Summary
该proctocol旨在为星形胶质细胞和神经元 中的体外 和 体内 线粒体Ca2 + 成像提供一种方法。
Abstract
线粒体Ca2+在控制细胞质Ca2+缓冲、能量代谢和细胞信号转导中起着关键作用。线粒体Ca2 +超载导致各种病理状况，包括神经变性和神经系统疾病中的凋亡细胞死亡。在这里，我们提出了一种细胞类型特异性和线粒体靶向分子方法，用于体外和体内星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca2 +成像。我们构建了编码线粒体靶向的Ca2 +指示素（GECIs）GCaMP5G或GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的DNA质粒，具有星形胶质细胞和神经元特异性启动子gfaABC1D和CaMKII以及线粒体靶向序列（mito-）。对于体外线粒体Ca2 +成像，质粒在培养的星形胶质细胞和神经元中转染以表达GCaMP5G / 6s。对于体内线粒体Ca2 +成像，制备腺相关病毒载体（AAV）并将其注射到小鼠大脑中，以在星形胶质细胞和神经元的线粒体中表达GCaMP5G / 6s。我们的方法提供了一种有用的方法来成像星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca2 +动力学，以研究细胞质和线粒体Ca2 +信号传导之间的关系，以及星形胶质细胞 - 神经元相互作用。
Introduction
线粒体是动态的亚细胞器，被认为是能量产生的细胞动力源。另一方面，线粒体可以响应局部或胞质Ca2 +上升而吸收基质中的Ca2 +。线粒体Ca2+摄取影响线粒体功能，包括代谢过程，如三羧酸（TCA）循环的反应和氧化磷酸化，并在生理条件下调节Ca2 +敏感蛋白1，2，3，4。线粒体Ca2 +超载也是细胞死亡的决定因素，包括各种脑部疾病5，6，7中的坏死和凋亡。它导致线粒体通透性过渡孔（mPTPs）的打开和半胱天冬酶辅因子的释放，从而引发凋亡细胞死亡。因此，研究活细胞中的线粒体Ca2 +动力学和处理非常重要，以更好地了解细胞生理学和病理学。
线粒体通过Ca2+摄取和流出之间的平衡来维持基质Ca2 +稳态。线粒体Ca2 +摄取主要由线粒体Ca2 +单转运体（MCU）介导，而线粒体Ca2 +外排由Na+-Ca2 +-Li+交换子（NCLXs）和H+/ Ca2 +交换子（mHCXs）8介导。平衡可以通过刺激G蛋白偶联受体（GPCRs）来干扰9。线粒体Ca2 +稳态也受线粒体缓冲的影响，形成不溶性xCa2 +-xPO4x-xOH复合物8。
细胞内和线粒体中Ca2+浓度（[Ca2+]）的变化可以通过荧光或发光Ca2+指示剂进行评估。Ca2+与指示剂的结合导致光谱修饰，允许在活细胞中实时记录游离细胞[Ca2+]。目前有两种类型的探针可用于监测细胞中的Ca2 +变化：有机化学指示剂和遗传编码的Ca2 +指示剂（GECI）。通常，对于所研究的生物学问题，可以使用具有不同Ca2 +亲和力（基于Kd），光谱特性（激发和发射波长），动态范围和灵敏度的不同变体。虽然许多合成的有机Ca2+指示剂已被用于胞质Ca2+成像，但只有少数可以选择性地加载到线粒体基质中用于线粒体Ca2+成像，其中Rhod-2是使用最广泛的（评论见10，11）。然而，Rhod-2在长时间的实验中存在泄漏的主要缺点;此外，它在线粒体，其他细胞器和细胞质基质之间分配，使得不同亚部门的绝对测量变得困难。相反，通过使用细胞型特异性启动子和亚细胞区室靶向序列，GECI可以在不同的细胞类型和亚细胞区室中表达，以便在体外或体内进行细胞和区室特异性Ca2 +成像。基于单波长荧光强度的GCaMP Ca2+指标最近成为GECIs的主要指标12、13、14、15、16。在本文中，我们提供了星形胶质细胞和神经元中GCaMP5G和GCaMP6s（GCaMP5G / 6s）的线粒体靶向和细胞类型特异性表达的方案，以及成像这些细胞类型中的线粒体Ca2 +摄取。使用该协议，可以揭示单个线粒体中GCaMP6G / 6s的表达，并且可以在体外和体内的星形胶质细胞和神经元中实现单个线粒体分辨率中的Ca2 +摄取 。
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Protocol
涉及动物的程序已获得密苏里大学哥伦比亚分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. DNA质粒的构建
注意：对于 体外 和 体内 成像，构建编码GCaMP5G / 6s的DNA质粒与星形胶质细胞和神经元特异性启动子以及线粒体靶向序列。
- 将线粒体基质（MM）靶向序列（mito-）插入ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCCCAA GATCCATTCGTTG 17到腺相关病毒（AAV）质粒pZac2.1骨架中的克隆位点EcoRI和BamHI中，以获得含有星形细胞gfaABC1D启动子或神经元CaMKII启动子18，19，20的质粒。
- 亚克隆GCaMP5G/6s进入克隆位点BamH I和Not 1中的上述质粒，得到新的质粒pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s和pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s，靶向星形胶质细胞和神经元中线粒体中的转基因表达20，21（图1A）。
- 制备pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G和pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA质粒用于 体外 研究转染（第2节）。产生AAV载体，血清型5用于星形胶质细胞，血清型9用于神经元，用于 体内 研究18（ 第3节）。
2. 星形胶质细胞和神经元中的 体外 线粒体Ca2+ 成像
- 准备来自P1新生小鼠皮层的原代星形胶质细胞和来自E15-16胚胎18，22，23，24皮层的原代神经元，并使用含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）和含有2%B27的神经元基础培养基（NBM）在24孔板中培养它们， 分别。
- 使用基于脂质的转染试剂，用pZac-gfaABC1D-GCaMP6s和pZac-CaMKII-GCaMP5G质粒转染成熟的星形胶质细胞和神经元，以表达星形胶质细胞线粒体中的GCaMP6s和神经元线粒体中的GCaMP5G 18，20，21。用0.5μgDNA转染每个孔中的细胞，并在6小时后更换培养基。
注意：星形胶质细胞和神经元在转染后1-2天准备好进行成像。 - 转染后1-2天进行体外线粒体Ca 2 +成像。
- 将用星形胶质细胞或神经元培养的玻璃盖玻片转移到落射荧光或两个光子显微镜下的PH-1灌注室。
- 在ACSF中用100μM ATP刺激星形细胞线粒体Ca2 +摄取，或用100μM谷氨酸/ 10μM甘氨酸20，25刺激神经元线粒体（图2和图3）。
注：溶液从ACSF到ATP-和谷氨酸/含甘氨酸的ACSF的变化由ALA-VM8灌注系统21控制。通过调节阀门，溶液变化的速度控制在1-2 mL / min。
3. 星形胶质细胞和神经元中的 体内 线粒体Ca2+ 成像
- AAV准备工作。
- 使用第1节中制备的DNA质粒制备以下重组腺相关病毒（rAAV）载体：rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G和rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s载体。
注意：在本实验中，制备了血清型5的rAAV载体以在星形胶质细胞的线粒体中表达GCaMP5G，并且制备了血清型9的rAAV载体以在神经元的线粒体中表达GCaMP6s。
- 使用第1节中制备的DNA质粒制备以下重组腺相关病毒（rAAV）载体：rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G和rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s载体。
- 立体定位 AAV 注入。
- 用3%异氟醚麻醉小鼠。
注意：在手术后期，异氟醚水平降低到2%。 - 在小鼠达到手术麻醉水平后，如尾巴和脚趾捏合所决定的那样，用修剪器将毛发剃除在手术部位，运动或躯体感觉皮层上。
- 将鼠标放在鼠标立体定位设备上，并用耳杆固定头部。在手术过程中将眼药膏涂抹在眼睛上以保护眼睛。在整个手术过程中，使用加热垫将小鼠的体温保持在37°C。
注意：使用无菌程序进行手术。所有手术工具都需要通过高压灭菌或热珠灭菌器进行灭菌。 - 将鼠标安装在立体定位装置上后，用交替的碘基磨砂膏和70%乙醇对头皮进行消毒三次。在头皮中线做一个切口，露出注射部位。
- 在bregma-lamda轴上切开皮肤，并在电机或躯体感觉皮层的预期注射位置用高速钻头创建一个〜1mm直径的毛刺孔。
- 使用含有腺相关病毒（rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G 载体 [1 x 1011 GC] 或 rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s 载体 [1 x 10 11 GC]）的33 G Hamilton 注射器在靶区注射多达 1 μL 病毒。
注意：例如，对于皮质病毒递送，分多个步骤在两个深度注射病毒溶液。首先，将针头插入距硬脑膜1毫米的深度，并允许5分钟让大脑恢复。然后，将针头向上移动至~700μm深度，并使用由微注射器泵控制器控制的汉密尔顿注射器以10 nL / s的注射速度注入500 nL病毒溶液。注射完成后，等待5分钟，让病毒扩散到大脑中。然后，将针头向上移动到深度为300μm的第二个注射位置。在这里，再注射500 nL的病毒溶液。等待10分钟，让病毒扩散到大脑中。 - 使用组织粘合剂关闭头皮和皮肤。让小鼠在加热垫上恢复。恢复后将小鼠送回动物设施。
- 用3%异氟醚麻醉小鼠。
- 线粒体Ca 2+信号的颅窗安装和 体内双光子（2-P） 成像。
注意：颅窗植入在AAV注射后3周在运动或躯体感觉皮层26，27，28，29上进行。卡洛芬（10mg / kg）皮下注射，以缓解手术前的潜在疼痛。颅窗外科手术与AAV注射外科手术相同，并且在无菌条件下进行。- 用3%异氟醚麻醉小鼠。
注意：这是初始剂量，以后的手术减少到2%。在成像过程中，腹膜内注射130mg氯胺酮/ 10mg木屈嗪/ kg体重溶解在ACSF中用于麻醉。 - 将鼠标放在鼠标立体定位设备上，并用耳杆固定头部。将眼药膏涂抹在眼睛上。在整个手术过程中，使用加热垫将小鼠的体温保持在37°C。
注意：所有手术工具都需要消毒。 - 在头皮中线做一个5-8毫米长的切口，用一把剪刀去除皮瓣。
- 颅骨暴露后，使用高速钻头在病毒注射区域（即运动皮层或躯体感觉皮层， 图1B）上进行直径2.0-3.0毫米的开颅手术。首先，做四个小孔，然后沿着连接孔的圆圈钻孔。然后，用锋利的剪刀抬起并取出骨头并移除。暴露的硬脑膜可以被移除或保持完整，以插入颅窗。
- 将直径为3-5毫米的玻璃盖玻片放在开颅手术上，并在开颅手术上携带透明硅胶。用牙签将颅窗轻轻推到大脑表面。然后，用少量硅胶粘合剂密封边缘。
注意：或者，可以在盖玻片和脑组织之间使用1.2%的低熔点琼脂糖凝胶代替硅胶盘。 - 最后，用牙胶密封盖玻片的边缘。小心将水泥稍微涂抹在颅窗的边缘，以牢固粘合。用牙胶将定制的金属头板连接到颅骨上。
注：金属板用于在成像过程中将鼠标头部固定在2-P显微镜的载物台上（图1C）。 - 在颅窗的盖玻片上加入0.5 mL ACSF溶液，以便在成像过程中浸入水中。
- 在星形胶质细胞中对丝裂-GCaMP5G和丝裂GCaMP6s中的神经元进行延时2-P成像，波长为910nm，通过颅窗（图1C）18，20，27。
注意：在成像过程中，小鼠在加热垫上以保持生理温度。小鼠将在成像过程结束后立即被处死。 - 当需要确定共定位时，用磺酰罗达明101（SR101） 在体内 标记星形胶质细胞。
- 在步骤3.3.4结束时，在皮质表面上将100μL100μM SR101在ACSF中施用1-5分钟。
- 用ACSF冲洗表面，洗去未绑定的SR101。使用2-P成像，可以在45-60分钟后观察到星形胶质细胞中mito-GCaMP5G和SR101的共同标记（图4A）。
- 用3%异氟醚麻醉小鼠。
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Representative Results
本研究的目的是提供一种方法，在体外和体内使用星形胶质细胞和神经元中的GECI对线粒体Ca2 +信号进行成像。本文给出了体外和体内线粒体Ca2 +成像的结果。
培养的星形胶质细胞和神经元中的体外线粒体Ca2 +信号传导
星形胶质细胞中的线粒体Ca2 +摄取可以通过ATP应用引起，神经元中的线粒体Ca2 +摄取可以通过灌注系统通过谷氨酸和甘氨酸应用引起。图2和图3显示GCaMP6分别在神经元中培养的星形胶质细胞和GCaMP5G中表达。星形胶质细胞中的线粒体Ca2 +摄取由具有单个线粒体分辨率的100μM ATP引发（图2B-D）。具有单线粒体分辨率的100μM谷氨酸和10μM甘氨酸诱导神经元中的线粒体Ca2 +摄取（图3B-D）。
星形胶质细胞和神经元中GCaMP5G或6S线粒体表达的体内2-P成像
成像是通过用Ultima 2-P显微镜系统收集星形胶质细胞和神经元中线粒体荧光信号的体内2-P延时成像来完成的。我们使用880-910nm的激发波长。图4显示了GCaMP5G在小鼠皮层星形胶质细胞中线粒体中的表达。GCaMP5G的星形胶质细胞特异性表达通过SR101与具有单线粒体分辨率的GCaMP5G共定位得到证实（图4A），并且可以观察到个体线粒体的自发Ca2 +变化（图4B-E）。图5A显示了与神经元标志物NeuN共定位的丝裂-GCaMP6的神经元特异性表达。神经元中丝裂-GCaMP6s的荧光显示了树突中的线粒体形态（图5B）。可以观察到树突中的自发线粒体Ca2 +增加（图5C-F）。
分析线粒体 Ca2+ 信号
通过使用图像分析软件计算星形胶质细胞和神经元中细胞体或单个线粒体的平均像素强度来量化荧光信号。Ca2+的加班变化（t）表示为F/Fo（t）值与时间的关系，其中Fo是背景减去的基线荧光，F是基线减去的荧光变化20，21。使用峰值 F/Fo 值来比较 Ca2+信号的幅度。
图1：用于星形胶质细胞和神经元特异性线粒体靶向转基因表达的DNA构建体，以及体内2-P成像。（A）pZac2.1质粒中遗传编码的Ca2 +指示剂GCaMP5G或GcaMP6s的DNA构建体分别具有gfaABC1D（向上）和CaMKII（低）启动子，分别递送到星形细胞和神经元线粒体基质。线粒体靶向是使用附加在荧光蛋白N端的线粒体基质（MM）特异性序列（mito）实现的。（B） 在小鼠皮层上进行开颅手术。（C）将小鼠的头骨连接到连接到固定在2-P显微镜载物台上的柱子的金属板上。插图显示了颅窗，颅骨上有一块金属板。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：培养的星形胶质细胞的线粒体Ca2 +成像（A-B）表达丝裂-GCaMP6s（A）的星形胶质细胞的2-P图像及其在指定时间（B）对100μM ATP刺激的反应。（C） 在 ATP 刺激后不同时间，四个单个线粒体（A，圆圈）中的有丝分裂-GCaMP6 的图像。（D）有丝分裂-GCaMP6s荧光变化的时间过程，绘制为ΔF / Fo，在ATP刺激后的四个线粒体中。红色箭头表示成像的开始时间。伪彩色刻度是此图和其他图中荧光强度的线性表示。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：培养神经元的线粒体Ca2 + 成像。 （A-B）表达神经元（A）的丝裂GCaMP5G的2-P图像及其在指定时间（B）对100μM谷氨酸和10μM甘氨酸的反应。（C） 谷氨酸刺激后不同时间四个线粒体（A，圆圈）中丝粒体-GCaMP5G的图像。（D）水润-GCaMP5G荧光在四个个体线粒体中的变化时间过程。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：星形胶质细胞中线粒体Ca2 +信号传导的体内2-P成像。 （A） 表达有丝分裂GCaMP5G的星形胶质细胞与SR101共定位的2-P图像。（B-C） 表达丝裂-GCaMP5G的星形胶质细胞的2-P图像，用于分析自发Ca2 +增加。（C-E）在星形胶质细胞（B，圆圈）中四个个体线粒体中，不同时间（C）的mito-GCaMP5G的图像以及Mito-GCaMP5G荧光变化的时间过程的图像，绘制为ΔF / Fo，在四个个体线粒体（E）中。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：神经元中线粒体Ca2 +信号传导的体内2-P成像（A）GCaMP6s（上部）与神经元标志物NeuN（中）在大脑中的共定位。（B） 具有线粒体形态的表达GCaMP6s的树突的高分辨率图像（由*s表示）。（C）GCaMP6s在神经元线粒体中表达。（D-F）分析神经元中自发线粒体Ca2 +增加。线粒体在不同时间（D）在C中表达水痘-GCaMP6s的伪彩色2-P图像。在不同时间（E-F）和丝裂-GCaMP6s荧光变化的时间过程中，在C（圆圈）的四个单个线粒体中，有丝粒体-GCaMP6s的图像，绘制为ΔF / Fo，在四个单独的线粒体（F）中。请点击此处查看此图的放大版本。
视频：线粒体Ca2+根据GCaMP5G荧光变化增加，响应培养的星形胶质细胞中100 μ M ATP。请点击这里下载此视频。
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Discussion
在本文中，我们提供了一种用于成像星形胶质细胞和神经元中线粒体Ca2 +信号的方法和方案。我们实施了线粒体靶向和细胞类型特异性策略来表达GECI GCaMP5G / 6s。为了靶向线粒体中的GCaMP5G / 6s，我们在质粒中加入了线粒体靶向序列。为了在体内星形胶质细胞和神经元中表达GCaMP5G/6s，我们将星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D和神经元特异性启动子CaMKII插入质粒中。星形胶质细胞和神经元中GCaMP5G/6s的细胞类型特异性表达可以通过星形胶质细胞中的SR101标记和NeuN神经元的免疫染色来证实。根据我们的数据，这些策略为体内星形胶质细胞和神经元中的线粒体Ca2 +成像提供了一种可靠的细胞类型特异性方法。
GECI表达的一个潜在问题是它可能导致Ca2 + 缓冲，因为它可能会通过Ca2 + 结合减少游离Ca2 +。 另一个可能要注意的问题是注射的病毒量。如果注射过多的病毒，则可能无法识别表达GECI的单个细胞。这些问题可以通过降低AAV的滴度来有效改善。光漂白也可能是一个问题。从理论上讲，所有荧光指示剂都会受到光漂白的影响。GCaMP5G/ 6s非常稳定，但在连续暴露于激发光下会漂白。避免光漂白的一种一般做法是减少组织暴露在激光下的时间，同时确保收集足够的荧光。如果使用高灵敏度PMT和高透光物镜，则可以实现这一点。也可以通过关闭图像之间的快门来减少光漂白。
在我们的体内2-P成像结果 中 ，可以在星形胶质细胞和神经元中观察到自发的线粒体增加。值得注意的是，这些线粒体Ca2 + 瞬变具有较长的持续时间（图4E 和 图5E），与Gobel等人最近的一份报告一致。这种现象的潜在机制尚不清楚，但值得进一步探讨。对于细胞质Ca2 + 的增加，星形胶质细胞和神经元具有不同的机制。G蛋白受体刺激导致星形胶质细胞中Ca2 +ER 增加，而电压门控Ca2 + 通道或谷氨酸受体的激活导致细胞质Ca2 + 神经元增加，其可以被线粒体吸收。在我们之前的研究20中，我们发现当Mito-GCaMP5G与IP3 5-磷酸酶（5ppase）培养的星形胶质细胞共转染时，ATP诱导的线粒体Ca2 + 增加可以在很大程度上被消除。然而，缺乏酶活性的5ppase的两个突变体，即R343A和R343A / R350A 5ppase，不影响ATP刺激后的线粒体Ca2 + 增加。这些结果表明，细胞质和线粒体Ca2 + 水平是高度耦合的，可能是因为星形胶质细胞中ER和线粒体之间的密切物理连接，细胞质基质作为Ca2 + 递送的中间管道。我们还发现谷氨酸刺激导致线粒体Ca2 + 神经元增加，这表明谷氨酸受体在Ca2 + 从细胞外空间进入中起作用。将来，研究星形胶质细胞和神经元中感觉驱动的线粒体Ca2 + 增加将会很有趣。
当表达两个不同荧光波长的GECI时，我们的方法可用于同时对同一细胞类型的胞质和线粒体Ca2 + 信号进行成像，例如，细胞质中的红色荧光GECI RCaMP和线粒体中的GCaMP，反之亦然31。这种方法也可用于生理学和病理学中星形胶质细胞 - 神经元相互作用的 体内 研究，GCaMP在星形胶质细胞中表达，在神经元中表达RCaMP，反之亦然。
GCaMP是一种基于GFP的单波长荧光团GECI。目前，GCaMP是最受欢迎的Ca2+指标，因为它们具有高信噪比（SNR）和大动态范围（DR）。最近，JGCaMP7传感器（GCaMP6的优化版本）被报道对单个尖峰的灵敏度有所提高16。GCaMP7传感器可以很容易地在我们的质粒中亚克隆，用于线粒体Ca2 +成像。总之，我们在这里提出的策略可用于成像神经元和星形胶质细胞中的线粒体Ca2 +摄取和处理，具有足够的灵敏度，以解决体内单个线粒体水平的Ca2 +变化。该协议代表了研究星形胶质细胞和神经元中的细胞质和线粒体Ca2 +信号传导以及星形胶质细胞 - 神经元相互作用的有用方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所（NINDS）资助的R01NS069726和R01NS094539到SD。我们感谢Erica DeMers的录音。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
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