Summary

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Abstract

La metástasis, que representa ~ 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer, implica la propagación sistémica de las células cancerosas desde tumores primarios a sitios secundarios como el hueso, el cerebro y el pulmón. Aunque ampliamente estudiados, los detalles mecanicistas de este proceso siguen siendo poco conocidos. Si bien las modalidades de imágenes comunes, incluida la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM), ofrecen diversos grados de visualización macroscópica, cada una carece de la resolución temporal y espacial necesaria para detectar la dinámica de las células tumorales individuales. Para abordar esto, se han descrito numerosas técnicas para la obtención de imágenes intravitales de sitios metastásicos comunes. De estos sitios, el pulmón ha demostrado ser especialmente difícil de acceder para las imágenes intravitales debido a su delicadeza y papel crítico en el mantenimiento de la vida. Aunque se han descrito previamente varios enfoques para la obtención de imágenes intravitales unicelulares del pulmón intacto, todos implican procedimientos altamente invasivos y terminales, lo que limita la duración máxima posible de la imagen a 6-12 h. Aquí se describe una técnica mejorada para la implantación permanente de una ventana óptica torácica mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL). Combinada con un enfoque adaptado a la microcartografía, la innovadora ventana óptica facilita la obtención de imágenes intravitales en serie del pulmón intacto a resolución de una sola célula en múltiples sesiones de imágenes y que abarcan varias semanas. Dada la duración sin precedentes durante el cual se pueden recopilar datos de imágenes, el WHRIL puede facilitar el descubrimiento acelerado de los mecanismos dinámicos subyacentes a la progresión metastásica y numerosos procesos biológicos adicionales dentro del pulmón.

Introduction

Responsable de ~ 90% de las muertes, la metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer1. Entre los principales sitios de metástasis clínicamente observados (hueso, hígado, pulmón, cerebro)2, el pulmón ha demostrado ser particularmente desafiante para las imágenes in vivo a través de microscopía intravital. Esto se debe a que el pulmón es un órgano delicado en movimiento perpetuo. El movimiento continuo de los pulmones, agravado aún más por el movimiento cardíaco intratorácico, representa una barrera sustancial para obtener imágenes precisas. Por lo tanto, debido a su relativa inaccesibilidad a las modalidades de imágenes ópticas intravitales de alta resolución, el crecimiento del cáncer dentro del pulmón a menudo se ha considerado un proceso oculto3.

En el entorno clínico, las tecnologías de imagen como la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM) permiten la visualización en lo profundo de órganos vitales intactos como el pulmón4. Sin embargo, si bien estas modalidades proporcionan excelentes vistas del órgano grueso (a menudo incluso revelando patología antes de la aparición de los síntomas clínicos), son de resolución inadecuada para detectar células tumorales diseminadas individuales a medida que avanzan a través de las primeras etapas de la metástasis. En consecuencia, en el momento en que las modalidades antes mencionadas proporcionan cualquier indicación de metástasis al pulmón, los focos metastásicos ya están bien establecidos y proliferan. Dado que el microambiente tumoral juega un papel fundamental en la progresión del cáncer y la formación de metástasis5,6, existe un gran interés en investigar los primeros pasos de la siembra metastásica in vivo. Este interés se alimenta aún más por la mayor apreciación de que las células cancerosas se diseminan incluso antes de que se detecte el tumor primario7,8 y la creciente evidencia de que sobreviven como células individuales y en un estado latente durante años o décadas antes de crecer en macrometástasis9.

Anteriormente, la obtención de imágenes del pulmón a resolución unicelular ha implicado necesariamente preparaciones ex vivo o explante10,11,12,13,limitando los análisis a puntos de tiempo únicos. Si bien estas preparaciones proporcionan información útil, no proporcionan ninguna idea de la dinámica de las células tumorales dentro del órgano conectado a un sistema circulatorio intacto.

Los recientes avances tecnológicos en imágenes han permitido la visualización intravital del pulmón intacto a resolución unicelular durante períodos de hasta 12 h14,15,16. Esto se logró en un modelo murino utilizando un protocolo que involucró ventilación mecánica, resección de la caja torácica e inmovilización pulmonar asistida por vacío. Sin embargo, a pesar de ofrecer las primeras imágenes de resolución celular única del pulmón fisiológicamente intacto, la técnica es altamente invasiva y terminal, lo que impide más sesiones de imágenes más allá del procedimiento índice. Esta limitación, por tanto, impide su aplicación al estudio de pasos metastásicos que tardan más de 12 h, como la latencia y el reinicio del crecimiento14,15,16. Además, los patrones de comportamiento celular observados utilizando este enfoque de imágenes deben interpretarse con cautela, dado que es probable que los diferenciales de presión inducidos por el vacío causen desviaciones en el flujo sanguíneo.

