Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62997
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering, University of Florida

Summary

Följande protokoll beskriver utvecklingen och optimeringen av ett arbetsflöde med hög genomströmning för maskodling, fluorescensavbildning och automatiserad bildbehandling för att kvantifiera polyglutaminaggregat som en bedömning av förändringar i proteostas.

Abstract

En ökning av förekomsten av neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) har främjat ett stort intresse för detta ämne genom åren. Denna ökade uppmärksamhet har krävt diversifiering och förbättring av djurmodeller som kan reproducera sjukdomsfenotyper som observerats hos människor med PCD. Även om murina modeller har visat sig vara ovärderliga, är de dyra och är förknippade med mödosamma metoder med låg genomströmning. Användning av Caenorhabditis elegans nematodmodell för att studera PCD har motiverats av dess relativa enkla underhåll, låga kostnad och snabba generationstid, vilket möjliggör applikationer med hög genomströmning. Dessutom gör hög bevarande mellan C. elegans och mänskliga genom denna modell till ett ovärderligt upptäcktsverktyg. Nematoder som uttrycker fluorescerande taggade vävnadsspecifika polyglutamin (polyQ) -kanaler uppvisar ålders- och polyQ-längdberoende aggregering som kännetecknas av fluorescerande foci. Sådana reportrar används ofta som ombud för att övervaka förändringar i proteostas över vävnader. Manuell aggregerad kvantifiering är tidskrävande, vilket begränsar experimentell genomströmning. Dessutom kan manuell focikvantifiering införa bias, eftersom aggregerad identifiering kan vara mycket subjektiv. Häri standardiserades ett protokoll bestående av maskodling, bildförvärv och databehandling för att stödja aggregerad kvantifiering med hög genomströmning med C . elegans som uttrycker tarmspecifik polyQ. Genom att implementera en C. elegans-baserad bildbehandlingspipeline med CellProfiler, en bildanalysprogramvara, har denna metod optimerats för att separera och identifiera enskilda maskar och räkna upp deras respektive aggregat. Även om begreppet automatisering inte är helt unikt är behovet av att standardisera sådana procedurer för reproducerbarhet, eliminering av förspänning från manuell räkning och ökning av genomströmningen hög. Det förväntas att dessa metoder drastiskt kan förenkla screeningprocessen för stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek med hjälp av C. elegans-modellen .

Introduction

Åldersberoende neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) såsom Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar, eller amyotrofisk lateralskleros, kännetecknas av felveckning av protein som leder till aggregering, celldöd och vävnadsdegenerering1. Medan proteinfelveckning erkänns som den skyldige, är etiologin för dessa sjukdomar inte klar. Som sådan har utvecklingen av effektiva terapier hindrats av bristen på kunskap om de faktorer och tillstånd som bidrar till sjukdomsdebut och progression. Nya studier tyder på att förändringar i mikrobiomet påverkar uppkomsten, progressionen och svårighetsgraden av PCD 2,3,4. Komplexiteten hos det mänskliga, eller till och med murina, mikrobiomet gör det emellertid svårt att genomföra studier som skulle avslöja mikrobernas exakta inflytande på deras värd. Därför används enklare organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofta som ett upptäcktsverktyg 5,6,7,8. Nyligen genomförda studier har använt C. elegans för att undersöka effekten av bakterier på värdproteostas och sjukdomspatogenes 9,10. Bakteriell kolonisering, hormesis och genomiska förändringar är bland exemplifierande förhållanden som påverkar aggregeringen av polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Dessutom uppvisar dessa felveckade proteinkluster polyQ-längd- och åldersberoende ackumulering inom värden och är associerade med nedsatt rörlighet 9,13. Det relativt enkla tillvägagångssättet att kvantifiera fluorescerande märkt puncta kan generera viktiga data om förhållanden, faktorer eller läkemedel som påverkar proteinveckning och aggregering.

Även om kvantifiering av fluorescerande puncta har visat sig vara ett tillförlitligt och relativt enkelt förfarande, återstår utmaningen att utveckla ett protokoll som skulle underlätta storskalig screening av föreningar, bakterier eller tillstånd som påverkar proteinaggregering. Konceptet automatiserad C. elegans bildbehandling och punctakvantifiering är inte helt nytt, eftersom ett antal praktiska stödverktyg har utvecklats14,15. Integrationen av odling, bildförvärv och en bearbetningspipeline är dock avgörande för att eliminera variationer i resultat och möjliggöra skärmar med högre genomströmning.

Som sådan är avsikten med detta manuskript att standardisera proceduren som används för att kvantifiera polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy för att upptäcka förändringar i proteostas. Denna uppgift uppnåddes genom att använda CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod16 som kan automatisera mask- och aggregatidentifiering, och är integrerad i ett större protokoll för odling av maskar, förvärv av bilder och bearbetning av data.

Protocol

Alla procedurer följde säkerhetsriktlinjerna som granskades och godkändes av Institutional Biosafety Committee vid University of Florida. Lämpliga biosäkerhetsåtgärder vidtogs för att minska risken för exponering för biologiska säkerhetsnivå-2-bakterier.

ANMÄRKNING: För alla experiment måste C. elegans förökas och bibehållas på NGM-plattor (nematodetillväxtmedie) som är seedade med Escherichia coli OP50.

1. Beredning av 10 cm NGM-plattor

  1. Kombinera 3 g NaCl, 2,5 g tryptika-pepton och 17 g agar i en 2 L kolv och fyll till 1 liter med dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Tillsätt magnetisk omrörningsstång före autoklavering.
  2. Autoklavera blandningen i 45 minuter vid 121 °C och ett tryck på 21 psi. Låt blandningen svalna till 50 °C i ett vattenbad.
  3. Använd aseptiska tekniker, tillsätt följande sterila lösningar: 1 ml 1 M CaCl2 · 2H2O, 1 ml 1 MMgSO4· 7H2O, 1 ml 5 mg/ml kolesterol upplöst i 100% etanol (uppvärmd till rumstemperatur) och 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6,0). Blanda med en magnetisk omrörningsplatta. Blandning kan utföras i 1 min vid 700 rpm.
  4. Häll tills blandningen fyller hela 10 cm plattan. Alternativt kan du använda en graderad serologisk pipett för att tillsätta cirka 20 ml blandning per platta.
  5. Låt plattorna torka i 24 timmar vid rumstemperatur före sådd med bakterier eller förvara de släta plattorna vid 4 °C efter torkning.
    OBS: Alla mediekomponenter hanteras med aseptiska tekniker. Steg 1.3-1.4 bör utföras i en laminär flödeshuv.

