Summary
Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.
Abstract
Il Ca2+ mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel controllo del buffering citosolico di Ca2+, del metabolismo energetico e della trasduzione del segnale cellulare. Il sovraccarico di Ca2+ mitocondriale contribuisce a varie condizioni patologiche, tra cui la neurodegenerazione e la morte cellulare apoptotica nelle malattie neurologiche. Qui presentiamo un approccio molecolare specifico per tipo cellulare e mitocondri per l'imaging mitocondriale Ca2+ in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. Abbiamo costruito plasmidi di DNA che codificano gli indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) con promotori astrociti e neuronali specifici gfaABC1D e CaMKII e sequenza di targeting dei mitocondri (mito-). Per l'imaging mitocondriale in vitro Di Ca2+, i plasmidi sono stati trasfettati in astrociti e neuroni in coltura per esprimere GCaMP5G/6s. Per l'imaging mitocondriale in vivo di Ca2+, sono stati preparati vettori virali adeno-associati (AAV) e iniettati nel cervello del topo per esprimere GCaMP5G/6s nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni. Il nostro approccio fornisce un mezzo utile per visualizzare la dinamica mitocondriale Ca2+ in astrociti e neuroni per studiare la relazione tra segnalazione citosolica e mitocondriale Ca2+, così come le interazioni astrociti-neuroni.
Introduction
I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici e sono considerati le centrali cellulari per la produzione di energia. D'altra parte, i mitocondri possono assorbire Ca2+ alla matrice in risposta a aumenti locali o citosolici di Ca2+. L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ influenza la funzione mitocondriale, compresi i processi metabolici come le reazioni nel ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la fosforilazione ossidativa, e regola le proteine sensibili al Ca2+in condizioni fisiologiche1,2,3,4. Il sovraccarico mitocondriale di Ca2+ è anche un fattore determinante per la morte cellulare, compresa la necrosi e l'apoptosi in vari disturbi cerebrali5,6,7. Provoca l'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTPs) e il rilascio di cofattore caspasi, che avvia la morte cellulare apoptotica. Pertanto, è importante studiare la dinamica e la manipolazione mitocondriale di Ca2+ nelle cellule viventi per comprendere meglio la fisiologia e la patologia cellulare.
I mitocondri mantengono l'omeostasi della matrice Ca2+ attraverso un equilibrio tra l'assorbimento di Ca2+ e l'efflusso. L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ è mediato principalmente dagli uniportatori mitocondriali Di Ca2+ (MCU), mentre l'efflusso mitocondriale di Ca2+ è mediato dagli scambiatori Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) e dagli scambiatori H+/Ca2+ (mHCX)8. L'equilibrio può essere perturbato attraverso la stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)9. L'omeostasi mitocondriale di Ca2+ è anche influenzata dal tamponamento mitocondriale dalla formazione di complessi insolubili xCa2+-xPO4x-xOH8.
