intravital Imaging21） 可以最大限度地减少此限制的影响。
鉴于WHRIL集成在小鼠的胸壁中，成像过程中的漂移通常不是一个重大问题，只要注意确保窗口和显微镜之间的附着牢固。尽管如此，在将小鼠置于显微镜载物台后立即的时间内，可以观察到一些少量的漂移。这可能来自小鼠身体的松弛或由于环境室引起的显微镜组件（载物台板，XY载物台，物镜）的热膨胀。在开始成像程序之前，通过分配约30分钟进行平衡可以避免这种漂移。这段时间允许小鼠的生理学在麻醉下稳定下来，并允许所有成分达到热平衡。任何少量的残余漂移都可以通过计算算法（如StackReg43 或HyperStackReg44）轻松处理。
最后，由于两个原因，该协议是对先前书面版本的改进。首先，视觉格式允许更好地概念化手术方案。这对于关键步骤特别有用，其中1）通过施加稳定温和的压缩空气流（步骤3.24，图1J）干燥肺部，2）盖玻片以防止气泡卡住的方式连接到窗框的中央孔（步骤3.31），以及3）在金属玻璃界面处添加少量液体氰基丙烯酸酯，以确保盖板玻璃和窗框之间的气密密封（步骤3.34，图1O）。
总之，随着WHRIL的出现，鉴于其在很长一段时间内对同一肺组织的亚细胞可视化的适应性，研究人员最近有能力解决许多未解答的问题。具体而言，本文概述的协议能够从根本上探索许多病理学背后的动态过程，包括癌症转移的进展。
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Disclosures
作者没有披露任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了以下资助的支持：CA216248，CA013330，Montefiore的Ruth L. Kirschstein T32培训补助金CA200561，METAvivor早期职业奖，Gruss-Lipper生物光子学中心及其综合成像计划，以及Jane A.和Myles P. Dempsey。我们要感谢爱因斯坦医学院的分析成像设施（AIF）的成像支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | N/A | concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning |
| 2 µm fluorescent microspheres | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% Isoflurane | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 braided silk with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm stainless steel window frame | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 2 |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Brass window tool holder | N/A | N/A | Custom-made, Supplemental Figure 3 |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | |
| Cautery pen | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| Chlorhexidine gluconate | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | |
| Bead sterilizer | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Insulin syringes | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| Neomycin/polymyxin B/bacitracin | Johnson & Johnson | 501373005 | Antibiotic ointmen |
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| Paper tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Rectangular Cover Glass | Corning | 2980-225 | |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Stainless steel cutting tool | N/A | N/A | Custom made, Supplementary Figure 1 |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry Part A. 95 (5), 448-457 (2019).
- DeClerck, Y. A., Pienta, K. J., Woodhouse, E. C., Singer, D. S., Mohla, S. The tumor microenvironment at a turning point knowledge gained over the last decade, and challenges and opportunities ahead: A white paper from the NCI TME network. Cancer Research. 77 (5), 1051-1059 (2017).
- Borriello, L., et al. The role of the tumor microenvironment in tumor cell intravasation and dissemination. European Journal of Cell Biology. 99 (6), 151098 (2020).
- Hosseini, H., et al. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer. Nature. 540 (7634), 552-558 (2016).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540, 589-612 (2016).
- Risson, E., Nobre, A. R., Maguer-Satta, V., Aguirre-Ghiso, J. A. The current paradigm and challenges ahead for the dormancy of disseminated tumor cells. Nature Cancer. 1 (7), 672-680 (2020).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), 6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Miyao, N., et al. Various adhesion molecules impair microvascular leukocyte kinetics in ventilator-induced lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (6), 1059-1068 (2006).
- Bernal, P. J., et al. Nitric-oxide-mediated zinc release contributes to hypoxic regulation of pulmonary vascular tone. Circulation Research. 102 (12), 1575-1583 (2008).
- Entenberg, D., et al. In vivo subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. IntraVital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55115 (2018).
- Entenbery, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ritsma, L., Ponsioen, B., van Rheenen, J. Intravital imaging of cell signaling in mice. IntraVital. 1 (1), 2-10 (2012).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Karagiannis, G. S., et al. Assessing tumor microenvironment of metastasis doorway-mediated vascular permeability associated with cancer cell dissemination using intravital imaging and fixed tissue analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59633 (2019).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 335-344 (2006).
- Rizzo, V., Kim, D., Duran, W. N., DeFouw, D. O. Ontogeny of microvascular permeability to macromolecules in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 49 (1), 49-63 (1995).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Ueki, H., et al. In vivo imaging of the pathophysiological changes and neutrophil dynamics in influenza virus-infected mouse lungs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 6622-6629 (2018).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of retinal blood flow using fluorescently labeled red blood cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: An assessment of hepatic hemodynamics. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52303 (2015).
- Chaigneau, E., Roche, M., Charpak, S. Unbiased analysis method for measurement of red blood cell size and velocity with laser scanning microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 644 (2019).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), 38590 (2012).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. American Journal of Pathology. 179 (1), 75-82 (2011).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Travis, W. D.
- Scholten, E. T., Kreel, L. Distribution of lung metastases in the axial plane. A combined radiological-pathological study. Radiologica Clinica (Basel). 46 (4), 248-265 (1977).
- Braman, S. S., Whitcomb, M. E.
- Herold, C. J., Bankier, A. A., Fleischmann, D.
- Kimura, H., et al. Real-time imaging of single cancer-cell dynamics of lung metastasis. Journal of Cellular Biochemistry. 109 (1), 58-64 (2010).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sharma, V. P.