2. Beredning av NGM-agar med FUDR i 24-brunnarsplattor

  1. Följ steg 1.1-1.3.
  2. Komplettera NGM med 5-Fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) och blanda för att uppnå en slutlig koncentration på 100 μg/ml.
    OBS: FUDR hämmar DNA-replikation och blockerar som ett resultat C. elegans reproduktion genom att rikta in sig på köns- och embryogenes, vilket i slutändan påverkar livslängden. Därför är det viktigt att låta maskar utvecklas fullt ut till unga vuxna innan de överförs till FUDR-innehållande plattor.
    VARNING: FUDR är giftigt och bör hanteras enligt tillverkarens säkerhetsdatablad.
  3. Använd en pipettpistol och fördela 1 ml NGM-FUDR i varje brunn.
    OBS: Denna process kan underlättas genom användning av ett automatiserat platthällningssystem.
  4. Låt plattan torka i 24 timmar vid rumstemperatur innan den sås med bakterier eller förvarar vanliga plattor vid 4 °C.

3. Sådd av plattor: OP50 och ytterligare testbakterier

  1. För att bereda en E. coli OP50-kultur över natten, tillsätt 200 μl av en bakteriell alikvot från en fryst stam till en 500 ml Erlenmeyerkolv som innehåller 250 ml färsk, steril Luria-buljong (LB).
    OBS: Mediavolymen beror på antalet plattor som behöver sås. För att förbereda andra bakteriekulturer, inokulera ett 16 ml odlingsrör innehållande 5 ml tillväxtmedium med bakterier från fryst lager med hjälp av en steril mikropipettspets.
  2. Inkubera över natten i en 37 °C inkubator och skaka vid 220 rpm (rotationer per minut).
    OBS: Använd steriliserade kolvar med minst dubbelt så stor arbetsvolym som media och försegla med autoklaverad aluminiumfolie. Utför inokuleringssteget och bakteriell dosering med aseptiska tekniker.
  3. Fördela 1-2 ml av E. coli OP50-kulturen över natten på mitten av varje 10 cm NGM-platta. Denna kultur behöver inte spridas runt NGM-plattan.
  4. Låt plattorna torka i rumstemperatur före användning/förvaring.
    OBS: Seedade plattor med lock på kan placeras i en huva med luftflöde för att underlätta torkningen.

4. Odling och sådd av plattor: 24-brunnsplattor

  1. Förbered en odling över natten av önskade bakteriestammar och följ odlingsanvisningarna i steg 3.1-3.2.
  2. Överför 200 μl av varje bakteriekultur till varje brunn på en 24-brunnsplatta innehållande NGM-agar. En volym bakterier på 200 μL täcker hela agarområdet och maximerar mängden mat för att säkerställa att maskar inte undviker bakteriegräsmattan.
  3. Låt plattorna vara spruckna i ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC) för att underlätta torkningen. Kontrollera plattorna regelbundet för att förhindra överdriven uttorkning och ändra plattans orientering för att främja jämnt luftflöde och torkning. Plattorna ska torka inom 5 timmar.
    OBS: Allt arbete med biologiska säkerhetsnivå-2-bakterier måste utföras i certifierade BSC och godkännas av Institutional Biosafety Committee.

5. Ålderssynkronisering

OBS: Alla steg bör utföras med rätt aseptiska tekniker (dvs. arbeta nära en låga eller inuti en BSC).

  1. Tvätta gravida hermafroditer från 10 cm OP50-plattor med filtersteriliserad M9-lösning (5,8 g Na2HPO4· 7H2O, 3,0 gKH2PO4, 5 g NaCl, 0,25 gMgSO4·7H2O, i 1 literddH2O).
    1. PipetterA M9-lösning på plattan flera gånger med hjälp av en steril serologisk pipett av glas eller plast för att lyfta maskar från bakteriegräsmattan.
    2. Samla upp masksuspensionen och överför lösningen till ett 15 ml polystyrenkoniskt rör.
  2. Centrifugera vid 270 x g, rumstemperatur (RT, ~23 °C), i 2 min.
  3. Aspirera med en vakuumfällkolv och kassera supernatanten och lämna maskpelleten ostörd.
    1. Resuspend pelleten i 5-10 ml M9 för att tvätta maskarna och upprepa steg 5,2-5,3 två gånger.
  4. Tillsätt 5 ml 20% bleklösning (8,25 ml ddH2O, 3,75 ml 1 M NaOH, 3,0 ml icke-bakteriedödande blekmedel) till röret och invertera kontinuerligt för att lösa upp maskarna. Ormar är redo att centrifugera när de nästan helt har lösts upp.
    OBS: Blekningstider och volym blekningslösning beror på provets storlek. Över- och underblekning är vanliga fel. Som sådan kräver denna process i allmänhet optimering för att avgöra när provet är klart för centrifugering.
  5. Centrifugera i 2 min vid 423 x g och kassera supernatanten.
  6. Tillsätt 10 ml steril M9 för att återsuspendera äggpelleten.
    1. Centrifugera röret i 2 min vid 423 x g för att pelletera äggen. Ta bort supernatanten med en aspiratorkolv.
    2. Upprepa steg 5.6–5.6.1.
  7. Resuspendera äggpelleten i 5 ml steril M9 och placera den på en mutter över natten vid önskad temperatur.
    OBS: Ålderssynkroniserade L1-larver är redo att överföras till plattorna följande dag.