Le variazioni intracellulari e mitocondriali della concentrazione di Ca2+ ([Ca2+])possono essere valutate mediante indicatori fluorescenti o luminescenti di Ca2+. Il legame di Ca2+ agli indicatori provoca modifiche spettrali, consentendo la registrazione di cellule libere [Ca2+]in tempo reale in cellule vive. Attualmente sono disponibili due tipi di sonde per monitorare i cambiamenti di Ca2+ nelle cellule: indicatori chimici organici e indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI). Generalmente, diverse varianti con diverse affinità di Ca2+ (basate su Kd),proprietà spettrali (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione), intervalli dinamici e sensibilità sono disponibili per le questioni biologiche in esame. Sebbene molti indicatori organici sintetici di Ca2+ siano stati utilizzati per l'imaging citosolico di Ca2+, solo pochi possono essere caricati selettivamente nella matrice mitocondriale per l'imaging mitocondriale Ca2+, con Rhod-2 che è il più utilizzato (per le recensioni vedi10,11). Tuttavia, Rhod-2 ha un grosso svantaggio di perdite durante esperimenti a lungo termine; inoltre, è suddiviso tra mitocondri, altri organelli e il citosol, rendendo difficili le misurazioni assolute in diversi sottocompartimenti. Al contrario, utilizzando promotori specifici per tipo cellulare e sequenze di targeting del compartimento subcellulare, i GECI possono essere espressi in diversi tipi di cellule e compartimenti subcellulari per l'imaging Ca2+ specifico per cellula e compartimento in vitro o in vivo. Gli indicatori GCaMP Ca2+ basati sull'intensità di fluorescenza a lunghezza d'onda singola sono recentemente emersi come principali GECI12,13,14,15,16. In questo articolo, forniamo un protocollo per il targeting dei mitocondri e l'espressione specifica del tipo cellulare di GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrociti e neuroni e l'imaging dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in questi tipi di cellule. Utilizzando questo protocollo, l'espressione di GCaMP6G/6s nei singoli mitocondri può essere rivelata e l'assorbimento di Ca2+ in risoluzione mitocondriale singola può essere ottenuto in astrociti e neuroni in vitro e in vivo.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Missouri-Columbia.
1. Costruzione di plasmidi a DNA
NOTA: Per l'imaging in vitro e in vivo, vengono costruiti plasmidi di DNA che codificano GCaMP5G/6s con promotori astrociti e neuroni specifici e sequenze di targeting mitocondriale.
- Inserire matrice mitocondriale (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 nei siti di clonazione EcoRI e BamHI nella spina dorsale del plasmide adeno-associato (AAV) pZac2.1 per ottenere plasmidi contenenti promotore astrocitico gfaABC1D o promotore caMKII neuronale18,19,20.
- Subclone GCaMP5G/6s nei siti di clonazione BamH I e Non 1 nei plasmidi di cui sopra per ottenere nuovi plasmidi pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s e pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s che mirano all'espressione transgenica nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni20,21 (Figura 1A).
- Preparare i plasmidi del DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s per la trasfezione per lo studio in vitro (Sezione 2). Produrre vettori AAV con sierotipo 5 per gli astrociti e sierotipo 9 per i neuroni per lo studio in vivo 18 (Sezione 3).
2. Imaging mitocondriale In vitro Ca2+ in astrociti e neuroni
- Preparare astrociti primari dalla corteccia di topi neonatali P1 e neuroni primari dalla corteccia degli embrioni E15-1618,22,23, 24e coltivarli su coperture di vetro di 12 mm di diametro in piastre a 24 pozzetti utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e il mezzo basale neuronale (NBM) contenente il 2% di B27, rispettivamente.
- Trasfettare astrociti e neuroni maturi con pZac-gfaABC1D-GCaMP6s e plasmidi pZac-CaMKII-GCaMP5G utilizzando reagenti di trasfezione a base lipidica per esprimere GCaMP6 nei mitocondri degli astrociti e GCaMP5G nei mitocondri dei neuroni18,20,21. Trasfettate le cellule in ogni pozzetto con 0,5 μg di DNA e cambiate il mezzo 6 ore dopo.
NOTA: Gli astrociti e i neuroni sono pronti per l'imaging 1-2 giorni dopo la trasfezione. - Eseguire l'imaging mitocondriale in vitro Ca2+ 1-2 giorni dopo la trasfezione.
- Trasferire le coperture di vetro coltivate con astrociti o neuroni nella camera di perfusione PH-1 sotto un microscopio a epifluorescenza o due fotoni.
- Stimolare l'assorbimento astrocitico mitocondriale di Ca2+ con 100 μM di ATP in ACSF, o stimolare i mitocondri neuronali con 100 μM di glutammato/10 μM di glicina20,25 (Figura 2 e Figura 3).
NOTA: le modifiche della soluzione da ACSF ad ACSF contenente ATP e glutammato/glicina sono controllate da un sistema di perfusione ALA-VM821. La velocità del cambio di soluzione è controllata a 1-2 ml/min regolando una valvola.
