成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

摘要

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的成像

摘要

线粒体 Ca²⁺ 在调控胞质 Ca 中起关键作用²⁺ 缓冲、能量代谢和细胞信号转导。线粒体钙超载²⁺ 有助于多种病理状况，包括神经系统疾病中的神经退行性变和凋亡性细胞死亡。本文介绍一种细胞类型特异且靶向线粒体的分子方法，用于线粒体Ca²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像 体外 和 体内我们构建了编码靶向线粒体的基因编码钙指示剂的DNA质粒²⁺ 指示剂（GECIs）GCaMP5G 或 GCaMP6s（GCaMP5G/6s），分别与星形胶质细胞特异性启动子 gfaABC1D、神经元特异性启动子 CaMKII 以及线粒体靶向序列（mito-）组合使用。对于 体外 线粒体 Ca²⁺ 成像前，将质粒转染至培养的星形胶质细胞和神经元中以表达 GCaMP5G/6s。对于 体内 线粒体 Ca²⁺ 成像，制备腺相关病毒载体（AAVs）并注射至小鼠脑内，以在星形胶质细胞和神经元的线粒体中表达GCaMP5G/6s。本方法为线粒体Ca²⁺成像提供了一种有效的手段²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的动力学研究细胞质与线粒体钙之间的关系²⁺ 信号传导以及星形胶质细胞-神经元相互作用。

引言

线粒体是动态的亚细胞器，被认为是细胞能量生成的“动力工厂”。另一方面，线粒体可在局部或胞质Ca²⁺浓度升高时将Ca²⁺摄取至基质中。线粒体Ca²⁺摄取影响线粒体功能，包括三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化等代谢过程，并在生理条件下调节Ca²⁺敏感蛋白^1,2,3,4。线粒体Ca²⁺超载也是多种脑部疾病中细胞死亡（包括坏死和凋亡）的决定因素^5,6,7。它可导致线粒体通透性转换孔（mPTP）开放以及半胱天冬酶（caspase）辅因子的释放，从而启动凋亡性细胞死亡。因此，研究活细胞中线粒体Ca²⁺的动态变化及其调控机制，对于深入理解细胞生理与病理过程具有重要意义。

线粒体维持基质 Ca²⁺ 通过Ca的平衡维持稳态²⁺ 摄取与外排。线粒体 Ca²⁺ 摄取主....

方案

涉及动物的实验程序已获得密苏里大学哥伦比亚分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. DNA 质粒的构建

注意：对于 体外 和 体内 成像，构建了编码GCaMP5G/6s的DNA质粒，该质粒含有星形胶质细胞和神经元特异性启动子以及线粒体靶向序列。

1. 插入线粒体基质（MM）靶向序列（mito-）ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ 到腺相关病毒（AAV）质粒 pZac2.1 骨架中的克隆位点 EcoRI 和 BamHI，以获得包含星形胶质细胞 gfaABC 的质粒₁D启动子或神经元CaMKII启动子^18,19,20.
2. 将 GCaMP5G/6s 亚克隆至上述质粒的 BamH I 和 Not I 克隆位点，获得新的质粒 pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s 和 pZac-....

结果

本研究的目的是提供一种用于成像线粒体 Ca²⁺ 使用GECIs在星形胶质细胞和神经元中检测信号 体外 和 体内. 两种结果 体外 和 体内 线粒体 Ca²⁺ 成像结果在此展示。

体外培养的星形胶质细胞和神经元中的线粒体 Ca²⁺ 信号检测
通过灌流系统施加 ATP 可诱导星形胶质细胞中的线粒体 Ca²⁺ 摄取，而施加谷氨酸和甘氨酸可诱导神经元中的线粒体 Ca²⁺ 摄取。图 2 和 图 3 分别显示 GCaMP6s 在培养的星形胶质细胞中表达，GCaMP5G 在神经元中表达。星形胶质细胞中的线粒体 Ca²⁺.......

讨论

本文提供了一种用于成像线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞和神经元中的信号。我们采用线粒体靶向和细胞类型特异性策略来表达GECI GCaMP5G/6s。为将GCaMP5G/6s靶向至线粒体，我们在质粒中引入了线粒体靶向序列。为在星形胶质细胞和神经元中表达GCaMP5G/6s 体内，我们在质粒中插入了星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D和神经元特异性启动子CaMKII。通过SR101对星形胶质细胞进行标记以及使用NeuN对神经元进行免疫染色，可验证GCaMP5G/6s在星形胶质细胞和神经元中的细胞类型特异性表达。根据我们的数据，这些策略为线粒体Ca²⁺²⁺ 星形胶质细胞与神经元中的成像 体内.

GECI表达的一个潜在问题是可能引起Ca²⁺缓冲效应，因为其可通过结合Ca²⁺降低游离Ca²⁺浓度。另一个需要注意的问题是病毒注射量。若注射过量病毒，可能无法识别出单个表达GECI的细胞。这些问题可通过降低AAV滴度来有效缓解。光漂白也可能是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工泪液软膏	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% 白凡士林
氰基丙烯酸酯胶水	World Precision Instruments		3M Vetbond 粘合剂
解剖体视显微镜	Nikon	SMZ 2B	用于手术
精细尖杜蒙特镊子	Fine Science Tools	11255-20	用于去除硬脑膜
玻璃盖玻片，厚度 0.13–0.17 mm	Fisher Scientific	12-542A	用于颅窗覆盖
高速微型钻机	Fine Science Tools	18000-17	配备骨抛光钻头
注射器	Hamilton	2.5 ml	用于病毒注射
氯胺酮	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg 体重
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9793	减少运动伪影
金属框架	定制	见图1	用于将脑组织固定于显微镜载物台
微量注射泵控制器	World Precision Instruments	UMP3	注射速度控制器
小鼠立体定位仪	Stoelting	51725	用于固定小鼠
灌流室	Warner Instruments	64-0284
灌流系统	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
自调节加热垫	Fine Science Tools	21061	防止小鼠体温过低
磺酰罗丹明101	Invitrogen	S-359	标记星形胶质细胞的红色荧光染料
手术剪，12 cm	Fine Science Tools	14002-12	用于解剖
环钻	Fine Science Tools	18004-23	用于清除组织材料
赛拉嗪	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg 体重