Summary
يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
Abstract
Mitochondrial Ca2+ يلعب دورا حاسما في السيطرة على التخزين المؤقت Ca2 + السيتوسوليك، واستقلاب الطاقة، ونقل الإشارات الخلوية. يساهم الحمل الزائد للميتوكوندريا Ca2+ في حالات مرضية مختلفة ، بما في ذلك التنكس العصبي وموت الخلايا المبرمج في الأمراض العصبية. هنا نقدم خلية من نوع محدد والميتوكوندريا التي تستهدف النهج الجزيئي للتصوير الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميدات الحمض النووي ترميز الميتوكوندريا استهداف المشفرة وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs) GCaMP5G أو GCaMP6s (GCaMP5G/6s) مع الخلايا الفلكية والخلايا العصبية محددة المروجين gfaABC1D وCaMKII وتسلسل استهداف الميتوكوندريا (ميتو-). للتصوير في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + ، تم تحويل البلازميدات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية المستزرعة للتعبير عن GCaMP5G/6s. في الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير, تم إعداد ناقلات الفيروس المرتبطة أدينو (AAVs) وحقنها في أدمغة الماوس للتعبير عن GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. نهجنا يوفر وسيلة مفيدة لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + ديناميات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية لدراسة العلاقة بين السيتوسوليك والميتوكوندريا Ca2 + الإشارات، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات دون الخلوية الديناميكية وتعتبر مراكز قوة الخلية لإنتاج الطاقة. من ناحية أخرى، يمكن أن يستغرق الميتوكوندريا Ca2 + إلى المصفوفة استجابة لارتفاع Ca2+ المحلي أو الخلوي. الميتوكوندريا Ca2+ امتصاص يؤثر على وظيفة الميتوكوندريا, بما في ذلك عمليات التمثيل الغذائي مثل ردود الفعل في دورة حمض tricarboxylic (TCA) والفوسفور التأكسدي, وينظم Ca2+البروتينات الحساسة في ظل الظروف الفسيولوجية1,2,3,4. الميتوكوندريا Ca2 + الزائد هو أيضا محدد للموت الخلية, بما في ذلك نخر وموت الخلايا المبرمج في اضطرابات الدماغ المختلفة5,6,7. فإنه يسبب فتح المسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (mPTPs) والإفراج عن العامل المساعد كاسباس، والتي تبدأ موت الخلايا المبرمج. لذلك ، من المهم دراسة ديناميات Mitochondrial Ca2 + والتعامل معها في الخلايا الحية لفهم فسيولوجيا الخلايا وعلم الأمراض بشكل أفضل.
الميتوكوندريا الحفاظ على مصفوفة Ca2 + التوازن من خلال التوازن بين امتصاص Ca2 + وefflux. يتم التوسط أساسا الميتوكوندريا كا2 + امتصاص من قبل الميتوكوندريا Ca2 + uniporters (MCUs)، في حين يتم التوسط الميتوكوندريا Ca2 + efflux من قبل نا+-Ca2 +- لي+ المبادلات (NCLXs) وH+/ Ca2 + المبادلات (mHCXs)8. يمكن أن يكون التوازن المضطرب من خلال تحفيز مستقبلات G-البروتين مقرونة (GPCRs)9. الميتوكوندريا Ca2 + التوازن يتأثر أيضا التخزين المؤقت الميتوكوندريا من خلال تشكيل xCa غير قابل للذوبان2 +-xPO4x-xOH المجمعات8.