3. Imaging mitocondriale In vivo Ca2+ in astrociti e neuroni
- Preparazioni AAV.
- Preparare i seguenti vettori di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) utilizzando i plasmidi del DNA preparati nella sezione 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vettori.
NOTA: In questo esperimento, i vettori rAAV del sierotipo 5 sono stati preparati per esprimere GCaMP5G nei mitocondri negli astrociti e i vettori rAAV del sierotipo 9 sono stati preparati per esprimere GCaMP6 nei mitocondri nei neuroni.
- Preparare i seguenti vettori di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) utilizzando i plasmidi del DNA preparati nella sezione 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G e rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vettori.
- Iniezione stereotassica di AAV.
- Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
NOTA: Più tardi durante l'intervento chirurgico, i livelli di isoflurano sono ridotti al 2%. - Dopo che il topo raggiunge un livello chirurgico di anestesia, come determinato dal pizzico della coda e della punta, radere i capelli sul sito chirurgico, sulla corteccia motoria o somatosensoriale, con un tagliacapelli.
- Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per proteggerli durante l'intervento chirurgico. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico.
NOTA: Eseguire interventi chirurgici utilizzando procedure asettiche. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave o con uno sterilizzatore a caldo. - Dopo che il mouse è stato montato sul dispositivo stereotassico, sterilizzare il cuoio capelluto con scrub alternato a base di iodio e etanolo al 70% tre volte. Fare un'incisione nella linea mediana del cuoio capelluto per esporre il sito di iniezione.
- Aprire la pelle nell'asse bregma-lamda e creare un foro di bava di circa 1 mm di diametro con un trapano ad alta velocità nella posizione di iniezione prevista del motore o della corteccia somatosensoriale.
- Utilizzare una siringa Hamilton da 33 G contenente virus adeno-associato (vettori rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] o vettori rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) per iniettare fino a 1 μL di virus nell'area bersaglio.
NOTA: ad esempio, per la somministrazione virale corticale, iniettare la soluzione virale a due profondità in più passaggi. In primo luogo, inserire l'ago a una profondità di 1 mm dalla dura e consentire 5 minuti per il recupero del cervello. Quindi, spostare l'ago fino a ~ 700 μm di profondità e iniettare 500 nL della soluzione virale ad una velocità di iniezione di 10 nL/s utilizzando una siringa hamilton controllata da un controller della pompa a microsiringa. Al termine dell'iniezione, attendere 5 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. Quindi, spostare l'ago fino alla seconda posizione di iniezione a una profondità di 300 μm. Qui, iniettare altri 500 nL della soluzione virale. Attendere 10 minuti per consentire al virus di diffondersi nel cervello. - Chiudere il cuoio capelluto e la pelle utilizzando un adesivo tissutale. Lascia che i topi si riprendano sulla piastra riscaldante. Rimanda i topi alla struttura per animali dopo il recupero.
- Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
- Installazione della finestra cranica e imaging in vivo a due fotoni (2-P) dei segnali mitocondriali Ca2+.
NOTA: L'impianto della finestra cranica viene eseguito 3 settimane dopo l'iniezione di AAV sulla corteccia motoria o somatosensoriale26,27,28,29. Carprofene (10 mg / kg) viene iniettato per via sottocutanea per fornire sollievo dal potenziale dolore prima dell'intervento chirurgico. Le procedure chirurgiche della finestra cranica sono identiche alle procedure chirurgiche di iniezione AAV e vengono eseguite in condizioni asettiche.- Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
NOTA: Questa è la dose iniziale e ridurre al 2% per l'intervento chirurgico in seguito. Durante l'imaging, per l'anestesia viene utilizzata un'iniezione intraperitoneale (IP) di 130 mg di ketamina/10 mg di xilazina/kg di peso corporeo disciolto in ACSF. - Posizionare il mouse sul dispositivo stereotassico del mouse e fissare la testa con le barre auricolari. Applicare unguento oftalmico agli occhi. Utilizzare una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C durante l'intervento chirurgico.
