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Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.

Abstract

L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.

Introduction

Depuis que Salvador Moncada et les lauréats du prix Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro et Ferid Murad ont identifié l’oxyde nitrique (NO) comme le facteur de relaxation dérivé de l’endothélium (EDRF) précédemment connu, le rôle central du NO a été établi dans plusieurs mécanismes clés couvrant la biologie vasculaire, les neurosciences, le métabolisme et la réponse de l’hôte 1,2,3,4,5,6,7 . L’administration exogène de gaz NO est devenue un traitement établi pour l’insuffisance respiratoire due à l’hypertension pulmonaire chez le nouveau-né8. Le gaz d’oxyde nitrique a également été étudié pour le traitement de l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS), du paludisme et d’autres maladies infectieuses, des lésions d’ischémie-reperfusion et pour la prévention des lésions rénales aiguës chez les patients subissant une chirurgie cardiaque 9,10,11,12. La nécessité de techniques de mesure précises pour évaluer les niveaux de NO, ses métabolites et ceux de ses protéines et composés cibles découle d’études mécanistes et interventionnelles.

En raison de sa forte réactivité, le NO peut subir des réactions différentes selon la matrice biologique dans laquelle il est produit et/ou libéré. En l’absence d’hémoglobine (Hb) ou d’autres oxy-hémoprotéines, le NO est oxydé presque complètement en nitrite (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

Le NO subit d’abord une autoxidation avec de l’oxygène moléculaire (O2) pour produire du dioxyde d’azote (NO2) et réagit avec le NO2 lui-même pour générer du trioxyde de diazote (N2O3). Une molécule deN2O3réagit avec l’eau (H2O) pour former deux molécules de NO2- et un proton (H+)13. Dans le sang total14,15, le NO et le NO2- sont rapidement convertis en nitrate (NO3-) car ces molécules réagissent avidement avec les groupes hémiques oxydés de Hb [Hb-Fe2+-O2 ou oxyhémoglobine (oxyHb)] pour donner no3-. Cette réaction est couplée à la transition du groupe hème à l’état ferrique [Hb-Fe3+ ou méthémoglobine (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

La barrière des globules rouges (GR) et l’espace immédiatement adjacent à l’endothélium sont les principaux facteurs limitant cette réaction et permettant à une petite partie du NO libéré par l’endothélium d’agir comme EDRF16,17. En fait, l’Hb sans cellules dans la circulation est connue pour perturber la vasodilatation dans les contextes expérimentaux et cliniques17,18. Dans les globules rouges, en fonction de l’oxygénation et de la concentration de NO2,, une portion de NO réagit avec la désoxyhémoglobine (Hb-Fe2+) pour former du fer-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO ou HbNO) :

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

Dans le RBC15,17, le NO 2- peut former de l’Hb-Fe3+ en réduisant l’Hb-Fe2+ conduisant à la libération de NO, qui à son tour lie Hb-Fe2+-O2 (préférentiellement) ou Hb-Fe2+.

La génération de dérivés du NO ne doit pas être considérée comme strictement unidirectionnelle, car le NO peut être régénéré à partir du NO2 et du NO3 dans divers tissus et par différentes enzymes (par exemple, par des bactéries intestinales ou dans les mitochondries, en particulier dans des conditions hypoxiques)19,20.

Une quantité variable de NO produite (ou administrée) conduit à la génération en aval de S-nitrosothiols, principalement par transnitrosation de thiol à partir deN2O3 en présence d’un nucléophile créant un intermédiaire donneur de NO+ (Nuc-NO+-NO2-) :

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Une autre possibilité pour la génération de S-nitrosothiols est la nitrosylation des thiols oxydés (NO réagissant avec un thiol oxydé):

RS• + PAS de → RS-NO

Ce mécanisme et l’oxydation directe du thiol par le NO2 pourraient n’être possibles que dans des conditions très spécifiques qui sont décrites ailleurs21. Les S-nitrosothiols vont des molécules légères comme le S-nitrosoglutathion aux grandes protéines contenant du thiol. La S-nitrosohémoglobine (S-NO-Hb) est formée par nitrosation d’un groupe thiol d’un résidu de cystéine conservé dans la chaîne β (β93C)22.

La génération et le métabolisme des S-nitrosothiols font partie d’importants mécanismes de régulation. Les exemples incluent la régulation du glutathion, des caspases, du N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et des récepteurs de la ryanodine 23,24,25,26,27,28. Auparavant considérée comme un médiateur majeur de la biologie du NO in vivo, l’albumine nitrosée (S-nitroso-albumine) semble être un transporteur de NO/NO+ sans activité biologique supplémentaire spécifique29.

Lors de la mesure de la concentration de NO et de ses dérivés à partir d’un échantillon biologique spécifique dans une matrice biologique, il est important de prendre en compte des caractéristiques telles que l’acidité, l’oxygénation, la température et la présence de réactifs. Les exemples incluent les donneurs de NO exogènes administrés et, dans le cadre d’une inflammationaiguë, le peroxyde d’hydrogène (H2O 2) réagissant avec le NO2 conduisant à la génération d’une concentration surnormale de radicaux libres comme le peroxynitrite (ONOO-)21. En plus de la méthode analytique utilisée, la phase préanalytique de la préparation et du stockage des échantillons est fondamentale. Les réactions en aval qui ne représentent pas l’activité in vivo du NO doivent être prédites, prises en compte et bloquées. Un exemple valable est l’instabilité du S-NO-Hb, nécessitant un traitement dédié des échantillons de sang lorsqu’il est ciblé pour la mesure22.

Les tests basés sur la chimiluminescence sont la référence absolue pour détecter les niveaux de NO et de ses principaux métabolites [NO2-, NO3-, S-NO et complexes fer-nitrosyle (Fe-NO)] dans tout fluide biologique, y compris les homogénats tissulaires30,31. Ces méthodes s’appuient sur le détecteur de chimiluminescence (CLD), un dispositif qui abrite la réaction du NO avec l’ozone (O3), générant le NO2 à l’état excité (NO2•). La relaxation du NO2• provoque l’émission d’un photon de lumière détecté par un tube photomultiplicateur, générant un signal électrique directement proportionnel à la teneur en NO du mélange gazeux échantillonné32. Un schéma simplifié du CLD est représenté.

Figure 1
Figure 1 : Schéma simplifié d’un détecteur de chimiluminescence pour le gaz d’oxyde nitrique. La détection d’oxyde nitrique (NO) basée sur la chimiluminescence est la génération stœchiométrique d’un photon par molécule de gaz NO introduite dans le détecteur de chimiluminescence (CLD). La réaction de chimiluminescence est obtenue dans une chambre désignée alimentée en ozone (O3) à partir d’un générateur interne, qui est maintenu à pression négative par connexion avec une pompe externe, permettant un afflux continu et constant de gaz d’échantillonnage. La génération d’O3 nécessite de l’oxygène diatomique (O2) qui est alimenté par un réservoir O2 dédié connecté au CLD (d’autres fabricants fournissent des CLD fonctionnant avec de l’air ambiant). Dans la chambre de réaction, chaque molécule de GAZ NO contenue dans le gaz échantillonné réagit avec l’oxygène pour produire une molécule de dioxyde d’azote à l’état activé (NO2*). En revenant à son état fondamental, chaque molécule de NO2* émet un photon qui est détecté par un tube photomultiplicateur (PMT) situé à côté de la chambre de réaction. Le PMT avec l’amplificateur associé et l’unité centrale de traitement produit un signal proportionnel au nombre de photons et au nombre de molécules de NO dans la chambre de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’entrée d’échantillon du CLD peut être connectée à un système de verrerie contenant une chambre de réaction pour les échantillons liquides. Le système est continuellement purgé avec un gaz inerte tel que l’azote, l’hélium ou l’argon, transférant le NO de la chambre de réaction au CLD. Des échantillons en phase liquide sont injectés à travers une membrane dédiée dans le récipient de purge.