Para superar estas limitaciones, recientemente se desarrolló una Ventana mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL), que facilita la obtención de imágenes en serie durante un período prolongado de días a semanas, sin necesidad de ventilación mecánica17. La técnica consiste en la creación de una “caja torácica transparente” con una cavidad torácica sellada para la preservación de la función pulmonar normal. El procedimiento es bien tolerado, lo que permite que el ratón se recupere sin alteraciones significativas en la actividad y función basales. Para localizar de forma fiable exactamente la misma región pulmonar en cada sesión de imagen respectiva, se aplicó a esta ventana una técnica conocida como microcartografía18. A través de esta ventana, fue posible capturar imágenes de células a medida que llegan al lecho vascular del pulmón, cruzan el endotelio, se dividen celularmente y crecen en micrometástasis.

Aquí, el estudio presenta una descripción detallada de un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación del WHRIL, que simplifica la cirugía al tiempo que aumenta su reproducibilidad y calidad. Si bien este protocolo fue diseñado para permitir la investigación de los procesos dinámicos subyacentes a la metástasis, la técnica puede aplicarse alternativamente a las investigaciones de numerosos procesos de biología y patología pulmonar.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Albert Einstein. 1. Pasivación de ventanas Enjuague los marcos ópticos de las ventanas (Figura suplementaria 2) con una solución al 1% (p/v) de detergente enzimáticamente activo. Dentro de un fras…

Representative Results

Los pasos del procedimiento quirúrgico descritos en este protocolo se resumen e ilustran en la Figura 1. Brevemente, antes de la cirugía, los ratones son anestesiados y se elimina el vello sobre el tórax izquierdo. Los ratones son intubados y ventilados mecánicamente para permitir la supervivencia tras la ruptura de la cavidad torácica. Se extirpa el tejido blando que recubre las costillas y se crea un pequeño defecto circular, que abarca las costillas6 y7. El ma…

Discussion

En sitios de metástasis a distancia, como el pulmón, las imágenes ópticas de alta resolución proporcionan información sobre la dinámica elaborada de la metástasis de las células tumorales. Al permitir la visualización in vivo de células cancerosas individuales y sus interacciones con el tejido huésped, las imágenes intravitales de alta resolución han demostrado ser fundamentales para comprender los mecanismos subyacentes a la metástasis.

Aquí se describe un protocolo q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa integrado de imágenes, y Jane A. y Myles P. Dempsey. Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Analíticas (AIF) en la Facultad de Medicina Einstein por el apoyo de imágenes.

Materials

1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc N/A  concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres Invitrogen F8827
5 mm coverslip Electron Microscopy Sciences 72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
5% Isoflurane Henry Schein, Inc 29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle Ethicon, Inc. 774B
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich 251275
8 mm stainless steel window frame N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie Ethicon, Inc. LA55G
5 mm disposable biopsy punch Integra  33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors Roboz RS-5980
Buprenorphine Hospira 0409-2012-32
Cautery pen Braintree Scientific GEM 5917
Chlorhexidine gluconate  Becton, Dickinson and Company 260100 ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister Falcon DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive Henkel Adhesives LOC1363589
Fiber-optic illuminator O.C. White Company FL3000
Bead sterilizer CellPoint Scientific GER 5287-120V Germinator 500
Graefe forceps Roboz RS-5135
Infrared heat lamp Braintree Scientific HL-1
Insulin syringes Becton Dickinson 329424
Isoflurane vaporizer SurgiVet VCT302
Jacobson needle holder with lock Kalson Surgical T1-140
Long cotton tip applicators Medline Industries MDS202055
Nair Church & Dwight Co., Inc. 40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin Johnson & Johnson 501373005 Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
Paper tape Fisher Scientific S68702
Murine ventilator Kent Scientific PS-02 PhysioSuite
Rectangular Cover Glass Corning 2980-225
Rodent intubation stand Braintree Scientific RIS 100
Small animal lung inflation bulb Harvard Apparatus 72-9083
Stainless steel cutting tool N/A N/A Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic Hi-Tech Pharmacal Co. 50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming Kent Scientific SURGI-M02 Heated surgical platform
Tracheal catheter Exelint International 26746 22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc. 528-112

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Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J. Vis. Exp. (173), e62761, doi:10.3791/62761 (2021).

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