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati. - Fai un'incisione di 5-8 mm di lunghezza nella linea mediana del cuoio capelluto e rimuovi un lembo di pelle usando un paio di forbici.
- Dopo che il cranio è stato esposto, eseguire la craniotomia di 2,0-3,0 mm di diametro utilizzando un trapano ad alta velocità sull'area iniettata dal virus (ad esempio, corteccia motoria o corteccia somatosensoriale, Figura 1B). In primo luogo, fare quattro piccoli fori, quindi praticare in un cerchio che collega i fori. Quindi, sollevare e rimuovere l'osso con forbici affilate e rimuovere. La dura madre esposta può essere rimossa o mantenuta intatta per l'impantazione della finestra cranica.
- Posizionare una copertura di vetro di 3-5 mm di diametro che trasporta un silicone trasparente sopra la craniotomia. Usa uno stuzzicadenti per spingere delicatamente la finestra cranica sulla superficie del cervello. Quindi, sigillare il bordo con una piccola quantità di adesivo siliconico.
NOTE: In alternativa, invece del disco di silicone, è possibile utilizzare gel di agarosio a basso punto di fusione all'1,2% tra il vetro di copertura e il tessuto cerebrale. - Infine, sigillare i bordi del coperchio con cemento dentale. Fare attenzione ad applicare leggermente il cemento sul bordo della finestra cranica per un forte incollaggio. Attaccare una piastra metallica su misura al cranio con cemento dentale.
NOTA: La piastra metallica viene utilizzata per fissare la testa del mouse allo stadio del microscopio 2-P durante la sessione di imaging (Figura 1C). - Aggiungere 0,5 mL di soluzione ACSF sopra il coperchio sulla finestra cranica per l'immersione in acqua durante l'imaging.
- Eseguire l'imaging 2-P time-lapse in vivo di mito-GCaMP5G in astrociti e mito-GCaMP6 in neuroni con lunghezza d'onda di 910 nm attraverso la finestra cranica(Figura 1C)18,20,27.
NOTA: durante l'imaging, i topi sono sulla piastra riscaldante per mantenere la temperatura fisiologica. I topi saranno sacrificati immediatamente dopo il completamento della sessione di imaging. - Etichettare gli astrociti in vivo con sulforodamina 101 (SR101) quando è necessario determinare la colocalizzazione.
- Alla fine del passaggio 3.3.4, applicare 100 μL di 100 μM SR101 in ACSF sulla superficie corticale per 1-5 min.
- Risciacquare la superficie con ACSF per lavare via l'SR101 non legato. Utilizzando l'imaging 2-P, la co-marcatura di mito-GCaMP5G e SR101 negli astrociti può essere osservata 45-60 minuti dopo (Figura 4A).
- Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano.
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Representative Results
Lo scopo di questo studio è stato quello di fornire una metodologia per l'immagine di segnali mitocondriali Ca2+ utilizzando GECI in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. I risultati dell'imaging mitocondriale Ca2+ sia in vitro che in vivo sono presentati qui.
Segnalazione mitocondriale invitro Ca2+ in astrociti e neuroni in coltura
L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ negli astrociti può essere suscitato dall'applicazione di ATP e l'assorbimento mitocondriale di Ca2+ nei neuroni può essere suscitato dall'applicazione di glutammato e glicina attraverso un sistema di perfusione. La Figura 2 e la Figura 3 mostrano che GCaMP6s è espresso rispettivamente in astrociti in coltura e GCaMP5G nei neuroni. L'assorbimento mitocondriale di Ca2+ negli astrociti è stato provocato da 100 μM di ATP con singola risoluzione mitocondriale (Figura 2B-D). Gli assorbimenti mitocondriali di Ca2+ nei neuroni sono stati suscitati da 100 μM di glutammato e 10 μM di glicina con singola risoluzione mitocondriale (Figura 3B-D).
