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Biology

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में कुल मात्रा का ठहराव स्वचालित करना

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62997
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering, University of Florida

Summary

निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रोटियोस्टेसिस में परिवर्तन के आकलन के रूप में पॉलीग्लूटामाइन समुच्चय को मापने के लिए कृमि संवर्धन, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और स्वचालित छवि प्रसंस्करण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो के विकास और अनुकूलन का वर्णन करता है।

Abstract

न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोटीन विरूपण रोगों (पीसीडी) के प्रसार में वृद्धि ने वर्षों से इस विषय में बहुत रुचि को बढ़ावा दिया है। इस बढ़े हुए ध्यान ने पीसीडी के साथ मनुष्यों में देखे गए रोग फेनोटाइप को पुन: पेश करने में सक्षम पशु मॉडल के विविधीकरण और सुधार का आह्वान किया है। यद्यपि म्यूरिन मॉडल अमूल्य साबित हुए हैं, वे महंगे हैं और श्रमसाध्य, कम-थ्रूपुट विधियों से जुड़े हैं। पीसीडी का अध्ययन करने के लिए कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस नेमाटोड मॉडल का उपयोग रखरखाव की सापेक्ष आसानी, कम लागत और तेजी से पीढ़ी के समय से उचित ठहराया गया है, जो उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, सी एलिगेंस और मानव जीनोम के बीच उच्च संरक्षण इस मॉडल को एक अमूल्य खोज उपकरण बनाता है। सूत्रकृमि जो फ्लोरोसेंटली टैग किए गए ऊतक-विशिष्ट पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) ट्रैक्ट्स को व्यक्त करते हैं, फ्लोरोसेंट फोकी की विशेषता उम्र- और पॉलीक्यू लंबाई-निर्भर एकत्रीकरण प्रदर्शित करते हैं। ऐसे पत्रकारों को अक्सर ऊतकों में प्रोटियोस्टेसिस में परिवर्तन की निगरानी के लिए प्रॉक्सी के रूप में नियोजित किया जाता है। मैनुअल कुल मात्रा का ठहराव समय लेने वाली है, प्रयोगात्मक थ्रूपुट को सीमित करती है। इसके अलावा, मैनुअल फोकी परिमाणीकरण पूर्वाग्रह का परिचय दे सकता है, क्योंकि कुल पहचान अत्यधिक व्यक्तिपरक हो सकती है। इसमें, कृमि संवर्धन, छवि अधिग्रहण और डेटा प्रोसेसिंग से युक्त एक प्रोटोकॉल को आंत-विशिष्ट पॉलीक्यू व्यक्त करने वाले सी एलिगेंस का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट कुल मात्रा का ठहराव का समर्थन करने के लिए मानकीकृत किया गया था। सेलप्रोफाइलर, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सी एलिगेंस-आधारित छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन को लागू करके, इस विधि को अलग-अलग कीड़े को अलग करने और पहचानने और उनके संबंधित समुच्चय की गणना करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यद्यपि स्वचालन की अवधारणा पूरी तरह से अद्वितीय नहीं है, प्रजनन क्षमता के लिए ऐसी प्रक्रियाओं को मानकीकृत करने, मैनुअल गिनती से पूर्वाग्रह का उन्मूलन और थ्रूपुट बढ़ाने की आवश्यकता अधिक है। यह अनुमान लगाया जाता है कि ये विधियां सी एलिगेंस मॉडल का उपयोग करके बड़े जीवाणु, जीनोमिक या दवा पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग प्रक्रिया को काफी सरल बना सकती हैं।

Introduction

अल्जाइमर, पार्किंसंस और हंटिंगटन रोगों, या एमियोट्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस जैसे आयु-निर्भर न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोटीन विरूपण रोग (पीसीडी) प्रोटीन मिसफोल्डिंग की विशेषता है जो एकत्रीकरण, कोशिका मृत्यु और ऊतक अध: पतन की ओर जाता है1. जबकि प्रोटीन मिसफोल्डिंग को अपराधी के रूप में पहचाना जाता है, इन बीमारियों का एटियलजि स्पष्ट नहीं है। इस प्रकार, प्रभावी उपचारों के विकास को उन कारकों और स्थितियों के बारे में ज्ञान की कमी से बाधित किया गया है जो रोग की शुरुआत और प्रगति में योगदान करते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि माइक्रोबायोम में परिवर्तन पीसीडी 2,3,4 की शुरुआत, प्रगति और गंभीरता को प्रभावित करते हैं। हालांकि, मानव, या यहां तक कि म्यूरिन, माइक्रोबायोम की जटिलता उन अध्ययनों का संचालन करना मुश्किल बनाती है जो उनके मेजबान पर रोगाणुओं के सटीक प्रभाव को प्रकट करेंगे। इसलिए, सरल जीव, जैसे कि कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस, अक्सर खोज उपकरण 5,6,7,8 के रूप में उपयोग किए जाते हैं। हाल के अध्ययनों ने मेजबान प्रोटियोस्टेसिस और रोग रोगजनन 9,10 पर बैक्टीरिया के प्रभाव की जांच करनेके लिए सी एलिगेंस को नियोजित किया है। बैक्टीरियल उपनिवेशण, हार्मेसिस और जीनोमिक परिवर्तन अनुकरणीय स्थितियों में से हैं जो पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू)ट्रैक्ट 9,11,12 के एकत्रीकरण को प्रभावित करते हैं। इसके अतिरिक्त, ये मिसफोल्डेड प्रोटीन क्लस्टर मेजबान के भीतर पॉलीक्यू लंबाई- और आयु-निर्भर संचय प्रदर्शित करते हैं और बिगड़ा हुआ गतिशीलता 9,13 से जुड़े होते हैं। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पंक्टा को मापने का अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण प्रोटीन तह और एकत्रीकरण को प्रभावित करने वाली स्थितियों, कारकों या दवाओं पर महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न कर सकता है।

यद्यपि फ्लोरोसेंट पंक्टा का परिमाणीकरण एक विश्वसनीय और अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया साबित हुई है, चुनौती एक प्रोटोकॉल विकसित करना है जो प्रोटीन एकत्रीकरण को प्रभावित करने वाले यौगिकों, बैक्टीरिया या स्थितियों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करेगा। स्वचालित सी एलिगेंस छवि प्रसंस्करण और पंक्टा परिमाणीकरण की अवधारणा पूरी तरह से उपन्यास नहीं है, क्योंकि कई व्यावहारिक समर्थन उपकरण14,15 विकसित किए गए हैं। हालांकि, संवर्धन, छवि अधिग्रहण और एक प्रसंस्करण पाइपलाइन का एकीकरण परिणामों में परिवर्तनशीलता को समाप्त करने और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन की अनुमति देने में आवश्यक है।

इस प्रकार, इस पांडुलिपि का इरादा प्रोटियोस्टेसिस में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रॉक्सी के रूप में सी एलिगेंस में पॉलीक्यू एकत्रीकरण को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को मानकीकृत करना है। यह कार्य सेलप्रोफ़ाइलर को नियोजित करके पूरा किया गया था, एक ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ़्टवेयर16 स्वचालित कृमि और कुल पहचान में सक्षम है, और कीड़े को संवर्धन, छवियों को प्राप्त करने और डेटा को संसाधित करने के लिए एक बड़े प्रोटोकॉल में एकीकृत है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं ने सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन किया जिनकी समीक्षा की गई और फ्लोरिडा विश्वविद्यालय की संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। जैविक सुरक्षा स्तर-2 जीवाणुओं के संपर्क में आने के जोखिम को कम करने के लिए समुचित जैव सुरक्षा उपाय किए गए थे।

नोट: सभी प्रयोगों के लिए, सी एलिगेंस को एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 के साथ वरीयता प्राप्त नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर प्रचारित और बनाए रखा जाना चाहिए।

1. 10 सेमी एनजीएम प्लेटों की तैयारी

  1. एनएसीएल के 3 ग्राम, ट्रिप्टिकेस-पेप्टोन के 2.5 ग्राम, और 17 ग्राम अगर को 2 एल फ्लास्क में मिलाएं, और डबल आसुत जल (डीडीएच2ओ) के साथ 1 एल भरें। ऑटोक्लेविंग से पहले चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस और 21 साई के दबाव पर 45 मिनट के लिए मिश्रण को आटोक्लेव करें। पानी के स्नान में मिश्रण को 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  3. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करते हुए, निम्नलिखित बाँझ समाधान जोड़ें: 1 एम सीएसीएल2 · 2 एच2ओ, 1 एमजीएसओ के 1 एमएल4 · एमएल कोलेस्ट्रॉलका1 एमएल 100% इथेनॉल (कमरे के तापमान पर गर्म), और 1 एम केएच 2 पीओ4 (पीएच = 6.0) के25एमएल में भंग हो गया। एक चुंबकीय हलचल प्लेट का उपयोग करके मिलाएं। मिश्रण 700 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए किया जा सकता है।
  4. तब तक डालें जब तक मिश्रण पूरी 10 सेमी प्लेट को भर न दे। वैकल्पिक रूप से, प्रति प्लेट मिश्रण के लगभग 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक स्नातक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
  5. प्लेटों को बैक्टीरिया के साथ बोने से पहले कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए सूखने दें या सूखने के बाद सादे प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सभी मीडिया घटकों सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग कर संभाला जाता है। चरण 1.3-1.4 एक लामिना प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।

