Summary
Denne proctocol har til formål at give en metode til in vitro og in vivo mitokondrie Ca2 + billeddannelse i astrocytter og neuroner.
Abstract
Mitokondrie Ca2 + spiller en afgørende rolle i at kontrollere cytosolic Ca2 + buffering, energi metabolisme, og cellulære signal transduktion. Overbelastning af mitokondrie Ca2+ bidrager til forskellige patologiske tilstande, herunder neurodegeneration og apoptotisk celledød i neurologiske sygdomme. Her præsenterer vi en celle-type specifikke og mitokondrier rettet mod molekylær tilgang til mitokondrie Ca2 + billeddannelse i astrocytter og neuroner in vitro og in vivo. Vi konstruerede DNA plasmider kodning mitokondrier-målretning genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocyt- og neuron-specifikke initiativtagere gfaABC1D og CaMKII og mitokondrier-målretning sekvens (mito-). For in vitro mitokondrie Ca2 + billeddannelse, plasmider blev transfected i kultiverede astrocytter og neuroner til at udtrykke GCaMP5G/6s. For in vivo mitokondrie Ca2 + billeddannelse, adeno-associerede virale vektorer (AAVs) blev udarbejdet og injiceret i musen hjerner til at udtrykke GCaMP5G/6s i mitokondrier i astrocytter og neuroner. Vores tilgang giver et nyttigt middel til at afbilde mitokondrie Ca2 + dynamik i astrocytter og neuroner til at studere forholdet mellem cytosolic og mitokondrie Ca2 + signalering, samt astrocyt-neuron interaktioner.
Introduction
Mitokondrier er dynamiske subcellulære organeller og betragtes som cellens kraftcentre til energiproduktion. På den anden side kan mitokondrier tage Ca2 + til matrixen som reaktion på lokale eller cytosolic Ca2 + stiger. Mitokondrie Ca2+ optagelse påvirker mitokondriefunktionen, herunder metaboliske processer såsom reaktioner i tricarboxylsyrecyklussen (TCA) og oxidativ fosforylering og regulerer Ca2+-følsomme proteiner under fysiologiske forhold1,2,3,4. Mitokondrie Ca2 + overbelastning er også en afgørende faktor for celledød, herunder nekrose og apoptose i forskellige hjernesygdomme5,6,7. Det forårsager åbningen af mitokondrie permeabilitet overgang marsvin (mPTPs) og frigivelsen af caspase cofaktor, som indleder apoptotisk celledød. Derfor er det vigtigt at studere mitokondrie Ca2 + dynamik og håndtering i levende celler for at forstå cellulær fysiologi og patologi bedre.
Mitokondrier opretholde matrix Ca2 + homøostase gennem en balance mellem Ca2 + optagelse og efflux. Mitokondrie Ca2 + optagelse er hovedsageligt medieret af mitokondrie Ca2 + uniporters (MCUs), mens mitokondrie Ca2 + efflux er medieret af Na+-Ca2 +-Li+ vekslere (NCLXs) og H+/ Ca2 + vekslere (mHCXs)8. Balancen kan forstyrres gennem stimulering af G-protein koblede receptorer (GPCRs)9. Mitokondrie Ca2 + homøostase er også påvirket af mitokondrie buffering ved dannelsen af uopløselige xCa2 +-xPO4x-xOH komplekser8.