يمكن تقييم التغيرات داخل الخلايا والميتوكوندريا في تركيز Ca2 + ([Ca2+]) من خلال مؤشرات الفلورسنت أو الإنارة Ca2+ . Ca2 + ملزمة للمؤشرات يسبب تعديلات الطيفية، مما يسمح لتسجيل الخلوية الحرة [Ca2 +] في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. يتوفر حاليا نوعان من المسابير لمراقبة تغيرات Ca2+ في الخلايا: المؤشرات الكيميائية العضوية ومؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECIs). عموما، المتغيرات المختلفة مع مختلف Ca2 + تقارب (على أساس Kد)،خصائص الطيفية (الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات)، والنطاقات الديناميكية، والحساسيات متاحة للأسئلة البيولوجية قيد التحقيق. على الرغم من أن العديد من الاصطناعية العضوية Ca2+ وقد استخدمت مؤشرات للتصوير الخلوي Ca2 + ، إلا أن عدد قليل فقط يمكن تحميلها بشكل انتقائي في مصفوفة الميتوكوندريا للتصوير Mitochondrial Ca2 + ، مع رود - 2 كونها الأكثر استخداما على نطاق واسع (للاستعراضات انظر10،11). ومع ذلك، رود-2 لديه عيب كبير من التسرب خلال التجارب طويلة الوقت بالطبع؛ بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقسيمه بين الميتوكوندريا ، العضيات الأخرى والسيتوسول ، مما يجعل القياسات المطلقة في الأقسام الفرعية المختلفة صعبة. في المقابل ، باستخدام المروجين محددة من نوع الخلية وتسلسل استهداف المقصورة دون الخلوية ، يمكن التعبير عن GECIs في أنواع مختلفة من الخلايا والمقصورات دون الخلوية للتصوير Ca2 + الخاص بالخلايا والمقصورة في المختبر أو في الجسم الحي. وقد ظهرت مؤخرا واحد الطول الموجي الفلورسينس القائم على كثافة GCaMP Ca2 + مؤشرات كبرى GECIs12،13،14،15،16. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولا لاستهداف الميتوكوندريا والتعبير عن نوع الخلية محددة من GCaMP5G وGCaMP6s (GCaMP5G/6s) في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، والتصوير الميتوكوندريا كا2 + امتصاص في هذه الأنواع من الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن التعبير عن GCaMP6G/6s في الميتوكوندريا الفردية، ويمكن تحقيق امتصاص Ca2+ في دقة الميتوكوندريا واحدة في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ميسوري - كولومبيا على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات.
1. بناء البلازميدات الحمض النووي
ملاحظة: للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي، يتم إنشاء بلازميدات الحمض النووي التي تترميز GCaMP5G/6s مع المروجين للخلايا الفلكية والخلايا العصبية الخاصة وتسلسل استهداف الميتوكوندريا.
- إدراج مصفوفة الميتوكوندريا (MM) - تسلسل الاستهداف (ميتو-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 في استنساخ المواقع EcoRI وBamHI في العمود الفقري للفيروس المرتبطة أدينو (AAV) بلازميد pZac2.1 للحصول على البلازميدات التي تحتوي على gfaABCالفلكية 1D المروج أو الخلايا العصبية CaMKII المروج18،19،20.
- Subclone GCaMP5G/6s في مواقع الاستنساخ BamH الأول وليس 1 في البلازميدات أعلاه للحصول على بلازميدات جديدة pZac-gfaABC1D-ميتو-GCaMP5G/6s وpZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s التي تستهدف التعبير المتحول في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية20،21 (الشكل 1A).
- إعداد pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G وpZac-CaMKII-mito-GCaMP6s الحمض النووي البلازميدات لtransfection للدراسة في المختبر (القسم 2). إنتاج ناقلات AAV مع النمط المصلي 5 للخلايا الفلكية والنمط المصلي 9 للخلايا العصبية للدراسة في الجسم الحي 18 (القسم 3).
2. في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + التصوير في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية
- إعداد الخلايا الفلكية الأولية من قشرة فئران P1 الوليدية والخلايا العصبية الأولية من قشرة E15-16 الأجنة18،22،23،24، وزراعة لهم على الزجاج قطرها 12 ملم coverlips في لوحات 24 جيدا باستخدام دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، والمتوسط القاعدي العصبية (NBM) التي تحتوي على 2٪ B27، على التوالي.