6. Maskberedning efter ålderssynkronisering

  1. Centrifugera de ålderssynkroniserade maskarna vid 270 x g i 3 minuter vid RT (~23 °C).
  2. Aspirera supernatanten i en ren miljö, till exempel en flödeshuv eller bredvid en Bunsen-brännare. Lämna cirka 200 μL av supernatanten och återsuspendera maskarna.
  3. Använd en mikropipett och överför den koncentrerade masksuspensionen till 10 cm NGM-plattor som tidigare har seedats med OP50.
    OBS: Varje tallrik kan stödja 1,500 maskar utan att få slut på mat; Denna koncentration kan dock kräva justering beroende på bakteriegräsmattans densitet och tillväxttemperatur. Det rekommenderas att använda flera plattor för att förhindra att maskar svälter. Det är viktigt att notera att dessa plattor inte får innehålla FUDR.
  4. Låt plattorna torka; Invertera sedan och förvara vid 25 °C i 48 timmar.
    OBS: Beroende på skärmens tillstånd kan maskar från steg 6.1 placeras direkt på testplattor (som innehåller bakterier, läkemedel eller testföreningar). Om det önskade testtillståndet påverkar utvecklingen bör maskar odlas på NGM som innehåller OP50 tills unga vuxna (~ 48 timmar) innan de utsätts för testförhållanden.
  5. Tvätta maskarna från plattorna med steril M9-lösning efter inkubationen på 48 timmar och placera dem i koniska rör.
    OBS: Vuxna maskar sjunker till botten av röret. Den exakta tiden varierar beroende på antalet maskar som återhämtats från 10 cm plattor. Under dessa förhållanden sätter maskarna sig ner inom 10 minuter.
  6. Utför visuell inspektion för att bestämma sedimenteringstidens varaktighet så att eventuella kvarvarande ägg eller kläckta larver tas bort.
  7. Tillsätt ytterligare 10 ml M9 för att skölja de kvarvarande bakterierna från maskkroppar.
    1. Centrifugera maskarna i 2–3 minuter vid 270 x g vid 23 °C.
    2. Utför tvättsteget ytterligare 3 gånger. För bästa resultat, lämna cirka 1-1,5 ml M9-lösning i röret efter den slutliga tvätten.
    3. Överför 10 μL av maskupphängningen till en glasskiva och räkna antalet maskar.
    4. Justera maskdensiteten till cirka 150 maskar per 10 μl M9. Koncentrationen av maskar i suspension kan justeras genom att antingen avlägsna eller tillsätta M9-lösning efter centrifugering.
    5. Bekräfta att den önskade koncentrationen har fastställts genom medelvärde från flera olika droppar. Det rekommenderas att i genomsnitt räkna från minst tre droppar.
  8. Med hjälp av aseptiska tekniker överför du 10 μl av masksuspensionen innehållande cirka 150 maskar till varje brunn på testplattan.
  9. Inspektera brunnarna under ett mikroskop för att säkerställa att var och en har ett tillräckligt antal maskar. Ytterligare maskar kan tillsättas före inkubation.
  10. Låt plattorna torka i cirka 10 minuter; och sedan invertera och överföra till en 25 °C inkubator i 72 timmar.
    OBS: Den slutliga inkubationsperioden kan justeras för att tillgodose experimentets behov. Inkubationstiden på 72 timmar är tillräcklig för att stödja tillväxten av 150 djur som utfodras med 200 μl bakterier i en 24-brunnsplatta vid 25 °C.

7. Förbereda maskar för avbildning

  1. För att underlätta effektivare sedimentering och minimera provförlust, immobilisera maskarna före tvätt för att förhindra simning.
    OBS: Om du arbetar med få prover kan detta uppnås genom exponering för levamisol (100 μM). Men om man arbetar med ett stort antal prover kan maskar immobiliseras genom frysning. Dessutom kommer förlängd frysning (18-24 h) att förhindra vidareutveckling av polyQ-aggregat under beredningen.
    1. Placera flerbrunnsplattor vid -20 °C i 15-20 minuter eller tills maskarna inte längre rör sig.
    2. Ta ut proverna ur frysen och låt dem sitta i 5 min.
  2. Använd en mikropipett, tillsätt 1 ml M9, kyld till 4 ° C, till en brunn av intresse, tryck upprepade gånger och tryck ner kolven 4-6 gånger för att tvätta maskarna i varje brunn.
    OBS: Ibland kan maskar hålla sig till mikropipettspetsar. Som sådan bör olika tips användas mellan varje brunn för att förhindra blandning av maskar.
  3. Överför masksuspensionen till ett mikrocentrifugrör och låt maskarna sjunka till botten.
  4. Aspirera och kassera supernatanten. Tvätta provet totalt tre gånger.
  5. Efter att maskar har lagt sig till botten under den sista tvätten, aspirera 500 μL supernatant och lämna 500 μL för att återsuspendera maskar.
  6. Överför den återstående maskupphängningen till en ny platt bottenplatta med 24 brunnar och placera den i en frys på -20 °C i 48 timmar.
    OBS: Frysande maskar minskar bakgrundsfluorescensen och möjliggör bättre visualisering av aggregat.

8. Bildbehandling

  1. Ta bort plattorna från frysen och låt tina, torka bort överflödig kondens och ta bort locket före avbildning.
    OBS: Detaljerna för bildtagning varierar beroende på vilken utrustning och programvara som används. Protokoll för detta avsnitt bör endast fungera som en vägledning, och ändringar kan förväntas. Det är också nödvändigt att ta bilder i tiff-filformatet.
  2. Använd följande mikroskopinställningar under bildtagning: Exponeringstid, 500 ms; 40x förstoring med 0,63x kameraadapter (25,2x), GFP-intensitet inställd på 100%.
    OBS: Olika mikroskopkonfigurationer och system kan få bilder som skiljer sig från de som anges i resultatavsnittet. För att uppnå en mer universell beskrivning av de bilder som krävs tillhandahålls mer objektiva detaljer om bilder. Aggregat måste vara mellan 1,0-10,0 pixlar i diameter med en fluorescerande intensitet på 0,10-1,0 (godtyckliga enheter, skala 0-1) för att kunna identifieras korrekt av CellProfiler. Den fluorescerande bakgrunden för dessa aggregerade bilder ligger i allmänhet under tröskelvärdet 0,10. För ljusfältsbilder varierar maskintensiteten från 0,7-1,0 med en bakgrundsintensitet på 0,1-0,2. Den genomsnittliga längden på maskar i ljusfältsbilder varierar från 250 pixlar till 350 pixlar i längd från huvud till svans.
  3. Justera kontrollerna för överfört ljus tills maskarna verkar starkt upplysta jämfört med den mörka bakgrunden. Undvik överexponering; det kommer att öka maskstorleken.
  4. Det kan vara nödvändigt att ändra maskarnas positioner i brunnen för att förhindra överdriven klumpning. Dispergera klumpiga maskar med en pipettspets.
  5. Ställ in kanalen på GFP för att upprätta ett fokusplan för båda bilderna.
    OBS: Det är viktigt att fokalplanet bestäms i GFP-kanalen. Alla förändringar i fokus som görs när du tar ljusfältsbilder kommer att resultera i feljustering av aggregat och maskar under bildanalysen.
  6. Fånga en ljusfältsbild och ta omedelbart motsvarande fluorescerande bild utan att störa plattan.
  7. Kör testbilder genom pipelinen för att fastställa intensitets- och storleksvärden för objekt i bilden enligt "OBS" efter steg 8.2.
    CELLPROFILER kan ge all nödvändig information om objektens intensitet och längd före analys.
  8. För att bedöma bilder, ladda ner först CellProfiler17. Öppna programvaran och dra och släpp bilder av intresse i rutan Bilder.
  9. Klicka på bilderna i fillistan för att öppna dem.
  10. I det övre vänstra hörnet av skärmen finns flera ikoner; använd dem för att mäta storleken på objekten eller förstora ett visst område. Välj förstoringsglaset för att markera ett område av intresse.
  11. Välj pilikonen för att mäta längden på både maskar och aggregat.
  12. Håll muspekaren över önskat objekt för att bestämma dess intensitetsvärde som kan ses på den nedre delen av skärmen.
    Eftersom alla bilder är tagna i gråskala kommer alla röda, blå och gröna pixelvärden att vara identiska.

