Summary
I denne studien presenterer vi en effektiv og reproduserbar protokoll for å isolere immunpopulasjonene i murin respiratorisk system. Vi tilbyr også en metode for identifisering av alle medfødte og adaptive immunceller som ligger i lungene til friske mus, ved hjelp av et 9-fargebasert strømningscytometripanel.
Abstract
Luftveiene er i direkte kontakt med utemiljøet og krever et nøyaktig regulert immunsystem for å gi beskyttelse samtidig som uønskede reaksjoner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vert for flere populasjoner av medfødte og adaptive immunceller som gir immunovervåking, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse cellene, som holder det sunne lunge immunforsvaret i balanse, deltar også i flere patologiske forhold som astma, infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft. Selektivt uttrykk for overflate og intracellulære proteiner gir unike immunofenotypiske egenskaper til immuncellene i lungen. Derfor har strømningscytometri en viktig rolle i identifiseringen av slike cellepopulasjoner under steady-state og patologiske forhold. Dette dokumentet presenterer en protokoll som beskriver en konsekvent og reproduserbar metode for å identifisere immuncellene som ligger i lungene til friske mus under steady-state forhold. Denne protokollen kan imidlertid også brukes til å identifisere endringer i disse cellepopulasjonene i ulike sykdomsmodeller for å bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet.
Introduction
Murin luftveiene inneholder et unikt immunsystem som er ansvarlig for å bekjempe patogener og opprettholde immun homeostase. Lungeimmunsystemet består av cellulære populasjoner med betydelig heterogenitet i fenotype, funksjon, opprinnelse og plassering. Resident alveolar makrofager (AMs), stammer hovedsakelig fra fostermonocytter, bor i alveolar lumen1, mens benmargsavledede interstitielle makrofager (IMs) bor i lungeparenchyma2. Direktemeldinger kan underklassifiseres ytterligere av uttrykket for CD206. CD206+ IMs fyller peribronchial og perivascular området, mens CD206- IMs er plassert på alveolar interstitium3. Noen få underklassifiseringer av direktemeldinger er foreslått nylig3,4,5,6. Selv om IMs er mindre studert enn AMs, støtter nyere bevis deres avgjørende rolle i reguleringen av immunsystemet i lungen7. I tillegg uttrykkes CD206 også i alternativt aktiverte AMs8.
Lunge dendritiske celler (DCs) er en annen heterogen gruppe lunge immunceller med hensyn til deres funksjonelle egenskaper, plassering og opprinnelse. Fire underkategorier av domenekontrollere er beskrevet i lungene: konvensjonelle CD103+ domenekontrollere (også kjent som cDC1), konvensjonelle CD11b+ domenekontrollere (også kjent som cDC2), monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC) og plasmacytoid-domenekontrollere9,10,11,12,13. De tre første underklassene kan defineres som hovedkomplekset for histokompatibilitet (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrykker MHC II og er mellomliggende positive for CD11c, men uttrykker høye nivåer av B220 og PDCA-19,13,16. I naive murin lunger er CD103 DCs og CD11b DCs plassert i luftveiene interstitium, mens plasmacytoid DCs ligger i alveolar interstitium17.
To store populasjoner av monocytter bor i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for den første inflammatoriske responsen. Derimot er ikke-klassiske monocytter Ly6C- og har blitt sett på som antiinflammatoriske celler3,16,18. Nylig ble en ekstra populasjon av CD64 + CD16.2 + monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C- monocytter og gir opphav til CD206 + IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsakelig i lungene under helminthinfeksjon eller allergiske forhold. Imidlertid er det et lite antall eosinofiler i lungeparenchyma under steady state, kjent som bosatt eosinofiler. I motsetning til de bosatte eosinofiler finnes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronkoalveolar lavage (BAL). I musemodeller av husstøvmitt (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungene etter antigenmediert stimulering. Det er foreslått at bosatte eosinofiler kan ha en regulatorisk rolle i allergi ved å hemme T-hjelper 2 (Th2) sensibilisering til HDM19.
I motsetning til resten av lunge myeloidceller uttrykker nøytrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er preget av en signatur av CD68-Ly6G + immunofenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har vist at lungene under steady state reserverer et basseng med nøytrofiler i det intravaskulære rommet og er vert for et betydelig antall ekstravaskulære nøytrofiler22. I likhet med eosinofiler finnes ikke nøytrofiler i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, som LPS-utfordring, astma eller lungebetennelse, nøytrofiler inn i alveolar lumen, noe som resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydelig antall CD45+ celler i lungen representerer naturlig morder (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloidmarkører24. I lungene til naive mus kan disse tre celletypene identifiseres basert på uttrykket av CD11b og MHC II18. Rundt 25% av lunge-CD45+ celler er B-celler, mens prosentandelen NK-celler er høyere i lungen enn andre lymfoide og ikke-lymfoide vev24,25,26. Blant lunge T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8- og spiller en viktig rolle i luftveisinfeksjoner26.
Fordi lungen er vert for et svært komplekst og unikt immunsystem, har flere gating strategier for identifisering av lungeimmunceller blitt utviklet og rapportert16,18,20,27. Gating strategien beskrevet heri gir en omfattende og reproduserbar måte å identifisere opptil 12 forskjellige lunge myeloid og ikke-myeloid immunpopulasjoner ved hjelp av 9 markører. Flere indikatorer er brukt til å validere resultatene. Videre er det gitt en detaljert metode for fremstilling av en encellet suspensjon som minimerer celledød og tillater identifisering av den mest komplette profilen til immuncellerommet i lungen. Det skal bemerkes at identifisering av ikke-immunceller i lungen, for eksempel epitelceller (CD45-CD326 +CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+), og fibroblaster krever en annen tilnærming28,29. Identifisering av slike populasjoner er ikke inkludert i protokollen og metoden som er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble utført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uker gamle C57BL/6 mus av begge kjønn ble brukt til å utvikle denne protokollen.
1. Kirurgisk eksisjon og vevsforberedelse
- Avlive musen ved intraperitoneally injisere 1 ml tribromoetanol (utarbeidet i henhold til standardprotokoll; Tabell over materialer).
MERK: CO2-kvelning bør unngås i lungestudier, da det kan forårsake lungeskade og endre egenskapene og egenskapene til lungeimmunceller. Cervical dislokasjon bør også unngås, da det kan forårsake mekanisk skade på lungen. - Overfør musen til et rent og dedikert område for kirurgisk drift.
- Stabiliser musens dorsale side ned ved å bruke nåler eller tape på de fire ekstremitetene. Bruk 70% etanol for å desinfisere huden på ventralområdet.
- Utfør et snitt i huden, fra nakken til magen. Fjern huden forsiktig fra thoracic området.
- Fjern forsiktig brystbenet og ribbeina.
- Skyll lungene ved å injisere 10 ml kald PBS direkte i høyre ventrikel, ved hjelp av en 18-21 G nål, til lungene blir helt hvite.
- Fjern forsiktig thymus og hjerte uten å berøre lungene.
- Løsne lungene forsiktig fra det omkringliggende vevet og overfør dem til et rør med kald BSA-buffer (tabell 1).
MERK: Det bør arbeides for å fjerne alt tilstøtende fett fra lungene før du forbereder encellet suspensjon ytterligere, da dette kan forringe avlesningene.
2. Fremstilling av encellet suspensjon
- Overfør lungene til en tom Petri-tallerken og hakk dem med to fine skalpeller. Overfør alle delene av hakket lunge til et nytt 50 ml konisk rør. Bruk 5 ml fordøyelsesbuffer til å vaske platen og tilsett den i 50 ml-røret som inneholder hakket lunge (tabell 1).
MERK: Fordøyelsesbufferen bør klargjøres umiddelbart før bruk. Bruk 5 mg/ml kollagennase28. Kombinasjonen av 1 eller 5 mg kollagenalse med BSA-buffer eller proteinfri PBS forbedret ikke resultatene (supplerende figur S1). - Fest lokket på røret og fordøye lungen i 30 min på en orbital shaker med en hastighet på 150 rpm ved 37 °C. Stopp reaksjonen ved å tilsette 10 ml kald BSA-buffer.
- Etter fordøyelsen, bruk en 18 G nål for å blande og oppløse lungestykkene. Plasser en 70 μm filtersil på toppen av et nytt 50 ml konisk rør.
MERK: Bruk av et mindre mikronfilter kan føre til tap av store myeloide populasjoner. - Overfør langsomt den fordøyde lungeblandingen direkte på silen. Bruk gummisiden av et 10 ml sprøytestempel for å knuse de resterende lungestykkene på filteret. Vask det bearbeidede materialet på filteret med BSA-buffer.
- Sentrifuger encellet suspensjon ved 350 × g i 8 min ved 4 °C.
- Kast forsiktig supernatanten og resuspender cellene i 1 ml ACK lysisbuffer. Bland godt ved hjelp av en 1 ml pipet, og inkuber i 90 s ved romtemperatur.
- Tilsett 10 ml kald BSA-buffer for å stoppe reaksjonen og sentrifugen ved 350 × g i 7 min ved 4 °C.Kast forsiktig supernatanten og bruk pelletsen i fargebufferen på nytt for å telle cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Resuspend cellene i en konsentrasjon på 5 × 106 celler/ml og bruk dem til overflatefarging (se avsnitt 3).
MERK: Til dette formål, skriv cellene i en 96-brønns rundbunnsplate etterfulgt av antistofffarging og vasker. Hvis en platesentrifuge ikke er tilgjengelig, bruk strømningsrør i stedet for plater. Med denne protokollen kan ~ 15-20 × 106 celler per lunge fås fra en 6-10 uker gammel C57BL / 6 mus av gjennomsnittlig størrelse.
3. Overflate antistoff farging
- Overfør 1 × 106 celler i 200 μL per brønn i en 96-brønns plate. Sentrifuger platen ved 350 × g i 7 min ved 4 °C. I mellomtiden klargjør du Fc-blokkløsningen ved å fortynne anti-16/32 antistoff (1:100) i fargebuffer (tabell 1).
- Resuspend cellene i 50 μL av den ferdiglagde Fc-blokkerende løsningen (Materialbord) og inkubere i 15-20 min ved 4 °C eller på is.
- Tilsett 150 μL fargebuffer og sentrifuger platen ved 350 × g i 5 min ved 4 °C. I mellomtiden, forberede overflaten antistoff cocktail ved å fortynne overflaten antistoffer (1:100; Tabell 2) i fargebufferen.
MERK: (i) Anti-16/32 antistoff for Fc-blokkering kan brukes med overflateantistoffene i samme blanding. (ii) Hvis fikserbar levedyktighetsfarge brukes, legg det til overflaten antistoffcocktail ved en fortynning på 1:1,000. - Resuspend cellene i 50 μL av den ferdiglagde overflaten antistoff cocktail og inkubere i 30-40 min ved 4 °C i mørket. Vask cellene med fargebuffer to ganger.
MERK: Hvis det ikke er behov for intracellulær farging, må du bruke cellene på nytt i 200 μL fargebuffer og gå direkte til innsamling av data på strømningscytometeret. Alternativt kan celler festes og lagres ved 4 °C for oppkjøp senere. Vi anbefaler å bruke cellene til strømningscytometri innen 24 timer.
4. Cellefiksering og intracellulær farging
- Klargjør fikserings-/permeabiliseringsbufferen (Fix/Perm Buffer) ved å blande tre deler fikserings-/permeabiliseringskonsentrat og 1 del fikserings-/permeabiliseringsdynningsmiddel for FoxP3/Transkripsjonsfaktorflekkebuffersett (tabell 1).
- Resuspend cellene i 50 μL av den ferdiglagde Fix / Perm Buffer per brønn av 96-brønnsplaten, hvor cellene ble belagt som beskrevet i avsnitt 3, og inkubere dem i 20-25 min ved 4 °C i mørket.
- Fortynn 10x permeabiliseringsbufferen som 1: 10 i renset deionisert vann for å forberede 1x permeabiliseringsbuffer.
- Vask cellene en gang med 1x permeabiliseringsbuffer. I mellomtiden forbereder du den intracellulære antistoffcocktailen ved å fortynne intracellulære antistoffer (1:100) i 1 ml permeabiliseringsbuffer.
- Resuspend cellene ved hjelp av 50 μL av den ferdiglagde overflaten antistoff cocktail per celle av 96-brønns tallerkenen og inkubere i 40 min ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene en gang med permeabiliseringsbuffer og en gang med fargebuffer. Etter den endelige vasken, resuspend cellene i 200 μL av farging buffer.
MERK: Hvis det ikke er noe strømningscytometer med plateleser tilgjengelig, overfør cellene til strømningscytometrirør. - Skaff deg minst 1,5 × 106 celler per prøve på strømningscytometeret.
MERK: For enkeltfarger og ubegrunnede kontrollprøver vil 0,5-1 × 106 celler per prøve være tilstrekkelig. Det anbefales å titere de enkelte antistoffene som brukes for å oppnå optimal farging og redusere kostnadene. Den nåværende protokollen er optimalisert ved hjelp av Fix/Perm Buffer utarbeidet ved hjelp av FoxP3-fargebuffersettet. Fordi CD68 er en cytoplasmatisk og ikke en kjernefysisk markør, kan andre permeabiliseringsløsninger som en lav konsentrasjon av paraformaldehyd eller cytofix / cytopermsett fra forskjellige leverandører være tilstrekkelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategi
Det første trinnet i vår gating strategi er utelukkelse av rusk og doublets (Figur 1A). Forsiktig utelukkelse av dobler er avgjørende for å unngå falske positive populasjoner (Supplerende figur S2). Deretter identifiseres immunceller ved hjelp av CD45+, en markør for hematopoietiske celler (figur 1B). Den levende døde flekken kan legges til for å utelukke døde celler. Denne protokollen resulterer imidlertid i at <5 % av CD45+-cellene (figur 1C) dør, mens flere CD45-celler identifiseres som døde (tilleggsfigur S3).
For å identifisere monocytter og nøytrofiler, i motsetning til tidligere studier som brukte spesifikke antistoffer for hver av disse populasjonene16,18, foretrekker vi å bruke et anti-GR-1 antistoff som identifiserer både Ly6C + og Ly6G + celler. Bruk av anti-GR-1-antistoffet sammen med anti-CD68 gjør det mulig å separere lungeimmuncellene i tre klynger: CD68-GR-1+, CD68+(som kan identifiseres ytterligere som GR-1+ eller GR-1-), og CD68-GR-1-/int (figur 1D). CD68 er en markør som hovedsakelig oppdages intracellulært. Surface CD68 ble undersøkt, men kunne ikke oppdages uten fiksering/permeabilisering (tilleggsfigur S4).
Polymorfoukleære celler (nøytrofiler) ble identifisert som CD45+CD68-GR-1+CD11b+ (figur 1E). Disse resultatene ble verifisert ved hjelp av GR1 sammen med et antistoff spesifikt for Ly6G (figur 2), en unik markør for polymorfoukære nøytrofiler16,18,27. Innenfor POPULASJONEN CD45+CD68-GR-1-/int er ca. 10-20 % MHCII- og CD11blow og representerer NK-cellene (figur 1F). NK1.1, en unik markør for NK-celler, ble brukt til å bekrefte dette (figur 3)25,30. CD45+CD68-GR1-/intCD11b-populasjonen består av MHCII- T-celler og MHCII+B-celler (figur 1F). Ytterligere to antistoffer ble brukt til å verifisere T-celler og B-celler-CD3 og B220, henholdsvis (figur 3).
I friske mus under steady-state forhold er de fleste CD45+ celler som oppdages i BAL AMs, de viktigste beboerne i luftveiene. Derfor ble BAL utført for å vurdere markørene som karakteriserer AMs20,31. Disse cellene er CD45+CD68+Siglec-F+CD11c+, men i motsetning til andre myeloide celler, uttrykker ikke høye nivåer av CD11b (figur 4). Den samme kombinasjonen av immunmarkører identifiserer også AMs i homogenater av totale lunger (figur 1G,H). I tillegg til AMs finnes det en distinkt cellepopulasjon som er positiv for CD11b, men ikke for CD11c, i CD45+CD68+Sigle-F+-porten (figur 1G). Denne CD45+CD68+Siglec-F+CD11b+CD11c-populasjonen av leukocytter representerer eosinofiler (figur 1G)19,32.
I porten med CD45+CD68+SiglecF-cellene (figur 1G) er det en CD11c+MHC+-populasjon som representerer lunge-DCer (figur 1I). Flere etterforskere identifiserer lunge-domenekontrollere som CD11c+MHCII+CD24+16,18. CD24-uttrykket ble vurdert for å bekrefte identiteten til denne populasjonen (figur 5A). De fleste lunge-domenekontrollerne er enten CD103+CD11b- eller CD103-CD11b+ (figur 1J). CD103+CD11b-domenekontrollerne representerer CD103+ konvensjonelle domenekontrollere og identifiseres som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103+CD11b-. Cd103-CD11b+-domenekontrollere er derimot delt inn i konvensjonelle domenekontrollere og moDCer basert på CD64-uttrykk (figur 1K). Derfor identifiseres konvensjonelle CD11b+-domenekontrollere som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64- mens MoDCene identifiseres som CD45+CD68+SiglecF-MHCII+CH11c+CD103-CD11b+CD64+ . I motsetning til konvensjonelle domenekontrollere er MoDCer svært positive for DC-markøren CD24 og positive for panmakrofagmarkører, inkludert F4/80, CD64 og MERTK (figur 5A)9,10,11,13,33,34.
IMs og klassiske og ikke-klassiske monocytter er i CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+ gate (figur 1L) og utmerker seg basert på CD64- og GR-1-uttrykk (figur 1M). CD64, en pan-makrofag markør, er hovedsakelig uttrykt av IMs og AMs, samt en undergruppe av DCs. Klassiske monocytter er også kjent som Ly6C + monocytter og ikke-klassiske monocytter som Ly6C-monocytter. Både monocytter og direktemeldinger er negative for Ly6G; Klassiske monocytter uttrykker imidlertid Ly6C og er derfor positive for GR-1. Til sammenligning er både interstitielle makrofager og ikke-klassiske monocytter negative for GR-1 og Ly6C3,4,11,16,18,20,35,36. I tillegg er ikke-klassiske monocytter CD11cint, mens klassiske monocytter er CD11c-. Selv om denne forskjellen i CD11c-uttrykk generelt er ubetydelig for å skille de to typer monocytter ved baseline, kan det være kritisk for patologiske forhold når klassiske monocytter akkumuleres. Basert på ovenstående er interstitielle makrofager definert som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64+, klassiske monocytter som CD45+CD68+Siglec-F-CD11c-CD11b+GR-1+CD64-, og ikke-klassiske monocytter som CD45+CD68+CD11c-/intCD11b+GR-1-CD64- . Både AMs og IMs er positive for alle makrofagmarkørene, inkludert CD68, CD64, F4/80 og MERTK proto-oncogene. I motsetning til direktemeldinger er imidlertid AMs CX3CR1-, i motsetning til IMs, noe som kan forklares med forskjellen i opprinnelsen til de to typene lungemakrofager4,37,38,39 (figur 5B).
Figur 1: Gating strategi av immunceller tilstede i murin lunge. Etter forsiktig utelukkelse av rusk, dobler, døde celler og ikke-immunceller (CD45-) (A-C), ble CD45+ celler delt inn i 3 hovedklynger basert på uttrykket av CD68 og GR-1 (D). Nøytrofiler tilhører CD68-GR-1+ populasjonen (E) mens CD68-GR-1-/int-populasjonen består av NK-celler, B-celler og T-celler (F). CD68+-celler kan videre deles inn i Siglec F+-celler (G), som er AMs og eosinofiler (H) og Siglec F-celler (G), som består av monocytter, IMs og DCer (I-M). Forkortelser: SSC-A = toppområde av sidespredningslys; FSC-A = toppområde for fremoverspredning av lys; SSC-H = topphøyde på sidespredning av lys; L/D = levende/død farging; MHC = stort histokompatibilitetskompleks; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-koblet myeloid differensieringsmarkør (Ly-6G); NK = naturlig morder; IMs = interstitielle makrofager; Domenekontrollere = dendrittiske celler; AMs = alveolar makrofager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ly6G i lungene uttrykkes kun av CD45+CD68-GR-1+CD11b+-celler identifisert som polymorfoukære nøytrofiler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Verifisering av identifisering av NK-celler, T-celler og B-celler ved gatingstrategien. Markører som er spesifikke for henholdsvis NK 1.1, CD3 og B220, ble brukt til å bekrefte identifiseringen av henholdsvis NK-celler, T-celler og B-celler. Det skal bemerkes at NKT-celler, hvis de finnes, kan falle i CD3 + cellepopulasjonen i NK-celleporten, og det er nødvendig med forsiktighet for å unngå forurensning av NK med NKT-celler. Forkortelser: NK = naturlig morder; MHC = stort histokompatibilitetskompleks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flertallet av immuncellene oppnådd ved bronkoalveolar lavage hos naive mus er alveolar makrofager. Forkortelser: AMs = alveolar makrofager; Domenekontrollere = dendrittiske celler; IM = interstitiell makrofag; SSC-A = toppområde av sidespredningslys; FSC-A = toppområde for fremoverspredning av lys; SSC-H = topphøyde på sidespredning av lys; SF = Siglec F; GR-1 = GPI-koblet myeloid differensieringsmarkør (Ly-6G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av uttrykket av forskjellige markører i immunceller. (A) Sammenligning av CD24-, CD64-, MERTK-, F4/80- og CD103-uttrykk i lunge-DCer. (B) Sammenligning av CD68, CD64, MERTK, F4/80, CD11c, Siglec F (SF), CD11b og CX3CR1 i lungemakrofager og monocytter. Forkortelser: Domenekontrollere = dendrittiske celler; MoDCer = monocytt-avledede domenekontrollere; AMs = alveolar makrofager; IMs = interstitielle makrofager; SF = Siglec F; MERTK = myeloid-epitel-reproduktiv tyrosin kinase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| BSA-buffer | PBS + 0,5% Bovine serum albumin | ||
| Fordøyelsesbuffer | Forvarsel (37 °C) BSA-buffer + 5 mg/ml kollagentype 1 + 0,2 mg/ml DNase I | ||
| Fargebuffer | PBS + 2,5% FBS | ||
| Buffer for korrigering/fordel | Tre deler fikserings-/permeabiliseringsdynningsmiddel og 1 del fikserings-/permeabiliseringsdiluens av Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ||
| Buffer for permeabilisering | 10x permeabiliseringsbuffer fra Foxp3 /Transcription Factor farging buffersett fortynnet 10 ganger i renset deionisert vann | ||
Tabell 1: Buffere.
| Antigen | Klon | Fluorokrom | Fortynning | Overflate/intracellulær |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Flate |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | Flate |
| CD68 | Aktiva-11 | PerCPCy5.5 | 1:100 | Intracellulær |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | Flate |
| Siglec F | S17007L | FITC | 1:100 | Flate |
| CD11c | N418 | BV650 eller BV510 | 1:100 | Flate |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Blending 594 | 1:100 | Flate |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Flate |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Flate |
| live / død fikserbar langt lest død celle flekk kit | FarRed (APC) eller Aqua (BV510) | 1:1000 | Flate | |
| CD3 | 17A2 | PE | 1:100 | Flate |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Flate |
| NK1.1 | PK136 | FITC | 1:100 | Flate |
| CD24 | 30-F1 | PE | 1:100 | Flate |
| MERTK | 2B10C42 | PE | 1:100 | Flate |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | Flate |
| CX3CR1 | SA011F11 | PE | 1:100 | Flate |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | 1:100 | Flate |
Tabell 2: Bruk av monoklonale antistoffer.
Supplerende figur S1: Den beste cellulære dissosiasjonen oppnås med 5 mg/ml kollagenalisse 1 i forhåndsvarslet PBS + 0,5 % BSA. Under alle forskjellige forhold ble 0,2 mg DNAse I også inkludert. Forkortelser: BSA = bovin serum albumin; FSC-A = toppområde for fremoverspredning av lys; L/D = levende/død farging; SF = Siglec F. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Inkludering av dobler kan føre til falske positive populasjoner. Forkortelse: FP = usann positiv. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Mer CD45- enn CD45+ har funksjoner som samsvarer med døde celler.
Supplerende figur S4: Overflatefarging for CD68 er ikke tilstrekkelig til å skille de enkelte immuncellepopulasjonene i lungene på riktig måte. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisering av lungeimmuneceller kan være utfordrende på grunn av de mange immuncelletypene som bor i lungen og deres unike immunofenotypiske egenskaper sammenlignet med deres kolleger som bor i andre vev. Under flere patologiske forhold vises celler med tydelige fenotypiske egenskaper i lungene. For eksempel resulterer bleomycinindusert lungeskade i rekrutteringen av sirkulerende monocytt-avledede makrofager i alveolarrommet, hvor de kan forbli så lenge som ett år og til og med vedvare etter bleomycinindusert fibrose. I motsetning til vevsresidente AM-er er de sirkulerende monocyttavledede makrofagene Siglec FlowCD11b+. Målrettet uttømming av de monocytt-avledede makrofagene resulterer i amelioration av bleomycinmediert lungefibrose16,40. Celler med lignende egenskaper rekrutteres til lungene under influensainfeksjon og gir langvarig beskyttelse mot streptokokk lungebetennelse15.
Basert på CD11c- og MHC II-uttrykk har direktemeldinger blitt ytterligere underkategorisert til IM1, IM2 og IM3. IM1 er immunofenotypisk definert som CD11c-MHC II-; IM2 er definert som CD11c-MHC II+; og IM3 er definert som MHC II+CD11c+. Det er foreslått at IM1, IM2 og IM3 representerer de fysiologiske stadiene av monocytt til makrofagovergang, i stedet for distinkte makrofager, med IM3 som representerer det monocytiske rommet41. Som nevnt ovenfor er MoDCer lite positive for DC-markøren CD24 og positive for pan-makrofagmarkører, inkludert F4/80, CD64 og MERTK9,10,11,13,33,34. Flere studier identifiserer imidlertid CD64+MERKT+-celler som lungemakrofager4,10. Både IM3 og MoDCer er definert som CD64+MERKT+MHCII+CD11C+, noe som tyder på at disse to populasjonene mest sannsynlig representerer samme celletype. I samsvar med denne hypotesen identifiserer gatingstrategien som presenteres her ikke en distinkt populasjon som representerer IM3-celler, i tillegg til MoDCer.
Kritiske trinn i protokollen beskrevet her inkluderer: 1) fjerning av alt tilstøtende fett fra lungene før du forbereder encellet suspensjon, da dette kan forvæde avlesningene; 2) permeabilisering før farging med anti-CD68 antistoffet. En begrensning i den nåværende protokollen er at den ikke kan identifisere ikke-immunceller i lungen, for eksempel epitel (CD45-CD326 +CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) og fibroblaster. Identifisering av slike populasjoner krever en annen tilnærming28,29. I tillegg krever protokollen farging for CD68, en intracellulær markør, som kan utgjøre en begrensning hvis undersøkeren ikke har erfaring med intracellulær farging. Betydningen av den nåværende protokollen og gatingstrategien med hensyn til eksisterende metoder er at denne strategien gir en strømlinjeformet tilnærming som bruker et lavere antall markører samtidig som den tillater reproduserbar identifisering av alle immunpopulasjonene i lungen.
Videre er det gitt en detaljert metode for fremstilling av en encellet suspensjon som minimerer celledød og tillater identifisering av en komplett profil av immuncellerommet i lungen. Selv om protokollen som er skissert her beskriver karakterisering og identifisering av lungeimmunasjonspopulasjoner under steady-state forhold, kan fremtidige anvendelser omfatte vurdering av disse populasjonene i ulike sykdomsmodeller der det kan bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet. Til slutt presenterer denne artikkelen en enkel og reproduserbar protokoll for lunge encellet forberedelse og et 9-fargebasert strømningscytometripanel for identifisering av 12 forskjellige immuncellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V.A.B. har patenter på PD-1-banen lisensiert av Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis og Dako. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S.
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H.
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
