Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Burada, nitrik oksit ve biyolojik olarak ilgili türevlerini, yüksek hassasiyete sahip kemilüminesans bazlı testler kullanarak tespit etmek için protokoller sunuyoruz.

Abstract

İn vivo nitrik oksit (NO) aktivitesi, doğrudan etkilerinin, NO otoksidasyonundan üretilen türevlerinin etkisinin ve nitroslu bileşiklerin etkilerinin birleşik sonuçlarıdır. NO metabolitlerinin ölçülmesi, hem vasküler seviyelerde hem de diğer dokularda, özellikle de eksojen NO'nun uygulandığı deneysel ortamlarda NO aktivitesini incelemek için gereklidir. Ozon bazlı kemilüminesans testleri, hem sıvılarda (plazma, doku homojenatları, hücre kültürleri dahil) hem de gaz karışımlarında (örneğin, ekshale edilen nefes) NO ve NO metabolitlerinin hassas ölçümlerine izin verir. NO, uyarılmış bir durumda azot dioksit üretmek için ozon ile reaksiyona girer. Sonuçta ortaya çıkan ışık emisyonu, fotoalgılamaya ve numunenin NO içeriğini yansıtan bir elektrik sinyalinin üretilmesine izin verir. Aynı numuneden elde edilen alikotlar, nitrat, nitrit, S-nitrosotioller ve demir-nitrosil kompleksleri gibi spesifik NO metabolitlerini ölçmek için kullanılabilir. Ek olarak, hücresiz hemoglobin tarafından tüketilen NO, kemilüminesans analizi ile de ölçülür. Tüm bu tekniklerin bir örneği verilmiştir.

Introduction

Salvador Moncada ve Nobel ödüllü Robert Furchgott, Louis Ignarro ve Ferid Murad, nitrik oksidi (NO) daha önce bilinen endotel kaynaklı gevşeme faktörü (EDRF) olarak tanımladıklarından beri, NO'nun merkezi rolü vasküler biyoloji, nörobilimler, metabolizma ve konakçı yanıtı boyunca uzanan birkaç anahtar mekanizmada kurulmuştur 1,2,3,4,5,6,7 . NO gazının eksojen olarak uygulanması, yenidoğanda pulmoner hipertansiyona bağlı solunum yetmezliği için yerleşik bir tedavi haline gelmiştir8. Nitrik oksit gazı ayrıca solunum sinsityal virüs (RSV) enfeksiyonu, sıtma ve diğer enfektif hastalıkların, iskemi-reperfüzyon hasarının tedavisinde ve kalp cerrahisi geçiren hastalarda akut böbrek hasarının önlenmesinde araştırılmıştır 9,10,11,12. NO'nun seviyelerini, metabolitlerini ve hedef protein ve bileşiklerinin seviyelerini değerlendirmek için hassas ölçüm tekniklerine duyulan ihtiyaç, hem mekanik hem de girişimsel çalışmalardan kaynaklanmaktadır.

Yüksek reaktivitesi nedeniyle, NO, üretildiği ve / veya salındığı biyolojik matrise bağlı olarak farklı reaksiyonlara maruz kalabilir. Hemoglobin (Hb) veya diğer oksi-hemoproteinlerin yokluğunda, NO neredeyse tamamen nitrite (NO2-) oksitlenir.

2NO + O 2 → 2NO2

NO 2 + NO → N2O3

N 2 O3 + H 2 O →NO2- + H+

NO, azot dioksit(NO 2) üretmek için önce moleküler oksijen (O2) ile otoksidasyona tabi tutulur ve diazot trioksit (N 2O3) üretmek için NO2'ninkendisi ile reaksiyona girer. N2O3'ün bir molekülü, iki NO 2- molekülü ve bir proton (H +) 13 oluşturmak için su (H2O) ile reaksiyona girer. Tam kan14,15 içinde, NO ve NO 2- hızla nitrata (NO 3-) dönüştürülür, çünkü bu moleküller Hb'nin oksitlenmiş heme grupları [Hb-Fe2 + -O 2 veya oksihemoglobin (oksiHb)] ile NO3- vermek için hevesle reaksiyona girer. Bu reaksiyon, heme grubunun ferrik duruma [Hb-Fe3+ veya methemoglobin (metHb)] geçişi ile birleştirilir:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ NO3-