9. Bildanalys

  1. Om du vill använda CellProfiler-bildanalyspipelinen ger du bildparen ett korrekt namn. Använd följande format: P1_A01_S1_C1, där P1 avser den specifika skylten och dess respektive numeriska beteckning; "A", hänvisar till raden och "01" till kolumnen; "S" avser ett specifikt bildpar för en enda brunn; "C" avser kanalen, där "1" används för att beteckna ljusfältsbilder och "2" för fluorescerande bilder.
  2. Ladda ner CellProfiler (version 4.1.3 eller högre) från den officiella webbplatsen17.
  3. Ladda ned pipelinen (tilläggsfil 1). Ladda upp pipelinen (Pipeline) till CellProfiler genom att välja File > Import > Pipeline from File .
    OBS: Modulerna 2 och 3 har inaktiverats eftersom de har ansetts onödiga. Deras funktion kan återställas om bildanalys inte ger tillfredsställande separation och identifiering av maskar; emellertid krävs modifiering av rörledningen.
  4. Om du vill införliva dessa moduler markerar du rutorna till vänster om varje modul. Byt namn på den binära indatabilden för modulen "UntangleWorms" till utdatabilden från modulen "convertobjectstoimage".
  5. Ett felmeddelande kan visas under den första användningen relaterad till modul 2. Om detta inträffar, fortsätt med analysen.
  6. Ladda upp en träningsuppsättning som används för att identifiera maskar till modulen "UntangleWorms". Den här träningsuppsättningen finns i tilläggsfil 2.
    1. Välj modulen UntangleWorms för att öppna dess inställningar.
    2. Identifiera filnamnet för träningsuppsättningen och välj ikonen för uppladdningsfilen.
    3. Ladda upp tilläggsfil 2 (träningsuppsättning).
  7. Ladda upp bilder genom att välja modulen Bilder i det övre vänstra hörnet. Dra och släpp korrekt namngivna bilder enligt beskrivningen i steg 9.1.
  8. Innan du analyserar bilder väljer du önskad utdatamapp som ska användas för att lagra resultaten.
    1. Klicka på knappen Utgångsinställningar som ligger nära programmets nedre vänstra hörn.
    2. Välj mappikonen till höger om Standardutmatning för att välja önskad utmatningsplats.
  9. Välj ikonen Analysera bilder för att påbörja bildanalysen.
  10. Om analysen tar för lång tid att slutföra och har fastnat i bearbetningen av en enda bild beror det troligen på problem från bildförvärv. Om detta inträffar avbryter du körningen och fortsätter att identifiera de obearbetade bilderna genom att sortera igenom utdatamappen och notera vilka bildnamn som inte hittas.
    Bilderna kan kräva ytterligare bearbetning för att ta bort stora eller intensivt upplysta artefakter som inte kan bearbetas av pipelinen. I vissa fall kan sådana bilder behöva uteslutas från analysen.
  11. Efter fullständig analys kommer programvaran att organisera resultaten i ett Excel-kalkylblad som innehåller enskilda maskar (kolumn N) och deras respektive antal aggregat (kolumn K).
    OBS: En lyckad körning kommer att producera ett Excel-kalkylblad som innehåller antalet aggregat per identifierad mask för varje brunn. Dessa data kan manipuleras på ett sätt som bestäms av experimentören.
  12. Ladda ner metadataarrangören (grafiskt användargränssnitt) från tilläggsfil 3 (Windows) eller kompletterande fil 4 (Mac) för att bekvämt organisera data från den utgående CSV-filen från CellProfiler.
    OBS: Denna programvara har ingen officiell licens och öppnas inte automatiskt efter nedladdning.
  13. Följ steg 9.14-9.17 om du använder Windows OS 64-bitars. Programvaran fungerar inte på Windows 32-bitars. Följ steg 9.18-9.20 om du använder Mac OS.
  14. För Windows OS, leta reda på den nedladdade filen och extrahera den till önskad plats.
  15. Leta reda på och öppna den extraherade mappen med namnet gui_windowsOS_64x och starta programmet genom att klicka på applikationsikonen "gui".
  16. En prompt kan öppnas och begära tillstånd att köra. Välj Mer info och klicka sedan på Lita på ändå.
  17. Metadataorganisatören är redo att dra och släppa CellProfiler-utdata CSV-filer. Fortsätt till steg 9.21.
  18. För Mac OS letar du reda på den nedladdade filen och öppnar gui_macOS_64x.zip. Detta steg bör automatiskt extrahera alla filer.
  19. Öppna den extraherade mappen som finns i "Nedladdningar".
  20. Högerklicka på programmet "gui" och välj Öppna. En uppmaning visas som ber om tillstånd att öppna på grund av bristen på en officiell licens. Välj Öppna och fortsätt till steg 9.21.
  21. Klicka på Ladda upp dina filer här eller dra och släpp önskade CellProfiler CSV-filer.
  22. Klicka på knappen Organisera , som tar användaren till en ny skärm med knappen Hämta filer . Klicka på knappen och välj önskad plats för att spara utdatafilen. Utdatafilen visas som det ursprungliga filnamnet med tillägget "_organized" som läggs till i filnamnet.