Intracellulære og mitokondrieændringer i Ca2+-koncentrationen ([Ca.2+]) kan vurderes ved hjælp af fluorescerende eller selvlysende Ca2+-indikatorer. Ca2+ binding til indikatorer forårsager spektrale modifikationer, der gør det muligt at registrere gratis cellulære [Ca2+] i realtid i levende celler. Der findes i øjeblikket to typer sonder til overvågning af Ca2+-ændringer i celler: organiske kemiske indikatorer og genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GEFI'er). Generelt er forskellige varianter med forskellige Ca2+ tilhørsforhold (baseret på Kd),spektrale egenskaber (excitation og emissionsbølgelængder), dynamiske områder og følsomheder tilgængelige for de biologiske spørgsmål, der undersøges. Selv om mange syntetiske organiske Ca2 + indikatorer er blevet brugt til cytosolic Ca2 + billeddannelse, kun få kan selektivt indlæses i mitokondrie matrix for mitokondrie Ca2 + billeddannelse, med Rhod-2 er den mest udbredte (for anmeldelser se10,11). Rhod-2 har dog en stor ulempe ved lækage under lange tidsforsøg; derudover er det opdelt mellem mitokondrier, andre organeller og cytosolen, hvilket gør absolutte målinger i forskellige underkomplekser vanskelige. I modsætning hertil kan GEFI'er ved hjælp af cellespecifikke promotorer og subcellulære rumretningssekvenser udtrykkes i forskellige celletyper og subcellulære rum til celle- og rumspecifikke Ca2+-billedbehandlings in vitro eller in vivo. Single-wavelength fluorescens intensitetsbaserede GCaMP Ca2+-indikatorer er for nylig dukket op som store GECIs12,13,14,15,16. I denne artikel leverer vi en protokol til mitokondrier-målretning og celle-type specifikke udtryk for GCaMP5G og GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocytter og neuroner, og billeddannelse mitokondrie Ca2 + optagelse i disse celletyper. Ved hjælp af denne protokol kan ekspressionen af GCaMP6G/6s i individuelle mitokondrier afsløres, og Ca2 + optagelse i enkelt mitokondrieopløsning kan opnås i astrocytter og neuroner in vitro og in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Missouri-Columbia.
1. Konstruktion af DNA plasmid
BEMÆRK: Til in vitro- og in vivo-billeddannelse konstrueres DNA-plasmider, der kodning GCaMP5G/6'ere med astrocyt- og neuronspecifikke promotorer og mitokondriemålretningssekvenser.
- Indsæt mitokondriematrix (MM)-målretningssekvens (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 ind i kloningsstederne EcoRI og BamHI i rygraden i adeno-associeret virus (AAV) plasmid pZac2.1 for at opnå plasmider, der indeholder astrocytisk gfaABC1D promotor eller neuronal CaMKII promotor18,19,20.
- Subclone GCaMP5G/6s i kloning steder BamH I og ikke 1 i ovenstående plasmider at få nye plasmider pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s og pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, der er rettet mod transgene udtryk i mitokondrier i astrocytter og neuroner20,21 (Figur 1A).
- Forbered pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA plasmider til transfection til in vitro-studiet (afsnit 2). Fremstil AAV-vektorer med serotype 5 til astrocytter og serotype 9 til neuroner til in vivostudie 18 (afsnit 3).
2. In vitro mitokondrie Ca2+ billeddannelse i astrocytter og neuroner
- Forberede primære astrocytter fra cortex af P1 neonatale mus og primære neuroner fra cortex af E15-16 embryoner18,22,23,24, og kultur dem på 12 mm diameter glas coverslips i 24-brønd plader ved hjælp af Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), der indeholder 10% fosterkvæg serum (FBS), og neuronal basal medium (NBM), der indeholder 2% B27, henholdsvis.
- Transfect modne astrocytter og neuroner med pZac-gfaABC1D-GCaMP6s og pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmider ved hjælp af lipid baseret transfection reagens til at udtrykke GCaMP6s i mitokondrier af astrocytter og GCaMP5G i mitokondrier af neuroner18,20,21. Transfekt celler i hver brønd med 0,5 μg DNA, og ændre medium 6 timer senere.
BEMÆRK: Astrocytter og neuroner er klar til billeddannelse 1-2 dage efter transfektion. - Udfør in vitro mitokondrie Ca2+ billeddannelse 1-2 dage efter transfection.