Kırmızı kan hücresi (RBC) bariyeri ve endotelin hemen bitişiğindeki boşluk, bu reaksiyonu sınırlayan ve endotel tarafından salınan NO'nun küçük bir kısmının EDRF16,17 olarak hareket etmesine izin veren ana faktörlerdir. Aslında, dolaşımdaki hücresiz Hb'nin deneysel ve klinik ortamlarda vazodilatasyonu bozduğu bilinmektedir17,18. RBC içinde, oksijenasyona ve NO 2- konsantrasyonuna bağlı olarak, NO'nun bir kısmı demir-nitrosil Hb (Hb-Fe 2 +-NO veya HbNO) oluşturmak için deoksihemoglobin (Hb-Fe 2 +) ile reaksiyona girer:

Hb-Fe2 + + NO → Hb-Fe2+-NO

RBC15,17'de, NO 2- Hb-Fe 2+'yı azaltarak Hb-Fe 2+'yı oluşturabilir ve bu da NO'nun salınımına yol açar ve bu da Hb-Fe2+-O2 (tercihen) veya Hb-Fe 2+'yı bağlar.

NO-türevlerinin üretimi kesinlikle tek yönlü olarak kabul edilmemelidir, çünkü NO, çeşitli dokularda ve farklı enzimlerde (örneğin, bağırsak bakterileri veya mitokondri içinde, özellikle hipoksik koşullar altında) NO-2- ve NO 3'ten rejenere edilebilir19,20.

Üretilen (veya uygulanan) değişken miktarda NO, esas olarak bir NO+ donör ara maddesi (Nuc-NO+-NO 2-) oluşturan bir nükleofil varlığındaN2O3'ten tiol transnitrozasyonu ile S-nitrosothiollerin aşağı akış üretimine yol açar:

N 2 O3 + RS- → RS-NO + NO2-

S-nitrosothiols üretimi için bir başka olasılık, oksitlenmiş tiollerin nitrosilasyonudur (oksitlenmiş bir tiol ile reaksiyona giren NO):

RS• + NO → RS-NO

Bu mekanizma ve NO2 ile doğrudan tiol oksidasyonu, yalnızca başka bir yerde21'de açıklanan çok özel koşullarda mümkün olabilir. S-nitrosothioller, S-nitrosoglutathione gibi hafif moleküllerden büyük tiol içeren proteinlere kadar uzanır. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb), β zincirinde (β93C)22 korunmuş bir sistein kalıntısının bir tiol grubunun nitrozasyonu ile oluşur.

S-nitrosothiollerin üretimi ve metabolizması önemli düzenleyici mekanizmaların bir parçasıdır. Örnekler arasında glutatyon, kaspazlar, N-metil-D-Aspartat (NMDA) ve ryanodin reseptörlerinin23,24,25,26,27,28 regülasyonu sayılabilir. Daha önce in vivo olarak NO biyolojisinin önemli bir aracısı olarak kabul edilen nitrosated albümin (S-nitroso-albumin), herhangi bir spesifik ek biyolojik aktivite içermeyen bir NO / NO + taşıyıcısı gibi görünmektedir29.

NO konsantrasyonunu ve türevlerini biyolojik bir matris içindeki belirli bir biyolojik numuneden ölçerken, asitlik, oksijenasyon, sıcaklık ve reaktiflerin varlığı gibi özellikleri dikkate almak önemlidir. Örnekler arasında uygulanan eksojen NO donörleri ve akut inflamasyon durumunda, NO2ile reaksiyona giren hidrojen peroksit (H2 O2), peroksinitrit (ONOO-)21 gibi serbest radikallerin olağanüstü konsantrasyonunun oluşmasına yol açar. Kullanılan analitik yönteme ek olarak, numune hazırlama ve depolamanın analitik öncesi aşaması da esastır. İn vivo NO aktivitesini temsil etmeyen aşağı akış reaksiyonları tahmin edilmeli, dikkate alınmalı ve bloke edilmelidir. Geçerli bir örnek, ölçüm22 için hedeflendiğinde kan örneklerinin özel bir tedavisini gerektiren S-NO-Hb'nin dengesizliğidir.