Representative Results

Här beskrivs ett C. elegans-arbetsflöde som inkluderar odlings-, bildförvärvs- och bearbetningsprotokoll som möjliggör bedömning av polyQ-aggregering i närvaro av olika bakterier med hjälp av ett 24-brunnsplattformat som odlings- och bildplattform (figur 1). Detta protokoll kan justeras för att studera effekten av bakterier, specifika tillstånd, små molekyler, läkemedel eller genomiska manipulationer på värdproteostas. Den beskrivna metoden har optimerats med hjälp av maskar som konstitutivt uttrycker intestinal polyQ smält till ett gult fluorescerande protein (vha6p: :p olyQ44::YFP); andra modeller som rapporterar om proteostas i muskler eller nervceller kan dock också användas med ytterligare optimering. Till exempel visar preliminära experiment tillämpningen av dessa metoder vid kvantifiering av proteinaggregat i andra vävnader såsom muskelpolyQ (Kompletterande figur 1). Modifiering av rörledningen kommer dock att krävas för att korrekt justera för aggregatets storlek och ljusstyrka, som nämns i avsnitt 8 OBS.

Figure 1
Bild 1: Visuell representation av arbetsflöde. De viktigaste stegen i protokollet inkluderar fem distinkta steg: maskberedning och ålderssynkronisering (steg 1-5), tarmkolonisering / maskbehandling (steg 6), provberedning för avbildning (steg 7), bildförvärv (steg 8) och bildbehandling (steg 9). "Avsnitten" i protokollet refereras till som "Steg" i figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De första optimeringsexperimenten avslöjade olika svårigheter i samband med överbeläggning på grund av ett stort antal avkommor, vilket resulterade i snabbare matutarmning. Tillskottet av FUDR i NGM-plattor som beskrivs i avsnitt 2 löste detta problem (figur 2). Dessutom, i närvaro av FUDR, hade maskar som matades med olika bakterier en mer konsekvent kroppsstorlek, vilket möjliggjorde mer enhetlig och exakt maskdetektering.

Figure 2
Figur 2: Användningen av FUDR förbättrar bildkvaliteten genom att minska avkomman. FUDR-kompletterade plattor eliminerar C. elegans-avkomma jämfört med maskar som odlas på NGM-plattor som inte är FUDR-kontroll såade med E. coli OP50. Bilder förvärvades med 25,2x förstoring (40x förstoring med en 0,63x kameraadapter). Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bakgrundsfluorescens bidrog till falsk positiv detektion av polyQ-aggregat. För att minska sådan fluorescenssignal i tarmkanalen och förbättra automatiserad detektion av aggregat var det nödvändigt att frysa maskar före avbildning. Frysmaskar vid -20 °C i 18-48 timmar förbättrade signifikant polyQ-aggregatdetektering genom att eliminera bakgrundsfluorescens (figur 3A). Det mänskliga ögat kan skilja mellan aggregat och bakgrundsfluorescens; Därför är den manuella räkningen före och efter frysningen densamma (figur 3B). Automatiserad räkning är dock inte lika exakt, men frysning förbättrade avsevärt automatiserade räkningar med noggrannhet jämförbar med manuell räkning (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Frysning förbättrar aggregatdetektering. Inlägg representerar närbilder av det markerade området. Skalstaplar = 500 μm. (B) Genomsnittligt antal aggregat per tarm i maskar koloniserade med P. aeruginosa MPAO1 före och efter frysning med manuell eller automatiserad (pipeline) aggregerad kvantifiering. Data representerar två biologiska replikat (n = 60-109). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Students t-test (**** p < 0,0001). Felstaplar representerar medelvärdets (SEM) standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Inverterad ljusfältsbelysning användes för att detektera hela C. elegans (figur 4A) och GFP-kanalen för att avbilda polyQ44: : YFP-aggregat (figur 4B). Maskdetektering, detangling och aggregerad kvantifiering för varje mask gjordes genom att tillämpa en optimerad CellProfiler-bildbehandlingspipeline (Kompletterande fil 1), vilket gör det möjligt att erhålla antalet aggregat per enskild mask (figur 4C-D). För att testa genomförbarheten av detta tillvägagångssätt och noggrannheten i den automatiska aggregatdetekteringen och kvantifieringen odlades maskar som uttrycker tarmspecifik polyQ44::YFP och förbereddes för avbildning enligt de etablerade protokollen (avsnitt 1-7). Antalet aggregat per mask bedömdes med hjälp av antingen den automatiserade rörledningen (avsnitt 8-9) eller manuell räkning. Varje experiment utfördes i tre oberoende försök med 90-571 maskar per tillstånd. Medan det genomsnittliga antalet aggregat per tarm som erhölls med två försök inte hade någon signifikant skillnad, hade maskar i den tredje studien betydligt färre aggregat när de kvantifierades med hjälp av den automatiserade metoden (figur 5A). Det genomsnittliga antalet aggregat från de tre studierna resulterade i något, men betydligt färre aggregat när kvantifieringen gjordes med hjälp av CellProfiler-pipelinen (avsnitt 8-9) (figur 5B). Ändå var skillnaden mellan de två tillvägagångssätten minimal, vilket indikerar att den automatiserade metoden kan tillämpas på storskaliga skärmar.

Figure 4
Bild 4: Aggregerad detektion med CellProfiler. (B) Ursprunglig fluorescerande bild som erhållits med hjälp av GFP-kanal och används för att identifiera och kvantifiera ett totalt antal tarmpolyQ44::YFP-aggregat. (C) Aggregat som identifierats med CellProfiler. (D) Ett totalt antal identifierade aggregat överlagrade över den ursprungliga fluorescerande bilden med mask- och aggregatkonturer. Bildtagning och bearbetning utfördes med hjälp av de inställningar som beskrivs i avsnitten 8-9. Panelerna E-H representerar närbilder av motsvarande konturerade områden i bilderna A-D. Bilder förvärvades med 25,2x förstoring (40x förstoring med en 0,63x kameraadapter). Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Effekt av automatiserad aggregerad kvantifiering. (A) Genomsnittligt aggregerat antal per tarm hos maskar koloniserade med kontroll E. coli OP50 med manuell räkning (manuell) och automatiserad CellProfiler-baserad kvantifiering (Pipeline). Resultaten representerar data som analyserats i tre separata prövningar (T1-T3) (n = 90-571). (B) Det genomsnittliga antalet aggregat per tarm erhölls med hjälp av manuell eller automatiserad (Pipeline) aggregerad kvantifiering. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Students t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01). Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att utvärdera reproducerbarheten av resultat bland olika experimenter förvärvades bilder från en platta innehållande sex brunnar av maskar som matades antingen Pseudomonas aeruginosa MPAO1 eller Escherichia coli OP50 av tre individer, varav två inte hade någon tidigare erfarenhet av att avbilda maskar med hjälp av dessa protokoll. Bilder som samlats in från varje brunn innehöll var som helst mellan 30-115 upptäckta maskar. En icke-signifikant skillnad i aggregering upptäcktes i maskar från samma brunnar som avbildades av de tre experimenterna. Medan det genomsnittliga antalet aggregat per tarm förblev mycket konsekvent mellan de tre experimenterna för maskar som matades MPAO1 och OP50, fanns det några statistiskt signifikanta skillnader i det genomsnittliga antalet aggregat men endast i maskar koloniserade av MPAO1 (Kompletterande figur 2). Dessa resultat belyser reproducerbarheten av resultaten även mellan oerfarna experimenter.