- Overfør glasovertræk, der er kultiveret med astrocytter eller neuroner, til PH-1 perfusionskammeret under en epifluorescence eller to fotonmikroskop.
- Stimulere astrocytisk mitokondrie Ca2 + optagelse med 100 μM ATP i ACSF, eller stimulere neuronal mitokondrier med 100 μM glutamat/10 μM glycin20,25 ( Figur2 og figur 3).
BEMÆRK: Løsningsændringer fra ACSF til ATP- og glutamat/glycinholdige ACSF styres af et ALA-VM8 perfusionssystem21. Opløsningsskiftets hastighed styres ved 1-2 mL/min ved justering af en ventil.
3. In vivo mitokondrie Ca2+ billeddannelse i astrocytter og neuroner
- AAV forberedelser.
- Forbered følgende rekombinante adeno-associerede virusvektorer (rAAV) ved hjælp af DNA-plasmiderne, der er udarbejdet i afsnit 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev rAAV vektorer af serotype 5 forberedt til at udtrykke GCaMP5G i mitokondrier i astrocytter og rAAV vektorer af serotype 9 var parat til at udtrykke GCaMP6s i mitokondrier i neuroner.
- Forbered følgende rekombinante adeno-associerede virusvektorer (rAAV) ved hjælp af DNA-plasmiderne, der er udarbejdet i afsnit 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G og rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer.
- Stereotaxisk AAV-injektion.
- Bedøve musen med 3% isoflurane.
BEMÆRK: Senere under operationen reduceres isofluranniveauet til 2%. - Efter musen når et kirurgisk niveau af anæstesi, som bestemt af hale og tå knivspids, barbere håret over kirurgi site, motor eller somatosensorisk cortex, med en hår trimmer.
- Placer musen på musen stereotaxic enhed og fastgør hovedet med øre barer. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at beskytte dem under operationen. Brug en varmepude til at holde musens kropstemperatur på 37 °C under hele operationen.
BEMÆRK: Udfør kirurgi ved hjælp af aseptiske procedurer. Alle kirurgiske værktøjer skal steriliseres enten ved autoklavering eller en varm perle sterilisator. - Når musen er monteret på den stereotaxiske enhed, sterilisere hovedbunden med vekslende jod baseret krat og 70% ethanol tre gange. Lav et snit i midten af hovedbunden for at eksponere injektionsstedet.
- Skær huden op i bregma-lamda-aksen og et skab et ~1 mm diameter burrhul med en højhastighedsboremaskine på motorens eller somatosensoriske cortexs tilsigtede injektionssted.
- Brug en 33 G Hamilton-sprøjte, der indeholder adeno-associeret virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vektorer [1 x 1011 GC] eller rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer [1 x 1011 GC]) til at injicere op til 1 μL virus i målområdet.
BEMÆRK: For eksempel, for kortikale viral levering, injicere virusopløsningen på to dybder i flere trin. Først skal du indsætte nålen til en dybde på 1 mm fra duraen og tillade 5 minutter for hjernen at komme sig. Flyt derefter nålen op til ~700 μm dybde og indsprøjt 500 nL af virusopløsningen med en injektionshastighed på 10 nL/s ved hjælp af en hamiltonsprøjte, der styres af en mikrosyringepumpecontroller. Når injektionen er afsluttet, vent i 5 minutter for at lade virussen sprede sig ind i hjernen. Flyt derefter nålen op til det andet injektionssted i en dybde på 300 μm. Her injicere yderligere 500 nL af virusopløsningen. Vent i 10 minutter for at lade virussen sprede sig ind i hjernen. - Luk hovedbunden og huden ved hjælp af et vævslim. Lad musene komme sig på varmepuden. Send mus tilbage til dyreanlægget efter bjærgning.
- Bedøve musen med 3% isoflurane.
- Kranial-vindue intstallation og in vivo to-foton (2-P) billeddannelse af mitokondrie Ca2 + signaler.
