Summary
Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.
Abstract
Le Ca2+ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca2+ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca2+ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca2+ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca2+, ainsi que les interactions astrocyte-neurone.
Introduction
Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca2+ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca2+dans des conditions physiologiques1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca2+ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca2+ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.
Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca2+ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca2+ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca2+ est médié par les échangeurs Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) et les échangeurs H+/ Ca2 + (mHCX)8. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)9. L’homéostasie mitochondriale Ca2+ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa2+-xPO4x-xOH insolubles8.
Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca2+ ([Ca2+]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca2+ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca2+ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca2+ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca2+ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca2+ (basées sur Kd),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca2+ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca2+ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca2+ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs12,13, 14,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca2+ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.
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Protocol
Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia.
1. Construction de plasmides d’ADN
REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits.
- Insérer la matrice mitochondriale (MM)-séquence de ciblage (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 dans les sites de clonage EcoRI et BamHI dans l’épine dorsale du plasmide du virus adéno-associé (AAV) pZac2.1 pour obtenir des plasmides contenant un promoteur astrocytaire gfaABC1D ou un promoteur neuronal CaMKII18,19,20.
- Subclone GCaMP5G/6s dans les sites de clonage BamH I et Not 1 dans les plasmides ci-dessus pour obtenir de nouveaux plasmides pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s et pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s qui ciblent l’expression transgénique dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones20,21 ( Figure1A).
- Préparer les plasmides d’ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s pour la transfection en vue d’une étude in vitro (section 2). Produire des vecteurs AAV avec le sérotype 5 pour les astrocytes et le sérotype 9 pour les neurones pour l’étude in vivo 18 (Section 3).
2. Imagerie mitochondriale in vitro ca2+ dans les astrocytes et les neurones
- Préparer les astrocytes primaires du cortex de souris néonatales P1 et les neurones primaires du cortex des embryons E15-1618,22 ,23,24, et les cultiver sur des couvertures de verre de 12 mm de diamètre dans des plaques de 24 puits en utilisant le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu neuronal basal (NBM) contenant 2% de B27, respectivement.
- Transfecter les astrocytes et les neurones matures avec des plasmides pZac-gfaABC1D-GCaMP6s et pZac-CaMKII-GCaMP5G en utilisant un réactif de transfection à base de lipides pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries des astrocytes et GCaMP5G dans les mitochondries des neurones18,20,21. Transfecter les cellules dans chaque puits avec 0,5 μg d’ADN, et changer le milieu 6 h plus tard.
REMARQUE: Les astrocytes et les neurones sont prêts pour l’imagerie 1-2 jours après la transfection. - Effectuer une imagerie mitochondriale in vitro ca2+ 1-2 jours après la transfection.
- Transférer les couvercles de verre cultivés avec des astrocytes ou des neurones dans la chambre de perfusion PH-1 sous un microscope à épifluorescence ou à deux photons.
- Stimuler l’absorption astrocytaire mitochondriale de Ca2+ avec 100 μM d’ATP dans le LCF, ou stimuler les mitochondries neuronales avec 100 μM de glutamate/10 μM de glycine20,25 (Figure 2 et Figure 3).
REMARQUE: Les changements de solution de ACSF à ACSF contenant de l’ATP et du glutamate / glycine sont contrôlés par un système de perfusion ALA-VM821. La vitesse du changement de solution est contrôlée à 1-2 mL/min en ajustant une vanne.
3. Imagerie mitochondriale in vivo Ca2+ dans les astrocytes et les neurones
- Préparations AAV.
- Préparer les vecteurs du virus adéno-associé recombinant (rAAV) suivants à l’aide des plasmides d’ADN préparés à la rubrique 1 : vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
REMARQUE: Dans cette expérience, les vecteurs rAAV du sérotype 5 ont été préparés pour exprimer GCaMP5G dans les mitochondries dans les astrocytes et les vecteurs rAAV du sérotype 9 ont été préparés pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries dans les neurones.
- Préparer les vecteurs du virus adéno-associé recombinant (rAAV) suivants à l’aide des plasmides d’ADN préparés à la rubrique 1 : vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
- Injection stéréotaxique d’AAV.
- Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
REMARQUE: Plus tard pendant la chirurgie, les niveaux d’isoflurane sont réduits à 2%. - Une fois que la souris a atteint un niveau chirurgical d’anesthésie, déterminé par le pincement de la queue et des orteils, rasez les cheveux sur le site de la chirurgie, le cortex moteur ou somatosensoriel, avec une tondeuse à cheveux.
- Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les protéger pendant la chirurgie. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie.
REMARQUE: Effectuer une intervention chirurgicale en utilisant des procédures aseptiques. Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés soit par autoclavage, soit par un stérilisateur de perles chaudes. - Une fois la souris montée sur le dispositif stéréotaxique, stérilisez le cuir chevelu avec un gommage à base d’iode alterné et 70% d’éthanol trois fois. Faites une incision dans la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le site d’injection.
- Coupez la peau dans l’axe bregma-lamda et créez un trou de bavure d’environ 1 mm de diamètre avec une perceuse à grande vitesse à l’emplacement d’injection prévu du moteur ou du cortex somatosensoriel.
- Utilisez une seringue Hamilton de 33 G contenant le virus adéno-associé (vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] ou vecteurs rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) pour injecter jusqu’à 1 μL de virus dans la zone cible.
REMARQUE: Par exemple, pour l’administration virale corticale, injecter la solution virale à deux profondeurs en plusieurs étapes. Tout d’abord, insérez l’aiguille à une profondeur de 1 mm de la dure-mère et laissez 5 min au cerveau pour récupérer. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’à ~700 μm de profondeur et injectez 500 nL de la solution virale à une vitesse d’injection de 10 nL/s à l’aide d’une seringue hamilton contrôlée par un contrôleur de pompe à microsyringe. Une fois l’injection terminée, attendez 5 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’au deuxième emplacement d’injection à une profondeur de 300 μm. Ici, injectez 500 nL supplémentaires de la solution virale. Attendez 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. - Fermez le cuir chevelu et la peau à l’aide d’un adhésif tissulaire. Laissez les souris récupérer sur le coussin chauffant. Renvoyer les souris à l’animalerie après leur rétablissement.
- Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
- Intstallation de la fenêtre crânienne et imagerie in vivo à deux photons (2-P) des signaux mitochondriaux Ca2+.
REMARQUE: L’implantation de la fenêtre crânienne se fait 3 semaines après l’injection d’AAV sur le cortex moteur ou somatosensoriel26,27,28,29. Le carprofène (10 mg/kg) est injecté par voie sous-cutanée pour soulager la douleur potentielle avant la chirurgie. Les procédures chirurgicales de la fenêtre crânienne sont identiques aux procédures chirurgicales d’injection AAV et sont effectuées dans des conditions aseptiques.- Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
REMARQUE: Il s’agit de la dose initiale et réduisez à 2% pour la chirurgie plus tard. Au cours de l’imagerie, une injection intrapéritonéale (IP) de 130 mg de kétamine/10 mg de xylazine/kg de poids corporel dissous dans le LCF est utilisée pour l’anesthésie. - Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie.
REMARQUE: Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés. - Faites une incision de 5 à 8 mm de long dans la ligne médiane du cuir chevelu et retirez un lambeau de peau à l’aide d’une paire de ciseaux.
- Une fois le crâne exposé, effectuer une craniotomie de 2,0 à 3,0 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse à grande vitesse sur la zone injectée par le virus (c.-à-d. cortex moteur ou cortex somatosensoriel, figure 1B). Tout d’abord, faites quatre petits trous, puis percez dans un cercle reliant les trous. Ensuite, soulevez et retirez l’os avec des ciseaux tranchants et retirez-le. La dure-mère exposée peut être enlevée ou conservée intacte pour l’empantation de la fenêtre crânienne.
- Placez un couvercle en verre de 3 à 5 mm de diamètre portant un silicone transparent sur la craniotomie. Utilisez un cure-dent pour pousser doucement la fenêtre crânienne sur la surface du cerveau. Ensuite, scellez le bord avec une petite quantité d’adhésif en silicone.
NOTES: Alternativement, au lieu d’un disque de silicone, 1,2% de gel d’agarose à faible point de fusion peut être utilisé entre le verre de couverture et le tissu cérébral. - Enfin, scellez les bords du couvercle avec du ciment dentaire. Prenez soin d’appliquer légèrement le ciment au bord de la fenêtre crânienne pour un collage fort. Fixez une plaque de tête en métal sur mesure au crâne avec du ciment dentaire.