Figure 2
Figure 2 : Structure d’un récipient de purge pour la détection par chimiluminescence du gaz d’oxyde nitrique Le récipient de purge (à droite) permet la détection du gaz d’oxyde nitrique (NO) ou de tout autre composé qui peut être facilement converti en gaz NO lorsqu’il est libéré d’un réactif en phase liquide. L’entrée de gaz inerte est reliée à une source (réservoir) d’un gaz inerte tel que l’argon, le xeon ou l’azote diatomique (N2). La valve à aiguille (s’ouvre à gauche) est utilisée pour le contrôle de la pression dans le récipient de purge et peut être complètement retirée pour nettoyer le récipient. L’orifice d’injection est recouvert d’un capuchon avec un septum membranaire pour l’injection d’échantillons. La membrane doit être remplacée souvent. Une veste chauffante entoure la chambre de réaction et est reliée à un bain d’eau chaude pour effectuer le test VCl3 en HCl. La sortie du récipient de purge est connectée au détecteur de chimiluminescence (CLD) ou au piège NaOH (requis pour VCl3 dans les tests HCl). Pour drainer le contenu de la chambre de réaction, fermez d’abord les robinets d’arrêt à l’entrée de gaz inerte et à la sortie du récipient de purge, fermez la vanne à aiguille, retirez le bouchon à l’orifice d’injection et enfin ouvrez le robinet d’arrêt au niveau du drain. Le piège NaOH (à gauche) doit être placé en ligne entre le récipient de purge et le CLD si le test VCl3 dans HCl est effectué en raison de la corrosivité du HCl. La connexion au CLD nécessite toujours qu’un filtre diélectrique à champ intense (IFD) soit placé entre le CLD et la sortie du récipient de purge (ou du piège NaOH, le cas échéant). Le filtre IFD élimine les particules en suspension dans l’air et empêche le liquide de passer à travers le récipient de purge. PTFE = polytétrafluoroéthylène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En conséquence, tout composé pouvant être converti en NO par une réaction chimique spécifique et contrôlée peut être détecté avec une sensibilité élevée dans tout fluide biologique et homogénat tissulaire24. La mesure directe du NO en phase gazeuse par chimiluminescence est effectuée dans des contextes expérimentaux et cliniques. Ces techniques sont largement décrites ailleurs 33,34,35. La mesure du NO2-, des S-nitrosothiols, des protéines S-nitrosées et des Fe-NO peut être effectuée en ajoutant des échantillons dans un mélange réactionnel avec du triiodure (I3-), qui libère stœchiométriquement du GAZ NO de tous ces composés:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

tandis que I3- ne réagit pas avec NO 3-15. Des mesures précises de chaque composé sont rendues possibles par le prétraitement des aliquotes d’échantillons avec du sulfanilamide acidifié (AS) avec ou sans chlorure mercurique (HgCl2). Plus précisément, le prétraitement avec AS élimine toute lateneur en NO 2. En conséquence, la teneur en NO mesurée par le CLD ne reflète que la somme des concentrations de S-NO et de Fe-NOs. L’injection de HgCl2 dans une aliquote d’échantillon avant l’injection de SA provoque la libération de NO2- par S-NO. Le traitement par AS (conduisant à l’élimination du NO2) garantit que la teneur en NO mesurée ne reflète que la concentration de Fe-NO. Une série de soustractions entre les évaluations permet de calculer la concentration précise des trois dérivés du NO22.

Figure 3
Figure 3 : Étapes de préparation de l’échantillon pour le test de chimiluminescence de l’acide acétiqueI3- dans l’acide acétique. Les étapes séquentielles de préparation du test de chimiluminescence de l’acideI3- dans l’acide acétique sont illustrées. L’utilisation de tubes centrifuges protégés contre la lumière est requise. Les tubes 1, 2 et 3 sont ceux utilisés pour préparer le test. Une autre aliquote d’échantillon (tube 4) est nécessaire pour le test VCl3 dans HCl si la mesure du nitrate (NO3-) est requise. Les étapes sont indiquées par des chiffres en rouge. Préremplir (étape 1) comme indiqué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) ou HgCl2 avant d’ajouter le volume de l’échantillon. Ajouter le volume de l’échantillon (2) comme indiqué, vortex, et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT). Ajouter (3) pbS ou sulfanilamide (AS) acidifié comme indiqué, vortex, et incuber pendant 3 min à TA. Exécuter le test (4). La concentration mesurée par le dosage est la somme de la concentration des composés rapportée sous chaque tube. Le tube numéro 1 permettra de mesurer les nitrites (NO2-), les S-nitrosothiols (S-NO) et les complexes fer-nitrosyle (Fe-NO) en un seul signal. Pour la mesure des nitrates (NO3-), les échantillons doivent être traités avec à la foisI3- dans l’acide acétique et VCl3 dans les dosages HCl, et la valeur obtenue à partir du tube 1 doit être soustraite de celle obtenue à partir du tube 4. *quantités suggérées à utiliser pour l’analyse de l’Hb pour la détermination du NO 2-résiduel, de la S-nitrosomémoglobine et de l’hémoglobine fer-nitrosyl. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour la mesure du NO3, le chlorure de vanadium (III) (VCl3) dans l’acide chlorhydrique (HCl) est utilisé pour la conversion du NO3- en NO dans le récipient de purge afin de mesurer le NO3- stœchiométriquement avec le CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Pour obtenir une conversion suffisamment rapide, la réaction doit être effectuée à 90-95 °C. La réduction de NO3- à NO2- est couplée à une réduction de NO2- à NO par HCl. Le vanadium métal réduit également les S-NO libérant leur fraction NO22,36. La concentration finale obtenue par CLD avecVCl3 dans HCl reflète la concentration globale de NO3-, NO2 et d’autres composés nitrosés. La soustraction de cette dernière valeur de la concentration obtenue avec CLD avec I3- permet de calculer la concentration de NO3- 36,37 (Figure 3).

Dans le test de consommation de NO, la libération continue de NO dans le récipient de purge par des donneurs de NO comme (Z)-1-[2-(2-aminoéthyl)-N-(2-ammonioéthyl)amino]diazène-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) génère un signal stable permettant de quantifier l’oxyHb sans cellule dans les échantillons injectés. La quantité de NO consommée dans le récipient de purge est en relation stœchiométrique avec la quantité d’oxyHb dans l’échantillon38.

Les protocoles de mesure des NO2, NO3, S-nitrosothiols, des complexes fer-nitrosyle et de LA CONSOMMATION DE NO par Hb sans cellules dans des échantillons de plasma sont illustrés. Les études sur le NO dans l’environnement RBC nécessitent un traitement spécifique de l’échantillon suivi d’une chromatographie d’exclusion pour mesurer les S-NO-Hb et Hb-NO extrêmement fragiles couplés à la détermination de la concentration totale d’Hb 15,22. La préparation des échantillons joue un rôle déterminant dans la correction de la mesure. La préexistence du NO2- dansH2Oet la libération du NO2- pendant le test peuvent conduire à la mesure de concentrations artificiellement plus élevées de dérivés du NO tels que le S-NO-Hb14,39. Des aspects importants de la préparation des échantillons sont également présentés.

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Protocol

Les procédures indiquées dans ce protocole sont conformes au comité d’examen du Massachusetts General Hospital. Les échantillons de sang utilisés avaient été prélevés lors d’une étude précédente et ont été anonymisés aux fins actuelles18.

REMARQUE: Voir les instructions du fabricant pour des conseils spécifiques concernant les connexions optimales entre les tubes et la verrerie constituant le récipient de purge, le lavage et l’entretien général. Les connexions doivent être fermes et soigneusement faites pour ne pas endommager la verrerie. Identifier les composants de la cuve de purge en verre : conduite d’entrée de gaz, cuve de purge avec enveloppe chauffante et condenseur, piège à bulles de gaz à hydroxyde de sodium (NaOH), ligne de connexion entre la cuve de purge et le barboteur, conduite de gaz de sortie de la cuve de purge (vers CLD) dotée d’un filtre diélectrique à champ intense (IFD). Une ligne de filtre IFD entre le récipient de purge et l’entrée de l’échantillon du CLD doit être en place chaque fois que l’ON mesure des métabolites sous forme liquide (plasma, cultures cellulaires, homogénats tissulaires) (tous les essais présentés dans le protocole). La préparation de l’échantillon dépend du liquide ou du tissu analysé et des composés d’intérêt. Des aspects importants de la phase préanalytique sont abordés dans les sections 1 et 2. Des étapes de préparation spécifiques pour des essais spécifiques sont incluses dans les sections 3 à 5. Les articles 6 à 8 s’appliquent à tous les essais.

1. Préparation de réactifs dédiés

NOTE: Pour plus de détails, reportez-vous aux publicationsprécédentes 15,22.