BEMÆRK: Kranievindue implantation sker 3 uger efter AAV injektion over motoren eller somatosensorisk cortex26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) injiceres subkutant for at lindre potentielle smerter før operationen. Kranievinduet kirurgiske procedurer er identiske med AAV injektion kirurgiske procedurer og udføres under aseptiske forhold.- Bedøve musen med 3% isoflurane.
BEMÆRK: Dette er den første dosis og reducere til 2% for operationen senere. Under billeddannelse anvendes en intraperitoneal (IP) injektion på 130 mg ketamin/10 mg xylazin/kg kropsvægt opløst i ACSF til anæstesi. - Placer musen på musen stereotaxic enhed og fastgør hovedet med øre barer. Påfør oftalmisk salve på øjnene. Brug en varmepude til at holde musens kropstemperatur på 37 °C under hele operationen.
BEMÆRK: Alle kirurgiske værktøjer skal steriliseres. - Lav et snit på 5-8 mm lang i midten af hovedbunden og fjern en klap af huden ved hjælp af en saks.
- Når kraniet er eksponeret, skal du udføre kraniotomi med en højhastighedstog (dvs. motorbark eller somatosensorisk cortex, figur 1B). Først skal du lave fire små huller, og derefter bore sammen i en cirkel, der forbinder hullerne. Løft derefter og fjern knoglen med skarp saks og fjern. Den eksponerede dura mater kan fjernes eller holdes intakt for impantation af kranievinduet.
- Placer en glasdækslede på 3-5 mm i diameter med en gennemsigtig silikone over kraniotomien. Brug en tandstikker til at skubbe kranievinduet forsigtigt på overfladen af hjernen. Derefter forsegles kanten med en lille mængde silikoneklæbemiddel.
NOTER: Alternativt, i stedet for silikone disk, 1,2% lav smeltepunkt agarose gel kan bruges mellem dækglasset og hjernevæv. - Endelig forsegle kanterne af coverlip med dental cement. Pas på at anvende cementen lidt i kanten af kranievinduet for stærk limning. Fastgør en specialfremstillet metalhovedplade til kraniet med tandcement.
BEMÆRK: Metalpladen bruges til at fastgøre musens hoved til stadiet af 2-P mikroskop under billedsessionen (Figur 1C). - Tilsæt 0,5 mL ACSF-opløsning over dækslerne på kranievinduet til vanddåben under billeddannelse.
- Udfør time-lapse in vivo 2-P imaging af mito-GCaMP5G i astrocytter og mito-GCaMP6s i neuroner med 910 nm bølgelængde gennem kranievinduet (Figur 1C)18,20,27.
BEMÆRK: Under billeddannelse er mus på varmepuden for at opretholde fysiologisk temperatur. Musene vil blive ofret umiddelbart efter billeddannelsen er afsluttet. - Mærk astrocytter in vivo med sulforhodamin 101 (SR101), når det er nødvendigt at bestemme colocalization.
- Ved afslutningen af trin 3.3.4 påføres 100 μL på 100 μM SR101 i ACSF på kortikale overflade i 1-5 min.
- Skyl overfladen med ACSF for at skylle den ubundne SR101 væk. Ved hjælp af 2-P billeddannelse kan co-mærkning af mito-GCaMP5G og SR101 i astrocytter observeres 45-60 minutter senere (Figur 4A).
- Bedøve musen med 3% isoflurane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne undersøgelse var at give en metode til at afbilde mitokondrie Ca2+ signaler ved hjælp af GEFI'er i astrocytter og neuroner in vitro og in vivo. Resultaterne af både in vitro og in vivo mitokondrie Ca2 + billeddannelse præsenteres her.