2. 24-अच्छी तरह से प्लेटों में एफयूडीआर के साथ एनजीएम अगर की तैयारी

  1. 1.1-1.3 चरणों का पालन करें।
  2. 5-फ्लोरो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) के साथ एनजीएम को पूरक करें और 100 μg / एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मिश्रण करें।
    नोट: एफयूडीआर डीएनए प्रतिकृति को रोकता है और परिणामस्वरूप, जर्मलाइन और भ्रूणजनन को लक्षित करके सी एलिगेंस प्रजनन को अवरुद्ध करता है, अंततः जीवनकाल को प्रभावित करता है। इसलिए, एफयूडीआर युक्त प्लेटों पर स्थानांतरित करने से पहले कीड़े को युवा वयस्कों में पूरी तरह से विकसित करने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है।
    सावधानी: एफयूडीआर विषाक्त है और निर्माता की सुरक्षा डेटा शीट के अनुसार संभाला जाना चाहिए।
  3. एक पिपेट बंदूक का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में एनजीएम-एफयूडीआर के 1 एमएल वितरित करें।
    नोट: इस प्रक्रिया को एक स्वचालित प्लेट डालने की प्रणाली के उपयोग से सुविधाजनक बनाया जा सकता है।
  4. बैक्टीरिया के साथ बोने या 4 डिग्री सेल्सियस पर सादे प्लेटों को संग्रहीत करने से पहले कमरे के तापमान पर प्लेट को 24 घंटे तक सूखने दें।

3. प्लेटों की बीजारोपण: ओपी 50 और अतिरिक्त परीक्षण बैक्टीरिया

  1. कोलाई ओपी 50 संस्कृति तैयार करने के लिए, जमे हुए स्टॉक से बैक्टीरिया विभाज्य के 200 μL को 500 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में जोड़ें जिसमें 250 मिलीलीटर ताजा, बाँझ लूरिया शोरबा (एलबी) होता है।
    नोट: मीडिया की मात्रा प्लेटों की संख्या पर निर्भर करती है जिन्हें वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। अन्य जीवाणु संस्कृतियों को तैयार करने के लिए, बाँझ माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक से बैक्टीरिया के साथ 5 मिलीलीटर विकास माध्यम युक्त 16-एमएल संस्कृति ट्यूब को टीका लगाएं।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर सेते हैं, 220 आरपीएम (रोटेशन प्रति मिनट) पर मिलाते हुए।
    नोट: मीडिया की कम से कम दो बार काम करने की मात्रा के साथ निष्फल फ्लास्क का उपयोग करें और आटोक्लेव एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सील करें। सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके टीकाकरण चरण और जीवाणु वितरण करें।
  3. प्रत्येक 10 सेमी एनजीएम प्लेट के केंद्र पर रात भर ई कोलाई ओपी 50 संस्कृति के 1-2 एमएल वितरित करें। इस संस्कृति को एनजीएम प्लेट के चारों ओर फैलाने की आवश्यकता नहीं है।
  4. भंडारण से पहले प्लेटों को कमरे के तापमान पर सूखने दें।
    नोट: ढक्कन के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों को सुखाने की सुविधा के लिए एयरफ्लो के साथ एक हुड में रखा जा सकता है।

4. प्लेटों की संवर्धन और बीजारोपण: 24-अच्छी तरह से प्लेटें

  1. चरण 3.1-3.2 में पाए जाने वाले संवर्धन निर्देशों का पालन करते हुए वांछित जीवाणु उपभेदों की रातोंरात संस्कृति तैयार करें।
  2. एनजीएम अगर युक्त 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 200 μL स्थानांतरण। बैक्टीरिया की 200 μL मात्रा पूरे अगर क्षेत्र को कवर करेगी, यह सुनिश्चित करने के लिए भोजन की मात्रा को अधिकतम करेगी कि कीड़े बैक्टीरिया लॉन से बचेंगे नहीं।
  3. सुखाने की सुविधा के लिए प्लेटों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में खुला छोड़ दें। अत्यधिक निर्जलीकरण को रोकने और यहां तक कि एयरफ्लो और सुखाने को बढ़ावा देने के लिए प्लेट अभिविन्यास को बदलने के लिए समय-समय पर प्लेटों की जांच करें। प्लेटों को 5 घंटे के भीतर सूखना चाहिए।
    नोट: जैविक सुरक्षा स्तर -2 बैक्टीरिया के साथ कोई भी काम प्रमाणित बीएससी में किया जाना चाहिए और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए।

5. आयु सिंक्रनाइज़ेशन

नोट: सभी चरणों को उचित सड़न रोकनेवाला तकनीकों (यानी, लौ के करीब या बीएससी के अंदर काम करना) का उपयोग करके किया जाना चाहिए।

  1. फिल्टर-निष्फल एम 9 समाधान का उपयोग करके 10 सेमी ओपी 50 प्लेटों से ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स धो लें (5.8 ग्राम ना2एचपीओ4 · 7 एच2ओ, केएच2पीओ4 के 3.0 ग्राम, एनएसीएल के 5 ग्राम, एमजीएसओ4 · 7 एच 2 ओ के0.25ग्राम, डीडीएच2ओ के 1 एल में)।
    1. बैक्टीरिया लॉन से कीड़े उठाने के लिए एक बाँझ ग्लास या प्लास्टिक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्लेट पर पिपेट एम 9 समाधान कई बार।
    2. कृमि निलंबन ले लीजिए और समाधान को 15 एमएल पॉलीस्टाइनिन शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 270 एक्स जी, कमरे के तापमान (आरटी, ~ 23 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्रित्र, 2 मिनट के लिए।
  3. एक वैक्यूम जाल फ्लास्क का उपयोग करके एस्पिरेट करें और सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें, जिससे कृमि गोली निर्बाध हो जाए।
    1. कीड़े धोने और दो बार चरण 5.2-5.3 दोहराने के लिए एम 9 के 5-10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. ट्यूब में 20% विरंजन समाधान के 5 एमएल (डीडीएच 2 ओ के8.25एमएल, 1 एम एनएओएच के 3.75 एमएल, गैर-कीटाणुनाशक ब्लीच के 3.0 एमएल) जोड़ें और कीड़े को भंग करने के लिए लगातार पलटें। कीड़े लगभग पूरी तरह से भंग होने के बाद अपकेंद्रित्र के लिए तैयार होते हैं।
    नोट: विरंजन समय और विरंजन समाधान की मात्रा नमूने के आकार पर निर्भर करेगी। ओवर और अंडर-ब्लीचिंग सामान्य त्रुटियां हैं। इस प्रकार, इस प्रक्रिया को आम तौर पर यह निर्धारित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है कि नमूना सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए कब तैयार है।
  5. 423 x g पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. अंडे की गोली को फिर से निलंबित करने के लिए बाँझ एम 9 के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. अंडे गोली करने के लिए 423 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। एक एस्पिरेटर फ्लास्क के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    2. चरण 5.6-5.6.1 दोहराएँ।
  7. बाँझ एम 9 के 5 मिलीलीटर में अंडे की गोली को फिर से निलंबित करें और इसे वांछित तापमान पर रात भर एक नटेटर पर रखें।
    नोट: आयु-सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा अगले दिन प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए तैयार होगा।