För att säkerställa att reproducerbarheten av aggregerad kvantifiering inte påverkas signifikant av maskpositionen valdes en uppsättning med 15 maskar och avbildades 15 separata gånger efter omrörning mellan varje bildtagning med hjälp av en pipettspets. Bilder av aggregat i maskar matade med E. coli OP50 och P. aeruginosa MPAO1 samlades in och analyserades med hjälp av CellProfiler. Det genomsnittliga antalet aggregat från var och en av dessa olika uppsättningar bilder var något men inte signifikant olika, vilket ytterligare stödde reproducerbarheten av denna metod (kompletterande figur 3).

Kolonisering av C. elegans-tarmen med gramnegativa enteriska patogener har visat sig störa proteostas över vävnader, med P. aeruginosa som bland de mest potenta inducerarna av polyQ-aggregering9. För att avgöra om dessa optimerade protokoll framgångsrikt kommer att detektera och kvantifiera P. aeruginosa-medierad förbättring av aggregering, koloniserades maskar som uttrycker intestinal polyQ med E. coli OP50 (kontrollbakterier) och P. aeruginosa MPAO1, avsnitt 1-8 genomfördes. De förvärvade bilderna analyserades med hjälp av CellProfiler (avsnitt 9, Tilläggsfil 1). Resultaten av automatiserad kvantifiering visar en signifikant ökning av antalet aggregat inducerade av P. aeruginosa MPAO1, vilket konsekvent resulterar i en tvåfaldig förbättring jämfört med maskar som matas med kontroll E. coli OP50 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Det genomsnittliga antalet aggregat per tarm i maskar koloniserade med kontroll E. coli OP50 och P. aeruginosa MPAO1. Antalet aggregat per tarm bedömdes med hjälp av CellProfiler (avsnitt 8-9). Data representeras som det genomsnittliga antalet aggregat per tarm i maskar koloniserade med OP50 (n = 1068) och MPAO1 (n = 1557). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Students t-test (**** p < 0,0001). Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den optimerade pipelinen har utformats för att stödja storskaliga skärmar för förhållanden som påverkar proteostas. För att testa genomförbarheten av detta tillvägagångssätt vid screening av stora bakteriebibliotek för deras effekt på värdproteostas användes rörledningen som beskrivs häri (avsnitt 1-9) för att testa effekten av 90 P. aeruginosa icke-essentiella gen knock-out mutantstammar på polyQ-aggregering18. Denna pilotskärm är en del av ett större projekt som är utformat för att screena alla P. aeruginosa icke-väsentliga mutantstammar för deras förmåga att påverka värdproteostas. Av 90 testade bakteriestammar visade kolonisering av C. elegans tarm med en kandidat en signifikant minskning av antalet aggregat (figur 7). Uppföljningsexperiment för att utvärdera känsligheten hos denna analys utfördes via manuella aggregaträkningar från ett slumpmässigt urval av sex P. aeruginosa-mutanter som skilde sig icke-signifikant från MPAO1-kontrollen. Dessa experiment utfördes med de mer traditionella 6 cm NGM-plattorna och överförde maskar till teststammar som L1 för att rekapitulera tidigare etablerade metoder9. Bekräftelseexperimenten genom manuell räkning avslöjade att ingen av mutanterna, inklusive den som signifikant minskade antalet aggregat (figur 7), påverkade polyQ-aggregeringen (kompletterande figur 4). Dessutom upptäcktes inte de subtila förändringar i aggregering som observerades i skärmen för de 90 mutanta stammarna bland manuella räkningar av utvalda kandidater, vilket indikerar att sådana förändringar kan uppstå på grund av biologisk och experimentell variabilitet, såsom lågt n-värde. Sammantaget indikerar resultaten att även om vår metod på ett tillförlitligt sätt kan plocka upp betydande förändringar, kommer subtila sannolikt att missas och alla potentiella kandidater måste bekräftas individuellt.

Figure 7
Figur 7: Antalet aggregat per tarm i en representativ provuppsättning maskar koloniserade av 92 bakteriestammar. Data representeras som det genomsnittliga antalet aggregat per tarm normaliserat till maskar koloniserade med MPAO1. Prickade linjer representerar det genomsnittliga antalet aggregat i maskar koloniserade med MPAO1 (topp, öppen cirkel) och OP50-kontroll (botten, öppen kvadrat). Solida symboler representerar 90 distinkta knock-out mutantstammar av P. aeruginosa MPAO1. Det genomsnittliga antalet aggregat per mask mellan maskar koloniserade med MPAO1 och en enda mutant var statistiskt signifikant. Grå cirklar representerar prover som har bekräftats manuellt (kompletterande bild 4). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA) följt av multipeljämförelse Dunnetts post-hoc-test (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att hantera den stora mängden data som genereras av CellProfiler utvecklades ett grafiskt användargränssnitt (GUI) för att automatisera databehandling och organisation (figur 8). GUI utvecklades med hjälp av Tkinter, en öppen källkod Python plattformsoberoende widget verktygslåda. Från de angivna metadata extraherar applikationen antalet aggregat (kolumn K) från varje brunn (kolumn J) som finns i en platta. Ett Python-datahanteringsbibliotek som heter "Pandas" användes för att utföra ovannämnda process. GUI-applikationen ger dra-och-släpp-stöd för användare att ladda upp datafiler. Data i varje fil lagras i form av en tvådimensionell tabellstruktur som kallas en dataram. Ett tomt ordlistepar initieras för varje unik brunn som finns i dataramen. Därefter räknas de distinkta aggregat som finns i varje brunn och läggs till i sina respektive ordbokspar. Kolumnen med mindre data är vadderad med tomma värdesträngar för att säkerställa att varje kolumn är jämn i storlek. Slutligen konverteras strukturen till en dataram som exporteras i form av ett kalkylblad till den katalog som anges av användaren.