In vitro mitokondrie Ca2+ signalering i kultiverede astrocytter og neuroner
Mitokondrie Ca2 + optagelse i astrocytter kan fremkaldes ved ATP ansøgning, og mitokondrie Ca2 + optagelse i neuroner kan fremkaldes af glutamat og glycin ansøgning gennem en perfusion system. Figur 2 og figur 3 viser, at GCaMP6s udtrykkes i henholdsvis kultiverede astrocytter og GCaMP5G i neuroner. Mitokondrie Ca2+ optagelse i astrocytter blev fremkaldt af 100 μM ATP med enkelt mitokondrieopløsning (Figur 2B-D). Mitokondrie Ca2+ optagelse i neuroner blev fremkaldt af 100 μM glutamat og 10 μM glycin med enkelt mitokondrieopløsning (Figur 3B-D).
In vivo 2-P billeddannelse af mitokondrie udtryk for GCaMP5G eller 6S i astrocytter og neuroner
Billeddannelsen udføres ved at indsamle time-lapse in vivo 2-P billeddannelse af mitokondrie fluorescenssignaler i astrocytter og neuroner med et Ultima 2-P mikroskopsystem. Vi bruger excitation bølgelængde 880-910 nm. Figur 4 viser udtryk for GCaMP5G i mitokondrier i astrocytter i musebarken. Det astrocytspecifikke udtryk for GCaMP5G blev bekræftet ved colocalization af SR101 med GCaMP5G med enkelt mitokondrieopløsning (Figur 4A), og spontane Ca2+ ændringer i individuelle mitokondrier kan observeres (Figur 4B-E). Figur 5A viser neuronspecifikt udtryk for mito-GCaMP6s colocalized med neuronal markør NeuN. Fluorescensen af mito-GCaMP6s i neuroner viser mitokondrie morfologi i dendritter (Figur 5B). Spontane mitokondrie Ca2+ stigninger i dendritter kan observeres (Figur 5C-F).
Analyse af mitokondrie Ca2+ signaler
Kvantificer de fluorescerende signaler ved at beregne de gennemsnitlige pixelintensiteter i cellekroppen eller individuelle mitokondrier i astrocytter og neuroner ved hjælp af en billedanalysesoftware. Ca2+ ændringer overtid (t) udtrykkes som F/Fo (t) værdier versus tid, hvor Fo er baggrunden fratrukket baseline fluorescens og F er baseline fratrukket fluorescensændring20,21. Brug de maksimale F/Fo-værdier til at sammenligne amplituden af Ca2+-signaler.
Figur 1: DNA-konstruktioner til astrocyt- og neuronspecifik mitokondrier-målretning transgene udtryk, og in vivo 2-P imaging. (A) DNA konstruktioner af genetisk kodede Ca2 + indikator GCaMP5G eller GcaMP6s i pZac2.1 plasmid med gfaABC1D (op) og CaMKII (lav) initiativtagere til levering til astrocytiske og neuronal mitokondrie matrix, henholdsvis. Mitokondrier-målretning opnås ved hjælp af en mitokondrie matrix (MM) specifik sekvens (mito) knyttet til N-endestationen for fluorescerende proteiner. (B) En kraniotomi over en muss cortex. (C) Kraniet af en mus er fastgjort til en metalplade forbundet til stillingen fastgjort på scenen af 2-P mikroskop. Indstædningen viser kranievinduet med en metalplade fastgjort til kraniet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mitokondrie Ca2+ billeddannelse af kultiverede astrocytter. (A-B) Et 2-P billede af en astrocyt, der udtrykker mito-GCaMP6s (A) og dens reaktion på stimulering af 100 μM ATP på det angivne tidspunkt (B). (C) Billeder af mito-GCaMP6s i de fire individuelle mitokondrier (i A, cirkler) på de forskellige tidspunkter efter ATP stimulation. (D) Tiden kurser af mito-GCaMP6s fluorescens ændringer, plottet som ΔF / Fo, i de fire individuelle mitokondrier efter ATP stimulation. Den røde pil angiver starttidspunktet for billeddannelse. Pseudofarveskalaen er en lineær repræsentation af fluorescensintensiteten i denne og andre figurer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mitokondrie Ca2+ billeddannelse af kultiverede neuroner. (A-B) Et 2-P billede af mito-GCaMP5G, der udtrykker neuron (A) og dets respons på 100 μM glutamat og 10 μM glycin på det angivne tidspunkt (B). (C) Billeder af mito-GCaMP5G i de fire individuelle mitokondrier (i A, cirkler) på forskellige tidspunkter efter glutamat stimulation. (D) Tidskurserne for mito-GCaMP5G fluorescens ændringer i de fire individuelle mitokondrier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: In vivo 2-P billeddannelse af mitokondrie Ca2+ signalering i astrocytter. (A) 2-P billeder af mito-GCaMP5G udtrykker astrocytter colocalized med SR101. (B-C) 2-P billede af en astrocyt udtrykker mito-GCaMP5G til analyse af spontan Ca2 + stigning. (C-E) Billeder af mito-GCaMP5G i de fire individuelle mitokondrier i astrocyt (i B, cirkler) på de forskellige tidspunkter (C) og tidsforløb af mito-GCaMP5G fluorescens ændringer, plottet som ΔF / Fo, i de fire individuelle mitokondrier (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: In vivo 2-P billeddannelse af mitokondrie Ca2+ signalering i neuroner. (A) Colocalization af GCaMP6s (øvre) med neuronal markør NeuN (midten) i hjernen. (B) Billeder i høj opløsning af dendritter, der udtrykker GCaMP6s med mitokondriemorfologi (angivet med *s). (C) GCaMP6s udtrykt i neuronal mitokondrier. (D-F) Analyse af spontan mitokondrie Ca2+ stigning i neuroner. Pseudocolor 2-P billede af mitokondrier udtrykker mito-GCaMP6s i C på forskellige tidspunkter (D). Billeder af mito-GCaMP6s i de fire individuelle mitokondrier i C (cirkler) på de forskellige tidspunkter (E-F) og tidsforløb af mito-GCaMP6s fluorescens ændringer, plottet som ΔF / Fo, i de fire individuelle mitokondrier (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Film: Mitokondrie Ca2 + stigninger baseret på GCaMP5G fluorescens ændringer som reaktion på 100 μM ATP i kultiverede astrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel leverer vi en metode og protokol til billeddannelse mitokondrie Ca2 + signaler i astrocytter og neuroner. Vi implementerede mitokondrier-målretning og celle type-specifikke strategier til at udtrykke GECI GCaMP5G/6s. For at målrette GCaMP5G/6s i mitokondrier, omfattede vi en mitokondrier-målretning sekvens i plasmider. For at udtrykke GCaMP5G/6s i astrocytter og neuroner in vivo, indsatte vi en astrocyt-specifik promotor gfaABC1D og neuronspecifik promotor CaMKII i plasmiderne. Celletypespecifikt udtryk for GCaMP5G/6'ere i astrocytter og neuroner kan bekræftes ved SR101 mærkning i astrocytter og immunstaining af neuroner med NeuN. Fra vores data giver disse strategier en pålidelig celletypespecifik tilgang til mitokondrie Ca2 + billeddannelse i astrocytter og neuroner in vivo.
Et potentielt problem for GECI udtryk er, at det kan forårsage Ca2 + buffering, da det kan reducere gratis Ca2 + af Ca2 + bindende. Et andet problem, der kan være opmærksom på, er mængden af virus injiceres. Individuelle celler, der udtrykker GECI, kan ikke identificeres, hvis der injiceres en overdreven virus. Disse problemer kan effektivt forbedres ved at reducere titer af AAV. Photobleaching kan også være et problem. Teoretisk set er alle fluorescerende indikatorer underlagt fotobleaching. GCaMP5G/6s er ret stabile, men de vil blege under konstant udsættelse for excitation lys. En generel praksis for at undgå fotobleaching er at reducere eksponeringstiden for væv til laserlys og samtidig sikre nok fluorescens indsamles. Dette kan opnås, hvis der anvendes højfølsomt PMT'er og højlystransmissionsmål. Photobleaching kan også reduceres ved at lukke lukkeren mellem billeder.