  1. Préparer une solution de sulfanilamide (AS) acidifiée à 5 % (290 mM) pour l’élimination du NO2- en dissolvant 500 mg de sulfanilamide dans 10 mL de 1N HCl. Cette solution est stable pendant des mois.
  2. Préparer une solution de chlorure mercurique (HgCl2) de 50 mM pour la libération de NO2 par les S-NO O.- en dissolvant 67,9 mg de HgCl2 dans 5 mL de PBS. Protégez la solution mère de la lumière.
  3. Préparer la solution bloquant le NO2 avec 800 mM de ferricyanure [K3Fe(CN)6] pour oxyder l’Hb avec 100 mM de N-éthylmaléimide (NEM) pour bloquer les groupes thiol et (FACULTATIF) une solution de nonylphényl-polyéthylène glycol à 10 % (Nonidet p-40) pour solubiliser les membranes des globules rouges.
    1. Ajouter K3Fe(CN)6 à l’eau désionisée et distillée (ddH2O, 263,5 g de poudre par litre) pour obtenir une concentration finale de 800 mM.
    2. Ajouter nem à la solution de 800 mM K3Fe(CN)6 dans ddH2O (12,5 g de poudre par litre pour avoir une concentration de 100 mM) et mélanger la solution pour dissoudre tous les cristaux.
    3. Ajouter une partie de NP-40 à 10 % à neuf parties de la solution NEM K3Fe(CN)6 100 mM neM de 800 mM (111 mL par litre) et bien mélanger (étape obligatoire pour l’analyse du sang total).
  4. Préparer la solution de stabilisation S-NO-Hb contenant 12 mMK3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM d’acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA, pour la chélation des métaux) et 1 % de détergent Nonidet p-40 à partir de leurs solutions mères.
    1. Préparer une solution de NEM de 200 mM en ajoutant des cristaux de NEM au PBS (25 mg/mL, par exemple 250 mg dans 10 mL de PBS) et mélanger la solution jusqu’à ce que tous les cristaux soient dissous (à fabriquer le jour de l’expérience).
    2. Préparer une solution de 800 mMK3Fe(CN)6 en ajoutantK3Fe(CN)6 à ddH2O (263,5 mg/mL par exemple 1,32 g dans 5 mL de ddH2O pour obtenir une concentration finale de 800 mM) (à réaliser le jour de l’expérience).
    3. Préparer une solution mère de DTPA de 10 mM en ajoutant 786 mg de DTPA à 200 mL de ddH2O et ajuster le pH à 7,0 avec 5N NaOH pour solubiliser complètement le DTPA.
    4. Ajouter 5 mL de solution NEM de 200 mM, 1,5 mL de solutionK3Fe(CN)6 de 800 mM et 1 mL de solution mère de DTPA à 81,5 mL de PBS à 7,2 pH, et enfin, ajouter enfin 11 mL de NP-40 à 10 % pour porter le volume final à 100 mL.

2. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Pour plus de détails sur la collecte d’échantillons, reportez-vous aux travaux précédemment publiés 15,22,40.

  1. Prélever du sang total
    1. Prélever le sang dans des tubes recouverts d’héparine préférant les veines aux vaisseaux artériels (sauf si cela est spécifiquement nécessaire) et préférant la mise en place d’un cathéter plutôt que la ponction veineuse (si possible) avec un cathéter ou un alésage d’aiguille d’au moins 20 G ou plus pour minimiser l’hémolyse.
    2. Ajouter immédiatement la solution bloquant le NO2( 1 partie de la solution à 4 parties de sang total), traiter (rubriques 3 ou 4), ou congeler et conserver à -80 °C.
  2. Recueillir du plasma et des globules rouges (GLOBULES ROUGES)
    1. Prélever le sang dans des tubes enduits d’héparine préférant le sang veineux au sang artériel (sauf si cela est spécifiquement nécessaire) et des aiguilles d’au moins 20 G ou plus pour minimiser l’hémolyse et centrifuger immédiatement pendant 5 min à 4000 x g à 4 °C.
    2. Mélanger le surnageant (plasma) avec la solution bloquant le NO2 (1 partie de la solution à 4 parties du surnageant) dans un nouveau tube et procédé (sections 3 ou 4), ou congeler et conserver à -80 °C.
      REMARQUE: Pour le test de consommation de NO, la solution de blocage du NO2 ne peut pas être utilisée. Le test peut être effectué sans prétraitement plasmatique.
    3. Remettre en suspension la pastille RBC du fond dans un nouveau tube prérempli avec une solution de stabilisation S-NO (voir étape 1.4) (1 mL de pastille à 9 mL de solution) et incuber pendant 5 min.
    4. Passer le lysat RBC dans une colonne de calibrage avec du polymère G-25 Sephadex qui a été préalablement rincé avec du ddH2O pour la chromatographie d’exclusion
    5. Recueillir la fraction d’Hb pour la traiter (section 4) et mesurer la concentration d’Hb à l’aide du réactif de Drabkin (pour la mesure de l’Hb, se référer aux travaux publiés précédemment22).
      REMARQUE: Pour préparer et échantillonner un tissu / organe spécifique, identifier son hile et l’isoler chirurgicalement. Inciser la veine, percer l’artère et injecter une solution saline héparinisée (10 U /mL) via l’artère. Excisez le tissu lorsque la solution saline commence à refluer au niveau de l’incision veineuse. Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur mécanique tout en ajoutant 1 partie de solution bloquant le NO2 à 4 parties de tissu homogénéisé.

3. VCl3 dans la préparation du test HCl

REMARQUE: Pour plus de détails sur VCl3 dans la préparation du test HCl, reportez-vous aux travaux publiés précédemment37,41.

ATTENTION : Le CLD sera endommagé si le piège NaOH n’est pas correctement en place lors de l’exécution de ce test. Cela est dû à la corrosivité du HCl.

  1. Préparer des solutions étalons de NO3- pour la courbe standard
    1. Dissoudre 85 mg de NaNO3 dans 10 mL de ddH2 Opour obtenir 0,1 M de NaNO3- (cette solution reste stable pendant quelques semaines).
    2. Utiliser la solution mère pour préparer des étalons par dilution dans ddH2O afin d’obtenir des concentrations de 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 afin d’effectuer une courbe d’étalonnage pour les échantillons de plasma ou d’urine (utilisez des concentrations plus faibles si vous travaillez avec des cultures cellulaires).
  2. Préparer la solution saturée VCl3 (chlorure de vanadium) pour la réduction du NO3 dans le récipient de purge
    ATTENTION : La réaction de l’eau et du VCl3 est exothermique. Faites attention à la température élevée de la verrerie lors de l’ajout d’acide et lors du rinçage de la verrerie à la fin de l’expérience.
    1. Dissoudre 1,6 g de VCl3 dans 200 mL de 1 M HCl en ajoutant d’abord VCl3 dans une fiole propre puis en ajoutant 200 mL de 1 M HCl.
    2. Filtrer la solution sous vide à travers du papier filtre (comme du papier filtre de 11 μm, mais n’importe quel papier filtre peut être utilisé).
      REMARQUE: La solution filtrée doit virer au bleu clair, tandis que la solution VCl3 non filtrée est brune à cause des particules non dissoutes.
    3. Gardez la solution saturée recouverte de papier d’aluminium ou de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) car le composé est sensible à la lumière.
  3. Préparer le bain-marie circulant
    1. Connectez un dispositif de bain d’eau circulant à la veste d’eau du récipient de purge. Assurez-vous que les lignes sont sèches avant l’amorçage.
    2. Commencez le bain-marie à 95 °C et vérifiez l’absence de fuites sur les conduites d’eau en appliquant des serviettes en papier (non adhérentes) autour des lignes.
  4. Installez le piège à bulles de gaz
    1. Vérifiez que le manchon en PTFE du barboteur est en place et qu’il n’est pas endommagé.
    2. Ouvrez le barboteur à gaz et injectez 15 mL de NaOH de 1 M dans la base du barboteur.
    3. Repositionnez le barboteur à gaz et scellez hermétiquement la connexion en appuyant sur le bas vers le haut et en tordant légèrement les deux parties. L’impossibilité de tourner le haut du barboteur sans appliquer de force indique un joint correct.
    4. Connectez la sortie du récipient de purge à l’entrée du piège à bulles de gaz.

4. I3- dans la préparation de dosage de l’acide acétique

REMARQUE: Pour plus de détails sur I3- dans la préparation de dosage de l’acide acétique, se référer aux travaux précédemment publiés 15,22,38,41,42.

  1. Préparer la courbe standard pour NO2-
    1. Préparer une solution mère en dissolvant 69 mg de nitrite de sodium (NaNO2) dans 10 mL de ddH2O pour obtenir une solution de 100 mM. Cette solution est stable si elle est stockée dans un récipient hermétique, réfrigérée et protégée de la lumière.
    2. Diluer en série la solution mère dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL prérempli de 900 μL de ddH2O : Ajouter 100 μL de la solution mère au premier tube de centrifugeuse, mélanger, étiqueter et utiliser 100 μL du tube pour le deuxième tube, puis répéter pour obtenir 10 mM, 1 mM, puis 100 μM.
    3. Diluer davantage avec ddH2O pour obtenir 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM et 500 nM NaNO2 aliquotes à utiliser dans la courbe d’étalonnage.
  2. Préparer l’acide acétique I3- dans le récipient de purge (peut être conservé à température ambiante (RT) pendant 1 semaine)22
    1. Ajouter 2 g d’iodure de potassium (KI) et 1,3 g d’iode (I2) à 40 mL de ddH2O et 140 mL d’acide acétique.
    2. Bien mélanger en remuant le mélange pendant au moins 30 min.
  3. Préparer les échantillons pour la détermination différentielle des complexes NO2-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, si Hb est prélevé) et fer-nitrosyle (Hb-NO si Hb est collecté) (Figure 3)
    1. Diviser chaque échantillon en 3 aliquotes de 270 μL (900 μL d’Hb si l’on mesure S-NO-Hb et Hb-NO) dans des tubes de microcentrifugation à protection contre la lumière, 2 d’entre eux préremplis de 30 μL de 1x PBS (100 μL si mesure S-NO-Hb et Hb-NO) et le troisième tube avec 30 μL de HgCl2 (100 μL si l’on mesure S-NO-Hb et Hb-NO), vortex et incubation à RT pendant 2 min (Figure 3).
    2. Ajouter 30 μL de 5 % AS à l’échantillon avec HgCl2 pour mesurer les Fe-NOs, (100 μL pour Hb-NO) et à un avec PBS ajouté pour mesurer les S-NOs et Fe-NOs (100 μL pour S-NO-Hb et Hb-NO) et ajouter 30 μL de PBS au troisième déjà pré-rempli avec 1x PBS pour mesurer NO2-, S-NOs et Fe-NOs (100 μL pour le NO2- résiduel de la collecte hb, S-NO et Hb-NO). Vortex et incubation à RT pendant 3 min (Figure 3).

5. AUCUNE consommation par configuration Hb sans cellule

REMARQUE: Pour plus de détails, reportez-vous à l’ouvrage38 publié précédemment.

  1. Préparer des solutions d’oxyHb standard à partir d’une solution mère purifiée d’Hb avec une concentration connue
    1. Diluer en série la solution mère dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par addition de ddH2O pour obtenir les solutions qui seront utilisées pour la courbe d’étalonnage : 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Préparer la solution DETA-NONOate
    1. Ajouter 10 mg de DETA-NONOate à 610 μL de 10 μM de NaOH dans un pH de 7,4 PBS pour générer 100 mM de DETA-NONOate et le maintenir sur la glace.

6. Démarrez le détecteur de chimiluminescence (CLD) et préparez le récipient de purge

REMARQUE: Pour la préparation du récipient de purge, reportez-vous à l’ouvrage43 publié précédemment.

  1. Vérifiez les connexions principales vers et depuis le CLD
    1. Connectez la conduite d’oxygène au CLD et ouvrez le réservoir d’oxygène à une pression convenue avec le fabricant du CLD.
    2. Assurez-vous que la ligne de filtre diélectrique à champ intense (IFD) est connectée au CLD, mais pas au récipient de purge ou au piège NaOH
  2. Démarrer le CLD
    1. Sur l’interface CLD, commencez à exécuter le programme de détection pour les tests en phase liquide.
    2. Vérifiez que l’apport en oxygène est adéquat. Si tel est le cas, le CLD commencera avec succès l’échantillonnage à partir de son entrée et indiquera la détection par un signal en millivolts (0-5 mV). Sinon, le CLD déclenchera un signal de diagnostic négatif.
  3. Préparer le récipient de purge
    1. Fermez le récipient de purge sur les trois orifices: vissez complètement la vanne à aiguille vers la droite, fermez les robinets d’arrêt d’entrée et de sortie.
    2. Retirer le bouchon du récipient de purge et ajouter une quantité suffisante du réactif spécifique au dosage prévu dans la chambre de réaction (tableau 1) afin que l’aiguille de la seringue utilisée pour injecter les échantillons puisse atteindre la colonne de liquide.
    3. Vérifiez la présence d’une valeur de référence souhaitée stable (tableau 1).
  4. Démarrer le flux de gaz de purge
    1. Assurez-vous que le réservoir de gaz inerte (p. ex., N2) est équipé d’un régulateur à deux étages et reliez le réservoir de gaz inerte à l’entrée de gaz du navire.
    2. Ouvrez le gaz avec une pression de sortie au régulateur de 1 à 5 psi, ouvrez l’entrée du récipient de purge et ouvrez lentement la vanne à aiguille du récipient de purge pour permettre l’entrée de gaz. Vérifiez le bouillonnement dans le récipient de purge.
  5. Ajuster le débit de gaz
    1. Enregistrez la pression de cellule mesurée par le CLD avec la ligne de filtre IFD en échantillonnant l’air ambiant.
    2. Repositionnez le bouchon sur le récipient de purge, connectez la conduite de filtre IFD au récipient de purge (ou au piège NaOH dans le test VCl3 dans HCl) et ouvrez la sortie du récipient de purge.
    3. Utilisez la vanne à aiguille pour atteindre la même pression de cellule au niveau CLD que celle enregistrée dans l’air ambiant.

7. Expérience

REMARQUE: Pour plus de détails concernant l’expérience, reportez-vous à l’ouvrage43 publié précédemment.

  1. Démarrer le programme d’acquisition du signal de chimiluminescence
    1. Connectez le port série du CLD au port série de l’ordinateur sur lequel le programme d’acquisition a été installé.
    2. Exécutez le programme d’analyse.
    3. Cliquez sur Acquérir, sélectionnez le dossier pour enregistrer le fichier .data, tapez le nom du fichier et cliquez sur Enregistrer.
      REMARQUE: Remarquez le temps d’exécution prédéfini à l’écran, car l’enregistrement s’arrête automatiquement lorsque le temps prédéfini s’écoule. Si nécessaire, la durée d’exécution prédéfinie peut être augmentée.
  2. Se préparer à des injections répétées d’échantillons
    1. Ajustez l’échelle de tension à l’écran pour avoir le contrôle sur la ligne de base ciblée en cliquant sur les boutons Minimum et/ou Maximum , puis en entrant la valeur souhaitée.
    2. Avoir un tube de 20 ou 50 mL rempli de ddH2O pour rincer la seringue entre les échantillons.
    3. Ayez une boîte de lingettes de tâches délicates facilement disponibles.
  3. Injection d’échantillons
    REMARQUE: Commencez par les solutions étalons pour la courbe d’étalonnage (injectez des échantillons les moins concentrés aux échantillons les plus concentrés), puis passez aux échantillons expérimentaux (envisagez de le faire en double ou en trois exemplaires).
    1. Rincez la seringue au moins deux fois ou plus avec du ddH2O avant de prélever chaque échantillon (et après chaque injection) et vérifiez chaque fois l’éjection d’eau non obstruée sur une lingette de travail.
    2. Insérez la seringue dans le tube d’échantillonnage tout en tenant la seringue et le tube à une distance rapprochée, tirez le piston jusqu’au volume souhaité tout en vous assurant qu’aucune bulle d’air et/ou pièces solides non homogénéisées ne sont piégées.
    3. Nettoyez l’extrémité de la seringue à l’aide d’un essuie-glace, puis insérez la seringue dans le capuchon septa à l’orifice d’injection et injectez après avoir vérifié que l’extrémité de la seringue se trouve dans la phase liquide dans la chambre de réaction.
  4. Marquez l’injection dans le logiciel et attendez
    1. Vérifiez que l’injection provoque un changement vers le haut du signal (figure supplémentaire 1) (vers le bas dans la consommation de NO par essai Hb sans cellule) et tapez le nom de l’échantillon en cliquant sur la case grise sous Noms des échantillons, puis cliquez sur Marquer l’injection.
      REMARQUE: Suspicion d’obstruction de la seringue si l’injection de l’échantillon ne génère pas de signal.
    2. Attendez que le signal électrique atteigne à nouveau la ligne de base (cela prend généralement 3-4 min). Ce temps peut être utilisé pour effectuer l’étape 7.3.1.
  5. Répétez toutes les étapes indiquées aux étapes 7.3 et 7.4 pendant et après chaque injection jusqu’à la fin de l’expérience. N’oubliez pas d’exécuter un échantillon de la solution de conservation (si elle est utilisée)
  6. Arrêter l’expérience
    1. Cliquez sur STOP pour interrompre l’acquisition du signal, arrêtez le CLD et éteignez le bain-marie (si le NO3- est mesuré).
    2. Interrompez le flux de gaz, ouvrez la vanne à aiguille, retirez le bouchon du récipient de purge, placez un conteneur à déchets sous le drain et ouvrez le robinet d’arrêt de vidange.
      REMARQUE: Si l’expérience nécessite une acquisition de données de plus de 60 minutes, il est nécessaire de redémarrer l’acquisition après 60 minutes d’exécution (répétez l’étape 7.1.3) et de créer un nouveau fichier.