Imaging in vivo 2-P dell'espressione mitocondriale di GCaMP5G o 6S in astrociti e neuroni
L'imaging viene eseguito raccogliendo l'imaging time-lapse in vivo 2-P dei segnali di fluorescenza mitocondriale negli astrociti e nei neuroni con un sistema di microscopio Ultima 2-P. Usiamo lunghezza d'onda di eccitazione 880-910 nm. La Figura 4 mostra l'espressione di GCaMP5G nei mitocondri negli astrociti nella corteccia del topo. L'espressione astrocitaria specifica di GCaMP5G è stata confermata dalla colocalizzazione di SR101 con GCaMP5G con risoluzione mitocondriale singola (Figura 4A), e si possono osservare cambiamenti spontanei di Ca2+ nei singoli mitocondri (Figura 4B-E). La Figura 5A mostra l'espressione neuronale specifica di mito-GCaMP6s colocalizzati con il marcatore neuronale NeuN. La fluorescenza dei mito-GCaMP6 nei neuroni mostra la morfologia mitocondriale nei dendriti (Figura 5B). Si possono osservare aumenti spontanei di Ca2+ mitocondriale nei dendriti (Figura 5C-F).
Analisi dei segnali mitocondriali Ca2+
Quantificare i segnali fluorescenti calcolando le intensità medie dei pixel del corpo cellulare o dei singoli mitocondri negli astrociti e nei neuroni utilizzando un software di analisi delle immagini. Le variazioni Ca2+ nel tempo (t) sono espresse come valori F/Fo (t) rispetto al tempo, dove Fo è la fluorescenza basale sottratta di fondo e F è la variazione di fluorescenza sottratta alla linea di base20,21. Utilizzare i valori F/Fo di picco per confrontare l'ampiezza dei segnali Ca2+.
Figura 1: Costrutti del DNA per l'espressione transgenica di mitocondri astrociti e neuroni specifici e imaging 2-P in vivo. (A) Costrutti di DNA dell'indicatore Ca2+ geneticamente codificato GCaMP5G o GcaMP6s in plasmide pZac2.1 con promotori gfaABC1D (su) e CaMKII (basso) per la consegna alla matrice mitocondriale astrocitica e neuronale, rispettivamente. Il targeting dei mitocondri è ottenuto utilizzando una sequenza specifica della matrice mitocondriale (MM) (mito) aggiunta all'N-terminus delle proteine fluorescenti. (B) Una craniotomia sopra la corteccia di un topo. (C) Il cranio di un topo è attaccato ad una piastra metallica collegata al palo fissato sullo stadio del microscopio 2-P. L'inserto mostra la finestra cranica con una piastra metallica attaccata al cranio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging mitocondriale Ca2+ di astrociti in coltura. (A-B) Un'immagine 2-P di un astrocita che esprime mito-GCaMP6s (A) e la sua risposta alla stimolazione di 100 μM ATP al momento indicato (B). (C) Immagini di mito-GCaMP6 nei quattro singoli mitocondri (in A, cerchi) nei diversi momenti dopo la stimolazione ATP. (D) I cicli temporali della fluorescenza mito-GCaMP6s cambiano, tracciati come ΔF/Fo, nei quattro singoli mitocondri dopo stimolazione ATP. La freccia rossa indica l'ora di inizio dell'imaging. La scala pseudocolore è una rappresentazione lineare dell'intensità della fluorescenza in questa e in altre figure. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging mitocondriale Ca2+ di neuroni in coltura. (A-B) Un'immagine 2-P del neurone che esprime mito-GCaMP5G (A) e la sua risposta a 100 μM di glutammato e 10 μM di glicina al momento indicato (B). (C) Immagini di mito-GCaMP5G nei quattro singoli mitocondri (in A, cerchi) in momenti diversi dopo la stimolazione del glutammato. (D) I corsi temporali della fluorescenza mito-GCaMP5G cambiano nei quattro singoli mitocondri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging in vivo 2-P