Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.
Abstract
O trato respiratório está em contato direto com o ambiente externo e requer um sistema imunológico precisamente regulado para fornecer proteção enquanto suprime reações indesejadas a antígenos ambientais. Os pulmões abrigam várias populações de células imunes inatas e adaptáveis que fornecem vigilância imunológica, mas também mediam respostas imunes protetoras. Essas células, que mantêm o sistema imunológico pulmonar saudável em equilíbrio, também participam de várias condições patológicas, como asma, infecções, doenças autoimunes e câncer. A expressão seletiva de proteínas superficiais e intracelulares fornece propriedades imunofenópicas únicas às células imunes do pulmão. Consequentemente, a citometria de fluxo tem um papel fundamental na identificação dessas populações celulares durante condições de estado estável e patológico. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um método consistente e reprodutível para identificar as células imunes que residem nos pulmões de camundongos saudáveis em condições de estado estável. No entanto, este protocolo também pode ser usado para identificar alterações nessas populações celulares em vários modelos de doenças para ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar.
Introduction
O trato respiratório murino contém um sistema imunológico único responsável por combater patógenos e manter a homeostase imunológica. O sistema imunológico pulmonar consiste em populações celulares com heterogeneidade significativa em seu fenótipo, função, origem e localização. Os macrófagos alveolares residentes (AMs), originados principalmente de monócitos fetais, residem no lúmen 1 alveolar, enquanto macrófagos intersticiais (IMs) derivados da medula óssea residem no pulmão parenchyma2. Os IMs podem ser ainda mais subclassificados pela expressão do CD206. Os IMs CD206+ povoam a área peribronquial e perivascular, enquanto os IMs CD206-IMs estão localizados no interstício alveolar3. Algumas subclassificações de IMs foram propostas recentemente 3,4,5,6. Embora os IMs sejam menos estudados do que as AMs, evidências recentes apoiam seu papel crucial na regulação do sistema imunológico do pulmão7. Além disso, o CD206 também é expresso em AMs8 ativados alternativamente.
As células dendríticas pulmonares (DCs) são outro grupo heterogêneo de células imunes pulmonares em relação às suas propriedades funcionais, localização e origem. Quatro subcategorias de DCs foram descritas no pulmão: DCs cd103+ convencionais (também conhecidos como cDC1), CD11b+ DCs convencionais (também conhecidos como cDC2), DCs derivados de monocitoides (MoDCs) e DCs 9,10,11,12,13. As três primeiras subclasses podem ser definidas como principais complexos de histocompatibilidade (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Os DCs plasmacitóides expressam MHC II e são intermediavelmente positivos para CD11c, mas expressam altos níveis de B220 e PDCA-19,13,16. Em pulmões murinos ingênuos, os DCs CD103 e os DCs CD11b estão localizados no interstício das vias aéreas, enquanto os DCs plasmacitóides estão localizados no interstício alveolar17.
Duas grandes populações de monócitos residem no pulmão durante o estado estável: monócitos clássicos e monócitos não clássicos. Os monócitos clássicos são Ly6C+ e são críticos para a resposta inflamatória inicial. Em contraste, os monócitos não clássicos são Ly6C e têm sido amplamente vistos como células anti-inflamatórias3,16,18. Recentemente, foi descrita uma população adicional de monócitos CD64+CD16.2+, que se originam de monócitos Ly6C e dão origem a IMs3 CD206+.
Os eosinófilos aparecem principalmente nos pulmões durante a infecção por helminto ou condições alérgicas. No entanto, há um pequeno número de eosinófilos no parenchyma pulmonar durante o estado estável, conhecidos como eosinófilos residentes. Ao contrário dos eosinófilos residentes, eosinófilos inflamatórios são encontrados no interstício pulmonar e na lavagem broncoalveolar (BAL). Em modelos de camundongos de ácaro de poeira doméstica (HDM), eosinófilos inflamatórios são recrutados para o pulmão após estimulação mediada por antígeno. Foi proposto que os eosinófilos residentes possam ter um papel regulatório na alergia, inibindo a sensibilização do auxiliar T 2 (Th2) para o HDM19.
Em contraste com o resto das células mielóides pulmonares, os neutrófilos expressam Ly6G, mas não CD68, e são caracterizados por uma assinatura do imunofenótipo CD68-Ly6G+16,20,21. Estudos de visualização mostraram que, durante o estado estável, o pulmão reserva um pool de neutrófilos no compartimento intravascular e hospeda um número considerável de neutrófilos extravasculares22. Semelhante aos eosinófilos, os neutrófilos não são encontrados em BAL em estado estável; no entanto, várias formas de estimulação imunológica, como desafio LPS, asma ou pneumonia, levam os neutrófilos para o lúmen alveolar, resultando em sua presença em BAL21,22,23.
Um número substancial de células CD45+ do pulmão representam o assassino natural (NK), células T e células B e são negativos para a maioria dos marcadores mieloides24. Nos pulmões de camundongos ingênuos, esses três tipos de células podem ser identificados com base na expressão de CD11b e MHC II18. Cerca de 25% das células CD45+ pulmonares são células B, enquanto a porcentagem de células NK é maior no pulmão do que outros tecidos linfoides e não linfoides24,25,26. Entre as células T pulmonares, uma fração considerável é CD4-CD8- e desempenha um papel importante nas infecções respiratórias26.
Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de gating para a identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas16,18,20,27. A estratégia de gating descrita aqui fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes mielóides pulmonares e não mieloides usando 9 marcadores. Marcadores adicionais foram usados para validar os resultados. Além disso, é fornecido um método detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular que minimize a morte celular e permita a identificação do perfil mais completo do compartimento de células imunes do pulmão. Deve-se notar que a identificação de células não imunes do pulmão, como células epiteliais (CD45-CD326+CD31-), células endoteliais (CD45-CD326-CD31+) e fibroblastos requer uma abordagem diferente28,29. A identificação dessas populações não está incluída no protocolo e método aqui descrito.
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Protocol
Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob diretrizes de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center. De seis a dez semanas de idade, os ratos C57BL/6 de ambos os sexos foram usados para desenvolver este protocolo.
1. Excisão cirúrgica e preparação tecidual
- Eutanize o mouse injetando 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiais).
NOTA: A asfixia por CO2 deve ser evitada em estudos pulmonares, pois pode causar lesão pulmonar e alterar as características e propriedades das células imunes pulmonares. A luxação cervical também deve ser evitada, pois pode causar lesões mecânicas no pulmão. - Transfira o mouse para uma área limpa e dedicada para operação cirúrgica.
- Estabilize o lado dorsal do rato para baixo usando agulhas ou fita nas quatro extremidades. Use 70% de etanol para higienizar a pele da área ventral.
- Faça uma incisão na pele, do pescoço ao abdômen. Remova cuidadosamente a pele da área torácica.
- Remova cuidadosamente o esterno e as costelas.
- Lave os pulmões injetando 10 mL de PBS frio diretamente no ventrículo direito, usando uma agulha de 18-21 G, até que os pulmões fiquem completamente brancos.
- Remova cuidadosamente o timo e o coração sem tocar nos pulmões.
- Retire suavemente os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo com tampão BSA frio (Tabela 1).
NOTA: Deve-se fazer esforços para remover toda a gordura adjacente dos pulmões antes de preparar ainda mais a suspensão unicelular, pois isso poderia influenciar as leituras.
2. Preparação de suspensão unicelular
- Transfira os pulmões para uma placa de Petri vazia e pique-os com dois bisturis finos. Transfira todos os pedaços do pulmão picado para um novo tubo cônico de 50 mL. Use 5 mL de tampão de digestão para lavar a placa e adicioná-la ao tubo de 50 mL contendo o pulmão picado (Tabela 1).
NOTA: O tampão de digestão deve ser preparado imediatamente antes do uso. Use 5 mg/mL de colagenase28. A combinação de 1 ou 5 mg de colagemnase com tampão BSA ou PBS livre de proteínas não melhorou os resultados (Figura Suplementar S1). - Fixar a tampa do tubo e digerir o pulmão por 30 minutos em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rpm a 37 °C. Pare a reação adicionando 10 mL de tampão BSA frio.
- Após a digestão, use uma agulha de 18 G para misturar e dissolver os pedaços pulmonares. Coloque um filtro de 70 μm no topo de um novo tubo cônico de 50 mL.
NOTA: O uso de um filtro de míccro menor pode resultar na perda de grandes populações mieloides. - Transfira lentamente a mistura pulmonar digerida diretamente no coador. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mL para esmagar as peças restantes do pulmão no filtro. Lave o material processado no filtro com tampão BSA.
- Centrifugar a suspensão unicelular a 350 × g por 8 min a 4 °C.
- Descarte cuidadosamente o supernasciente e resuspenja as células em 1 mL de tampão de lise ACK. Misture bem usando uma tubulação de 1 mL e incubar por 90 s à temperatura ambiente.
- Adicione 10 mL de tampão BSA frio para parar a reação e centrífuga a 350 × g por 7 min a 4 °C.Descarte cuidadosamente o supernatário e resuspenque a pelota no Tampão de Coloração para contar as células usando um hemócito.
- Resuspengem as células a uma concentração de 5 × 106 células/mL e use-as para coloração superficial (ver seção 3).
NOTA: Para este fim, coloque as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços seguida de manchas de anticorpos e lavagens. Se uma centrífuga de placa não estiver disponível, use tubos de fluxo em vez de placas. Com este protocolo, ~15-20 × 106 células por pulmão podem ser obtidas de um mouse C57BL/6 de 6-10 semanas de idade de tamanho médio.
3. Mancha de anticorpos de superfície
- Transfira 1 × 106 células em 200 μL por poço em uma placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 350 × g por 7 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare a solução de bloco de Fc diluindo anticorpo anti-16/32 (1:100) no tampão de coloração (Tabela 1).
- Resuspenda as células em 50 μL da solução pré-preparada de bloqueio de Fc (Tabela de Materiais) e incubar por 15-20 min a 4 °C ou no gelo.
- Adicione 150 μL de tampão de coloração e centrifule a placa a 350 × g por 5 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos da superfície diluindo anticorpos superficiais (1:100; Tabela 2) no tampão de coloração.
NOTA: (i) Anticorpo anti-16/32 para bloqueio de Fc pode ser usado com os anticorpos superficiais na mesma mistura. (ii) Se for usado o corante de viabilidade fixável, adicione-o ao coquetel de anticorpos da superfície a uma diluição de 1:100. - Resuspenda as células em 50 μL do coquetel de anticorpos de superfície pré-preparado e incubar por 30-40 min a 4 °C no escuro. Lave as células com tampão de coloração duas vezes.
NOTA: Se não for necessária uma coloração intracelular, resuspensar as células em 200 μL de tampão de coloração e proceder diretamente à aquisição de dados no citómetro de fluxo. Alternativamente, as células podem ser fixadas e armazenadas a 4 °C para aquisição posteriormente. Recomendamos o uso das células para citometria de fluxo dentro de 24 h.
4. Fixação celular e coloração intracelular
- Prepare o buffer de fixação/permeabilização (Fix/Perm Buffer) misturando três partes do concentrado de fixação/permeabilização e 1 parte da fixação/permeabilização diluída do Conjunto de Buffer de Manchas de Fator FoxP3/Transcrição (Tabela 1).
- Resuspenque as células em 50 μL do buffer fixo/perm pré-preparado por poço da placa de 96 poços, onde as células foram banhadas como descrito na seção 3, e incuba-las por 20-25 min a 4 °C no escuro.
- Diluir o tampão de permeabilização de 10x como 1: 10 em água deionizada purificada para preparar 1x tampão de permeabilização.
- Lave as células uma vez com 1x de tampão de permeabilização. Enquanto isso, prepare o coquetel de anticorpos intracelulares diluindo anticorpos intracelulares (1:100) em 1 mL de tampão de permeabilização.
- Resuspenque as células usando 50 μL do coquetel de anticorpos de superfície pré-preparado por célula da placa de 96 poços e incubar por 40 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células uma vez com tampão de permeabilização e uma vez com tampão de coloração. Após a lavagem final, resuspenja as células em 200 μL de tampão de coloração.
NOTA: Se não houver um citómetro de fluxo com leitor de placas, transfira as células para tubos de citometria de fluxo. - Adquira um mínimo de 1,5 × 106 células por amostra no citômetro de fluxo.
NOTA: Para cores simples e amostras de controle não manchadas, 0,5-1 × 106 células por amostra serão suficientes. Recomenda-se a titer os anticorpos individuais utilizados para alcançar a coloração ideal e reduzir custos. O presente protocolo foi otimizado usando o Buffer Fix/Perm preparado usando o conjunto de buffer de coloração FoxP3. Como o CD68 é um citoplasmático e não um marcador nuclear, outras soluções de permeabilização, como uma baixa concentração de paraformaldeído ou cytofix/cytoperm kits de vários fornecedores podem ser suficientes.
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Representative Results
Estratégia gating
O primeiro passo da nossa estratégia de gating é a exclusão dos detritos e dobras (Figura 1A). A exclusão cuidadosa dos doublets é fundamental para evitar populações falso-positivas (Figura Suplementar S2). Em seguida, as células imunes são identificadas usando CD45+, um marcador para células hematopoiéticas (Figura 1B). A mancha morta pode ser adicionada para excluir células mortas. No entanto, este protocolo resulta na morte de <5% das células CD45+ (Figura 1C), enquanto mais células CD45 são identificadas como mortas (Figura Suplementar S3).
Para identificar monócitos e neutrófilos, em contraste com estudos anteriores que utilizaram anticorpos específicos para cada uma dessas populações16,18, preferimos usar um anticorpo anti-GR-1 que identifica tanto as células Ly6C+ quanto as células Ly6G+. O uso do anticorpo anti-GR-1 juntamente com o anti-CD68 permite a separação das células imunes pulmonares em três aglomerados: CD68-GR-1+, CD68+(que pode ser identificado ainda mais como GR-1+ ou GR-1-), e CD68-GR-1-/int (Figura 1D). CD68 é um marcador que é predominantemente detectado intracelularmente. O SURFACE CD68 foi sondado, mas não pôde ser detectado sem fixação/permeabilização (Figura Suplementar S4).
As células polimorfonucleares (neutrófilos) foram identificadas como CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (Figura 1E). Esses resultados foram verificados utilizando-se GR1 juntamente com um anticorpo específico para Ly6G (Figura 2), um marcador único para neutrófilos polimorfonucleares16,18,27. Dentro da população CD45+CD68-GR-1-/int, aproximadamente 10-20% são MHCII e CD11blow e representam as células NK (Figura 1F). NK1.1, um marcador único para células NK, foi usado para confirmar isso (Figura 3)25,30. A população CD45+CD68-GR1-/intCD11b é composta por células MHCII-T e células B MHCII+ (Figura 1F). Foram utilizados dois anticorpos adicionais para verificar células T e células B-CD3 e B220, respectivamente (Figura 3).
Em camundongos saudáveis em condições de estado estável, a maioria das células CD45+ detectadas em BÁLS são AMs, os principais residentes das vias aéreas. Assim, foi realizada a BAL para avaliação dos marcadores que caracterizam as AMs20,31. Essas células são CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+ mas, ao contrário de outras células mielóides, não expressam altos níveis de CD11b (Figura 4). A mesma combinação de marcadores imunológicos também identifica AMs em homogeneizadores de pulmões totais (Figura 1G,H). Além dos AMs, no portão CD45+CD68+Sigle-F+ (Figura 1G), há uma população celular distinta que é positiva para CD11b, mas não para CD11c. Este CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c- população de leucócitos representa eosinófilos (Figura 1G)19,32.
No portão com as células CD45+CD68+SiglecF (Figura 1G), há uma população CD11c+MHC+ que representa DCs pulmonares (Figura 1I). Vários pesquisadores identificam DCs pulmonares como CD11c+MHCII+CD24+16,18. A expressão CD24 foi avaliada para confirmar a identidade dessa população (Figura 5A). A maioria dos DCs pulmonares são CD103+CD11b- ou CD103-CD11b+ (Figura 1J). Os CD103+CD11b-DCs representam os DCs convencionais CD103+ e são identificados como CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. Em contraste, os DCs CD103-CD11b+ são divididos em DCs convencionais e MoDCs baseados na expressão CD64 (Figura 1K). Portanto, os DCs convencionais do CD11b+ são identificados como CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64- enquanto os MoDCs são identificados como CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . Em contraste com os DCs convencionais, os MoDCs são baixos positivos para o marcador DC CD24 e positivos para marcadores pan-macrófagos, incluindo F4/80, CD64 e MERTK (Figura 5A)9,10,11,13,33,34.
IMs e monócitos clássicos e não clássicos estão no portão CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ (Figura 1L) e são distinguidos com base na expressão CD64 e GR-1 (Figura 1M). CD64, um marcador pan-macrófago, é expresso principalmente por IMs e AMs, bem como um subconjunto de DCs. Monócitos clássicos também são conhecidos como monócitos Ly6C+ e monócitos não clássicos como monócitos Ly6C. Tanto monócitos quanto IMs são negativos para Ly6G; no entanto, os monócitos clássicos expressam Ly6C e, portanto, são positivos para gr-1. Em contrapartida, tanto macrófagos intersticiais quanto monócitos não clássicos são negativos para GR-1 e Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. Além disso, os monócitos não clássicos são CD11cint, enquanto os monócitos clássicos são CD11c-. Embora essa diferença na expressão CD11c seja geralmente insignificante por distinguir os dois tipos de monócitos na linha de base, pode ser fundamental para condições patológicas quando monócitos clássicos se acumulam. Com base nos macrófagos intersticiais acima, os macrófagos intersticiais são definidos como CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, monócitos clássicos como CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, e monócitos não clássicos como CD45+CD68+CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64- . Tanto as AMs quanto os IMs são positivos para todos os marcadores de macrófago, incluindo CD68, CD64, F4/80 e MERTK proto-oncogene. No entanto, ao contrário dos IMs, os AMs são CX3CR1-, em contraste com os IMs, o que poderia ser explicado pela diferença na origem dos dois tipos de macrófagos pulmonares4,37,38,39 (Figura 5B).
Figura 1: Estratégia de gating de células imunes presentes no pulmão murino. Após a exclusão cuidadosa de detritos, dobras, células mortas e as células não imunes (CD45-) (A-C), as células CD45+ foram separadas em 3 aglomerados principais com base na expressão de CD68 e GR-1 (D). Os neutrófilos pertencem à população CD68-GR-1+ (E), enquanto a população CD68-GR-1-/int consiste em células NK, células B e células T (F). As células CD68+ podem ser ainda divididas em células Siglec F+(G), que são AMs e eosinófilos (H), e células F Siglec (G), que consistem em monócitos, IMs e DCs (I-M). Abreviaturas: SSC-A = área de pico de luz lateral dispersa; FSC-A = área de pico de luz dispersa para a frente; SSC-H = altura máxima da luz lateral dispersa; L/D = coloração viva/morta; MHC = maior complexo de histocompatibilidade; SF = Siglec F; GR-1 = Marcador de diferenciação mielóide ligado ao GPI (Ly-6G); NK = assassino natural; IMs = macrófagos intersticiais; DCs = células dendríticas; AMs = macrófagos alveolares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O Ly6G no pulmão é expresso apenas por células CD45+CD68-GR-1+CD11b+ identificadas como neutrófilos polimorfonucleares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Verificação da identificação de células NK, células T e células B pela estratégia de gating. Foram utilizados marcadores específicos para células NK 1.1, CD3 e B220 para verificar a identificação de células NK, células T e células B, respectivamente. Deve-se notar que as células NKT, se presentes, podem cair na população de células CD3+ dentro do portão de células NK, e é necessário cautela para evitar a contaminação de NK com células NKT. Abreviaturas: NK = assassino natural; MHC = maior complexo de histocompatibilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A maioria das células imunes obtidas por lavagem broncoalveolar em camundongos ingênuos são macrófagos alveolares. Abreviaturas: AMs = macrófagos alveolares; DCs = células dendríticas; IM = macrófago intersticicial; SSC-A = área de pico de luz lateral dispersa; FSC-A = área de pico de luz dispersa para a frente; SSC-H = altura máxima da luz lateral dispersa; SF = Siglec F; GR-1 = Marcador de diferenciação mielóide ligado ao GPI (Ly-6G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação da expressão de diferentes marcadores em células imunes. (A) Comparação da expressão CD24, CD64, MERTK, F4/80 e CD103 em DCs pulmonares. (B) Comparação de CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b e CX3CR1 em macrófagos e monócitos pulmonares. Abreviaturas: DCs = células dendríticas; MoDCs = DCs derivados de monócitos; AMs = macrófagos alveolares; IMs = macrófagos intersticiais; SF = Siglec F; MERTK = mieloide-epitelial-reprodutiva tyrosine quinase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão BSA | PBS + 0,5% albumina de soro bovino | ||
| Tampão de digestão | Prewarmed (37 °C) Tampão BSA + 5 mg/mL colagenase tipo 1 + 0,2 mg/mL DNase I | ||
| Tampão de coloração | PBS + 2,5% FBS | ||
| Buffer de correção/perm | Três partes do diluente de fixação/permeabilização diluídas e 1 parte da fixação/permeabilização diluída do Conjunto de Buffer de Manchas de Fator Foxp3/Transcrição | ||
| Tampão de permeabilização | Tampão de permeabilização de 10x do conjunto de manchas do fator Foxp3/Transcrição diluído 10 vezes em água desionizada purificada | ||
Tabela 1: Buffers.
| Antígeno | Clone | Fluorochrome | Diluição | Superfície/intracelular |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Superfície |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Superfície |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | intracelular |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Superfície |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Superfície |
| CD11c | N418 | BV650 ou BV510 | 1:100 | Superfície |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Superfície |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Superfície |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Superfície |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | FarRed (APC) ou Aqua (BV510) | 1:1000 | Superfície | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | Superfície |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Superfície |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Superfície |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Superfície |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | Superfície |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Superfície |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Superfície |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Superfície |
Tabela 2: Uso de anticorpos monoclonais.
Figura suplementar S1: A melhor dissociação celular é alcançada por 5 mg/mL de colagenase 1 em PBS pré-armado + 0,5% BSA. Em todas as condições diferentes, 0,2 mg de DNAse I também foi incluído. Abreviaturas: BSA = albumina de soro bovino; FSC-A = área de pico de luz dispersa para a frente; L/D = coloração viva/morta; SF = Siglec F. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S2: A inclusão de doublets pode resultar em populações falso-positivas. Abreviação: FP = falso positivo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S3: Mais CD45- do que CD45+ têm recursos consistentes com células mortas. Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S4: A coloração superficial para CD68 não é adequada para distinguir adequadamente as populações de células imunes individuais do pulmão. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A identificação de células imunes pulmonares pode ser desafiadora devido aos múltiplos tipos de células imunes residentes no pulmão e suas características imunofenópicas únicas em comparação com suas contrapartes residentes em outros tecidos. Em várias condições patológicas, células com características fenotípicas distintas aparecem nos pulmões. Por exemplo, a lesão pulmonar induzida pela bleomicina resulta no recrutamento de macrófagos derivados de monócitos circulantes no espaço alveolar, onde podem permanecer por até um ano e até persistir após a fibrose induzida pela bleomicina. Em contraste com os AMs residentes em tecidos, os macrófagos derivados de moncida circulantes são Siglec FlowCD11b+. O esgotamento direcionado dos macrófagos derivados do monócito resulta na amenização da fibrose pulmonar mediada pela bleomicina16,40. Células com características semelhantes são recrutadas para os pulmões durante a infecção por influenza e fornecem proteção prolongada contra pneumonia estreptocócica15.
Com base na expressão CD11c e MHC II, os IMs foram subcategorizados em IM1, IM2 e IM3. IM1 são imunofenotipicamente definidos como CD11c-MHC II-; IM2 são definidos como CD11c-MHC II+; e IM3 são definidos como MHC II+CD11c+. Foi proposto que o IM1, O IM2 e o IM3 representem os estágios fisiológicos do monócito à transição macrófago, em vez de distintas categorias de macrófagos, com IM3 representando o compartimento monocítico41. Como mencionado acima, os MoDCs são baixos positivos para o marcador DC CD24 e positivos para marcadores pan-macrófagos, incluindo F4/80, CD64 e MERTK9,10,11,13,33,34. No entanto, vários estudos identificam as células CD64+MERKT+ como macrófagos pulmonares4,10. Tanto os IM3 quanto os MoDCs foram definidos como CD64+MERKT+MHCII+CD11C+, sugerindo que essas duas populações provavelmente representam o mesmo tipo de célula. Coerente com essa hipótese, a estratégia de gating aqui apresentada não identifica uma população distinta representando células IM3, além de MoDCs.
As etapas críticas do protocolo aqui descrito incluem: 1) a remoção de toda a gordura adjacente dos pulmões antes de preparar a suspensão unicelular, pois isso poderia influenciar as leituras; 2) permeabilização antes de colorir com o anticorpo anti-CD68. Uma limitação do presente protocolo é que ele não pode identificar células não imunes do pulmão, como epitelial (CD45-CD326+CD31-), células endoteliais (CD45-CD326-CD31+) e fibroblastos. A identificação dessas populações requer uma abordagem diferente28,29. Além disso, o protocolo requer coloração para CD68, um marcador intracelular, o que pode representar uma limitação se o investigador não tiver experiência em coloração intracelular. A importância do presente protocolo e da estratégia de gating em relação aos métodos existentes é que essa estratégia fornece uma abordagem simplificada que utiliza um menor número de marcadores, permitindo a identificação reprodutível de todas as populações imunes do pulmão.
Além disso, é fornecido um método detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular que minimize a morte celular e permita a identificação de um perfil completo do compartimento de células imunes do pulmão. Embora o protocolo aqui descrito descreva a caracterização e identificação de populações imunes pulmonares em condições de estado estável, aplicações futuras podem incluir a avaliação dessas populações em vários modelos de doenças onde pode ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar. Em conclusão, este artigo apresenta um protocolo simples e reprodutível para preparação de células únicas pulmonares e um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores para a identificação de 12 diferentes populações de células imunes.
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Disclosures
V.A.B. tem patentes sobre o caminho PD-1 licenciado por Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis e Dako. Os autores não declaram outros interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA238263 e R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
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