REMARQUE: La plaque métallique est utilisée pour fixer la tête de la souris à l’étape du microscope 2-P pendant la séance d’imagerie (Figure 1C). - Ajouter 0,5 mL de solution ACSF sur le couvercle de la fenêtre crânienne pour une immersion dans l’eau pendant l’imagerie.
- Effectuer une imagerie time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G dans les astrocytes et mito-GCaMP6s dans les neurones d’une longueur d’onde de 910 nm à travers la fenêtre crânienne (Figure 1C)18,20,27.
REMARQUE: Pendant l’imagerie, les souris sont sur le coussin chauffant pour maintenir la température physiologique. Les souris seront sacrifiées immédiatement après la fin de la séance d’imagerie. - Marquer les astrocytes in vivo avec la sulforhodamine 101 (SR101) lorsqu’il est nécessaire de déterminer la colocalisation.
- À la fin de l’étape 3.3.4, appliquer 100 μL de 100 μM SR101 dans ACSF sur la surface corticale pendant 1 à 5 min.
- Rincez la surface avec ACSF pour laver le SR101 non lié. En utilisant l’imagerie 2-P, le co-marquage de mito-GCaMP5G et SR101 dans les astrocytes peut être observé 45-60 min plus tard(Figure 4A).
- Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
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Representative Results
L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca2+ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ sont présentés ici.
Signalisation mitochondrialein vitro du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones en culture
L’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes peut être provoquée par l’application d’ATP, et l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les neurones peut être provoquée par l’application de glutamate et de glycine à travers un système de perfusion. La figure 2 et la figure 3 montrent que GCaMP6s est exprimé dans les astrocytes cultivés et GCaMP5G dans les neurones, respectivement. L’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes a été provoquée par 100 μM d’ATP avec une résolution mitochondriale unique(Figure 2B-D). Les absorptions mitochondriales de Ca2+ dans les neurones ont été provoquées par 100 μM de glutamate et 10 μM de glycine avec une résolution mitochondriale unique(Figure 3B-D).
Imagerie 2-P in vivo de l’expression mitochondriale de GCaMP5G ou 6S dans les astrocytes et les neurones
L’imagerie se fait en collectant l’imagerie 2-P in vivo en accéléré des signaux de fluorescence mitochondriale dans les astrocytes et les neurones avec un système de microscope Ultima 2-P. Nous utilisons la longueur d’onde d’excitation 880-910 nm. La figure 4 montre l’expression de GCaMP5G dans les mitochondries dans les astrocytes du cortex de la souris. L’expression spécifique des astrocytes de GCaMP5G a été confirmée par la colocalisation de SR101 avec GCaMP5G avec une résolution mitochondriale unique(Figure 4A),et des changements spontanés de Ca2+ dans les mitochondries individuelles peuvent être observés(Figure 4B-E). La figure 5A montre l’expression spécifique aux neurones de mito-GCaMP6s colocalisés avec le marqueur neuronal NeuN. La fluorescence des mito-GCaMP6 dans les neurones montre la morphologie mitochondriale chez les dendrites (Figure 5B). On observe des augmentations spontanées du Ca2+ mitochondrial chez les dendrites (Figure 5C-F).
Analyse des signaux mitochondriaux Ca2+
Quantifiez les signaux fluorescents en calculant l’intensité moyenne en pixels du corps cellulaire ou des mitochondries individuelles dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les variations Ca2+ au fil du temps (t) sont exprimées en valeurs F/Fo (t) par rapport au temps, où Fo est la fluorescence de base soustraite de fond et F est la variation de fluorescence soustraite de base20,21. Utilisez les valeurs de crête F/Fo pour comparer l’amplitude des signaux Ca2+.
Figure 1: Constructions d’ADN pour l’expression transgénique ciblant les mitochondries spécifiques aux astrocytes et aux neurones, et l’imagerie 2-P in vivo. (A) Constructions d’ADN d’indicateur Ca2+ génétiquement codé GCaMP5G ou GcaMP6s dans le plasmide pZac2.1 avec des promoteurs gfaABC1D (up) et CaMKII (faible) pour l’administration à la matrice mitochondriale astrocytaire et neuronale, respectivement. Le ciblage des mitochondries est réalisé à l’aide d’une séquence spécifique de matrice mitochondriale (MM) (mito) ajoutée à la terminaison N des protéines fluorescentes. (B) Une craniotomie sur le cortex d’une souris. (C) Le crâne d’une souris est attaché à une plaque métallique reliée au poteau fixé sur l’étage du microscope 2-P. L’encart montre la fenêtre crânienne avec une plaque métallique attachée au crâne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Imagerie mitochondriale Ca2+ d’astrocytes en culture. (A-B) Image 2-P d’un astrocyte exprimant mito-GCaMP6s (A) et sa réponse à la stimulation de 100 μM ATP au moment indiqué (B). (C) Images de mito-GCaMP6s dans les quatre mitochondries individuelles (en A, cercles) à différents moments après la stimulation de l’ATP. (D) Les cycles temporels de la fluorescence mito-GCaMP6s changent, tracés comme ΔF / Fo, dans les quatre mitochondries individuelles après stimulation ATP. La flèche rouge indique l’heure de début de l’imagerie. L’échelle de pseudocolore est une représentation linéaire de l’intensité de fluorescence dans cette figure et dans d’autres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Imagerie mitochondriale Ca2+ de neurones cultivés. (A-B) Une image 2-P du neurone exprimant le mito-GCaMP5G(A)et sa réponse à 100 μM de glutamate et 10 μM de glycine au moment indiqué(B). (C) Images de mito-GCaMP5G dans les quatre mitochondries individuelles (en A, cercles) à différents moments après la stimulation du glutamate. (D) Les cycles temporels de la fluorescence mito-GCaMP5G changent dans les quatre mitochondries individuelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Imagerie 2-P in vivo de la signalisation mitochondriale Ca2+ dans les astrocytes. (A) Images 2-P de mito-GCaMP5G exprimant des astrocytes colocalisés avec SR101. (B-C) Image 2-P d’un astrocyte exprimant mito-GCaMP5G pour l’analyse de l’augmentation spontanée de Ca2+. (C-E) Images de mito-GCaMP5G dans les quatre mitochondries individuelles dans l’astrocyte (en B, cercles) aux différents moments (C) et les changements de fluorescence mito-GCaMP5G, tracés comme ΔF / Fo, dans les quatre mitochondries individuelles (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Imagerie in vivo 2-P de la signalisation mitochondriale Ca2+ dans les neurones. (A) Colocalisation de GCaMP6s (supérieur) avec le marqueur neuronal NeuN (milieu) dans le cerveau. (B) Images haute résolution de dendrites exprimant GCaMP6s avec morphologie mitochondriale (indiquée par *s). (C) GCaMP6s exprimés dans les mitochondries neuronales. (D-F) Analyse de l’augmentation spontanée du Ca2+ mitochondrial dans les neurones. Image pseudocolore 2-P des mitochondries exprimant mito-GCaMP6s en C à différents moments (D). Images de mito-GCaMP6s dans les quatre mitochondries individuelles en C (cercles) à différents moments(E-F)et les cycles temporels des changements de fluorescence mito-GCaMP6s, tracés comme ΔF / Fo, dans les quatre mitochondries individuelles (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film: Le Ca2+ mitochondrial augmente en fonction des changements de fluorescence GCaMP5G en réponse à 100 μM ATP dansles astrocytes en culture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca2+ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un promoteur spécifique aux astrocytes gfaABC1D et un promoteur spécifique aux neurones CaMKII dans les plasmides. L’expression spécifique de type cellulaire de GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones peut être confirmée par le marquage SR101 dans les astrocytes et l’immunocoloration des neurones avec NeuN. À partir de nos données, ces stratégies fournissent une approche fiable spécifique au type cellulaire pour l’imagerie mitochondriale Ca2+ dans les astrocytes et les neurones in vivo.
Un problème potentiel pour l’expression GECI est qu’elle peut provoquer une mise en mémoire tampon Ca2+ car elle peut réduire la liaison Libre Ca2+ par Ca2+. Un autre problème auquel on pourrait prêter attention est la quantité de virus injectée. Les cellules individuelles exprimant GECI peuvent ne pas être identifiées si un virus excessif est injecté. Ces problèmes peuvent être efficacement améliorés en réduisant le titre de l’AAV. Le photoblanchiment peut également être un problème. Théoriquement, tous les indicateurs fluorescents sont sujets au photoblanchiment. Les GCaMP5G/6 sont assez stables, mais ils blanchiront sous une exposition continue à la lumière d’excitation. Une pratique générale pour éviter le photoblanchiment est de réduire le temps d’exposition des tissus à la lumière laser tout en veillant à ce que suffisamment de fluorescence soit collectée. Cela peut être réalisé si des PMT à haute sensibilité et des objectifs de transmission de la lumière élevée sont utilisés. Le photoblanchiment peut également être réduit en fermant l’obturateur entre les images.
Dans nos résultats d’imagerie 2-P in vivo, des augmentations mitochondriales spontanées peuvent être observées à la fois dans les astrocytes et les neurones. Notamment, ces transitoires mitochondriaux ca2+ ont de longues durées(Figure 4E et Figure 5E),ce qui correspond à un rapport récent de Gobel et al.30. Le mécanisme sous-jacent de ce phénomène n’est pas clair mais mérite d’être poursuivi. Pour l’augmentation cytosolique du Ca2+, les astrocytes et les neurones ont des mécanismes différents. Les stimulations des récepteurs de la protéine G provoquent une augmentation du Ca2+ dans les astrocytes, tandis que les activations des canaux Ca2+ dépendants de la tension ou des récepteurs du glutamate provoquent une augmentation cytosolique du Ca2+ dans les neurones, qui peuvent être absorbées par les mitochondries. Dans notre étude précédente20, nous avons constaté que lorsque le mito-GCaMP5G était cotransfecté avec des astrocytes cultivés en culture IP3 5-phosphatase (5ppase), l’augmentation mitochondriale du Ca2+ induite par l’ATP pouvait être largement abolie. Cependant, les deux mutants de la 5ppase, c’est-à-dire R343A et R343A/R350A 5ppase, qui manquent d’activité enzymatique, n’ont pas affecté l’augmentation mitochondriale du Ca2+ après la stimulation de l’ATP. Ces résultats indiquent que les niveaux cytosoliques et mitochondriaux de Ca2+ sont fortement couplés, probablement en raison de la connexion physique intime entre l’ER et les mitochondries dans les astrocytes, le cytosol servant de conduit intermédiaire pour l’administration de Ca2+. Nous avons également constaté que la stimulation du glutamate provoquait une augmentation mitochondriale du Ca2+ dans les neurones, ce qui suggère que les récepteurs du glutamate jouent un rôle dans l’entrée du Ca2+ de l’espace extracellulaire. À l’avenir, il sera intéressant d’étudier les augmentations sensorielles du Ca2+ mitochondrial dans les astrocytes et les neurones.
Notre approche peut être utilisée pour imager simultanément les signaux cytosoliques et mitochondriaux Ca2+ dans le même type de cellule lorsque deux GECI de longueurs d’onde de fluorescence différentes sont exprimées, par exemple, une florescence rouge GECI RCaMP dans le cytoplasme et GCaMP dans les mitochondries, ou vice versa31. Cette approche peut également être utilisée pour l’étude in vivo des interactions astrocyte-neurone en physiologie et en pathologie avec GCaMP exprimé dans les astrocytes et RCaMP dans les neurones, ou vice versa.
GCaMP est un fluorophore GECI à longueur d’onde unique à base de GFP. Actuellement, les GCaMP sont les indicateurs Ca2+ les plus préférés en raison de leur rapport signal/bruit (SNR) élevé et de leurs grandes plages dynamiques (DR). Récemment, des capteurs jGCaMP7, la version optimisée de GCaMP6, ont été signalés avec une sensibilité améliorée aux pics individuels16. Les capteurs GCaMP7 peuvent être facilement sous-clonés dans nos plasmides pour l’imagerie mitochondriale Ca2+. En résumé, les stratégies que nous avons présentées ici peuvent être utilisées pour imager l’absorption et la manipulation mitochondriales du Ca2+ dans les neurones et les astrocytes avec une sensibilité suffisante pour résoudre les changements de Ca2+ au niveau mitochondrial unique in vivo. Ce protocole représente un moyen utile d’étudier la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones, ainsi que les interactions astrocyte-neurone.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) subventions R01NS069726 et R01NS094539 à SD. Nous remercions Erica DeMers pour l’enregistrement audio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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