Figure 8
Figur 8: Grafiskt användargränssnitt.

Kompletterande figur 1: Detektion av muskelspecifika polyQ-aggregat. Maskar som uttrycker muskelspecifik polyQ35::YFP pläterades som L1 och odlades på OP50 i 48 timmar. När maskar utvecklades till unga vuxna överfördes de till NGM-plattor med 24 brunnar, kompletterades med 100 μg/ml FUDR och såddes med MPAO1 i ytterligare 72 timmar före avbildning. (A) Brightfield-bild som används för att identifiera maskkroppar. (B) Ursprunglig fluorescerande bild som förvärvats med GFP-kanal. (C) Aggregat som identifierats med CellProfiler. (D) Ett totalt antal identifierade aggregat överlagrade över den ursprungliga fluorescerande bilden med mask- och aggregatkonturer. Bildtagning och bearbetning utfördes med hjälp av de inställningar som beskrivs i avsnitten 8-9. Panelerna E-H representerar närbilder av motsvarande konturerade områden i bilderna A-D. Skala staplar = 500 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Reproducerbarhet av aggregerad kvantifiering mellan olika experimenter. Genomsnittligt antal aggregat kvantifierade med CellProfiler för sex brunnar maskar koloniserade med P. aeruginosa MPAO1 (svarta staplar) och sex brunnar av maskar koloniserade med kontroll E. coli OP50 (grå staplar). Varje brunn avbildades av tre experimenter (AVS, DMC, RDH). Data representeras som det genomsnittliga antalet aggregat per tarm (n = 30-115). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys test för flera jämförelser (* p < 0,05, ** p < 0,01). Felfält representerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Effekten av maskposition på reproducerbarheten av aggregerad kvantifiering. Genomsnittligt aggregerat antal per tarm hos maskar koloniserade med kontroll E. coli OP50 (grå staplar) och P. aeruginosa MPAO1 (svarta staplar). Resultaten representerar det genomsnittliga antalet aggregat per tarm (15≥n≥12) kvantifierat med CellProfiler. Maskarnas position i brunnarna ändrades genom agitation mellan varje förvärv. Inga statistiskt signifikanta skillnader hittades i någon av grupperna. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägs ANOVA följt av Tukeys test av flera jämförelser. Felfält representerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande bild 4: Bekräftelse av pilotskärmen med manuell räkning. Det genomsnittliga antalet aggregat per tarm kvantifierades manuellt. Data representerar aggregeringsprofiler av maskar som koloniserats med sex MPAO1 knock-out mutanter (grå cirklar Figur 7) jämfört med MPAO1- och OP50-kontroller av vild typ (n = 30). Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägs ANOVA följt av multipeljämförelse Dunnetts post-hoc-test (**** p < 0,0001). Felfält representerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Effekten av FUDR på intestinal polyQ-aggregering. Data representeras som det genomsnittliga antalet polyQ44::YFP-aggregat per tarm (n = 20). Maskar överfördes till kontrollplattor (ingen FUDR) eller FUDR-innehållande plattor (100 μg/ml) efter 48 timmars tillväxt vid 25 °C på E. coli OP50. Manuella räkningar samlades in efter ytterligare 48 timmar. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Students t-test (ns = ej signifikant). Felfält representerar SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 1: Proteostas-pipeline. Nedladdningsbar pipeline för bildanalys för användning i CellProfiler. Anvisningar för ansökan finns i avsnitt 9. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Träningsset som lossar mask. Fil som ska laddas upp till modulen "UntangleWorms". Denna speciella träningsuppsättning är specifik för maskarna som används i det första tillvägagångssättet. Förändringar i maskstorlek och form kommer att förändra noggrannheten och kvaliteten på identifieringen. Det kan vara nödvändigt att skapa en mer personlig träningsfil. Instruktioner för att skapa en ny träningsuppsättning finns på den officiella CellProfiler-webbplatsen17. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: Grafiskt användargränssnitt för Windows operativsystem. gui_windowsOS_64x.zip. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 4: Grafiskt användargränssnitt för Mac-operativsystem. gui_MacOS_64x.zip. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Det beskrivna protokollet beskriver procedurer för C. elegans odling, avbildning och bildbehandling som innehåller CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod. De representativa resultaten visar reproducerbarhet, minskning av bias och skalbarhet. Detta standardiserade förfarande kommer att förbättra screeningstrategier som används med stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek. Medan andra automatiserade C. elegans-metoder för objektdetektering finns, erbjuder den beskrivna tekniken en standardiserad pipeline med högre genomströmning som integrerar odling, bildförvärv och analys.

Flera varianter av maskodling måste testas för att optimera protokollet som beskrivs häri. Ursprungligen överfördes maskar till provbakterier omedelbart efter ålderssynkronisering (L1-steg). Ett sådant tillvägagångssätt resulterade emellertid i en population av maskar med varierande storlekar, även bland maskar inom samma brunn. C. elegans är kända för att undvikapatogener 19, vilket kan ha bidragit till den observerade variationen i storlek och i slutändan påverka nedströms avbildningsmaskdetektering, i synnerhet. För att eliminera sådan variation täcktes hela NGM-området i varje brunn med testbakterier. Dessutom utfodrades maskar med E. coli OP50 och tilläts utvecklas fullt ut till unga vuxna i 48 timmar vid 25 °C. Att låta maskar nå vuxen ålder på E. coli OP50 innan de överfördes till testbakterier resulterade i en mer konsekvent kroppsstorlek. Dessutom eliminerades överbeläggning och snabb matutarmning av avkomma genom att komplettera NGM-agar med FUDR. Implementeringen av FUDR tog bort avkomma och förbättrade automatiserad maskidentifiering, som doldes av avkomma som blandades med föräldrapopulationen. Det är dock viktigt att vara försiktig och använda lämpliga kontroller när du använder FUDR, eftersom föreningen är känd för att påverka C. elegans proteostas och livslängd20,21. Under de förhållanden som beskrivs i detta protokoll påverkade FUDR inte intestinal polyQ-aggregering (kompletterande figur 5); därför var dess användning lämplig och fördelaktig för den beskrivna metoden.