della segnalazione mitocondriale Di Ca2+ negli astrociti. (A) Immagini 2-P di mito-GCaMP5G che esprimono astrociti colocalizzati con SR101. (B-C) Immagine 2-P di un astrocita che esprime mito-GCaMP5G per l'analisi dell'aumento spontaneo di Ca2+. (C-E) Immagini di mito-GCaMP5G nei quattro singoli mitocondri nell'astrocita (in B, cerchi) nei diversi tempi (C) e nei decorshi temporali dei cambiamenti di fluorescenza mito-GCaMP5G, tracciati come ΔF/Fo, nei quattro singoli mitocondri (E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging in vivo 2-P della segnalazione mitocondriale Di Ca2+ nei neuroni. (A) Colocalizzazione di GCaMP6s (superiore) con marcatore neuronale NeuN (al centro) nel cervello. (B) Immagini ad alta risoluzione di dendriti che esprimono GCaMP6 con morfologia mitocondriale (indicata da *s). (C) GCaMP6 espressi in mitocondri neuronali. (D-F) Analisi dell'aumento spontaneo mitocondriale di Ca2+ nei neuroni. Immagine pseudocolore 2-P dei mitocondri che esprimono mito-GCaMP6s in C in tempi diversi (D). Immagini di mito-GCaMP6 nei quattro singoli mitocondri in C (cerchi) nei diversi momenti (E-F) e i corsi temporali dei cambiamenti di fluorescenza mito-GCaMP6s, tracciati come ΔF/Fo, nei quattro singoli mitocondri (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film: Il mitocondriale Ca2+ aumenta in base ai cambiamenti di fluorescenza GCaMP5G in risposta a 100 μM ATP negli astrociti coltivati. Clicca qui per scaricare questo film.
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Discussion
In questo articolo, forniamo un metodo e un protocollo per l'imaging dei segnali mitocondriali Ca2+ in astrociti e neuroni. Abbiamo implementato strategie di targeting dei mitocondri e specifiche per tipo cellulare per esprimere GECI GCaMP5G/6s. Per indirizzare GCaMP5G / 6 nei mitocondri, abbiamo incluso una sequenza di targeting dei mitocondri nei plasmidi. Per esprimere GCaMP5G/6s in astrociti e neuroni in vivo,abbiamo inserito un promotore astrocitario specifico gfaABC1D e un promotore neurone-specifico CaMKII nei plasmidi. L'espressione specifica di tipo cellulare di GCaMP5G/6s negli astrociti e nei neuroni può essere confermata dall'etichettatura SR101 negli astrociti e dall'immunocolorazione dei neuroni con NeuN. Dai nostri dati, queste strategie forniscono un approccio affidabile specifico per tipo di cellula per l'imaging mitocondriale Di Ca2+ in astrociti e neuroni in vivo.
Un potenziale problema per l'espressione GECI è che potrebbe causare il buffering di Ca2+ poiché potrebbe ridurre il legame libero di Ca2+ di Ca2+. Un altro problema a cui si potrebbe prestare attenzione è la quantità di virus iniettato. Le singole cellule che esprimono GECI potrebbero non essere identificate se viene iniettato un virus eccessivo. Questi problemi possono essere efficacemente migliorati riducendo il titolo di AAV. Anche il fotosbiancamento potrebbe essere un problema. Teoricamente, tutti gli indicatori fluorescenti sono soggetti a fotosbiancamento. I GCaMP5G/6 sono abbastanza stabili, ma sbiancano sotto continua esposizione alla luce di eccitazione. Una pratica generale per evitare il fotosbiancamento è quella di ridurre il tempo di esposizione del tessuto alla luce laser, assicurando al contempo che venga raccolta una quantità sufficiente di fluorescenza. Ciò può essere ottenuto se vengono utilizzati PMT ad alta sensibilità e obiettivi di trasmissione della luce elevata. Il fotosbiancamento può anche essere ridotto chiudendo l'otturatore tra le immagini.