- Transfect الخلايا الفلكية الناضجة والخلايا العصبية مع pZac-gfaABC1D-GCaMP6s وpZac-CaMKII-GCaMP5G البلازميدات باستخدام كاشف العدوى القائم على الدهون للتعبير عن GCaMP6s في الميتوكوندريا من الخلايا الفلكية وGCaMP5G في الميتوكوندريا من الخلايا العصبية18,20,21. خلايا العدوى في كل بئر مع 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي، وتغيير المتوسطة 6 ساعة في وقت لاحق.
ملاحظة: الخلايا الفلكية والخلايا العصبية جاهزة للتصوير بعد 1-2 أيام من العدوى. - إجراء التصوير في المختبر الميتوكوندريا Ca2+ بعد 1-2 أيام من العدوى.
- نقل الأغطية الزجاجية المستزرعة مع الخلايا الفلكية أو الخلايا العصبية إلى غرفة التشوش PH-1 تحت المجهر الضوئي أو اثنين.
- تحفيز الميتوكوندريا الفلكية Ca2+ امتصاص مع 100 μM ATP في ACSF, أو تحفيز الميتوكوندريا العصبية مع 100 ميكرومتر الغلوتامات/10 ميكرومتر غليسين20,25 (الشكل 2 والشكل 3).
ملاحظة: يتم التحكم في تغييرات الحل من ACSF إلى ATP- والغلوتامات / الجليسين التي تحتوي على ACSF من قبل نظام تغلغل ALA-VM821. يتم التحكم في سرعة تغيير الحل عند 1-2 مل / دقيقة عن طريق ضبط صمام.
3. في الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية
- الاستعدادات AAV.
- إعداد ناقلات الفيروسات التالية المؤتلفة المرتبطة بال أدينو (rAAV) باستخدام بلازميدات الحمض النووي المعدة في القسم 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G و rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم إعداد ناقلات rAAV من النمط المصلي 5 للتعبير عن GCaMP5G في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية وكانت ناقلات rAAV من النمط المصلي 9 مستعدة للتعبير عن GCaMP6s في الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.
- إعداد ناقلات الفيروسات التالية المؤتلفة المرتبطة بال أدينو (rAAV) باستخدام بلازميدات الحمض النووي المعدة في القسم 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G و rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
- حقن AAV ستيريوتاكسيك.
- تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
ملاحظة: في وقت لاحق أثناء الجراحة، يتم تخفيض مستويات isoflurane إلى 2٪. - بعد أن يصل الفأر إلى مستوى جراحي من التخدير ، كما يحدده الذيل وقرصة إصبع القدم ، حلق الشعر فوق موقع الجراحة أو القشرة الحركية أو الحسية ، مع أداة تشذيب الشعر.
- ضع الماوس على جهاز الماوس المجسم وأصلح الرأس بقضبان الأذن. ضعي مرهم العيون على العينين لحمايتهما أثناء الجراحة. استخدم وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية طوال الجراحة.
ملاحظة: إجراء عملية جراحية باستخدام إجراءات مطهرة. جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقيم إما عن طريق الالاستعباد التلقائي أو معقم حبة ساخنة. - بعد تركيب الماوس على الجهاز المجسم، قم بتعقيم فروة الرأس بفرك قائم على اليود بالتناوب و70٪ إيثانول ثلاث مرات. إجراء شق في خط الوسط من فروة الرأس لفضح موقع الحقن.
- قطع فتح الجلد في محور bregma-lamda وخلق ثقب بور قطرها ~ 1 ملم مع حفر عالية السرعة في موقع الحقن المقصود من القشرة الحركية أو سوماتوسينسوري.