6. उम्र-सिंक्रनाइज़ेशन के बाद कीड़ा तैयारी

  1. आरटी (~ 23 डिग्री सेल्सियस) पर 3 मिनट के लिए 270 एक्स जी पर आयु-सिंक्रनाइज़ कीड़े अपकेंद्रित्र।
  2. एक स्वच्छ वातावरण में सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, जैसे कि प्रवाह हुड या बनसेन बर्नर के बगल में। सतह पर तैरनेवाला के लगभग 200 μL छोड़ दें और कीड़े को फिर से निलंबित करें।
  3. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, केंद्रित कृमि निलंबन को 10 सेमी एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें जिन्हें पहले ओपी 50 के साथ वरीयता दी गई है।
    नोट: प्रत्येक प्लेट भोजन से बाहर निकलने के बिना 1,500 कीड़े का समर्थन कर सकती है; हालांकि, इस एकाग्रता को बैक्टीरिया लॉन के घनत्व और विकास तापमान के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। कीड़े को भूख से बचाने के लिए कई प्लेटों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन प्लेटों में एफयूडीआर नहीं होना चाहिए।
  4. प्लेटों को सूखने दें; फिर उल्टा और 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: स्क्रीन की स्थिति के आधार पर, चरण 6.1 से कीड़े सीधे परीक्षण प्लेटों (बैक्टीरिया, ड्रग्स या परीक्षण यौगिकों युक्त) पर रखा जा सकता है। यदि वांछित परीक्षण की स्थिति विकास को प्रभावित करती है, तो कीड़े को ओपी 50 युक्त एनजीएम पर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए जब तक कि युवा वयस्कों (~ 48 घंटे) को परीक्षण स्थितियों के लिए उजागर करने से पहले।
  5. 48 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, बाँझ एम 9 समाधान के साथ प्लेटों से कीड़े धो लें और उन्हें शंक्वाकार ट्यूबों में रखें।
    नोट: वयस्क कीड़े ट्यूब के नीचे डूब जाएगा। सटीक समय 10 सेमी प्लेटों से बरामद कीड़े की संख्या के अनुसार अलग-अलग होगा। इन स्थितियों के तहत, कीड़े 10 मिनट के भीतर बस जाते हैं।
  6. बसने के समय की अवधि निर्धारित करने के लिए दृश्य निरीक्षण करें जैसे कि किसी भी अवशिष्ट अंडे या हैच किए गए लार्वा को हटा दिया जाता है।
  7. कृमि निकायों से अवशिष्ट बैक्टीरिया को कुल्ला करने के लिए एम 9 का एक अतिरिक्त 10 एमएल जोड़ें।
    1. 23 डिग्री सेल्सियस पर 270 x g पर 2-3 मिनट के लिए कीड़े अपकेंद्रित्र।
    2. धोने के चरण को अतिरिक्त 3 बार करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, अंतिम धोने के बाद ट्यूब में लगभग 1-1.5 एमएल एम 9 समाधान छोड़ दें।
    3. एक ग्लास स्लाइड पर कृमि निलंबन के 10 μL स्थानांतरण और कीड़े की संख्या गिनती।
    4. एम 9 के 10 μL प्रति लगभग 150 कीड़े के लिए कृमि घनत्व समायोजित करें। निलंबन में कीड़े की एकाग्रता को सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एम 9 समाधान को हटाने या जोड़कर समायोजित किया जा सकता है।
    5. पुष्टि करें कि वांछित एकाग्रता कई अलग-अलग बूंदों से औसत गिनती द्वारा स्थापित की गई है। कम से कम तीन बूंदों से औसत गिनती करने की सिफारिश की जाती है।
  8. सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करते हुए, परीक्षण प्लेट के प्रत्येक कुएं में लगभग 150 कीड़े युक्त कृमि निलंबन के 10 μL हस्तांतरण।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक में पर्याप्त संख्या में कीड़े हैं, माइक्रोस्कोप के तहत कुओं का निरीक्षण करें। इनक्यूबेशन से पहले अतिरिक्त कीड़े जोड़े जा सकते हैं।
  10. प्लेटों को लगभग 10 मिनट तक सूखने दें; और फिर उल्टा और 72 घंटे के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित।
    नोट: अंतिम इनक्यूबेशन अवधि प्रयोग की जरूरतों को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। 72 घंटे इनक्यूबेशन समय 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में 200 μL बैक्टीरिया पर खिलाने वाले 150 जानवरों के विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है।

7. इमेजिंग के लिए कीड़े तैयार करना

  1. अधिक प्रभावी निपटान की सुविधा और नमूना हानि को कम करने के लिए, तैराकी को रोकने के लिए धोने से पहले कीड़े को स्थिर करें।
    नोट: यदि कुछ नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, तो यह लेवामिसोल (100 μM) के संपर्क के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, यदि बड़ी संख्या में नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, तो कीड़े को ठंड से स्थिर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विस्तारित ठंड (18-24 घंटे) तैयारी के दौरान पॉलीक्यू समुच्चय के आगे के विकास को रोक देगा।
    1. 15-20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर बहु अच्छी तरह से प्लेटों प्लेस या जब तक कीड़े अब कदम नहीं है।
    2. फ्रीजर से नमूने निकालें और उन्हें 5 मिनट के लिए बैठने दें।
  2. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, एम 9 के 1 एमएल जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, ब्याज की एक अच्छी तरह से, प्रत्येक कुएं में कीड़े धोने के लिए प्लंजर को बार-बार दबाएं और दबाएं।
    नोट: कभी-कभी, कीड़े माइक्रोपिपेट युक्तियों से चिपक सकते हैं। जैसे, कीड़े के मिश्रण को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं के बीच विभिन्न युक्तियों का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. कृमि निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कीड़े को नीचे डूबने दें।
  4. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और त्यागें। नमूने को कुल तीन बार धोएं।
  5. अंतिम धोने के दौरान कीड़े नीचे तक बसने के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 500 μL की आकांक्षा करें, जिससे कीड़े को फिर से निलंबित करने के लिए 500 μL छोड़ दिया जाए।
  6. शेष कृमि निलंबन को एक नए फ्लैट-बॉटम 24-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे 48 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    नोट: ठंड कीड़े पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करता है और समुच्चय के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है।

8. इमेजिंग

  1. फ्रीजर से प्लेटों को निकालें और पिघलने दें, अतिरिक्त संक्षेपण को मिटा दें, और इमेजिंग से पहले ढक्कन को हटा दें।
    नोट: छवि कैप्चर का विवरण उपयोग किए गए उपकरण और सॉफ़्टवेयर के अनुसार अलग-अलग होगा। इस अनुभाग के लिए प्रोटोकॉल केवल एक गाइड के रूप में काम करना चाहिए, और संशोधनों की उम्मीद की जानी चाहिए। टिफ फ़ाइल प्रारूप में छवियों को कैप्चर करना भी आवश्यक है।
  2. छवि कैप्चर के दौरान, निम्नलिखित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें: एक्सपोजर समय, 500 एमएस; 0.63x कैमरा एडाप्टर (25.2x) के साथ 40x आवर्धन, जीएफपी तीव्रता 100% पर सेट है।
    नोट: विभिन्न माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन और सिस्टम परिणाम अनुभाग में प्रदान किए गए लोगों से अलग छवियों को प्राप्त कर सकते हैं। आवश्यक छवियों का अधिक सार्वभौमिक विवरण प्राप्त करने के लिए, छवियों के बारे में अधिक उद्देश्य विवरण प्रदान किए जाते हैं। समुच्चय व्यास में 1.0-10.0 पिक्सेल के बीच होना चाहिए जिसमें सेलप्रोफाइलर द्वारा ठीक से पहचाना जाना चाहिए 0.10-1.0 (मनमानी इकाइयां, स्केल 0-1) की फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ। इन कुल छवियों के लिए फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि आम तौर पर 0.10 दहलीज से नीचे है। ब्राइटफील्ड छवियों के लिए, कृमि तीव्रता 0.1-0.2 की पृष्ठभूमि तीव्रता के साथ 0.7-1.0 से होती है। ब्राइटफील्ड छवियों में कीड़े की औसत लंबाई सिर से पूंछ तक की लंबाई में 250 पिक्सेल से 350 पिक्सेल तक होती है।
  3. प्रेषित प्रकाश नियंत्रण समायोजित करें जब तक कि कीड़े अंधेरे पृष्ठभूमि की तुलना में उज्ज्वल रूप से प्रबुद्ध दिखाई न दें। ओवरएक्सपोजर से बचें; यह कीड़े के आकार को बढ़ाएगा।
  4. अत्यधिक क्लंपिंग को रोकने के लिए कुएं के भीतर कीड़े की स्थिति को बदलना आवश्यक हो सकता है। एक पिपेट टिप का उपयोग कर क्लंप्ड कीड़े फैलाएं।
  5. दोनों छवियों के लिए एक फोकल विमान स्थापित करने के लिए चैनल को जीएफपी पर सेट करें।
    नोट: यह आवश्यक है कि फोकल विमान जीएफपी चैनल में निर्धारित किया जाए। ब्राइटफील्ड छवियों को कैप्चर करते समय फोकस में किए गए किसी भी बदलाव के परिणामस्वरूप छवि विश्लेषण के दौरान समुच्चय और कीड़े का गलत संरेखण होगा।
  6. एक ब्राइटफील्ड छवि पर कब्जा करें और तुरंत प्लेट को परेशान किए बिना इसकी संबंधित फ्लोरोसेंट छवि लें।
  7. चरण 8.2 के बाद "नोट" के अनुसार छवि में वस्तुओं के लिए तीव्रता और आकार मान निर्धारित करने के लिए पाइपलाइन के माध्यम से परीक्षण छवियां चलाएं।
    नोट: सेलप्रोफ़ाइलर विश्लेषण से पहले वस्तुओं की तीव्रता और लंबाई के बारे में सभी आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकता है।
  8. छवियों का आकलन करने के लिए, सबसे पहले, सेलप्रोफ़ाइलर17 डाउनलोड करें। सॉफ़्टवेयर खोलें और छवियों बॉक्स में रुचि की छवियों को खींचें और छोड़ें।
  9. उन्हें खोलने के लिए फ़ाइल सूची में छवियों पर क्लिक करें।
  10. स्क्रीन के ऊपरी बाएं कोने में कई आइकन हैं; वस्तुओं के आकार को मापने या किसी विशिष्ट क्षेत्र को बढ़ाने के लिए उनका उपयोग करें। ब्याज के क्षेत्र को उजागर करने के लिए आवर्धक ग्लास का चयन करें।
  11. कीड़े और समुच्चय दोनों की लंबाई को मापने के लिए तीर आइकन का चयन करें।
  12. स्क्रीन के निचले हिस्से पर देखे जा सकने वाले अपने तीव्रता मूल्य को निर्धारित करने के लिए वांछित वस्तु पर होवर करें।
    नोट: चूंकि सभी छवियां ग्रेस्केल में ली गई हैं, इसलिए सभी लाल, नीले और हरे पिक्सेल मान समान होंगे।

9. छवि विश्लेषण

  1. सेलप्रोफ़ाइलर छवि विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करने के लिए, छवि जोड़े को ठीक से नाम दें। निम्नलिखित प्रारूप का उपयोग करें: P1_A01_S1_C1, जहां पी 1 विशिष्ट प्लेट और इसके संबंधित संख्यात्मक पदनाम को संदर्भित करता है; "ए", पंक्ति को संदर्भित करता है और कॉलम को "01"; "एस" एक एकल कुएं के लिए एक विशिष्ट छवि जोड़ी को संदर्भित करता है; "सी" चैनल को संदर्भित करता है, जहां "1" का उपयोग ब्राइटफील्ड छवियों को निरूपित करने के लिए किया जाता है और फ्लोरोसेंट छवियों के लिए "2" का उपयोग किया जाता है।
  2. आधिकारिक वेबसाइट17 से सेलप्रोफाइलर (संस्करण 4.1.3 या उच्चतर) डाउनलोड करें।
  3. पाइपलाइन डाउनलोड करें (पूरक फ़ाइल 1)। फ़ाइल से पाइपलाइन आयात > आयात > पाइपलाइन का चयन करके पाइपलाइन (पाइपलाइन) को सेलप्रोफ़ाइलर में अपलोड करें।
    नोट: मॉड्यूल 2 और 3 को अक्षम कर दिया गया है क्योंकि उन्हें अनावश्यक माना गया है। यदि छवि विश्लेषण संतोषजनक पृथक्करण और कीड़े की पहचान नहीं करता है तो उनके कार्य को बहाल किया जा सकता है; हालाँकि, पाइपलाइन के संशोधन की आवश्यकता है।
  4. इन मॉड्यूल को शामिल करने के लिए, प्रत्येक मॉड्यूल के बाईं ओर स्थित बक्से का चयन करें। "कन्वर्टऑब्जेक्टस्टोइमेज" मॉड्यूल से आउटपुट छवि के लिए "अनटैंगलवॉर्म्स" मॉड्यूल के लिए इनपुट बाइनरी छवि का नाम बदलें।
  5. मॉड्यूल 2 से संबंधित प्रारंभिक उपयोग के दौरान एक त्रुटि संदेश प्रकट हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
  6. "अनटैंगलवॉर्म्स" मॉड्यूल में कीड़े की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक प्रशिक्षण सेट अपलोड करें। यह प्रशिक्षण सेट पूरक फ़ाइल 2 में पाया जा सकता है।
    1. इसकी सेटिंग्स खोलने के लिए अनटैंगलवॉर्म मॉड्यूल का चयन करें।
    2. प्रशिक्षण सेट फ़ाइल नाम की पहचान करें और अपलोड फ़ाइल आइकन का चयन करें।
    3. पूरक फ़ाइल 2 (प्रशिक्षण सेट) अपलोड करें।
  7. ऊपरी बाएं कोने में छवियों मॉड्यूल का चयन करके छवियों को अपलोड करें। चरण 9.1 में वर्णित के रूप में ठीक से नामित छवियों को खींचें और छोड़ें।
  8. छवियों का विश्लेषण करने से पहले, वांछित आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें जिसका उपयोग परिणामों को संग्रहीत करने के लिए किया जाएगा।
    1. प्रोग्राम के निचले बाएं कोने के पास स्थित आउटपुट सेटिंग्स बटन पर क्लिक करें।
    2. वांछित आउटपुट स्थान चुनने के लिए डिफ़ॉल्ट आउटपुट के दाईं ओर फ़ोल्डर आइकन का चयन करें।
  9. छवि विश्लेषण शुरू करने के लिए छवियों का विश्लेषण करें आइकन का चयन करें।
  10. यदि विश्लेषण को पूरा करने में बहुत लंबा समय लगता है और एक ही छवि को संसाधित करने में अटक जाता है, तो यह छवि अधिग्रहण के मुद्दों के कारण होने की संभावना है। यदि ऐसा होता है, तो रन को निरस्त करें और आउटपुट फ़ोल्डर के माध्यम से सॉर्ट करके असंसाधित छवि (ओं) की पहचान करने के लिए आगे बढ़ें और यह देखते हुए कि कौन से छवि नाम नहीं मिले हैं।
    नोट: छवियों को पाइपलाइन द्वारा संसाधित नहीं किया जा सकता है जो बड़ी या तीव्रता से जलाया कलाकृतियों को हटाने के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है। कुछ मामलों में, ऐसी छवियों को विश्लेषण से बाहर रखने की आवश्यकता हो सकती है।
  11. पूर्ण विश्लेषण के बाद, सॉफ़्टवेयर परिणामों को एक एक्सेल स्प्रेडशीट में व्यवस्थित करेगा जिसमें व्यक्तिगत कीड़े (कॉलम एन) और उनके संबंधित समुच्चय (कॉलम के) शामिल हैं।
    नोट: एक सफल रन प्रत्येक कुएं के लिए प्रति पहचाने गए कीड़े समुच्चय की संख्या युक्त एक एक्सेल स्प्रेडशीट का उत्पादन करेगा। इन आंकड़ों को प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित तरीके से हेरफेर किया जा सकता है।
  12. सेलप्रोफ़ाइलर से आउटपुट सीएसवी फ़ाइल से डेटा को आसानी से व्यवस्थित करने के लिए पूरक फ़ाइल 3 (विंडोज) या पूरक फ़ाइल 4 (मैक) से मेटाडेटा आयोजक (ग्राफिकल यूजर इंटरफेस) डाउनलोड करें।
    नोट: इस सॉफ़्टवेयर के पास आधिकारिक लाइसेंस नहीं है और डाउनलोड करने के बाद स्वचालित रूप से नहीं खोला जाएगा।
  13. विंडोज ओएस 64-बिट का उपयोग करते समय 9.14-9.17 चरणों का पालन करें। सॉफ्टवेयर विंडोज 32-बिट पर काम नहीं करेगा। मैक ओएस का उपयोग करते समय चरण 9.18-9.20 का पालन करें चरण 9.21-9.22 दोनों ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए समान हैं।
  14. विंडोज ओएस के लिए, डाउनलोड की गई फ़ाइल का पता लगाएं और इसे वांछित स्थान पर निकालें।
  15. gui_windowsOS_64x नामित निकाले गए फ़ोल्डर का पता लगाएं और खोलें और "जीयूआई" एप्लिकेशन आइकन पर क्लिक करके एप्लिकेशन लॉन्च करें।
  16. एक प्रॉम्प्ट चलाने की अनुमति का अनुरोध करते हुए खोल सकता है। अधिक जानकारी का चयन करें और फिर वैसे भी विश्वास करें क्लिक करें.
  17. मेटाडेटा आयोजक सेलप्रोफाइलर आउटपुट सीएसवी फ़ाइलों को खींचने और छोड़ने के लिए तैयार है। चरण 9.21 पर जारी रखें।
  18. मैक ओएस के लिए, डाउनलोड की गई फ़ाइल का पता लगाएं और gui_macOS_64x.zip खोलें। यह चरण स्वचालित रूप से सभी फ़ाइलों को निकालना चाहिए।
  19. "डाउनलोड" में पाए गए निकाले गए फ़ोल्डर को खोलें।
  20. "जीयूआई" एप्लिकेशन पर राइट-क्लिक करें और ओपन का चयन करें। एक प्रॉम्प्ट आधिकारिक लाइसेंस की कमी के कारण खोलने की अनुमति मांगते हुए दिखाई देगा। खोलें का चयन करें और चरण 9.21 के लिए जारी रखें।
  21. यहां अपनी फ़ाइलें अपलोड करें पर क्लिक करें या वांछित सेलप्रोफाइलर सीएसवी फ़ाइलों को खींचें और छोड़ दें।
  22. व्यवस्थित करें बटन पर क्लिक करें, जो उपयोगकर्ता को डाउनलोड फ़ाइलें बटन के साथ एक नई स्क्रीन पर लाएगा। बटन पर क्लिक करें और आउटपुट फ़ाइल को सहेजने के लिए वांछित स्थान का चयन करें। आउटपुट फ़ाइल फ़ाइल नाम में जोड़े गए "_organized" एक्सटेंशन के साथ मूल फ़ाइल नाम के रूप में दिखाई देगी।

Representative Results

एलिगेंस वर्कफ़्लो जिसमें संवर्धन, छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रोटोकॉल शामिल हैं जो संवर्धन और इमेजिंग प्लेटफॉर्म (चित्रा 1) के रूप में 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप का उपयोग करके विभिन्न बैक्टीरिया की उपस्थिति में पॉलीक्यू एकत्रीकरण के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल को मेजबान प्रोटियोस्टेसिस पर बैक्टीरिया, विशिष्ट स्थितियों, छोटे अणुओं, दवाओं या जीनोमिक जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। वर्णित विधि को कीड़े का उपयोग करके अनुकूलित किया गया है जो आंतों के पॉलीक्यू को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वीएचए 6पी: :p ओलीक्यू 44:: वाईएफपी) से जुड़े हुए व्यक्त करते हैं; हालाँकि, मांसपेशियों या न्यूरॉन्स में प्रोटियोस्टेसिस पर रिपोर्ट करने वाले अन्य मॉडलों का उपयोग आगे के अनुकूलन के साथ भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक प्रयोग मांसपेशियों के पॉलीक्यू (पूरक चित्रा 1) जैसे अन्य ऊतकों में प्रोटीन समुच्चय की मात्रा का ठहराव में इन विधियों के आवेदन का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, पाइपलाइन में संशोधन को कुल आकार और चमक के लिए ठीक से समायोजित करने की आवश्यकता होगी, जैसा कि धारा 8 नोट में उल्लेख किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: वर्कफ़्लो दृश्य प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों में पांच अलग-अलग चरण शामिल हैं: कृमि तैयारी और आयु-सिंक्रनाइज़ेशन (चरण 1-5), आंतों का उपनिवेशीकरण / कृमि उपचार (चरण 6), इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी (चरण 7), छवि अधिग्रहण (चरण 8), और छवि प्रसंस्करण (चरण 9)। प्रोटोकॉल के "अनुभाग" को आंकड़े में "चरण" के रूप में संदर्भित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रारंभिक अनुकूलन प्रयोगों ने बड़ी संख्या में संतानों के कारण भीड़भाड़ से जुड़ी विभिन्न कठिनाइयों का खुलासा किया, जिसके परिणामस्वरूप तेजी से भोजन की कमी हुई। धारा 2 में वर्णित एनजीएम प्लेटों में एफयूडीआर के पूरक ने इस समस्या को हल किया (चित्रा 2)। इसके अतिरिक्त, एफयूडीआर की उपस्थिति में, विभिन्न बैक्टीरिया को खिलाए गए कीड़े में अधिक सुसंगत शरीर का आकार था, जिसने अधिक समान और सटीक कृमि का पता लगाने की अनुमति दी।

Figure 2
चित्रा 2: एफयूडीआर का उपयोग संतान को कम करके छवि की गुणवत्ता में सुधार करता है। एफयूडीआर-पूरक प्लेटें ई कोलाई ओपी 50 के साथ वरीयता प्राप्त गैर-एफयूडीआर नियंत्रण एनजीएम प्लेटों पर उगाए गए कीड़े की तुलना में सी एलिगेंस संतान को खत्म करती हैं। छवियों को 25.2x आवर्धन (0.63x कैमरा एडाप्टर के साथ 40x आवर्धन) पर अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ने पॉलीक्यू समुच्चय के झूठे सकारात्मक पता लगाने में योगदान दिया। आंतों के मार्ग में इस तरह के प्रतिदीप्ति संकेत को कम करने और समुच्चय के स्वचालित पता लगाने में सुधार करने के लिए, इमेजिंग से पहले कीड़े को फ्रीज करना आवश्यक था। 18-48 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंड कीड़े पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 ए) को खत्म करके पॉलीक्यू कुल पता लगाने में काफी सुधार हुआ। मानव आंख समुच्चय और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने में सक्षम है; इसलिए फ्रीज से पहले और बाद में मैनुअल गिनती समान है (चित्रा 3 बी)। हालांकि, स्वचालित गिनती उतनी सटीक नहीं है, लेकिन मैन्युअल गिनती (चित्रा 3 बी) की तुलना में सटीकता के साथ स्वचालित गिनती में काफी सुधार हुआ है।

Figure 3
चित्रा 3: ठंड कुल पहचान में सुधार करती है (ए) ठंड से पहले और बाद में आंतों के पॉलीक्यू 44:: वाईएफपी व्यक्त करने वाले सी एलिगेंस की फ्लोरोसेंट छवियां। आवेषण चयनित क्षेत्र की क्लोज-अप छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार = 500 μm. (B) मैनुअल या स्वचालित (पाइपलाइन) कुल मात्रा का ठहराव का उपयोग करके ठंड से पहले और बाद में पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 के साथ उपनिवेशित कीड़े में प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या। डेटा दो जैविक प्रतिकृतियों (एन = 60-109) का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के टी-टेस्ट (** पी < 0.0001) का उपयोग करके की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उल्टे ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग पूरे सी एलिगेंस (चित्रा 4 ए) और जीएफपी चैनल को पॉलीक्यू 44:: वाईएफपी समुच्चय (चित्रा 4 बी) की छवि का पता लगाने के लिए किया गया था। प्रत्येक कीड़े के लिए कृमि का पता लगाने, डिटैंगलिंग और कुल मात्रा का ठहराव एक अनुकूलित सेलप्रोफाइलर छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन (पूरक फ़ाइल 1) को लागू करके किया गया था, जो व्यक्तिगत कृमि (चित्रा 4 सी-डी) प्रति समुच्चय की संख्या प्राप्त करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता और स्वचालित कुल पहचान और मात्रा का ठहराव की सटीकता का परीक्षण करने के लिए, आंत-विशिष्ट पॉलीक्यू 44 :: वाईएफपी व्यक्त करने वाले कीड़े सुसंस्कृत थे और स्थापित प्रोटोकॉल (अनुभाग 1-7) के अनुसार इमेजिंग के लिए तैयार किए गए थे। प्रति कीड़ा समुच्चय की संख्या का मूल्यांकन स्वचालित पाइपलाइन (धारा 8-9) या मैनुअल गिनती का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक प्रयोग प्रति स्थिति 90-571 कीड़े का उपयोग करके तीन स्वतंत्र परीक्षणों में किया गया था। जबकि दो परीक्षणों के साथ प्राप्त प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, तीसरे परीक्षण में कीड़े में स्वचालित दृष्टिकोण (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किए जाने पर काफी कम समुच्चय थे। तीन परीक्षणों से समुच्चय की औसत संख्या के परिणामस्वरूप थोड़ा, लेकिन काफी कम समुच्चय जब मात्रा का ठहराव सेलप्रोफाइलर पाइपलाइन (अनुभाग 8-9) (चित्रा 5 बी) का उपयोग करके किया गया था। बहरहाल, दो दृष्टिकोणों के बीच का अंतर न्यूनतम था, यह दर्शाता है कि स्वचालित विधि को बड़े पैमाने पर स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: सेलप्रोफाइलर का उपयोग करके कुल पहचान( ए) ब्राइटफील्ड छवि कृमि निकायों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाती है। (बी) जीएफपी चैनल का उपयोग करके अधिग्रहित मूल फ्लोरोसेंट छवि और आंतों के पॉलीक्यू 44:: वाईएफपी समुच्चय की कुल संख्या की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। (सी) सेलप्रोफ़ाइलर का उपयोग करके पहचाने गए समुच्चय। (डी) कीड़े और कुल रूपरेखा के साथ मूल फ्लोरोसेंट छवि पर लगाए गए पहचाने गए समुच्चय की कुल संख्या। छवि कैप्चर और प्रसंस्करण अनुभाग 8-9 में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके किया गया था। पैनल ई-एच छवियों ए-डी में संबंधित उल्लिखित क्षेत्रों की क्लोज-अप छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। छवियों को 25.2x आवर्धन (0.63x कैमरा एडाप्टर के साथ 40x आवर्धन) पर अधिग्रहित किया गया था। स्केल सलाखों = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित कुल मात्रा का ठहराव की प्रभावकारिता। (ए) मैनुअल गिनती (मैनुअल) और स्वचालित सेलप्रोफाइलर-आधारित मात्रा का ठहराव (पाइपलाइन) का उपयोग करके नियंत्रण ई कोलाई ओपी 50 के साथ उपनिवेशित कीड़े में प्रति आंत औसत कुल संख्या। परिणाम तीन अलग-अलग परीक्षणों (टी 1-टी 3) (एन = 90-571) में विश्लेषण किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या मैनुअल या स्वचालित (पाइपलाइन) कुल मात्रा का ठहराव का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के टी-टेस्ट (* पी < 0.05, ** पी < 0.01) का उपयोग करके की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विभिन्न प्रयोगकर्ताओं के बीच परिणामों की प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, कीड़े के छह कुओं वाली प्लेट से छवियां जिन्हें स्यूडोमोनास एरुगिनोसा एमपीएओ 1 या एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 खिलाया गया था, तीन व्यक्तियों द्वारा अधिग्रहित किया गया था, जिनमें से दो को इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके इमेजिंग कीड़े का कोई पूर्व अनुभव नहीं था। प्रत्येक कुएं से एकत्र की गई छवियों में 30-115 के बीच कहीं भी कीड़े पाए गए थे। एकत्रीकरण में एक गैर-महत्वपूर्ण अंतर उन्हीं कुओं से कीड़े में पाया गया था जिन्हें तीन प्रयोगकर्ताओं द्वारा चित्रित किया गया था। जबकि प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या एमपीएओ 1 और ओपी 50 खिलाए गए कीड़े के लिए तीन प्रयोगकर्ताओं के बीच बहुत सुसंगत रही, समुच्चय की औसत संख्या में कुछ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर थे, लेकिन केवल एमपीएओ 1 (पूरक चित्रा 2) द्वारा उपनिवेशित कीड़े में। ये परिणाम अनुभवहीन प्रयोगकर्ताओं के बीच भी परिणामों की प्रजनन क्षमता को उजागर करते हैं।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि कुल मात्रा का ठहराव की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की क्षमता कृमि की स्थिति से काफी प्रभावित नहीं है, 15 कीड़े का एक सेट चुना गया था और एक विंदुक टिप का उपयोग करके प्रत्येक छवि कैप्चर के बीच आंदोलन के बाद 15 अलग-अलग बार इमेज किया गया था। ई कोलाई ओपी 50 और पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 के साथ खिलाए गए कीड़े में समुच्चय की छवियों को सेलप्रोफाइलर का उपयोग करके एकत्र और विश्लेषण किया गया था। छवियों के इन विभिन्न सेटों में से प्रत्येक से समुच्चय की औसत संख्या थोड़ी लेकिन गैर-काफी अलग थी, आगे इस दृष्टिकोण (पूरक चित्रा 3) की प्रजनन क्षमता का समर्थन करती है।

ग्राम-नकारात्मक आंत्र रोगजनकों के साथ सी एलिगेंस आंत का उपनिवेशीकरण ऊतकों में प्रोटियोस्टेसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें पी एरुगिनोसा पॉलीक्यू एकत्रीकरण9 के सबसे शक्तिशाली प्रेरकों में से एक है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये अनुकूलित प्रोटोकॉल एकत्रीकरण के पी एरुगिनोसा-मध्यस्थता वृद्धि का सफलतापूर्वक पता लगाएंगे और मात्रा निर्धारित करेंगे, आंतों के पॉलीक्यू को व्यक्त करने वाले कीड़े ई कोलाई ओपी 50 (नियंत्रण बैक्टीरिया) के साथ उपनिवेशित किए गए थे, और पी। अधिग्रहित छवियों का विश्लेषण सेलप्रोफाइलर (धारा 9, पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके किया गया था। स्वचालित मात्रा का ठहराव के परिणाम पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 द्वारा प्रेरित समुच्चय की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप लगातार नियंत्रण ई कोलाई ओपी 50 (चित्रा 6) के साथ खिलाए गए कीड़े की तुलना में दो गुना वृद्धि होती है।

Figure 6
चित्रा 6: नियंत्रण ई कोलाई ओपी 50 और पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 के साथ उपनिवेशित कीड़े में प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या। प्रति आंत समुच्चय की संख्या का मूल्यांकन सेलप्रोफाइलर (धारा 8-9) का उपयोग करके किया गया था। डेटा को ओपी 50 (एन = 1068) और एमपीएओ 1 (एन = 1557) के साथ उपनिवेशित कीड़े में प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या के रूप में दर्शाया जाता है। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के टी-टेस्ट (** पी < 0.0001) का उपयोग करके की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुकूलित पाइपलाइन को प्रोटियोस्टेसिस को प्रभावित करने वाली स्थितियों के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। मेजबान प्रोटियोस्टेसिस पर उनके प्रभाव के लिए बैक्टीरिया के बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग में इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, यहां वर्णित पाइपलाइन को पॉलीक्यू एकत्रीकरण 18 पर 90 पी एरुगिनोसा गैर-आवश्यक जीन नॉक-आउट उत्परिवर्ती उपभेदों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया गया था (खंड1-9)। यह पायलट स्क्रीन मेजबान प्रोटियोस्टेसिस को प्रभावित करने की उनकी क्षमता के लिए सभी पी एरुगिनोसा गैर-आवश्यक उत्परिवर्ती उपभेदों को स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन की गई एक बड़ी परियोजना का हिस्सा है। परीक्षण किए गए 90 जीवाणु उपभेदों में से, एक उम्मीदवार के साथ सी एलिगेंस आंत के उपनिवेशीकरण ने समुच्चय (चित्रा 7) की संख्या में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। इस परख की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए अनुवर्ती प्रयोगों को छह पी एरुगिनोसा म्यूटेंट के यादृच्छिक चयन से मैनुअल कुल गिनती के माध्यम से किया गया था जो एमपीएओ 1 नियंत्रण से गैर-महत्वपूर्ण रूप से भिन्न था। इन प्रयोगों को अधिक पारंपरिक 6 सेमी एनजीएम प्लेटों का उपयोग करके किया गया था, पहले सेस्थापित विधियों को पुन: प्रस्तुत करने के लिए एल 1 के रूप में परीक्षण उपभेदों पर कीड़े स्थानांतरित करना। मैनुअल गिनती द्वारा पुष्टि प्रयोगों से पता चला है कि म्यूटेंट में से कोई भी, जिसमें समुच्चय (चित्रा 7) की संख्या में काफी कमी आई है, पॉलीक्यू एकत्रीकरण (पूरक चित्रा 4) प्रभावित हुआ है। इसके अलावा, चयनित उम्मीदवारों की मैनुअल गिनती के बीच 90 उत्परिवर्ती उपभेदों की स्क्रीन में देखे गए एकत्रीकरण में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता नहीं लगाया गया था, यह दर्शाता है कि जैविक और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के कारण ऐसे परिवर्तन उत्पन्न हो सकते हैं, जैसे कि कम एन मान। सामूहिक रूप से, परिणाम इंगित करते हैं कि जबकि हमारी विधि मज़बूती से महत्वपूर्ण परिवर्तन उठा सकती है, सूक्ष्म लोगों को याद किया जाएगा, और सभी संभावित उम्मीदवारों को व्यक्तिगत रूप से पुष्टि करनी होगी।

Figure 7
चित्रा 7: 92 जीवाणु उपभेदों द्वारा उपनिवेशित कीड़े के प्रतिनिधि नमूना सेट में प्रति आंत समुच्चय की संख्या। डेटा को एमपीएओ 1 के साथ उपनिवेशित कीड़े के लिए सामान्यीकृत प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या के रूप में दर्शाया जाता है। बिंदीदार रेखाएं एमपीएओ 1 (शीर्ष, खुले सर्कल) और ओपी 50 नियंत्रण (नीचे, खुले वर्ग) के साथ उपनिवेशित कीड़े में समुच्चय की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करती हैं। ठोस प्रतीक पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 के 90 अलग-अलग नॉक-आउट उत्परिवर्ती उपभेदों का प्रतिनिधित्व करते हैं। एमपीएओ 1 और एक एकल उत्परिवर्ती के साथ उपनिवेशित कीड़े के बीच प्रति कीड़ा समुच्चय की औसत संख्या सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। ग्रे सर्कल मैन्युअल रूप से पुष्टि किए गए नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं (पूरक चित्रा 4)। सांख्यिकीय महत्व की गणना विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी, जिसके बाद कई तुलना डनेट के पोस्ट-हॉक टेस्ट (** पी < 0.01, **** पी < 0.0001) थे। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेलप्रोफ़ाइलर द्वारा उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा का प्रबंधन करने के लिए, डेटा प्रोसेसिंग और संगठन (चित्रा 8) को स्वचालित करने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) विकसित किया गया था। जीयूआई को एक ओपन-सोर्स पायथन क्रॉस-प्लेटफ़ॉर्म विजेट टूलकिट, टिंक्टर का उपयोग करके विकसित किया गया था। दिए गए मेटाडेटा से, एप्लिकेशन प्लेट में मौजूद प्रत्येक कुएं (कॉलम जे) से समुच्चय (कॉलम के) की संख्या निकालता है। उपरोक्त प्रक्रिया को पूरा करने के लिए "पांडा" नामक एक पायथन डेटा हैंडलिंग लाइब्रेरी का उपयोग किया गया था। जीयूआई एप्लिकेशन उपयोगकर्ताओं को डेटा फ़ाइलों को अपलोड करने के लिए ड्रैग-एंड-ड्रॉप समर्थन प्रदान करता है। प्रत्येक फ़ाइल में डेटा को दो-आयामी सारणीबद्ध संरचना के रूप में संग्रहीत किया जाता है जिसे डेटा फ्रेम कहा जाता है। डेटा फ्रेम के भीतर पाए जाने वाले प्रत्येक अद्वितीय कुएं के लिए एक खाली शब्दकोश जोड़ी शुरू की जाती है। अगला, प्रत्येक कुएं में पाए जाने वाले अलग-अलग समुच्चय को गिना जाता है और उनके संबंधित शब्दकोश जोड़े में जोड़ा जाता है। कम डेटा वाले कॉलम को खाली मूल्यवान स्ट्रिंग्स के साथ गद्देदार किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक कॉलम आकार में भी है। अंत में, संरचना को एक डेटा फ्रेम में परिवर्तित किया जाता है जिसे स्प्रेडशीट के रूप में उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट निर्देशिका में निर्यात किया जाता है।

Figure 8
चित्र 8: ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: मांसपेशियों-विशिष्ट पॉलीक्यू समुच्चय का पता लगाना। मांसपेशियों-विशिष्ट पॉलीक्यू 35 को व्यक्त करने वाले कीड़े:: वाईएफपी को एल 1 एस के रूप में चढ़ाया गया था और 48 घंटे के लिए ओपी 50 पर सुसंस्कृत किया गया था। एक बार कीड़े युवा वयस्कों में विकसित होने के बाद, उन्हें 24-अच्छी तरह से एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया, 100 μg / एमएल एफयूडीआर के साथ पूरक किया गया और इमेजिंग से पहले अतिरिक्त 72 घंटे के लिए एमपीएओ 1 के साथ वरीयता प्राप्त की गई। (ए) ब्राइटफील्ड छवि का उपयोग कृमि निकायों की पहचान करने के लिए किया जाता है। (बी) जीएफपी चैनल का उपयोग करके अधिग्रहित मूल फ्लोरोसेंट छवि। (सी) सेलप्रोफ़ाइलर का उपयोग करके पहचाने गए समुच्चय। (डी) कीड़े और कुल रूपरेखा के साथ मूल फ्लोरोसेंट छवि पर लगाए गए पहचाने गए समुच्चय की कुल संख्या। छवि कैप्चर और प्रसंस्करण अनुभाग 8-9 में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके किया गया था। पैनल ई-एच छवियों ए-डी में संबंधित उल्लिखित क्षेत्रों की क्लोज-अप छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल सलाखों = 500 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: विभिन्न प्रयोगकर्ताओं के बीच कुल मात्रा का ठहराव की प्रजनन क्षमता। एरुगिनोसा एमपीएओ 1 (ब्लैक बार) और नियंत्रण ई कोलाई ओपी 50 (ग्रे बार) के साथ उपनिवेशित कीड़े के छह कुओं के लिए सेलप्रोफाइलर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित समुच्चय की औसत संख्या। प्रत्येक कुएं को तीन प्रयोगकर्ताओं (एवीएस, डीएमसी, आरडीएच) द्वारा चित्रित किया गया था। डेटा को प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या के रूप में दर्शाया जाता है (एन = 30-115)। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक तरफा एनोवा का उपयोग करके की गई थी, जिसके बाद तुकी के कई तुलना परीक्षण (* पी < 0.05, ** पी < 0.01) थे। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: कुल मात्रा का ठहराव की प्रजनन क्षमता पर कृमि की स्थिति का प्रभाव। नियंत्रण ई कोलाई ओपी 50 (ग्रे बार) और पी एरुगिनोसा एमपीएओ 1 (ब्लैक बार) के साथ उपनिवेशित कीड़े में प्रति आंत औसत कुल संख्या। परिणाम सेलप्रोफाइलर का उपयोग करके प्रति आंत (15≥एन≥12) समुच्चय की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। कुओं के भीतर कीड़े की स्थिति प्रत्येक अधिग्रहण के बीच आंदोलन द्वारा बदल दी गई थी। किसी भी समूह में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। सांख्यिकीय महत्व की गणना टुकी के कई तुलना परीक्षण के बाद एक तरफा एनोवा का उपयोग करके की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: मैनुअल गिनती के साथ पायलट स्क्रीन की पुष्टि। प्रति आंत समुच्चय की औसत संख्या मैन्युअल रूप से निर्धारित की गई थी। डेटा जंगली प्रकार के एमपीएओ 1 और ओपी 50 नियंत्रण (एन = 30) की तुलना में छह एमपीएओ 1 नॉक-आउट म्यूटेंट (ग्रे सर्कल चित्रा 7) के साथ उपनिवेशित कीड़े के एकत्रीकरण प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक तरफा एनोवा का उपयोग करके की गई थी, जिसके बाद कई तुलना डनेट के पोस्ट-हॉक परीक्षण (**** पी < 0.0001) थे। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: आंतों के पॉलीक्यू एकत्रीकरण पर एफयूडीआर का प्रभाव। डेटा को पॉलीक्यू 44 की औसत संख्या के रूप में दर्शाया जाता है:: वाईएफपी प्रति आंत समुच्चय (एन = 20)। ई कोलाई ओपी 50 पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे की वृद्धि के बाद कीड़े को नियंत्रण (कोई एफयूडीआर) या एफयूडीआर युक्त प्लेटों (100 μg / एमएल) पर स्थानांतरित कर दिया गया था। मैनुअल गिनती एक अतिरिक्त 48 घंटे के बाद एकत्र किए गए थे। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के टी-टेस्ट (एनएस = महत्वपूर्ण नहीं) का उपयोग करके की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: प्रोटियोस्टेसिस पाइपलाइन। सेलप्रोफ़ाइलर में उपयोग के लिए डाउनलोड करने योग्य छवि विश्लेषण पाइपलाइन। आवेदन के लिए निर्देश धारा 9 में पाए जा सकते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: प्रशिक्षण सेट कीड़े को खोलना। फ़ाइल को "अनटैंगलवर्म" मॉड्यूल में अपलोड किया जाना है। यह विशेष प्रशिक्षण सेट प्रारंभिक दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले कीड़े के लिए विशिष्ट है। कृमि आकार और आकार में परिवर्तन पहचान की सटीकता और गुणवत्ता को बदल देगा। अधिक वैयक्तिकृत प्रशिक्षण फ़ाइल बनाना आवश्यक हो सकता है। एक नया प्रशिक्षण सेट बनाने के निर्देश आधिकारिक सेलप्रोफाइलर वेबसाइट17 पर पाए जा सकते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: विंडोज ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। gui_windowsOS_64x.zip. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: मैक ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। gui_MacOS_64x.zip. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल सी एलिगेंस संवर्धन, इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है जिसमें सेलप्रोफाइलर, एक ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर शामिल है। प्रतिनिधि परिणाम प्रजनन क्षमता, पूर्वाग्रह में कमी और मापनीयता प्रदर्शित करते हैं। यह मानकीकृत प्रक्रिया बड़े जीवाणु, जीनोमिक या दवा पुस्तकालयों के साथ नियोजित स्क्रीनिंग रणनीतियों में सुधार करेगी। जबकि ऑब्जेक्ट डिटेक्शन के अन्य स्वचालित सी एलिगेंस तरीके मौजूद हैं, वर्णित तकनीक एक मानकीकृत, उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन प्रदान करती है जो संवर्धन, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण को एकीकृत करती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए कृमि की खेती के कई रूपों का परीक्षण किया जाना था। प्रारंभ में, कीड़े को आयु-सिंक्रनाइज़ेशन (एल 1 चरण) के तुरंत बाद नमूना बैक्टीरिया में स्थानांतरित कर दिया गया था। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप चर आकार वाले कीड़े की आबादी हुई, यहां तक कि एक ही कुएं के भीतर कीड़े के बीच भी। एलिगेंस रोगज़नक़ परिहार19 के लिए जाने जाते हैं, जो आकार में देखी गई परिवर्तनशीलता में योगदान दे सकते हैं और अंततः विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम इमेजिंग-वर्म डिटेक्शन को प्रभावित कर सकते हैं। इस तरह की परिवर्तनशीलता को खत्म करने के लिए, प्रत्येक कुएं में पूरे एनजीएम क्षेत्र को परीक्षण बैक्टीरिया के साथ कवर किया गया था। कोलाई ओपी 50 खिलाया गया और 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए युवा वयस्कों में पूरी तरह से विकसित करने की अनुमति दी गई। परीक्षण बैक्टीरिया पर स्थानांतरित करने से पहले ई कोलाई ओपी 50 पर वयस्कता तक पहुंचने की अनुमति देने के परिणामस्वरूप शरीर का आकार अधिक सुसंगत हो गया। इसके अतिरिक्त, एफयूडीआर के साथ एनजीएम अगर को पूरक करके संतान द्वारा भीड़भाड़ और तेजी से भोजन की कमी को समाप्त कर दिया गया था। एफयूडीआर के कार्यान्वयन ने संतान को हटा दिया और स्वचालित कृमि पहचान को बढ़ाया, जिसे माता-पिता की आबादी के साथ संतान मिश्रण द्वारा अस्पष्ट किया गया था। हालांकि, एफयूडीआर का उपयोग करते समय सतर्क रहना और उचित नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यौगिक को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है सी। इस प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों के तहत, एफयूडीआर ने आंतों के पॉलीक्यू एकत्रीकरण (पूरक चित्रा 5) को प्रभावित नहीं किया; इसलिए, इसका उपयोग वर्णित विधि के लिए उपयुक्त और फायदेमंद था।

इमेजिंग से पहले फ्रीजिंग नमूने पाइपलाइन के सफल रोजगार में एक महत्वपूर्ण कदम साबित हुए। ठंड से पहले कुल गिनती मैनुअल गिनती (चित्रा 3 बी) की तुलना में काफी अधिक थी। इमेजिंग से पहले 18-48 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े रखने पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम और अंततः कुल पता लगाने में सुधार (चित्रा 3 ए)। कुल पहचान पर ठंड के प्रभावों की केवल पॉलीक्यू के लिए जांच की गई है और इस तरह के प्रभावों की आगे की जांच के बिना अन्य मॉडलों के लिए सामान्यीकृत नहीं किया जाना चाहिए।

सभी स्थितियों को समान रखने के बावजूद, यह देखा गया कि प्रति कृमि समुच्चय की औसत संख्या विभिन्न रनों के बीच भिन्न हो सकती है, जबकि ओपी 50 बनाम एमपीएओ 1 के साथ उपनिवेशित जानवरों में समुच्चय की संख्या के बीच का अनुपात सुसंगत रहा (चित्रा 6, पूरक चित्रा 2, पूरक चित्रा 5)। इसलिए, प्रत्येक रन में हमेशा ई कोलाई ओपी 50 नियंत्रण, या किसी भी अतिरिक्त उपयुक्त संदर्भ नियंत्रण को शामिल करना आवश्यक है। प्रयोगों के बीच कुल गिनती में इस तरह की परिवर्तनशीलता पर्यावरणीय परिस्थितियों (तापमान, आर्द्रता) 22,23 या आनुवंशिक पृष्ठभूमि8 से प्रभावित हो सकती है। वास्तव में, यह देखा गया कि लंबे समय तक संस्कृति के बाद, आंतों की प्रतिदीप्ति काफी कम हो गई या पूरी तरह से खो गई, जिसके लिए जमे हुए स्टॉक से एक नया तनाव पिघलने की आवश्यकता थी। प्रतिदीप्ति में देखी गई कमी आनुवंशिक परिवर्तनों का परिणाम हो सकती है जो विषाक्त ट्रांसजीन को दबाते हैं, जैसे कि पॉलीक्यू व्यक्त करने वाले। बहरहाल, विभिन्न प्रयोगकर्ताओं (पूरक चित्रा 2) के बीच मनाया परिणामों की असाधारण प्रजनन क्षमता, जैविक प्रतिकृतियों (चित्रा 5) के बीच, और एक ही नमूना (पूरक चित्रा 3) के भीतर इस दृष्टिकोण की ताकत पर जोर देते हैं।

कई रिपोर्टों में प्रोटियोस्टेसिस 9,11,12,13,24,25 का अध्ययन करने के लिए आंतों के पॉलीक्यू को नियोजित किया गया है। हालांकि, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और रीडआउट विधियों के बीच परिवर्तनशीलता के कारण परिणामों के बीच सीधी तुलना नहीं की जा सकती है। बहरहाल, पहले प्रकाशित डेटा के कुछ परिणाम यहां वर्णित स्वचालित मात्रा का ठहराव द्वारा पुन: प्रस्तुत किए जाते हैं, जिसमें एकत्रीकरण 9,13 के जीवाणु प्रेरण और समुच्चय 11 की तुलनीय संख्या शामिल है। सामूहिक रूप से, वर्णित पाइपलाइन प्रोटियोस्टेसिस का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है।

यहां वर्णित विधि में कुछ अंतर्निहित चुनौतियां हैं। उदाहरण के लिए, यह इस प्रोटोकॉल के सभी घटकों को मास्टर करने के लिए पर्याप्त समय की आवश्यकता है, जो प्रोटोकॉल की धारा 8 के लिए विशेष रूप से सच है, जिसके लिए यह निर्धारित करने के लिए परख के साथ परिचित होने की आवश्यकता है कि अधिग्रहित छवियां पाइपलाइन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं या नहीं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली छवि अधिग्रहण सेटिंग्स से विचलन संभव है; हालाँकि, सेटिंग्स और वर्म प्रशिक्षण सेट के संशोधन की आवश्यकता होगी। यह पाइपलाइन विभिन्न आकारों के समुच्चय और उन लोगों को अलग कर सकती है जो छू रहे हैं, जो समुच्चय के "सम्मिश्रण" को सीमित करता है और अंततः पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाता है। हालाँकि, स्वीकृत आकार सीमा से अधिक बड़े समुच्चय की पहचान करने का प्रयास करते समय समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं, क्योंकि ऊपरी आकार थ्रेशोल्ड का विस्तार करने से खराब पहचान के कारण त्रुटियां हो सकती हैं, जैसे कि स्पर्श करने वाले समुच्चय को अलग करने में असमर्थता। छवि विश्लेषण से पहले सटीकता, आकार और तीव्रता के बीच संतुलन पाया जाना चाहिए। कुल पहचान को बढ़ाने में सक्षम तंत्रिका नेटवर्क बनाने के लिए मशीन लर्निंग को शामिल करके कुल पहचान की दक्षता में और सुधार किया जा सकता है। वर्तमान में इस तरह के सुधारों का पता लगाया जा रहा है और वर्तमान मुद्दों को संबोधित करने में बहुत सहायता मिलेगी जैसे कि विभिन्न फोकल विमानों पर झूठ बोलने वाले समुच्चय का पता लगाना या जिनके असामान्य आकार हैं।

वर्णित विधि की एक उल्लेखनीय कमजोरी स्वचालित कुल गिनती में परिवर्तनशीलता है, क्योंकि वे हमेशा विभिन्न जीवाणु उपभेदों को खिलाए गए कीड़े में मैनुअल गिनती द्वारा पुनरावृत्ति नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, स्वचालित गिनती के आधार पर, कीड़े खिलाया पी एरुगिनोसा उत्परिवर्ती 53 (एम 53) जंगली प्रकार के तनाव (एमपीएओ 1) (चित्रा 7) की तुलना में काफी कम समुच्चय था; हालांकि, हिट की पुष्टि ने कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (पूरक चित्रा 4)। सामान्य तौर पर, उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीन में झूठी-सकारात्मक हिट डिटेक्शन की उच्च दर होती है, और वर्णित विधि कोई अपवाद नहीं है26. इस प्रकार, यह सभी संभावित हिट की पुष्टि करने के लिए प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है।

जबकि इस प्रोटोकॉल को मेजबान प्रोटियोस्टेसिस को प्रभावित करने वाले बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक स्क्रीनिंग रणनीति फिट करने के लिए अनुकूलित किया गया था, प्रत्येक चरण को जीनोमिक आरएनएआई पुस्तकालयों, छोटे अणुओं या अन्य स्थितियों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है। एक विशिष्ट स्क्रीनिंग रणनीति की आवश्यकताओं के अनुरूप प्रत्येक चरण में अतिरिक्त संशोधन किए जा सकते हैं। इसके अलावा, यह तकनीक लचीलेपन का एक स्तर प्रदान करती है जो एक विशिष्ट मॉडल के अनुरूप प्रत्येक चरण के अनुकूलन की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण को अन्य ऊतकों में पॉलीक्यू एकत्रीकरण या छवियों में पाई जाने वाली अन्य विशेषताओं को निकालने के लिए बढ़ाया जा सकता है जैसे कि प्रेरक फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों (जैसे, हीट शॉक जीन) का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करना, प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का आकलन करना (उदाहरण के लिए, डीएएफ -16 का परमाणु स्थानीयकरण), अन्य रोग मॉडल में एकत्रीकरण का अध्ययन करना (एβ1-42, α-सिन्यूक्लिन, टीडीपी -43, आदि) जैसे कृमि का आकार।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव मौजूद नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (1आरओ 3 एजी 069056-01) और डीएमसी को वित्त पोषण करने वाले संक्रामक रोग सोसाइटी ऑफ अमेरिका द्वारा समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। हम पांडुलिपि को प्रूफरीड करने के लिए सीज़िज़ लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। कार्टून आंकड़े बायोरेंडर भुगतान लाइसेंस का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube

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References

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जीव विज्ञान अंक 176 सी एलिगेंस प्रोटियोस्टेसिस पॉलीग्लूटामाइन एकत्रीकरण
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