Nei nostri risultati dell'imaging 2-P in vivo, si possono osservare aumenti mitocondriali spontanei sia negli astrociti che nei neuroni. In particolare, questi transienti mitocondriali di Ca2+ hanno una lunga durata (Figura 4E e Figura 5E), in linea con un recente rapporto di Gobel et al.30. Il meccanismo alla base di questo fenomeno non è chiaro, ma vale la pena di essere perseguito ulteriormente. Per l'aumento citosolico di Ca2+, astrociti e neuroni hanno meccanismi diversi. Le stimolazioni del recettore della proteina G causano un aumento di Ca2+ in ER negli astrociti mentre le attivazioni dei canali Ca2+ voltaggio-dipendenti o dei recettori del glutammato causano un aumento citosolico Ca2+ dei neuroni, che possono essere assorbiti dai mitocondri. Nel nostro precedente studio20,abbiamo scoperto che quando mito-GCaMP5G è stato cotrasfettato con astrociti in coltura IP3 5-fosfatasi (5ppasi), l'aumento mitocondriale Di Ca2+ indotto da ATP potrebbe essere in gran parte abolito. Tuttavia, i due mutanti di 5ppasi, cioè R343A e R343A / R350A 5ppase, che mancano di attività enzimatica, non hanno influenzato l'aumento mitocondriale di Ca2+ dopo la stimolazione dell'ATP. Questi risultati indicano che i livelli citosolici e mitocondriali di Ca2+ sono altamente accoppiati, probabilmente a causa dell'intima connessione fisica tra l'ER e i mitocondri negli astrociti, con il citosol che funge da condotto intermedio per la consegna di Ca2+. Abbiamo anche scoperto che la stimolazione del glutammato ha causato l'aumento mitocondriale di Ca2+ nei neuroni, suggerendo che i recettori del glutammato svolgono un ruolo nell'ingresso di Ca2+ dallo spazio extracellulare. In futuro, sarà interessante studiare gli aumenti di Ca2+ mitocondriale guidati dai sensi negli astrociti e nei neuroni.
Il nostro approccio può essere utilizzato per visualizzare simultaneamente segnali citosolici e mitocondriali Ca2+ nello stesso tipo di cellula quando vengono espressi due GECI di diverse lunghezze d'onda di fluorescenza, ad esempio una fluorescente rossa GECI RCaMP nel citoplasma e GCaMP nei mitocondri, o viceversa31. Questo approccio può essere utilizzato anche per lo studio in vivo delle interazioni astrocita-neurone in fisiologia e patologia con GCaMP espresso in astrociti e RCaMP nei neuroni, o viceversa.
GCaMP è un fluoroforo a lunghezza d'onda singola GECI basato su GFP. Attualmente, i GCaMP sono gli indicatori Ca2+ più preferiti a causa del loro elevato rapporto segnale-rumore (SNR) e delle ampie gamme dinamiche (DR). Recentemente, i sensori jGCaMP7, la versione ottimizzata di GCaMP6, sono stati segnalati con una migliore sensibilità ai singoli picchi16. I sensori GCaMP7 possono essere facilmente subclonati nei nostri plasmidi per l'imaging mitocondriale Ca2+. In sintesi, le strategie che abbiamo presentato qui possono essere utilizzate per visualizzare l'assorbimento e la manipolazione del Ca2+ mitocondriale nei neuroni e negli astrociti con sensibilità sufficiente per risolvere i cambiamenti di Ca2+ a livello mitocondriale singolo in vivo. Questo protocollo rappresenta un mezzo utile per studiare la segnalazione citosolica e mitocondriale Ca2+ in astrociti e neuroni, nonché le interazioni astrociti-neuroni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 a SD. Ringraziamo Erica DeMers per la registrazione audio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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