I vores resultater af in vivo 2-P billeddannelse kan spontane mitokondrieforøgelser observeres både hos astrocytter og neuroner. Disse mitokondrie Ca2+-transienter har især lange varigheder (figur 4E og figur 5E), i overensstemmelse med en nylig rapport fra Gobel et al.30. Den underliggende mekanisme i dette fænomen er ikke klar, men er værd at forfølge yderligere. For cytosolic Ca2 + stigning, astrocytter og neuroner har forskellige mekanismer. G-protein receptor stimulationer forårsage Ca2 + stigning i ER i astrocytter, mens aktiveringer af spænding gated Ca2 + kanaler eller glutamat receptorer forårsage cytosolic Ca2 + stigning i neuroner, som kan tages af mitokondrier. I vores tidligere undersøgelse20fandt vi, at når mito-GCaMP5G blev cotransfected med IP3 5-fosfattase (5ppase) dyrkede astrocytter, ATP-induceret mitokondrie Ca2 + stigning kunne stort set afskaffes. De to mutanter af 5ppase, dvs. R343A og R343A/R350A 5ppase, som mangler enzymatisk aktivitet, påvirkede imidlertid ikke mitokondrie Ca2+-stigningen efter ATP-stimulation. Disse resultater tyder på, at cytosolic og mitokondrie Ca2 + niveauer er stærkt koblet, sandsynligvis på grund af den intime fysiske forbindelse mellem ER og mitokondrier i astrocytter, med cytosol tjener som en mellemliggende kanal for Ca2 + levering. Vi fandt også, at glutamat stimulation forårsaget mitokondrie Ca2 + stigning i neuroner, tyder glutamat receptorer spiller en rolle i Ca2 + indrejse fra ekstracellulære rum. I fremtiden vil det være interessant at studere sensorisk-drevet mitokondrie Ca2 + stigninger i astrocytter og neuroner.
Vores tilgang kan bruges til samtidig at afbilde cytosolic og mitokondrie Ca2 + signaler i samme celletype, når to GECIs af forskellige fluorescens bølgelængder udtrykkes, fx en rød florescence GECI RCaMP i cytoplasma og GCaMP i mitokondrier, eller omvendt31. Denne tilgang kan også bruges til in vivo-studiet af astrocyt-neuroninteraktioner i fysiologi og patologi med GCaMP udtrykt i astrocytter og RCaMP i neuroner eller omvendt.
GCaMP er en GFP-baseret enkelt bølgelængde fluorophor GECI. I øjeblikket er GCaMPs de mest foretrukne Ca2+ indikatorer på grund af deres høje signal-til-støj-forhold (SNR) og store dynamiske områder (DR). For nylig blev jGCaMP7 sensorer, den optimerede version af GCaMP6, rapporteret med forbedret følsomhed over for individuelle pigge16. GCaMP7 sensorer kan nemt subcloned i vores plasmider for mitokondrie Ca2 + billeddannelse. Sammenfattende kan de strategier, vi præsenterede her, bruges til at afbilde mitokondrie Ca2 + optagelse og håndtering i neuroner og astrocytter med tilstrækkelig følsomhed til at løse Ca2 + ændringer på enkelt mitokondrieniveau in vivo. Denne protokol repræsenterer et nyttigt middel til at studere cytosolic og mitokondrie Ca2 + signalering i astrocytter og neuroner, samt astrocyt-neuron interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health National Institute of Neurologiske Lidelser og Stroke (NINDS) tilskud R01NS069726 og R01NS094539 til SD. Vi takker Erica DeMers for lydoptagelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