- استخدم حقنة هاملتون سعة 33 جراما تحتوي على فيروس مرتبط بال أدينو (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G المتجهات [1 ×10 11 GC] أو rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s المتجهات [1 × 1011 GC]) لحقن ما يصل إلى 1 ميكرولتر من الفيروس في المنطقة المستهدفة.
ملاحظة: على سبيل المثال، لتوصيل الفيروس القشري، حقن محلول الفيروس في عمقين في خطوات متعددة. أولا، أدخل الإبرة إلى عمق 1 ملم من دورا والسماح 5 دقائق للدماغ لاسترداد. ثم، نقل الإبرة تصل إلى عمق ~ 700 ميكرومتر وحقن 500 nL من محلول الفيروس بسرعة حقن 10 nL/s باستخدام حقنة هاملتون التي تسيطر عليها وحدة تحكم مضخة microsyringe. بعد اكتمال الحقن، انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للفيروس بالانتشراء في الدماغ. ثم، نقل الإبرة تصل إلى موقع الحقن الثاني على عمق 300 ميكرومتر. هنا، حقن 500 nL إضافية من محلول الفيروس. انتظر لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشراء في الدماغ. - أغلق فروة الرأس والجلد باستخدام لاصق الأنسجة. دع الفئران تتعافى على منصة التدفئة أرسل الفئران إلى منشأة الحيوانات بعد الشفاء.
- تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
- تثبيت نافذة الجمجمة وفي الجسم الحي اثنين فوتون (2-P) التصوير من الميتوكوندريا Ca2 + إشارات.
ملاحظة: يتم زرع نافذة الجمجمة 3 أسابيع بعد حقن AAV على القشرة الحركية أو الحسية26،27،28،29. يتم حقن Carprofen (10 ملغ / كغ) تحت الجلد لتوفير الإغاثة من الألم المحتمل قبل الجراحة. العمليات الجراحية نافذة الجمجمة متطابقة مع العمليات الجراحية حقن AAV ويتم تنفيذها في ظل ظروف مطهرة.- تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
ملاحظة: هذه هي الجرعة الأولية وتقليل إلى 2٪ لعملية جراحية في وقت لاحق. أثناء التصوير، يتم استخدام حقن داخل الصفاق (IP) من 130 ملغ الكيتامين / 10 ملغ xylazine / كجم وزن الجسم المذاب في ACSF للتخدير. - ضع الماوس على جهاز الماوس المجسم وأصلح الرأس بقضبان الأذن. تطبيق مرهم العيون على العينين. استخدم وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية طوال الجراحة.
ملاحظة: جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقيم. - إجراء شق من 5-8 ملم طويلة في خط الوسط من فروة الرأس وإزالة رفرف من الجلد باستخدام زوج من مقص.
- بعد تعرض الجمجمة، قم بإجراء عملية استئصال القحف بقطر 2.0-3.0 مم باستخدام مثقاب عالي السرعة فوق منطقة حقن الفيروس (أي قشرة المحرك أو قشرة سوماتوسينسوري، الشكل 1B). أولا، جعل أربعة ثقوب صغيرة، ومن ثم حفر على طول في دائرة تربط الثقوب. ثم ارفع العظم وأزله بمقص حاد وأزيله. يمكن إزالة ماطر دورا المكشوفة أو الاحتفاظ بها سليمة ل impantation من النافذة القحفية.
- ضع غطاء زجاجي قطره 3-5 مم يحمل سيليكون شفاف فوق فغر القحف. استخدام مسواك لدفع نافذة الجمجمة بلطف على سطح الدماغ. ثم ختم الحافة مع كمية صغيرة من لاصقة السيليكون.
ملاحظات: بدلا من ذلك، بدلا من قرص السيليكون، يمكن استخدام 1.2٪ منخفضة نقطة انصهار هلام agarose بين الزجاج الغطاء وأنسجة الدماغ. - وأخيرا، ختم حواف غطاء مع أسمنت الأسنان. الحرص على تطبيق الاسمنت قليلا على حافة النافذة القحفية لارتباط قوي. إرفاق لوحة رأس معدنية مصنوعة خصيصا إلى الجمجمة مع أسمنت الأسنان.
ملاحظة: يتم استخدام لوحة معدنية لإصلاح رأس الماوس إلى مرحلة المجهر 2-P أثناء جلسة التصوير(الشكل 1C). - أضف 0.5 مل من محلول ACSF على الغطاء على النافذة القحفية لغمر الماء أثناء التصوير.
- أداء الفاصل الزمني في تصوير فيفو 2-P من mito-GCaMP5G في الخلايا الفلكية وmito-GCaMP6s في الخلايا العصبية مع الطول الموجي 910 نانومتر من خلال نافذة الجمجمة (الشكل 1C)18,20,27.
ملاحظة: أثناء التصوير، الفئران على لوحة التدفئة للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية. سيتم التضحية بالفئران فور الانتهاء من جلسة التصوير. - تسمية الخلايا الفلكية في الجسم الحي مع سولفورهودامين 101 (SR101) عندما يكون من الضروري تحديد كولوكاليد.
- في نهاية الخطوة 3.3.4، ضعي 100 ميكرولتر من 100 ميكرومتر SR101 في ACSF على السطح القشري لمدة 1-5 دقائق.
- شطف السطح مع ACSF لغسل SR101 غير منضم. باستخدام التصوير 2-P، يمكن ملاحظة المشاركة في وضع العلامات من mito-GCaMP5G و SR101 في الخلايا الفلكية 45-60 دقيقة في وقت لاحق(الشكل 4A).
- تخدير الماوس مع 3٪ isoflurane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذه الدراسة لتوفير منهجية لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + إشارات باستخدام GECIs في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي. يتم تقديم نتائج كل من المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير هنا.
في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + الإشارة في الخلايا الفلكية المستزرعة والخلايا العصبية
يمكن الحصول على الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية عن طريق تطبيق ATP، ويمكن الحصول على امتصاص الميتوكوندريا Ca2+ في الخلايا العصبية عن طريق تطبيق الغلوتامات والجليسين من خلال نظام التروية. الشكل 2 والشكل 3 تظهر GCaMP6s يتم التعبير عنها في الخلايا الفلكية المستزرعة وGCaMP5G في الخلايا العصبية، على التوالي. وقد أثار الميتوكوندريا كا2 + امتصاص في الخلايا الفلكية من قبل 100 μM ATP مع قرار واحد الميتوكوندريا(الشكل 2B-D). وقد أثار الميتوكوندريا Ca2 + الإقبال في الخلايا العصبية من قبل 100 ميكرومتر الغلوتامات و 10 ميكرومتر الجليسين مع قرار واحد الميتوكوندريا (الشكل 3B-D).
في تصوير الجسم الحي 2-P للتعبير الميتوكوندريا من GCaMP5G أو 6S في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية
يتم التصوير عن طريق جمع الفاصل الزمني في تصوير vivo 2-P للإشارات الفلورية الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية مع نظام المجهر Ultima 2-P. نحن نستخدم الطول الموجي الإثارة 880-910 نانومتر. يظهر الشكل 4 التعبير عن GCaMP5G في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية في قشرة الماوس. تم تأكيد التعبير عن الخلايا الفلكية الخاصة GCaMP5G من خلال كولوكالنج SR101 مع GCaMP5G مع قرار الميتوكوندريا واحد (الشكل 4A)، ويمكن ملاحظة عفوية Ca2 + التغييرات في الميتوكوندريا الفردية (الشكل 4B-E). الشكل 5A يظهر تعبير الخلايا العصبية محددة من ميتو-GCaMP6s كولوكال مع علامة الخلايا العصبية NeuN. الفلورية من mito-GCaMP6s في الخلايا العصبية يظهر مورفولوجيا الميتوكوندريا في dendrites (الشكل 5B). يمكن ملاحظة الميتوكوندريا التلقائية Ca2 + الزيادات في التشعبات(الشكل 5C-F).
تحليل الميتوكوندريا Ca2+ إشارات
قياس الإشارات الفلورية عن طريق حساب متوسط كثافة بكسل من جسم الخلية أو الميتوكوندريا الفردية في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام برنامج تحليل الصور. Ca2+ يتم التعبير عن التغييرات الإضافية (t) كقيم F/Fo (t) مقابل الوقت، حيث يكون Fo هو مضان خط الأساس مطروحا من الخلفية وF هو تغيير الفلورية مطروحا من خط الأساس20،21. استخدم قيم F/Fo القصوى لمقارنة سعة إشارات Ca2+.
الشكل 1: الحمض النووي يبني ل astrocyte- والخلايا العصبية محددة الميتوكوندريا استهداف التعبير المتحول, وفي التصوير في الجسم الحي 2-P. (A) يبني الحمض النووي من المشفرة وراثيا كا2 + مؤشر GCaMP5G أو GcaMP6s في pZac2.1 البلازميد مع gfaABC1D (حتى) وCaMKII (منخفضة) المروجين لتسليمها إلى مصفوفة الميتوكوندريا الفلكية والخلايا العصبية، على التوالي. يتم تحقيق استهداف الميتوكوندريا باستخدام تسلسل محدد لمصفوفة الميتوكوندريا (MM) (ميتو) ملحق بالنهاية N للبروتينات الفلورية. (ب)استئصال القحف فوق قشرة الفأر. (ج)يتم إرفاق جمجمة فأر بلوحة معدنية متصلة بالوظيفة الثابتة على خشبة مسرح المجهر 2-P. تظهر اللوحة الداخلية النافذة القحفية مع لوحة معدنية متصلة بالجمجمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الميتوكوندريا Ca2+ تصوير الخلايا الفلكية المستزرعة. (A-B) صورة 2-P لخلايا أسترة تعبر عن mito-GCaMP6s(A)واستجابتها لتحفيز 100 μM ATP في الوقت المحدد(B). (ج) صور من mito-GCaMP6s في الميتوكوندريا الفردية الأربعة (في A, دوائر) في أوقات مختلفة بعد التحفيز ATP. (D)الدورات الزمنية للتغيرات الفلورية mito-GCaMP6s، كما رسمت ΔF / Fo، في الميتوكوندريا الفردية الأربعة بعد التحفيز ATP. يشير السهم الأحمر إلى وقت بدء التصوير. مقياس الألوان الزائفة هو تمثيل خطي لشدة الفلورسينس في هذا الشكل وغيره. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الميتوكوندريا Ca2+ التصوير من الخلايا العصبية المستزرعة. (أ-ب) صورة 2-P من mito-GCaMP5G التعبير عن الخلايا العصبية(A)واستجابتها ل100 ميكرومتر الغلوتامات و 10 ميكرومتر الجليسين في الوقت المشار إليه (B). (ج) صور من mito-GCaMP5G في الميتوكوندريا الفردية الأربعة (في A, دوائر) في أوقات مختلفة بعد التحفيز الغلوتامات. (د)الدورات الزمنية للتغيرات مضان ميتو-GCaMP5G في الميتوكوندريا الفردية الأربعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: في تصوير vivo 2-P من الميتوكوندريا Ca2 + الإشارات في الخلايا الفلكية. (A) 2-P صور mito-GCaMP5G التعبير عن الخلايا الفلكية كولوكالIZED مع SR101. (B-C) 2-P صورة من الخلايا الفلكية التعبير عن mito-GCaMP5G لتحليل عفوية Ca2+ زيادة. (C-E) صور mito-GCaMP5G في الميتوكوندريا الفردية الأربعة في الخلايا الفلكية (في B، الدوائر) في أوقات مختلفة (C) والدورات الزمنية للتغيرات الفلورية mito-GCaMP5G، المرسومة باسم ΔF/Fo، في الميتوكوندريا الفردية الأربعة (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: في الجسم الحي 2-P التصوير من الميتوكوندريا Ca2+ الإشارات في الخلايا العصبية. (A) كولوكالينج من GCaMP6s (العليا) مع علامة الخلايا العصبية نيون (وسط) في الدماغ. (ب) صور عالية الدقة من dendrites التعبير عن GCaMP6s مع مورفولوجيا الميتوكوندريا (المشار إليها من قبل * ق). (C) GCaMP6s أعرب في الميتوكوندريا العصبية. (D-F) تحليل عفوية الميتوكوندريا Ca2+ زيادة في الخلايا العصبية. الزائفةصورة 2-P من الميتوكوندريا التعبير عن mito-GCaMP6s في C في أوقات مختلفة (D). صور mito-GCaMP6s في الميتوكوندريا الفردية الأربعة في C (دوائر) في أوقات مختلفة(E-F)والدورات الزمنية للتغيرات الفلورية mito-GCaMP6s ، المرسومة باسم ΔF / Fo ، في الميتوكوندريا الفردية الأربعة(F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم: الميتوكوندريا Ca2+ الزيادات على أساس التغييرات الفلورية GCaMP5G استجابة ل100 μM ATPفي الخلايا الفلكية المثقفة. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة وبروتوكول لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + إشارات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. قمنا بتنفيذ استراتيجيات استهداف الميتوكوندريا ونوع الخلية الخاصة للتعبير عن GECI GCaMP5G/6s. لاستهداف GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا، أدرجنا تسلسل استهداف الميتوكوندريا في البلازميدات. للتعبير عن GCaMP5G/6s في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في الجسم الحي، أدخلنا gfaABC1D المروج الخلايا الفلكية محددة والخلايا العصبية محددة المروج CaMKII في البلازميدات. يمكن تأكيد التعبير الخاص من نوع الخلية من GCaMP5G/6s في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية عن طريق وضع العلامات SR101 في الخلايا الفلكية والتأنيم المناعي للخلايا العصبية مع NeuN. من بياناتنا، توفر هذه الاستراتيجيات نهجا محددا موثوقا به لنوع الخلية للتصوير Mitochondrial Ca2+ في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في الجسم الحي.
مشكلة محتملة واحدة للتعبير GECI هو أنه قد يسبب Ca2 + التخزين المؤقت لأنه قد يقلل Ca2 + حرة بواسطة ربط Ca2 +. وثمة مشكلة أخرى يمكن الاهتمام بها وهي كمية الفيروس المحقون. قد لا يتم تحديد الخلايا الفردية التي تعبر عن GECI إذا تم حقن فيروس مفرط. ويمكن تحسين هذه المشاكل بشكل فعال عن طريق الحد من titer من AAV. قد يكون Photobleaching أيضا مشكلة. نظريا، جميع مؤشرات الفلورسنت عرضة للbleaching. GCaMP5G/6s مستقرة تماما، لكنها سوف تبيض تحت التعرض المستمر للضوء الإثارة. إحدى الممارسات العامة لتجنب photobleaching هو تقليل وقت تعرض الأنسجة للضوء الليزر مع ضمان ما يكفي من الفلورسينس يتم جمعها. ويمكن تحقيق ذلك إذا استخدمت PMTs عالية الحساسية وأهداف انتقال الضوء العالي. يمكن أيضا تقليل Photobleaching عن طريق إغلاق الغالق بين الصور.
في نتائجنا للتصوير الحي 2-P ، يمكن ملاحظة زيادات الميتوكوندريا التلقائية في كل من الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الميتوكوندريا Ca2 + العابرين لها فترات طويلة (الشكل 4E والشكل 5E)، بما يتفق مع تقرير صدر مؤخرا عن Gobel وآخرون. والآلية الأساسية لهذه الظاهرة ليست واضحة ولكنها جديرة بمواصلة متابعتها. للسيتوسوليك Ca2+ زيادة, الخلايا الفلكية والخلايا العصبية لديها آليات مختلفة. تسبب محفزات مستقبلات البروتين GCa 2+ زيادة في الطوارئ في الخلايا الفلكية في حين أن تنشيط قنوات Ca2 + المسورة بالجهد أو مستقبلات الغلوتامات يسبب زيادة في الخلايا العصبية Ca2 + ، والتي يمكن امتصاصها من قبل الميتوكوندريا. في دراستنا السابقة20، وجدنا أنه عندما تم cotransfected mito-GCaMP5G مع IP3 5-phosphatase (5ppase) الخلايا الفلكية المستزرعة ، يمكن إلغاء الميتوكوندريا الناجمة عن ATP Ca2 + الزيادة إلى حد كبير. ومع ذلك ، فإن اثنين من المسوخ من 5ppase ، أي R343A و R343A /R350A 5ppase ، والتي تفتقر إلى النشاط الأنزيمي ، لم تؤثر على زيادة الميتوكوندريا Ca2 + بعد تحفيز ATP. تشير هذه النتائج إلى أن مستويات السيتوسول والميتوكوندريا Ca2+ مقرونة إلى حد كبير ، على الأرجح بسبب الصلة الجسدية الحميمة بين ER والميتوكوندريا في الخلايا الفلكية ، مع السيتوسول بمثابة قناة وسيطة لتسليم Ca2 + . وجدنا أيضا أن تحفيز الغلوتامات تسبب في زيادة الميتوكوندريا Ca2+ في الخلايا العصبية ، مما يشير إلى أن مستقبلات الغلوتامات تلعب دورا في دخول Ca2 + من الفضاء خارج الخلية. في المستقبل، سيكون من المثير للاهتمام لدراسة الحسية يحركها الميتوكوندريا Ca2 + الزيادات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
ويمكن استخدام نهجنا لتصوير الإشارات الخلوية والميتوكوندريا Ca2 + في نفس نوع الخلية في نفس الوقت عندما يتم التعبير عن اثنين من GECIs من أطوال موجية مضان مختلفة، على سبيل المثال، وفلوريسانس الأحمر GECI RCaMP في السيتوبلازم وGCaMP في الميتوكوندريا، أو العكسبالعكس 31. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج لدراسة في الجسم الحي من التفاعلات بين الخلايا العصبية الفلكية في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض مع GCaMP أعرب في الخلايا الفلكية وRCaMP في الخلايا العصبية، أو العكس بالعكس.
GCaMP هو GFP القائم على الطول الموجي واحد الفلوروفوري GECI. حاليا، GCaMPs هي مؤشرات Ca2+ المفضلة بسبب نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية (SNR) والنطاقات الديناميكية الكبيرة (DR). في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أجهزة استشعار jGCaMP7 ، الإصدار الأمثل من GCaMP6 ، مع تحسين الحساسية للمسامي الفردية16. يمكن أن تكون أجهزة الاستشعار GCaMP7 subcloed بسهولة في البلازميدات لدينا للتصوير Ca2 + الميتوكوندريا. باختصار، يمكن استخدام الاستراتيجيات التي قدمناها هنا لتصوير امتصاص الميتوكوندريا Ca2+ والتعامل معها في الخلايا العصبية والخلايا الفلكية مع حساسية كافية لحل تغييرات Ca2+ على مستوى الميتوكوندريا الواحد في الجسم الحي. يمثل هذا البروتوكول وسيلة مفيدة لدراسة الإشارات الخلوية والميتوكوندريا Ca2+ في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية ، وكذلك التفاعلات بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) منح R01NS069726 وR01NS094539 إلى SD. نشكر إيريكا ديمرس على التسجيل الصوتي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