8. Mesures et calculs

REMARQUE: Les mesures et les calculs sont effectués hors ligne et peuvent être effectués à un moment différent.

  1. Démarrer le programme d’acquisition de chimiluminescence pour l’analyse de données hors ligne
    1. Démarrez le programme et cliquez sur Processus.
    2. Sélectionnez le fichier d’expérience, puis cliquez sur Ouvrir.
  2. Calculer l’aire sous la courbe pour chaque administration
    1. Le logiciel affiche automatiquement à l’écran la ligne de base (figure supplémentaire 2A, ligne jaune horizontale) et l’axe de crête de chaque onde générée par chaque administration d’échantillon (lignes jaunes verticales) : vérifiez leur position correcte (ou ajustez-la en cliquant sur chaque ligne et en la déplaçant avec la souris ou les flèches) et cliquez sur Seuil OK (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE: Dans le test de mesure de la consommation de NO par Hb sans cellule, le logiciel ne parvient généralement pas à capturer correctement la forme d’onde générée par l’injection d’échantillon. En zoomant sur chaque forme d’onde, l’opérateur peut facilement assister le logiciel dans le calcul de la surface (Figure supplémentaire 2).
    2. Le logiciel trace automatiquement le début (ligne verte verticale) et la fin (ligne rouge verticale) de chaque pic causé par chaque administration d’échantillon: vérifiez leur position correcte (ou ajustez en cliquant sur chaque ligne et en la déplaçant avec la souris ou les flèches) et cliquez sur Intégrer (Figure supplémentaire 2C).
      REMARQUE: Certaines zones de la trace peuvent être définies à tort comme des injections à ce stade, et certains pics peuvent être automatiquement comptés deux fois. Les deux erreurs peuvent être réidentifiées et supprimées à l’étape 8.2.2
    3. Le logiciel fait automatiquement correspondre chaque zone de signal suite à une injection marquée pendant l’expérience et son nom attribué : naviguez dans chaque pic (indiqué par une ligne verticale jaune) avec le nom attribué en cliquant sur Pic suivant et Pic précédent, puis cliquez sur le bouton Tout OK pour enfin obtenir le calcul pour toutes les zones à l’écran.
    4. Afin de corriger toutes les erreurs de dénomination ou de correspondance commises par l’utilisateur ou par le programme, utilisez au besoin les boutons indiqués dans le fichier supplémentaire 1.
  3. Transférer les valeurs de la courbe d’étalonnage dans une feuille de calcul et générer une équation de régression linéaire (figure supplémentaire 3)
    1. Transférez les données du programme CLD vers une nouvelle feuille de calcul par copier-coller. Organisez les deux colonnes de la feuille de données en tant que Concentration d’échantillon et Aire sous la courbe, puis ajoutez une valeur correspondante de zéro sur les deux colonnes.
    2. Sélectionnez les deux colonnes, cliquez sur Insérer > Scatter, puis sous le menu Création de graphique , sélectionnez Ajouter un élément de graphique > courbe de tendance > linéaire.
    3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la courbe de tendance générée, cliquez sur Format de la courbe de tendance, puis cliquez sur les options Afficher les équations sur le graphique et Afficher la valeur R au carré sur le graphique dans le menu Format de la courbe de tendance pour obtenir une équation d’étalonnage linéaire simple.
  4. Transférer la surface calculée de chaque échantillon pour calculer sa concentration (figure supplémentaire 3)
    1. Signalez chaque valeur sur la feuille de calcul. Dans la colonne suivante, appliquez l’équation obtenue à partir de l’étape 8.3.3 pour obtenir la concentration de chaque échantillon injecté, où y est la concentration (valeur de la nouvelle colonne) et x est l’aire sous la courbe mesurée après injection.
      NOTE: N’oubliez pas de prendre en compte la concentration mesurée dans la solution de conservation (si elle est utilisée) et de soustraire les valeurs en conséquence.

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Representative Results

La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3).

La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée avec un test colorimétrique) et la consommation de NO chez les patients sortant d’un pontage cardiopulmonaire (CPB) pendant une chirurgie cardiaque est illustrée à la figure 5. On peut supposer qu’après la CPB, il y a une concentration plus élevée de groupes hémiques dans le statut Hb-Fe2+-O2 (Figure 5, rouge) par rapport aux patients recevant du NO pendant la CPB dont seule une minorité de groupes hémiques d’Hb sans cellules consomme du NO (Figure 5, vert).

Le protocole d’évaluation de la consommation de NO par Hb sans cellules a déjà été appliqué pour tester des échantillons de plasma de 50 patients subissant une chirurgie cardiaque et nécessitant une CPB. Le sang a été prélevé au départ et 15 min, 4 h et 12 h après la CPB. Le but de l’étude était d’étudier la relation existante entre la résistance vasculaire pulmonaire et systémique et l’augmentation de l’hémolyse observée après la CPB. La concentration d’Hb sans cellules a été évaluée à l’aide d’un test colorimétrique d’Hb. L’hémolyse a culminé 15 minutes après la CPB. L’Hb libre accumulé a été lentement éliminé du plasma en 12 h18 (figure 6A). Au lieu de cela, la consommation de NO a culminé à 15 minutes et a atteint les valeurs de référence en seulement 4 h (Figure 6B). Les courbes de régression linéaire de la consommation de NO par Hb sans cellule ont montré une relation stœchiométrique au point de temps post-CPB de 15 minutes par opposition à la ligne de base, 4 h et 12 h après la CPB (Figure 6C). L’explication de la différence observée dans la cinétique réside dans l’abondance de Hb libre nouvellement libéré qui n’a pas encore rencontré de molécules NO libérées par l’endothélium du patient. La concentration d’oxyHb (piégeage du NO et entraînant une consommation dans le test) était, en fait, plus élevée à 15 minutes qu’à tout autre moment. Le plasma recueilli au départ et à d’autres moments présentait une composante relativement plus élevée de metHb, qui avait déjà été oxydé par le NO, ne se liait pas au NO et ne provoquait pas de consommation dans le test. Les résistances vasculaires pulmonaires et systémiques ont été mesurées de manière invasive et ont culminé à 15 min. Pour la première fois dans cette population de patients spécifique, il a été observé que la consommation de NO par Hb libre était associée temporellement à une vasoconstriction, ce qui a confirmé des observations antérieures sur des modèles animaux et chez des patients atteints de drépanocytose18.

L’administration de gaz NO pendant la CPB et après la chirurgie augmente la quantité relative de metHb circulant par rapport à l’oxyHb. Lorsque les patients subissant une chirurgie cardiaque ont été traités avec du gaz NO en peropératoire et postopératoire, l’augmentation observée de l’Hb libre après CPB (Figure 7A) n’a pas été associée à une augmentation de la consommation de NO, telle que mesurée avec le protocole susmentionné (Figure 7B). Le gaz NO administré de manière exogène convertit la plupart de l’oxyHb en metHb, qui à son tour ne récupère pas le NO in vivo ni ne consomme de NO in vitro (données non publiées).

Figure 4
Figure 4 : Consommation d’oxyde nitrique par oxyhémoglobine purifiée sans cellules. Dosage de consommation d’oxyde nitrique effectué en injectant des échantillons de concentrations connues d’oxyhémoglobine purifiée sans cellules. La ligne de régression est indiquée en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Consommation d’oxyde nitrique et concentration d’hémoglobine sans cellules chez les patients subissant une chirurgie cardiaque avec pontage cardiopulmonaire. Le taux d’hémoglobine sans cellules de chaque patient, mesuré à l’aide d’un kit colorimétrique, a été tracé avec la consommation d’oxyde nitrique (NO) mesurée par chimiluminescence. Des échantillons de sang ont été prélevés 15 minutes après la fin de la CPB. Les lignes de régression sont indiquées pour les patients en chirurgie cardiaque ne recevant pas (en rouge) ou ne recevant pas (en vert) de NO pendant le pontage cardiopulmonaire (CPB). L’hémoglobine est exprimée en μM des groupes hémiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Consommation d’oxyde nitrique et d’hémoglobine sans cellules chez les patients en chirurgie cardiaque. (A) La concentration d’hémoglobine (Hb) sans cellules dans le plasma des patients subissant une chirurgie cardiaque avec pontage cardiopulmonaire (CPB) (N = 50) a été déterminée à différents moments à l’aide d’un kit de détermination colorimétrique disponible dans le commerce. Les données ont été analysées en adaptant un modèle mixte avec des preuves d’un effet fixe entre les points temporels. La concentration plasmatique à différents moments a été comparée à la valeur initiale avec le test de comparaison multiple de Tukey. (B) Consommation d’oxyde nitrique (NO) par plasma obtenue à partir des mêmes échantillons que ceux utilisés pour la quantification de l’Hb libre. Les données ont été analysées en assemblant un modèle mixte présentant des preuves d’un effet fixe entre les points temporels. La concentration plasmatique à différents moments a été comparée à l’inclusion avec le test de comparaison multiple de Dunnett. (C) Lignes de régression pour la teneur en plasma d’Hb sans cellules correspondant à la consommation de NO. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns non significatif. Les données sont présentées sous forme de médiane ± intervalle interquartile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Effets de l’administration de gaz d’oxyde nitrique sur la consommation d’oxyde nitrique chez les patients subissant une chirurgie cardiaque. (A) Concentration d’hémoglobine sans cellules dans le plasma des patients subissant une chirurgie cardiaque avec pontage cardiopulmonaire (CPB) recevant un placebo (N = 28) ou un gaz d’oxyde nitrique (NO) (N = 22) pendant 24 heures depuis le début de la CPB. La concentration a été déterminée à différents moments à l’aide d’un kit colorimétrique disponible dans le commerce. Les données ont été analysées par le test de Friedman, indiquant la présence d’un effet entre les points temporels dans les deux groupes. La concentration plasmatique à différents moments a été comparée à la valeur initiale avec le test de comparaison multiple de Dunn. (B) Consommation de NO par plasma obtenue à partir des mêmes échantillons utilisés pour la quantification de l’Hb sans cellules. Les données ont été analysées par le test de Friedman, indiquant la présence d’un effet entre les points temporels dans les deux groupes. La concentration plasmatique à différents moments a été comparée à la valeur initiale avec le test de comparaison multiple de Dunn. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Les données sont présentées sous forme de médiane ± intervalle interquartile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Test Mélange de réactifs Ligne de base cible (mV)
VCl3 dans HCl 5 mL de VCl3 dans une solution saturée de HCl + 100 μL d’agent antimousse 0–5 mV*
I3– dans l’acide acétique 5–7 mL de réactifI3– 0–5 mV*
AUCUNE consommation par l’hémoglobine sans cellules 5–7 mL de PBS à pH 7,4 + 100 μL d’agent antimousse + 20 μL de solution expansée de DETA-NONOate 70–100 mV**
*valeur idéale : la valeur de référence pourrait être plus élevée en raison de la qualité de l’air dans l’environnement expérimental
**assurer la stabilité pendant 20 min avant de commencer l’expérience.

Tableau 1 : Composition du réactif des vaisseaux de purge et valeur de référence cible pour divers essais de chimiluminescence. Purger la composition du réactif du récipient pour chaque essai décrit. NO = oxyde nitrique; PBS = Phosphate Buffer Saline; DETA-NONOate : (Z)-1-[2-(2-aminoéthyl)-N-(2-ammonioéthyl)amino]diazène-1-ium-1,2-diolate. *valeur idéale : la valeur de référence peut être plus élevée en raison de la qualité de l’air dans l’environnement expérimental. **assurer la stabilité pendant 20 min avant de commencer l’expérience. Pour effectuer le test de consommation de NO, l’échelle doit être modifiée sur le logiciel pour capturer des valeurs comprises entre 70 mV et 100 mV (par exemple, 0-100 mV), qui est la tension de base ciblée. Cet ajustement est suggéré pour avoir un contrôle total sur l’injection de l’échantillon, ce qui permet de documenter le signal se déplaçant de la ligne de base après l’injection d’un échantillon et d’observer le signal revenant à la ligne de base. L’enregistrement des données n’est pas influencé ni limité à l’échelle visualisée.

Figure supplémentaire 1 : Pics après la détection de NO dans le test VCl3 dans HCl. Les pics qui suivent l’administration de l’échantillon dans le VCl3 dans HCl sont affichés sur le logiciel du bundle CLD. Le calcul de la surface sous le pic pour chaque injection est indiqué pour plus de commodité et expliqué dans la figure supplémentaire 2. Dans cette expérience, des étalons de différentes concentrations ont été administrés pour la courbe d’étalonnage, suivis d’échantillons de plasma. La dilution est une solution utile pour calculer les métabolites à partir d’échantillons qui produisent du NO à l’extrémité supérieure ou même en dehors de la courbe d’étalonnage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Calcul automatisé assisté par l’utilisateur de la zone sous le pic. Lors de l’exécution du test de consommation de NO par hémoglobine sans cellules, il peut être nécessaire de définir manuellement les pics afin de fournir au logiciel les limites les plus précises pour mesurer la zone sous le pic générée par chaque injection d’échantillon. (A) Vue d’ensemble représentative d’une expérience enregistrée. On y accède en cliquant sur Traiter dans le menu principal et en sélectionnant et en ouvrant le fichier enregistré qui vous intéresse. La ligne jaune représente le seuil de signal (mV) qui constitue le segment droit de la zone sous le pic. En cliquant dessus, l’utilisateur peut le faire glisser vers la zone du signal. Les axes x et y peuvent être modifiés pour zoomer sur le pic d’intérêt pour une mesure précise en cliquant sur les boutons inférieurs gauches ou en tapant la valeur minimale et maximale souhaitée pour chacun. (B) Positionnement au seuil. L’utilisateur peut sélectionner le seuil de base optimal en faisant glisser la ligne jaune vers le point médian du signal juste avant la descente du signal causée par l’injection d’échantillon. Pour continuer à limiter la zone, l’utilisateur doit cliquer sur le bouton Définir les pics manuellement . (C) Positionnement des curseurs de début et de fin. En cliquant sur le bouton Définir le curseur de démarrage , une ligne verte apparaît à l’écran. La ligne verte doit être placée (en faisant glisser et en relâchant) au tout début de la descente causée par l’injection de l’échantillon. Le même bouton change son étiquette en Définir le curseur de fin en cliquant sur lequel une ligne rouge apparaît à l’écran. La ligne rouge doit être placée au point où le signal atteint à nouveau la ligne de base après la déviation causée par la consommation de NO de l’échantillon injecté. Au total, la ligne de seuil (jaune, B), la ligne verte et la ligne rouge dessinent avec précision la zone générée par l’injection d’échantillon. (D) Céder la superficie sous le pic. En cliquant sur le bouton Intégrer (C), la zone calculée sous le pic est affichée en haut à droite de l’écran. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Feuille de calcul représentative avec courbe d’étalonnage et résultats. Les zones calculées sous les pics générés par la consommation d’oxyde nitrique (NO) par injection d’échantillons avec une concentration connue d’hémoglobine sans cellules (exprimée en [μM] d’hème) sont indiquées en haut à gauche (sur fond jaune). Les valeurs sont tracées pour construire la courbe d’étalonnage et son équation linéaire résultante y= mx + q. La pente (m) est le nombre de groupes hémiques oxyHb (μM) nécessaires pour diminuer le signal détecté par le tube photomultiplicateur de 1 mV. Les valeurs calculées à partir d’injections triples (Run N 1,2,3) d’échantillons d’un patient obtenus à quatre moments différents (marqués par différentes couleurs de fond) ont été saisies dans la feuille de calcul. La moyenne de chaque triple a été utilisée pour donner la valeur de la consommation de NO causée par chaque échantillon en résolvant l’équation linéaire : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Equation 1

Fichier supplémentaire 1 : Examen des pics à l’aide du logiciel fourni. Ce fichier comprend une capture d’écran prise à partir du logiciel fourni et les actions autorisées pour chaque bouton. Pour chaque pic (y compris les faux pics causés par des artefacts), l’utilisateur peut utiliser les boutons indiqués dans le fichier pour confirmer, ignorer, supprimer ou nommer un pic spécifique, selon les besoins. L’utilisateur peut également enregistrer un pic qui n’a pas été détecté auparavant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé de contamination par le NO2. Chaque réactif (en particulier la solution bloquant le NO2) et chaque diluant (y compris le ddH2O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO2- afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec une demi-vie dans le sang total d’environ 10 min et génère rapidement du NO3-. Le temps qui s’écoule entre la collecte de sang et la centrifugation, ou blocage du NO2-, peut donc provoquer des erreurs préanalytiques et doit être minimisé15. Dans un dosage utilisant des échantillons de plasma, prélever le sang de préférence dans des tubes d’héparine et centrifuger à 750 x g pendant 5 min à 4 °C après blocage du groupe thiol avec 40 μL de 200 nM NEM produits en dissolvant 250 mg de NEM dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La solution mère peut être conservée à 4 °C. Les composés tels que la nitroarginine, le nitroprusside et la nitroglycérine qui inhibent la NO synthase (NOS) subissent une conversion lente et non quantitative en NO, ce qui entraîne une élévation de base. Si l’utilisation d’inhibiteurs de NOS fait partie de l’enquête, il est conseillé d’utiliser des bloqueurs qui ne contiennent pas de groupes nitro43. La pression d’entrée dans le récipient de purge doit correspondre à la pression négative continue exercée par le CLD pour l’échantillonnage. Si la pression d’entrée est faible, la distillation sous vide du milieu peut entraîner une contamination des conduites et des chambres de purge des gaz, entraînant une distorsion du signal. De plus, de petits volumes d’air peuvent pénétrer dans le récipient de purge et réagir avec la solution pour générer un no excessif. Au contraire, une pression excessive causée par un débit supérieur au débit de prélèvement de l’échantillon pourrait libérer du NO dans l’atmosphère, ce qui entraînerait une sous-estimation du signal15. En outre, le protocole VCl3 dans HCl et I3- dans l’acide acétique nécessite plusieurs dilutions pendant la préparation et de multiples calculs pour obtenir la concentration de l’échantillon. Chaque étape doit être soigneusement enregistrée car les dilutions et les calculs sont reconnus par de nombreux groupes comme la principale source d’erreur44.

L’ajoutd’une solution bloquant le NO 2 (étape 2.1.2) provoque la lyse des globules rouges, réduisant ainsi tout OxyHb en MetHb. Il évite la réduction rapide des protéines contenant du fer (principalement OxyHb) par NO2- avec la génération ultérieure de NO3-. Le traitement des échantillons avec cette solution lors du prélèvement est nécessaire pour mesurer correctement le NO2- et/ou le NO3-. En revanche, la solution ne doit pas être utilisée lors de la planification de la consommation de NO par dosage hb sans cellule. Les aliquotes de la solution bloquant le NO2- doivent être stockées avec les échantillons et utilisées pour éliminer la partie du signal causée par la solution elle-même. Enfin, les facteurs de dilution doivent être pris en compte pour calculer la concentration finale du métabolite mesuré. Dans le dosageI3- dans l’acide acétique, la concentration de NO2- est obtenue en soustrayant la concentration de l’aliquote contenant de l’AS sansHgCl2 (S-NO et Fe-NO) de celle de l’aliquote contenant uniquement du PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). Pour calculer la concentration de S-NO (protéines mercure-labiles), la concentration de l’aliquote traitée avec AS avec HgCl2 (Fe-NO ou nitroso-protéines stables au mercure) doit être soustraite de celle de l’aliquote traitée avec AS sans HgCl2. Avant de soustraire, l’utilisateur doit rappeler de multiplier la concentration de chaque aliquote par 0,8181 (270/330) pour tenir compte du facteur de dilution utilisé lors des préparations de l’échantillon (figure 3). Le même concept s’applique à la mesure du S-NO-Hb et du Hb-NO, où les concentrations absolues sont une fraction de l’Hb22 mesurée. Selon le type d’échantillon, un comptage précis de la concentration de NO3- peut nécessiter l’exécution à la fois du protocole VCl3 dans HCl et du protocoleI3- dans le protocole d’acide acétique pour finalement soustraire la concentration de NO2- de celles de NO3- et NO2-. Cela n’est pas toujours nécessaire dans les échantillons de sang total et de plasma, par exemple, où le NO3- dépasse généralement de loin le NO2-.

Il est très important de rappeler que le CLD sera endommagé si le piège NaOH n’est pas au bon endroit lors de l’exécution d’un test VCl3 dans HCl en raison de la corrosivité du HCl. La solution de NaOH 1 M utilisée pour remplir le piège NaOH peut être achetée ou préparée soit en dissolvant 4 g de sel de NaOH dans 100 mL de ddH2O, soit en diluant 5 mL de NaOH à 50 % dans 100 mL de ddH2O. Lorsqu’il est dilué à 10 μM avec ddH2O, le NaOH est très utile pour éliminer les débris protéiques par injection dans le récipient de purge.

Le signal de base détecté par le CLD doit être stable et dans les 0-5 mV. Un signal de base plus élevé pourrait être causé par la pollution de l’air (par le NO et ses dérivés), et cela peut être vérifié en laissant l’entrée à l’air libre. Si une tension plus élevée n’est observée que dans la cuve de purge, alors que la contamination du réservoir par du gaz inerte doit être envisagée, elle est le plus souvent due à la persistance de restes organiques ou à la présence de NO2- dans le tube. Le lavage de la cuve de purge plusieurs fois avec ddH2O peut aider à minimiser la tension de base. En cas d’échec, l’incubation du récipient de purge avec 100 mM de NaOH pendant 24-48 h suivie de plusieurs lavages avec ddH2O aide à éliminer les polluants. Dans le test HB sans cellule de consommation de NO, le signal CLD requis est de 70 à 100 mV pendant au moins 20 à 30 minutes. Si le signal n’est pas stable (c.-à-d. que la tension diminue), une dose supplémentaire de 10 μL de DETA NONOate peut être ajoutée au récipient de purge. Cela peut être répété au besoin. Il est essentiel de se rappeler que la poudre inutilisée et le NONOate de DETA déjà expansé doivent être maintenus à -80 ° C. Ce réactif se désintègre rapidement malgré un stockage optimal et peut-être sous-performant lorsqu’il n’est pas fraîchement préparé, nécessitant de multiples injections dans le récipient de purge et conduisant à un signal isoélectrique moins stable. Plus important encore, il devrait être étendu dans le PBS avec un pH de 7,4 car cela optimise sa demi-vie (56 h à pH 7,4 à température ambiante contre dissociation quasi instantanée à pH de 5,0)45. La seringue utilisée pour l’injection de DETA NONOate doit être exclusivement dédiée à cette action et non utilisée pour l’injection d’échantillons.

Si l’injection d’un échantillon génère un pic supérieur au point supérieur de la courbe d’étalonnage, surtout si elle génère une tension supérieure à 700 mv, il est conseillé de diluer l’échantillon (2x ou 4x) pour minimiser l’erreur. Cela s’applique également au test de consommation de NO si le creux causé par l’injection d’échantillon est plus profond que celui causé par l’injection de l’échantillon le plus concentré utilisé dans la courbe d’étalonnage. La preuve d’un pic (ou d’un passage) dans le signal après l’injection qui est inférieur à prévu ou absent peut indiquer un colmatage de la seringue de précision utilisée pour l’injection. En raison des petits volumes utilisés (10-20 μL/échantillon), en particulier si des tests plasmatiques ou urinaires sont effectués, il peut être difficile de faire la distinction entre une seringue remplie et l’absence de l’échantillon en raison du colmatage de la seringue. Il est conseillé de faire attention à la résistance faite par le piston. Après confirmation par inspection de la seringue, l’élimination de l’obstruction peut être tentée en lavant à plusieurs reprises la seringue avec ddH2O et en frottant la seringue sur une lingette de tâche délicate si l’obstruction est visible de l’extérieur. En cas de doute, il est conseillé d’éjecter le volume de l’échantillon lors d’une lingette de travail et de revenir laver la seringue avec ddH2O et d’essayer de répéter l’administration de l’échantillon. Le moussage est une complication courante et force l’expérience à se terminer une fois que la hauteur de la colonne de liquide dépasse celle de la colonne de réaction, provoquant une instabilité du signal. Le dépassement de la dose d’agent antimoussant indiquée dans le protocole peut entraîner une augmentation du signal de base et doit être évité. Le nombre d’échantillons provoquant la formation d’un moussage excessif devient prévisible lorsque des essais répétés sont effectués, un phénomène qui devrait éclairer la façon dont l’expérience peut être planifiée de manière optimale. Une étape facultative pour diminuer la mousse consiste à mélanger le plasma ou le surnageant tissulaire avec du méthanol froid (rapport 1:1) et à centrifuger pendant 15 min, 13000 x g à 4 °C. Il faut considérer que le méthanol provoque la précipitation des protéines. Seuls les S-ON et fe-NON légers qui ne sont pas de nature protéique sont mesurés. Ainsi, cette option ne peut pas être adoptée dans les études sur le sang total ou dans tout autre cas où il existe un intérêt pour les protéines S-NO et Fe-NO.

D’autres solutions de réactifs autres que VCl3 dans HCl et leI3- dans l’acide acétique ont été décrites et adoptées avec succès. L’acide ascorbique réduit spécifiquement le NO2-, ne réagit pas avec le NO3- ni les S-NO, et peut être utilisé pour réduire la masse des échantillons injectés et des calculs dans les situations où le NO2- est la seule molécule d’intérêt. Le principal piège est la stabilité limitée du réactif, nécessitant des changements plus fréquents de la solution de réactif et, par conséquent, des étalonnages répétés46. Un essai utilisant du monoxyde de carbone et de la cystéine saturée de chlorure cupreux (CuCl) (méthode 3C) peut détecter spécifiquement les S-NO avec une sensibilité comparable àI3- mais nécessite toujours un traitement avec et sans HgCl2 pour éviter des réactions non spécifiques47. Pour obtenir une plus grande précision dans l’analyse du signal, les expériences sont enregistrées au format .data afin que l’analyse de forme d’onde hors ligne puisse être effectuée avec un logiciel différent du programme groupé indiqué dans le protocole.

Une fois la première injection effectuée, l’expérience ne peut pas être arrêtée. Si une pause est nécessaire et/ou si une condition est modifiée (composition du milieu de la cuve de purge, débit de gaz de purge, tension de base), l’expérience n’est valable que pour les échantillons injectés jusqu’à ce point. Une nouvelle courbe standard doit être effectuée avant de mesurer plus d’échantillons. La précision permise par les tests basés sur la chimiluminescence a un prix. Les essais prennent beaucoup de temps pour un certain nombre de raisons: 1) l’automatisation n’est pas possible car l’injection manuelle d’échantillons est nécessaire en double; 2) la plupart des réactifs utilisés ne peuvent pas être stockés pendant de longues périodes; 3) chaque expérience doit être commencée en exécutant des échantillons étalons à des concentrations connues pour l’étalonnage et ne peut être suspendue à moins que l’étalonnage ne soit répété; 4) chaque échantillon est divisé en aliquotes contenant différents mélanges de réactifs pour bloquer des réactions spécifiques afin de calculer finalement la concentration de métabolites spécifiques en soustrayant d’autres.

Ces travaux sont axés sur le dispositif Zysense NOA 280i, qui a un seuil de détection de <1 ppb NO en phase gazeuse (correspondant à jusqu’à 1 pM de NO en phase liquide) et un débit d’échantillonnage de 10-300 mL/min. D’autres CLD sont disponibles avec un système de tubes de faisceau pour la mesure des métabolites en phase liquide. Les CLD d’écophysique ont un seuil de sensibilité plus élevé, 1 ppb dans leur modèle le plus sensible, mais l’avantage de ne pas nécessiter de réservoir d’oxygène pour la génération d’ozone. D’autre part, leur débit d’échantillonnage rapporté est de 1000 mL / min, ce qui implique une consommation plus élevée du réservoir de gaz inerte utilisé pour le récipient de purge. D’autres machines CLD sont dédiées à l’analyse du NO expiré pour un usage clinique.

La chimiluminescence est la méthode la plus sensible et la plus validée pour évaluer spécifiquement la consommation de NO par Hb sans cellules dans le domaine de l’hémolyse. D’autres techniques sont disponibles pour mesurer les composés nitroso NO, NO 2, NO3, S-NO et nitroso labile au mercure. La mesure directe du gaz NO peut être obtenue soit par chimiluminescence, soit avec l’utilisation d’électrodes dédiées allant de la mesure du gaz expiré aux électrodes à cellule unique. Ceux-ci ne mesurent que le gaz NO, sont moins chers (mais plus périssables), nécessitent un étalonnage plus fréquent et sont moins précis par rapport à un CLD31. Les nitrites et le NO3- ont été historiquement mesurés avec la réaction de Griess, une technique colorimétrique qui, dans sa version originale, détecte les deux molécules sans possibilité de distinguer leur concentration relative dans l’échantillon. Les variantes modernes de la technique impliquent la chromatographie en phase inverse utilisant la séparation de l’échantillon en deux colonnes, permettant deux réactions indépendantes avec NO3- et NO2-. La sensibilité de ces méthodes est micromolaire ou légèrement inférieure, par rapport à 1 nM avec CLD. Les principaux pièges sont la consommation de temps et l’incompatibilité avec des échantillons prétraités avec du mercure et/ou du ferricyanure14. Les S-NO peuvent être détectés avec des techniques colorimétriques et fluorométriques ainsi qu’avec une sensibilité allant jusqu’à 0,5 μM par rapport à 100 fM décrite en utilisant la chimiluminescence comme indiqué dans le protocoleI3- dans l’acide acétique 14,41,42. Le test de commutation de biotine, bien qu’il n’ait pas réussi à détecter les S-ON dans la gamme picomolaire, a l’avantage de générer des protéines marquées à la biotine qui peuvent être purifiées et identifiées par l’analyse protéomique48. Lorsqu’on l’examine en détail, chaque technique partage un piège commun, qui est l’extrême réactivité du NO et de ses dérivés imposant un blocage des réactions à des fins de mesure in vitro. Le prétraitement des échantillons est essentiel, et répondre à la question de savoir si un certain prétraitement bloque complètement une réaction ou le fait mieux qu’un autre a été jusqu’à présent une force motrice vers une augmentation des études méthodologiques. Alors que l’extrême réactivité in vivo du NO a certainement été une incitation à la recherche de méthodes sensibles pour la détection de ses métabolites, la mesure directe du NO a connu des progrès significatifs au cours des trois dernières décennies depuis le développement du premier détecteur ampérométrique en 1990. Plus de vingt sondes différentes ont été décrites depuis lors, y compris des nanocapteurs utilisés pour étudier la teneur en NO49 d’une seule cellule. Les capteurs électrochimiques sont les principaux outils capables de détecter le NO à la fois in vivo et en temps réel. En médecine pulmonaire, de nombreuses études ont comparé des machines à électrodes à des CLD. La mesure du NO expiré est plus simple que d’autres tests pour la détection de métabolites, nécessitant soit une connexion directe de la conduite de gaz (via un filtre IFD) à un complément respiratoire à système fermé, soit quelques respirations dans un sac pour une analyse hors ligne, mais le coût et la portabilité plus faible des CLD sont à l’arrêt. Un certain nombre de dispositifs électrochimiques répondent actuellement aux critères d’utilisation clinique, bien qu’ils aient une sensibilité et une reproductibilité inférieures à celles des CLD. De plus, la concordance en termes de valeurs mesurées absolues est sous-optimale entre les dispositifs, il est donc recommandé que les patients soient toujours suivis avec le même dispositif électrochimique50. L’utilisation de CLD dans des contextes tels que la mesure du NO expiré par voie nasale et dans des contextes de recherche tels que le NO inhalé à faible dose et à forte dose est toujours nécessaire.

Des mesures précises du NO, de ses dérivés et des protéines de liaison au NO sont nécessaires à de nombreux niveaux pour comprendre un mécanisme de signalisation négligé et encore pour la plupart inconnu. Les domaines d’application couvrent la biologie et la pathologie aux niveaux préclinique et clinique avec des domaines cibles spécifiques, notamment l’immunobiologie, les neurosciences, les sciences cardiovasculaires et les maladies infectieuses. Des études précliniques et des essais cliniques étudient l’utilisation du GAZ NO inhalé comme agent thérapeutique. Des connaissances plus approfondies sur la façon dont le gaz NO exogène influence la concentration de métabolites de NO et de protéines liées au NO à tous les niveaux, du plasma aux compartiments cellulaires, seront nécessaires. La mise en œuvre de la protéomique à haut rendement peut probablement augmenter le nombre de médiateurs connus qui sont influencés par le NO et ses dérivés et peut nécessiter de nouvelles études mécanistes nécessitant des mesures précises des métabolites du NO.

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Disclosures

L.B. reçoit un soutien salarial de K23 HL128882/NHLBI NIH en tant que chercheur principal pour ses travaux sur l’hémolyse et l’oxyde nitrique. LB reçoit des subventions de « Fast Grants for COVID-19 research » au Mercatus Center de l’Université George Mason et d’iNO Therapeutics LLC. B.Y. est soutenu par des subventions d’un NHLBI/#R21HL130956 et du DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. a reçu des brevets à MGH sur la production électrique d’oxyde nitrique.

L.B. et B.Y. ont déposé une demande de brevet pour l’administration de NO dans la maladie COVID-19 numéro de demande PCT: PCT/US2021/036269 déposé le 7 juin 2021. RWC reçoit un soutien salarial d’Unitaid en tant que chercheur principal pour le développement technologique visant à un diagnostic décentralisé de la tuberculose chez les enfants situés dans des milieux à faibles ressources.

Acknowledgments

Les protocoles rapportés dans ce manuscrit ont été rendus possibles grâce aux contributions accumulées par d’anciens boursiers du laboratoire de recherche en anesthésie en soins intensifs du Dr Warren Zapol, département d’anesthésie du Massachusetts General Hospital. Nous reconnaissons la contribution des Drs Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli et Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

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References

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Médecine numéro 180
Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés
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Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

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