Frysning av prover före avbildning visade sig vara ett kritiskt steg i en framgångsrik anställning av rörledningen. Det sammanlagda antalet före frysningen var betydligt högre än det manuella antalet (figur 3B). Att hålla maskar vid -20 °C i 18-48 timmar före avbildning minskade bakgrundsfluorescensen och i slutändan förbättrade aggregatdetekteringen (figur 3A). Effekterna av frysning på aggregerad detektion har endast undersökts för polyQ och bör inte generaliseras till andra modeller utan ytterligare undersökning av sådana effekter.

Trots att alla förhållanden hölls desamma observerades att det genomsnittliga antalet aggregat per mask kunde variera mellan olika körningar, medan förhållandet mellan antalet aggregat hos djur som koloniserades med OP50 jämfört med MPAO1 förblev konsekvent (figur 6, kompletterande figur 2, kompletterande figur 5). Därför är det viktigt att alltid inkludera E. coli OP50-kontroll, eller eventuella ytterligare lämpliga referenskontroller, i varje körning. Sådan variation i aggregerat antal mellan experiment kan påverkas av miljöförhållanden (temperatur, fuktighet)22,23 eller genetisk bakgrund8. Faktum är att det observerades att efter långvarig odling minskade tarmfluorescensen drastiskt eller förlorades helt, vilket krävde upptining av en ny stam från fruset lager. Den observerade minskningen av fluorescens kan vara ett resultat av genetiska förändringar som undertrycker toxiska transgener, såsom de som uttrycker polyQ. Icke desto mindre betonar den exceptionella reproducerbarheten av de resultat som observerats mellan olika experimenter (kompletterande figur 2), mellan biologiska replikat (figur 5) och inom samma prov (kompletterande figur 3) styrkan i detta tillvägagångssätt.

Många rapporter har använt intestinal polyQ för att studera proteostas 9,11,12,13,24,25. En direkt jämförelse mellan resultat kan dock inte göras på grund av variation mellan experimentella tillvägagångssätt och avläsningsmetoder. Icke desto mindre rekapituleras några resultat från tidigare publicerade data av den automatiserade kvantifiering som beskrivs häri, inklusive bakteriell induktion av aggregering 9,13 och ett jämförbart antal aggregat11. Sammantaget erbjuder den beskrivna pipelinen ett värdefullt verktyg för att studera proteostas.

Metoden som beskrivs häri har vissa inneboende utmaningar. Det tar till exempel tillräckligt med tid för att behärska alla komponenter i detta protokoll, vilket särskilt gäller för avsnitt 8 i protokollet, vilket kräver förtrogenhet med analysen för att avgöra om de förvärvade bilderna är lämpliga för pipelineanalys. Avvikelser från de bildförvärvsinställningar som används i detta protokoll är möjliga; det kommer dock sannolikt att krävas ändring av inställningarna och maskträningsuppsättningen. Denna pipeline kan skilja aggregat av olika storlekar och de som berör, vilket begränsar "blandning" av aggregat och i slutändan ökar detekteringskänsligheten. Problem kan dock uppstå när du försöker identifiera stora aggregat som överskrider det accepterade storleksintervallet, eftersom utvidgning av den övre storlekströskeln kan leda till fel som orsakas av dålig identifiering, till exempel oförmågan att skilja aggregat som berör. En balans mellan noggrannhet, storlek och intensitet måste hittas före bildanalysen. Effektiviteten för aggregerad identifiering kan förbättras ytterligare genom att införliva maskininlärning för att skapa ett neuralt nätverk som kan förbättra aggregatdetektering. Sådana förbättringar undersöks för närvarande och kommer i hög grad att hjälpa till att ta itu med aktuella frågor som detektering av aggregat som ligger på olika fokalplan eller som har onormala former.

En anmärkningsvärd svaghet med den beskrivna metoden är variationen i automatiserade aggregaträkningar, eftersom de inte alltid rekapituleras av manuella räkningar i maskar som matas med olika bakteriestammar. Till exempel, baserat på automatiserade räkningar, hade maskar som matades med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant färre aggregat jämfört med vildtypsstammen (MPAO1) (figur 7); Bekräftelsen av träffen visade dock ingen signifikant skillnad (kompletterande figur 4). I allmänhet har läkemedelsskärmar med hög genomströmning en hög frekvens av falskt positiv träffdetektering, och den beskrivna metoden är inget undantag26. Således är det en kritisk del av protokollet att bekräfta alla potentiella träffar.

Medan detta protokoll optimerades för att passa en screeningstrategi för att identifiera bakterier som påverkar värdproteostas, kan varje steg modifieras ytterligare för att testa effekten av genomiska RNAi-bibliotek, små molekyler eller andra tillstånd. Ytterligare ändringar kan göras vid varje steg för att passa kraven i en specifik screeningstrategi. Dessutom ger denna teknik en nivå av flexibilitet som möjliggör optimering av varje steg för att passa en specifik modell. Till exempel kan detta tillvägagångssätt utvidgas till polyQ-aggregering i andra vävnader eller extrahera andra funktioner som detekteras i bilder, såsom övervakning av genuttryck med hjälp av inducerbara fluorescerande reportrar (t.ex. värmechockgener), bedömning av subcellulär lokalisering av proteiner (t.ex. kärnlokalisering av DAF-16), studier av aggregering i andra sjukdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuklein, TDP-43, etc.) eller bedömning av fysiologiska fenotyper, såsom maskstorlek.

Disclosures

Författarna har förklarat att inga intressekonflikter föreligger.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) och Infectious Diseases Society of America finansiering till DMC. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar medlemmarna i Czyz Lab för korrekturläsning av manuskriptet. Tecknade figurer genererades med BioRender betald licens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soto, C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).
  2. Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk. Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).
  3. Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. Our gut microbiome: The evolving inner self. Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).
  4. Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).
  5. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).
  6. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).
  7. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  8. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  9. Walker, A. C., et al. Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate. PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).
  10. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  11. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
  12. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).
  13. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).
  14. Hakim, A., et al. WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms. BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).
  15. Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).
  16. Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).
  17. CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: http://www.cellprofiler.org (2021).
  18. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  19. Schulenburg, H., Ewbank, J. J. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).
  20. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  21. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).
  23. Shinn-Thomas, J. H. Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth. BMC Research Notes. 12 (1), (2019).
  24. Alexander-Floyd, J., et al. Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans. BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).
  25. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  26. Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. False positives in the early stages of drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).

Tags

Biologi utgåva 176 C. elegans proteostas polyglutamin aggregering
Automatisera aggregatkvantifiering i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., … More

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., Walker, A. C., Pagolu, C. N., Enslow, S. M., Czyż, D. M. Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (176), e62997, doi:10.3791/62997 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter