Summary
Denne proctocol har som mål å gi en metode for in vitro og in vivo mitokondrie Ca2 + avbildning i astrocytter og nevroner.
Abstract
Mitokondrie Ca2+ spiller en kritisk rolle i å kontrollere cytosolisk Ca2+ buffering, energimetabolisme og cellulær signaltransduksjon. Overbelastning av mitokondrie Ca2+ bidrar til ulike patologiske forhold, inkludert nevrodegenerasjon og apoptotisk celledød ved nevrologiske sykdommer. Her presenterer vi en celle-type spesifikk og mitokondrier rettet mot molekylær tilnærming for mitokondrie Ca2 + avbildning i astrocytter og nevroner in vitro og in vivo. Vi konstruerte DNA-plasmider som koding av mitokondrier rettet mot genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECIer) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocytt- og nevronspesifikke promotører gfaABC1D og CaMKII og mitokondri-målrettingssekvens (mitokondrier-målrettingssekvens (mitokito-). For in vitro mitokondrie Ca2+ avbildning ble plasmidene transfektert i dyrkede astrocytter og nevroner for å uttrykke GCaMP5G / 6s. For in vivo mitokondrie Ca2+ avbildning ble adeno-assosierte virale vektorer (AAVs) utarbeidet og injisert i musehjernene for å uttrykke GCaMP5G / 6s i mitokondrier i astrocytter og nevroner. Vår tilnærming gir et nyttig middel til å bilde mitokondrie Ca2 + dynamikk i astrocytter og nevroner for å studere forholdet mellom cytosolisk og mitokondrie Ca2 + signalering, samt astrocytt-neuron interaksjoner.
Introduction
Mitokondrier er dynamiske subcellulære organeller og regnes som cellekraftverkene for energiproduksjon. På den annen side kan mitokondrier ta opp Ca2 + til matrisen som svar på lokale eller cytosoliske Ca2 + stiger. Mitokondrie Ca2+ opptak påvirker mitokondriefunksjonen, inkludert metabolske prosesser som reaksjoner i trikarboksylsyre (TCA) syklus og oksidativ fosforylering, og regulerer Ca2 +-sensitive proteiner under fysiologiske forhold1,2,3,4. Mitokondrie Ca2 + overbelastning er også en determinant for celledød, inkludert nekrose og apoptose i ulike hjernesykdommer5,6,7. Det forårsaker åpningen av mitokondrie permeabilitet overgangsporer (mPTPer) og frigjøring av caspase cofactor, som initierer apoptotisk celledød. Derfor er det viktig å studere mitokondrie Ca2 + dynamikk og håndtering i levende celler for å forstå cellulær fysiologi og patologi bedre.
Mitokondrier opprettholder matrise Ca2 + homeostase gjennom en balanse mellom Ca2 + opptak og efflux. Mitokondrie Ca2 + opptak er hovedsakelig formidlet av mitokondrie Ca2 + uniporters (MCUer), mens mitokondrie Ca2 + efflux formidles av Na+-Ca2 +-Li+ vekslere (NCLXs) og H+/ Ca2 + vekslere (mHCXs)8. Balansen kan fortrenges gjennom stimulering av G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs)9. Mitokondrie Ca2+ homeostase påvirkes også av mitokondriebuffering ved dannelsen av uoppløselige xCa2+-xPO4x-xOH-komplekser8.
Intracellulære og mitokondrieendringer i Ca2+ konsentrasjon ([Ca2+]) kan evalueres ved fluorescerende eller lysende Ca2+ indikatorer. Ca2 + binding til indikatorer forårsaker spektrale modifikasjoner, slik at opptak av gratis cellulær [Ca2 +] i sanntid i levende celler. To typer sonder er for tiden tilgjengelige for å overvåke Ca2+ endringer i celler: organiske kjemiske indikatorer og genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECIer). Generelt er forskjellige varianter med forskjellige Ca2+ affiniteter (basert på Kd), spektralegenskaper (eksitasjons- og utslippsbølgelengder), dynamiske områder og følsomheter tilgjengelige for de biologiske spørsmålene som undersøkes. Selv om mange syntetiske organiske Ca2 + indikatorer har blitt brukt til cytosolisk Ca2 + avbildning, kan bare noen få selektivt lastes i mitokondriematrisen for mitokondrie Ca2 + bildebehandling, med Rhod-2 som den mest brukte (for vurderinger se10,11). Rhod-2 har imidlertid en stor ulempe med lekkasje under lange tidskurseksperimenter; I tillegg er det partisjonert mellom mitokondrier, andre organeller og cytosolen, noe som gjør absolutte målinger i forskjellige underkomponenter vanskelig. Ved å bruke celletypespesifikke promotorer og subcellulære rommålrettingssekvenser kan GECIer derimot uttrykkes i forskjellige celletyper og subcellulære rom for celle- og romspesifikke Ca2+ bildebehandling in vitro eller in vivo. Lysstoffintensitetsbaserte GCaMP Ca2+-indikatorer med én bølgelengde har nylig dukket opp som store GECIer12,13,14,15,16. I denne artikkelen tilbyr vi en protokoll for mitokondri-målretting og celletype spesifikt uttrykk for GCaMP5G og GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocytter og nevroner, og bildebehandling av mitokondrie Ca2+ opptak i disse celletypene. Ved hjelp av denne protokollen kan uttrykket av GCaMP6G / 6s i individuelle mitokondrier avsløres, og Ca2 + opptak i enkel mitokondrieoppløsning kan oppnås i astrocytter og nevroner in vitro og in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Missouri-Columbia.
1. Bygging av DNA-plasmider
MERK: For in vitro- og in vivo-avbildning er DNA-plasmider som koder GCaMP5G/6s med astrocytt- og nevronspesifikke promotorer og mitokondriemålrettingssekvenser konstruert.
- Sett inn mitokondriematrise (MM)-målrettingssekvens (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 inn i kloning nettsteder EcoRI og BamHI i ryggraden av adeno-assosiert virus (AAV) plasmid pZac2.1 å oppnå plasmider som inneholder astrocytisk gfaABC1D promotor eller nevronal CaMKII promotør18,19,20.
- Subclone GCaMP5G/6s inn i kloningsstedene BamH I og Ikke 1 i de ovennevnte plasmidene for å få nye plasmider pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s og pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s som retter seg mot transgene uttrykk i mitokondrier i astrocytter og nevroner20,21 (Figur 1A).
- Forbered pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-plasmider for transfeksjon for in vitro-studie (avsnitt 2). Produser AAV-vektorer med serotype 5 for astrocytter og serotype 9 for nevroner for in vivo-studie 18 (avsnitt 3).
2. In vitro mitokondrie Ca2+ avbildning i astrocytter og nevroner
- Forbered primære astrocytter fra cortex av P1 neonatal mus og primære nevroner fra cortex av E15-16 embryoer18,22,23,24, og kultur dem på 12 mm diameter glassdeksler 24-brønnsplater ved bruk av Dulbeccos Modifiserte Ørnemedium (DMEM) som inneholder 10 % foster bovint serum (FBS) og nevronalt basalmedium (NBM) som inneholder 2 % B27, henholdsvis.
- Transfekt modne astrocytter og nevroner med pZac-gfaABC1D-GCaMP6s og pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmider som bruker lipidbasert transfeksjonsreagens for å uttrykke GCaMP6s i mitokondriene til astrocytter og GCaMP5G i mitokondriene til nevroner18,20,21. Transfektceller i hver brønn med 0,5 μg DNA, og endre mediet 6 timer senere.
MERK: Astrocyttene og nevronene er klare til avbildning 1-2 dager etter transfeksjon. - Utfør in vitro mitokondrie Ca2+ avbildning 1-2 dager etter transfeksjon.
- Overfør glassdekslene dyrket med astrocytter eller nevroner til PH-1 perfusjonskammeret under en epifluorescens eller to fotonmikroskop.
- Stimulere astrocytisk mitokondrie Ca2 + opptak med 100 μM ATP i ACSF, eller stimulere nevronal mitokondrier med 100 μM glutamat / 10 μM glycin20,25 ( Figur2 og Figur 3).
MERK: Løsningsendringer fra ACSF til ATP- og glutamat/glycinholdig ACSF styres av et ALA-VM8 perfusjonssystem21. Hastigheten på løsningsendringen styres ved 1-2 ml/min ved å justere en ventil.
3. In vivo mitokondrie Ca2+ avbildning i astrocytter og nevroner
- AAV-forberedelser.
- Forbered følgende rekombinante adeno-assosierte virusvektorer (rAAV) ved hjelp av DNA-plasmidene som er utarbeidet i avsnitt 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-vektorer.
MERK: I dette eksperimentet ble rAAV-vektorer av serotype 5 forberedt på å uttrykke GCaMP5G i mitokondrier i astrocytter og rAAV-vektorer av serotype 9 ble forberedt på å uttrykke GCaMP6s i mitokondrier i nevroner.
- Forbered følgende rekombinante adeno-assosierte virusvektorer (rAAV) ved hjelp av DNA-plasmidene som er utarbeidet i avsnitt 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-vektorer.
- Stereotaxic AAV injeksjon.
- Bedøv musen med 3% isofluran.
MERK: Senere under operasjonen reduseres isoflurannivåene til 2%. - Etter at musen når et kirurgisk nivå av anestesi, som bestemt av hale og tå klemme, barber håret over operasjonsstedet, motoren eller somatosensorisk cortex, med en hårtrimmer.
- Plasser musen på musen stereotaxic enheten og fest hodet med ørestenger. Påfør oftalmisk salve på øynene for å beskytte dem under operasjonen. Bruk en varmepute for å holde kroppstemperaturen til musen ved 37 °C gjennom hele operasjonen.
MERK: Utfør kirurgi ved hjelp av aseptiske prosedyrer. Alle kirurgiske verktøy må steriliseres enten ved autoklavering eller en varm perlesterilisator. - Etter at musen er montert på stereotaxic enheten, steriliser hodebunnen med vekslende jodbasert skrubb og 70% etanol tre ganger. Lag et snitt i midtlinjen i hodebunnen for å eksponere injeksjonsstedet.
- Klipp åpne huden i bregma-lamda-aksen og lag et burrhull med ~1 mm diameter med en høyhastighetsbor på den tiltenkte injeksjonsplasseringen til motoren eller somatosensorisk cortex.
- Bruk en 33 G Hamilton-sprøyte som inneholder adeno-assosiert virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-vektorer [1 x10 11 GC] eller rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer [1 x 1011 GC]) for å injisere opptil 1 μL virus ved målet.
MERK: For eksempel, for kortikale viruslevering, injiser virusløsningen på to dybder i flere trinn. Først setter du nålen inn i en dybde på 1 mm fra dura og la 5 min for hjernen å gjenopprette. Flytt deretter nålen opp til ~ 700 μm dybde og injiser 500 nL av virusoppløsningen med en injeksjonshastighet på 10 nL / s ved hjelp av en hamilton sprøyte kontrollert av en mikrosyringe pumpekontroller. Etter at injeksjonen er fullført, vent i 5 min for å la viruset spre seg inn i hjernen. Flytt deretter nålen opp til det andre injeksjonsstedet med en dybde på 300 μm. Her injiserer du ytterligere 500 nL av virusløsningen. Vent i 10 min for å la viruset spre seg inn i hjernen. - Lukk hodebunnen og huden ved hjelp av et vevslim. La musene komme seg på varmeputen. Send mus tilbake til dyreavdelingen etter utvinning.
- Bedøv musen med 3% isofluran.
- Kranial-vindu intstallering og in vivo to-foton (2-P) bilde av mitokondrie Ca2 + signaler.
MERK: Kranial vindusimplantasjon gjøres 3 uker etter AAV injeksjon over motoren eller somatosensorisk cortex26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) injiseres subkutant for å lindre potensielle smerter før operasjonen. Kranialvinduet kirurgiske prosedyrer er identiske med AAV injeksjon kirurgiske prosedyrer og utføres under aseptiske forhold.- Bedøv musen med 3% isofluran.
MERK: Dette er den første dosen og redusere til 2% for operasjonen senere. Under avbildning brukes en intraperitoneal (IP) injeksjon på 130 mg ketamin/10 mg xylazin/kg kroppsvekt oppløst i ACSF til anestesi. - Plasser musen på musen stereotaxic enheten og fest hodet med ørestenger. Påfør oftalmisk salve på øynene. Bruk en varmepute for å holde kroppstemperaturen til musen ved 37 °C gjennom hele operasjonen.
MERK: Alle kirurgiske verktøy må steriliseres. - Lag et snitt på 5-8 mm langt i midtlinjen i hodebunnen og fjern en hudklaff ved hjelp av en saks.
- Etter at skallen er eksponert, utfør kraniotomi med en hastighet på 2,0-3,0 mm ved hjelp av en høyhastighetsbor over det injiserte virusområdet (dvs. motor cortex eller somatosensorisk cortex, figur 1B). Først lager du fire små hull, og bor deretter sammen i en sirkel som forbinder hullene. Løft deretter og fjern beinet med skarp saks og fjern. Den eksponerte dura mater kan fjernes eller holdes intakt for impantasjon av kranialvinduet.
- Legg en glassdeksler på 3-5 mm i diameter med gjennomsiktig silikon over kraniotomien. Bruk en tannpirker til å skyve kranialvinduet forsiktig på overflaten av hjernen. Deretter forsegler du kanten med en liten mengde silikonlim.
MERKNADER: Alternativt, i stedet for silikonskive, kan 1,2% lavt smeltepunkt agarose gel brukes mellom dekselglasset og hjernevevet. - Til slutt forsegler kantene på dekslene med tannsement. Pass på å bruke sementen litt på kanten av kranialvinduet for sterk binding. Fest en skreddersydd metallhodeplate til skallen med tannsement.
MERK: Metallplaten brukes til å feste musens hode til scenen på 2-P mikroskop under bildebehandlingsøkten (Figur 1C). - Tilsett 0,5 ml ACSF-oppløsning over dekslene på kranialvinduet for vann nedsenking under avbildning.
- Utfør tidsforløp in vivo 2-P-avbildning av mito-GCaMP5G i astrocytter og mito-GCaMP6s i nevroner med 910 nm bølgelengde gjennom kranialvinduet (Figur 1C)18,20,27.
MERK: Under avbildningen er mus på varmeputen for å opprettholde fysiologisk temperatur. Musene vil bli ofret umiddelbart etter at bildeøkten er fullført. - Merk astrocytter in vivo med sulforhodamin 101 (SR101) når det er nødvendig å bestemme colokalisering.
- På slutten av trinn 3.3.4, påfør 100 μL av 100 μM SR101 i ACSF på kortikale overflaten i 1-5 min.
- Skyll overflaten med ACSF for å vaske bort den ubundne SR101. Ved hjelp av 2-P-bildebehandling kan du observere samtidig merking av mito-GCaMP5G og SR101 i astrocytter 45-60 min senere (figur 4A).
- Bedøv musen med 3% isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne studien var å gi en metodikk for å bilde mitokondrie Ca2 + signaler ved hjelp av GECIer i astrocytter og nevroner in vitro og in vivo. Resultatene av både in vitro og in vivo mitokondrie Ca2+ avbildning presenteres her.
In vitro mitokondrie Ca2+ signalering i dyrkede astrocytter og nevroner
Mitokondrie Ca2+ opptak i astrocytter kan fremkalles av ATP-applikasjon, og mitokondrie Ca2 + opptak i nevroner kan fremkalles av glutamat og glycinapplikasjon gjennom et perfusjonssystem. Figur 2 og figur 3 viser at GCaMP6s uttrykkes i henholdsvis dyrkede astrocytter og GCaMP5G i nevroner. Mitokondrie Ca2+ opptak i astrocytter ble fremkalt av 100 μM ATP med enkel mitokondrieoppløsning (Figur 2B-D). Mitokondrie Ca2+ opptak i nevroner ble fremkalt av 100 μM glutamat og 10 μM glycin med enkel mitokondrieoppløsning (Figur 3B-D).
In vivo 2-P avbildning av mitokondrieuttrykk av GCaMP5G eller 6S i astrocytter og nevroner
Avbildningen gjøres ved å samle tidsforløp in vivo 2-P avbildning av mitokondriefluorescenssignaler i astrocytter og nevroner med et Ultima 2-P mikroskopsystem. Vi bruker eksitasjonsbølgelengde 880-910 nm. Figur 4 viser uttrykk for GCaMP5G i mitokondrier i astrocytter i musebarken. Det astrocyttspesifikke uttrykket for GCaMP5G ble bekreftet ved colokalisering av SR101 med GCaMP5G med enkel mitokondrieoppløsning (figur 4A), og spontan Ca2+ endringer i individuelle mitokondrier kan observeres (Figur 4B-E). Figur 5A viser nevronspesifikk uttrykk for mito-GCaMP6s colokalisert med nevronalmarkør NeuN. Fluorescensen av mitokt-GCaMP6s i nevroner viser mitokondriemorfologi i dendritter (Figur 5B). Spontan mitokondrie Ca2+ økning i dendritter kan observeres (Figur 5C-F).
Analyse av mitokondrie Ca2+ signaler
Kvantifisere fluorescerende signaler ved å beregne gjennomsnittlige pikselintensiteter i cellekroppen eller individuelle mitokondrier i astrocytter og nevroner ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Ca2+ endringer overtid (t) uttrykkes som F/Fo (t) verdier versus tid, der Fo er bakgrunnen trukket fra baseline fluorescens og F er baseline trukket fluorescens endring20,21. Bruk de høyeste F/Fo-verdiene til å sammenligne amplituden til Ca2+-signaler.
Figur 1: DNA-konstruksjoner for astrocytt- og nevronspesifikk mitokondrier rettet mot transgene uttrykk, og in vivo 2-P avbildning. (A) DNA-konstruksjoner av genetisk kodet Ca2+ indikator GCaMP5G eller GcaMP6s i pZac2.1 plasmid med gfaABC1D (opp) og CaMKII (lav) promotorer for levering til henholdsvis astrocytisk og nevronal mitokondriematrise. Mitokondri-målretting oppnås ved hjelp av en mitokondriematrise (MM) spesifikk sekvens (mitito) vedlagt N-terminus av fluorescerende proteiner. (B) En kraniotomi over cortex av en mus. (C) Hodeskallen på en mus er festet til en metallplate koblet til stiften festet på scenen av 2-P mikroskop. Innsettet viser kranialvinduet med en metallplate festet til skallen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mitokondrie Ca2+ avbildning av kultiverte astrocytter. (A-B) Et 2-P bilde av en astrocytt som uttrykker mitokt-GCaMP6s (A) og dens respons på stimuleringen av 100 μM ATP på det angitte tidspunktet (B). (C) Bilder av mitokito-GCaMP6s i de fire individuelle mitokondriene (i A, sirkler) på de forskjellige tidspunktene etter ATP-stimulering. (D) Tidsforløpene for mitokito-GCaMP6s fluorescens endres, plottet som ΔF/Fo, i de fire individuelle mitokondriene etter ATP-stimulering. Den røde pilen angir starttidspunktet for avbildning. Pseudofargeskalaen er en lineær representasjon av fluorescensintensiteten i denne og andre figurer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mitokondrie Ca2+ avbildning av dyrkede nevroner. (A-B) Et 2-P bilde av mito-GCaMP5G som uttrykker neuron (A) og dets respons på 100 μM glutamat og 10 μM glycin på angitt tidspunkt (B). (C) Bilder av mitokito-GCaMP5G i de fire individuelle mitokondriene (i A, sirkler) på forskjellige tidspunkter etter glutamatstimulering. (D) Tidsforløpene for mitokito-GCaMP5G fluorescens endres i de fire individuelle mitokondriene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vivo 2-P avbildning av mitokondrie Ca2+ signalering i astrocytter. (A) 2-P bilder av mito-GCaMP5G som uttrykker astrocytter colokalisert med SR101. (B-C) 2-P bilde av en astrocytt som uttrykker mito-GCaMP5G for analyse av spontan Ca2 + økning. (C-E) Bilder av mitokito-GCaMP5G i de fire individuelle mitokondriene i astrocytten (i B, sirkler) på de forskjellige tidspunktene (C) og tidskursene for mitokito-GCaMP5G fluorescens endres, plottet som ΔF / Fo, i de fire individuelle mitokondriene (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: In vivo 2-P avbildning av mitokondrie Ca2+ signalering i nevroner. (A) Colocalization av GCaMP6s (øvre) med nevronal markør NeuN (midten) i hjernen. (B) Høyoppløselige bilder av dendritter som uttrykker GCaMP6s med mitokondriemorfologi (indikert med * s). (C) GCaMP6s uttrykt i nevronale mitokondrier. (D-F) Analyse av spontan mitokondrie Ca2 + økning i nevroner. Pseudocolor 2-P bilde av mitokondriene som uttrykker mitokito-GCaMP6s i C på forskjellige tidspunkter (D). Bilder av mitokito-GCaMP6s i de fire individuelle mitokondriene i C (sirkler) på de forskjellige tidspunktene (E-F) og tidskursene for mitokito-GCaMP6s fluorescens endres, plottet som ΔF / Fo, i de fire individuelle mitokondriene (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film: Mitokondrie Ca2 + øker basert på GCaMP5G fluorescensendringer som svar på 100 μM ATP i kultiverte astrocytter. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen tilbyr vi en metode og protokoll for avbildning av mitokondrie Ca2+ signaler i astrocytter og nevroner. Vi implementerte mitokondri-målretting og celletypespesifikke strategier for å uttrykke GECI GCaMP5G/6s. For å målrette GCaMP5G/6s i mitokondrier inkluderte vi en mitokondri-målrettingssekvens i plasmidene. For å uttrykke GCaMP5G / 6s i astrocytter og nevroner in vivo, satte vi inn en astrocyttspesifikk promotor gfaABC1D og nevronspesifikk promotor CaMKII i plasmidene. Celletype spesifikt uttrykk for GCaMP5G/6s i astrocytter og nevroner kan bekreftes ved SR101 merking i astrocytter og immunstaining av nevroner med NeuN. Fra våre data gir disse strategiene en pålitelig celletypespesifikk tilnærming for mitokondrie Ca2 + avbildning i astrocytter og nevroner in vivo.
Et potensielt problem for GECI-uttrykk er at det kan føre til ca2 + bufring siden det kan redusere gratis Ca2 + av Ca2 + binding. Et annet problem som kan bli lagt merke til er mengden virus som injiseres. Individuelle celler som uttrykker GECI kan ikke identifiseres hvis et overdrevent virus injiseres. Disse problemene kan effektivt forbedres ved å redusere titeret til AAV. Photobleaching kan også være et problem. Teoretisk sett er alle fluorescerende indikatorer utsatt for fotobleking. GCaMP5G/6s er ganske stabile, men de vil bleke under kontinuerlig eksponering for eksitasjonslys. En generell praksis for å unngå fotobleking er å redusere eksponeringstiden for vev til laserlys samtidig som du sikrer at nok fluorescens samles inn. Dette kan oppnås hvis høysensitive PMTer og høye lysoverføringsmål brukes. Photobleaching kan også reduseres ved å lukke lukkeren mellom bilder.
I våre resultater av in vivo 2-P-avbildning kan spontane mitokondrieøkninger observeres både i astrocytter og nevroner. Spesielt har disse mitokondrie Ca2 + transientene lange varigheter (Figur 4E og Figur 5E), i samsvar med en nylig rapport fra Gobel et al.30. Den underliggende mekanismen for dette fenomenet er ikke klart, men er verdt å bli forfulgt videre. For cytosolisk Ca2+ økning har astrocytter og nevroner forskjellige mekanismer. G-proteinreseptorstimuleringer forårsaker Ca2 + økning i ER i astrocytter mens aktiveringene av spenningsportede Ca2 + kanaler eller glutamatreseptorer forårsaker cytosolisk Ca2 + økning i nevroner, som kan tas opp av mitokondrier. I vår forrige studie20fant vi at når mitokito-GCaMP5G ble cotransfected med IP3 5-fosfatase (5ppase) dyrket astrocytter, ATP-indusert mitokondrie Ca2 + økning kunne i stor grad avskaffes. Imidlertid påvirket de to mutantene av 5ppase, det vil si R343A og R343A / R350A 5ppase, som mangler enzymatisk aktivitet, ikke mitokondrie Ca2 + økning etter ATP-stimulering. Disse resultatene indikerer at cytosoliske og mitokondrie Ca2 + nivåer er svært koblet, sannsynligvis på grunn av den intime fysiske forbindelsen mellom ER og mitokondrier i astrocytter, med cytosolen som en mellomleddledning for Ca2 + levering. Vi fant også ut at glutamatstimulering forårsaket mitokondrie Ca2 + økning i nevroner, noe som tyder på at glutamatreseptorer spiller en rolle i Ca2 + oppføring fra ekstracellulært rom. I fremtiden vil det være interessant å studere sensorisk drevet mitokondrie Ca2 + økning i astrocytter og nevroner.
Vår tilnærming kan brukes til samtidig å avbilde cytosoliske og mitokondrie Ca2+ signaler i samme celletype når to GECIer av forskjellige fluorescensbølgelengder uttrykkes, for eksempel en rød florescens GECI RCaMP i cytoplasma og GCaMP i mitokondrier, eller omvendt31. Denne tilnærmingen kan også brukes til in vivo-studiet av astrocytt-nevroninteraksjoner i fysiologi og patologi med GCaMP uttrykt i astrocytter og RCaMP i nevroner, eller omvendt.
GCaMP er en GFP-basert enkeltbølgelengde fluorofor GECI. For tiden er GCaMPs de mest foretrukne Ca2 + -indikatorene på grunn av deres høye signal-til-støy-forhold (SNR) og store dynamiske områder (DR). Nylig ble jGCaMP7-sensorer, den optimaliserte versjonen av GCaMP6, rapportert med forbedret følsomhet for individuelle pigger16. GCaMP7 sensorer kan enkelt subcloned i våre plasmider for mitokondrie Ca2 + bildebehandling. Oppsummert kan strategiene vi presenterte her brukes til å avbilde mitokondrie Ca2 + opptak og håndtering i nevroner og astrocytter med tilstrekkelig følsomhet for å løse Ca2 + endringer på enkelt mitokondrienivå in vivo. Denne protokollen representerer et nyttig middel for å studere cytosolisk og mitokondrie Ca2 + signalering i astrocytter og nevroner, samt astrocytt-nevron interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som gir R01NS069726 og R01NS094539 til SD. Vi takker Erica DeMers for lydopptaket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