Kemilüminesans bazlı testler, doku homojenatları30,31 dahil olmak üzere herhangi bir biyolojik sıvıdaki NO ve ana metabolitlerinin [NO2-, NO3-, S-NO ve demir-nitrosil kompleksleri (Fe-NO)] seviyelerini tespit etmek için altın standarttır. Bu yöntemler, NO'nun ozon (O3) ile reaksiyonunu barındıran ve uyarılmış bir durumda (NO2 •) NO2 üreten bir cihaz olan kemilüminesans dedektörüne (CLD) dayanır. NO2• gevşemesi, bir fotoçarpan tüpü tarafından algılanan bir ışık fotonunun emisyonuna neden olur ve örneklenen gaz karışımının NO içeriği ile doğru orantılı bir elektrik sinyali üretir32. CLD'nin basitleştirilmiş bir şeması temsil edilir.

Figure 1
Şekil 1: Nitrik oksit gazı için bir kemilüminesans dedektörünün basitleştirilmiş şeması. Nitrik oksidin (NO) kemilüminesans temelli tespiti, kemilüminesans dedektöründe (CLD) tanıtılan NO gaz molekülü başına bir fotonun stokiyometrik üretimidir. Kemilüminesans reaksiyonu, harici bir pompa ile bağlanarak negatif basınçta tutulan ve numune gazının sürekli ve sabit girişine izin veren dahili bir jeneratörden ozon (O3) ile beslenen belirlenmiş bir odada elde edilir. O3 üretimi, CLD ile bağlantılı özel bir O2 tankı tarafından sağlanan diyatomik oksijen (O2) gerektirir (diğer üreticiler ortam havasıyla çalışan CLD'ler sağlar). Reaksiyon odasında, örneklenen gazda bulunan her bir NO gazı molekülü, aktif durumda (NO2*) bir azot dioksit molekülü üretmek için oksijenle reaksiyona girer. Zemin durumuna geri dönerek, her NO2 * molekülü, reaksiyon odasına bitişik bulunan bir fotoçarpan tüpü (PMT) tarafından tespit edilen bir foton yayar. İlgili amplifikatör ve merkezi işlem ünitesi ile PMT, foton sayısı ve reaksiyon odasındaki NO moleküllerinin sayısı ile orantılı bir sinyal üretir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CLD'nin numune girişi, sıvı numuneler için bir reaksiyon odası içeren bir cam eşya sistemine bağlanabilir. Sistem azot, helyum veya argon gibi inert bir gazla sürekli olarak temizlenir ve NO'yu reaksiyon odasından CLD'ye aktarır.

Figure 2
Şekil 2: Nitrik oksit gazının kemilüminesans bazlı tespiti için bir tahliye kabının yapısı Temizleme kabı (sağda), nitrik oksit (NO) gazının veya bir sıvı faz reaktifinden salındığında kolayca NO gazına dönüştürülebilen başka bir bileşiğin algılanmasına izin verir. İnert gaz girişi, Argon, Xeon veya diyatomik azot (N2) gibi inert bir gazın kaynağına (tankına) bağlanır. İğne valfi (sola açılır) boşaltma kabı içindeki basınç kontrolü için kullanılır ve kabı temizlemek için tamamen çıkarılabilir. Enjeksiyon portu, numune enjeksiyonu için membran septumlu bir kapakla kaplanmıştır. Membran sık sık değiştirilmelidir. Isıtmalı bir ceket reaksiyon odasını çevreler ve HCl testinde VCl3'ü gerçekleştirmek için bir sıcak su banyosuna bağlanır. Temizleme kabı çıkışı, kemilüminesans dedektörüne (CLD) veya NaOH tuzağına (HCl tahlillerinde VCl3 için gereklidir) bağlanır. Reaksiyon odası içeriğini boşaltmak için, önce inert gaz girişindeki ve boşaltma kabı çıkışındaki stopcock'ları kapatın, iğne valfini kapatın, enjeksiyon portundaki kapağı çıkarın ve son olarak tahliyede stopcock'u açın. HCl'nin aşındırıcılığı nedeniyle HCl tahlilindeki VCl3 gerçekleştirilirse, NaOH tuzağının (solda) temizleme kabı ile CLD arasına satır içi olarak yerleştirilmesi gerekir. CLD'ye bağlantı her zaman CLD ile boşaltma kabının çıkışı (veya kullanılıyorsa NaOH tuzağı) arasına yerleştirilecek yoğun alan dielektrik (IFD) filtresini gerektirir. IFD filtresi havadaki partikülleri uzaklaştırır ve sıvının tahliye kabından geçmesini durdurur. PTFE = politetrafloroetilen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuç olarak, spesifik ve kontrollü bir kimyasal reaksiyon yoluyla NO'ya dönüştürülebilen herhangi bir bileşik, herhangi bir biyolojik sıvı ve doku homojenatında yüksek hassasiyetle tespit edilebilir24. Kemilüminesans yoluyla gaz fazı NO'nun doğrudan ölçümü hem deneysel hem de klinik ortamlarda gerçekleştirilir. Bu teknikler başka yerlerde kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır33,34,35. NO2-, S-nitrosothiols, S-nitrosated proteinler ve Fe-NO'ların ölçümü, tüm bu bileşiklerden stokiyometrik olarak NO gazını serbest bırakan triiyodür (I3-) ile bir reaksiyon karışımında numuneler eklenerek gerçekleştirilebilir:

I3- → I2 + I-

2NO 2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H 2 O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

Ben3- NO 3-15 ile reaksiyona girmezken. Her bileşiğin hassas ölçümleri, numune alikotlarının merkürik klorürlü veya merkürik klorürsüz (HgCl2) asitlenmiş sülfanilamid (AS) ile ön işlemden geçirilmesiyle mümkün olur. Özellikle, AS ile ön işlem tüm NO2- içeriğini kaldırır. Sonuç olarak, CLD tarafından ölçülen NO içeriği yalnızca S-NO'ların ve Fe-NO'ların konsantrasyonunun toplamını yansıtır. AS enjeksiyonundan önce bir numune aliquot'a HgCl2'nin enjekte edilmesi, NO2- nin S-NO tarafından salınmasına neden olur. AS ile tedavi (NO2- çıkarılmasına yol açar), ölçülen NO içeriğinin sadece Fe-NO'ların konsantrasyonunu yansıtmasını sağlar. Değerlendirmeler arasındaki bir dizi çıkarma, üç NO türevinin kesin konsantrasyonunu hesaplamaya izin verir22.

Figure 3
Şekil 3: Asetik asit kemilüminesans testinde I3- için numune hazırlama adımları. Asetik asit kemilüminesans testinde I3- hazırlanması için sıralı adımlar gösterilmiştir. Işık korumalı santrifüj tüplerinin kullanılması gereklidir. Tüp 1, 2 ve 3, tahlili hazırlamak için kullanılanlardır. Nitrat (NO3-) ölçümü gerekiyorsa, HCl testinde VCl3 için başka bir örnek aliquot (tüp 4) gereklidir. Adımlar kırmızı renkli sayılarla gösterilir. Numune hacmini eklemeden önce fosfat tampon salin (PBS) veya HgCl2 ile belirtildiği gibi önceden doldurma (Adım 1). Numune hacmini (2) belirtildiği gibi ekleyin, girdap yapın ve oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kuluçkaya yatırın. (3) PBS veya asitlenmiş sülfanilamid (AS) belirtildiği gibi, vorteks ekleyin ve RT'de 3 dakika boyunca inkübe edin. Tahlil ile ölçülen konsantrasyon, her tüp altında bildirilen bileşiklerin konsantrasyonunun toplamıdır. 1 numaralı tüp, nitrit (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) ve demir-nitrosil komplekslerinin (Fe-NO'lar) tek bir sinyal olarak ölçülmesine izin verecektir. Nitrat (NO 3-) ölçümü için, numuneler hem asetik asitte I 3- hem de HCl tahlillerinde VCl 3 ile çalıştırılmalı ve tüp 1'den elde edilen değer, tüp 4'ten elde edilenden çıkarılmalıdır. *Kalıntı NO2-, S-nitrosohemoglobin ve demir-nitrosil-hemoglobinin belirlenmesi için Hb analizi için kullanılması önerilen miktarlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NO 3- ölçümü için, hidroklorik asit (HCl) içindeki Vanadyum (III) klorür (VCl3), CLD ile NO 3- stokiyometrik olarak NO 3- ölçümü için temizleme kabında NO- 3- 'ye dönüştürülmesi için kullanılır:

2 NO 3-+ 3V +3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+

Yeterince hızlı bir dönüşüm elde etmek için, reaksiyonun 90-95 ° C'de yapılması gerekir. NO3'ten NO 2'ye indirgeme, HCl tarafından NO2'nin NO'ya indirgenmesi ile birleştirilir. Vanadyum metali ayrıca NO moiety22,36'larını serbest bırakan S-NO'ları azaltır. CLD tarafından HCl'de VCl 3 ile elde edilen nihai konsantrasyon, NO3-, NO2 ve diğer nitroslu bileşiklerin toplam konsantrasyonunu yansıtır. İkinci değerin I 3- ile CLD ile verilen konsantrasyondan çıkarılması, NO 3- konsantrasyon 36,37'nin hesaplanmasına izin verir (Şekil 3).

NO tüketim tahlilinde, (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-amonyoetil)amino]diazen-1-ium-1,2-diyol (DETA-NONOate) gibi NO donörleri tarafından temizleme kabında NO'nun sürekli salınması, enjekte edilen numunelerde hücresiz oksiHb'nin ölçülmesine izin veren kararlı bir sinyal üretir. Temizleme kabında tüketilen NO miktarı, numunedeki oksiHb miktarı ile stokiyometrik bir ilişki içindedir38.

Plazma örneklerinde NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, demir-nitrosil kompleksleri ve hücresiz Hb ile NO tüketiminin ölçümü için protokoller gösterilmiştir. RBC ortamında NO ile ilgili çalışmalar, toplam Hb konsantrasyonu 15,22'nin belirlenmesi ile birlikte son derece kırılgan S-NO-Hb ve Hb-NO'yu ölçmek için dışlama kromatografisi ile birlikte spesifik numune muamelesi ve ardından dışlama kromatografisi gerektirir. Numune hazırlama, ölçümün düzeltilmesinde etkilidir. Tahlil sırasındaH2 O'da NO 2'ninönceden varlığı ve NO 2'nin salınması, S-NO-Hb 14,39 gibi yapay olarak daha yüksek konsantrasyonlarda NO türevlerinin ölçülmesine yol açabilir. Numune hazırlamanın önemli yönleri de sunulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde belirtilen prosedürler Massachusetts Genel Hastanesi inceleme kuruluna uygundur. Kullanılan kan örnekleri önceki bir çalışma sırasında toplanmıştı ve mevcut amaç için tanımlanmamıştı18.

NOT: Boşaltma kabını, yıkamayı ve genel bakımı oluşturan boru ve cam eşyalar arasındaki optimum bağlantılarla ilgili özel rehberlik için üreticinin talimatlarına bakın. Cam eşyalara zarar vermemek için bağlantıların sağlam ve dikkatli bir şekilde yapılması gerekir. Cam tahliye kabının bileşenlerini tanımlayın: gaz giriş hattı, ısıtma ceketi ve kondenserli tahliye kabı, sodyum hidroksit (NaOH) gaz kabarcık tuzağı, tahliye kabı ile kabarcık arasındaki bağlantı hattı, yoğun bir alan dielektrik (IFD) filtresi ile donatılmış tahliye kabı çıkış gaz hattı (CLD'ye). Temizleme kabı ile CLD'nin numune girişi arasındaki bir IFD filtre hattı, sıvı formdaki NO metabolitleri (plazma, hücre kültürleri, doku homojenatları) her ölçüldüğünde (protokolde sunulan tüm tahliller) yerinde olmalıdır. Numune hazırlama, analiz edilen sıvı veya dokuya ve ilgili bileşiklere bağlıdır. Preanalitik aşamanın önemli yönleri bölüm 1 ve 2'de ele alınmıştır. Belirli tahliller için özel hazırlık adımları bölüm 3-5'te yer almaktadır. Bölüm 6-8 tüm tahliller için geçerlidir.

1. Özel reaktiflerin hazırlanması

NOT: Daha fazla ayrıntı için, önceki yayınlar 15,22'ye bakın.

  1. 500 mg sülfanilamidin 10 mL 1N HCl'ye çözündürülmesiyle NO2- giderimi için% 5 (290 mM) asitlenmiş sülfanilamid (AS) çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm aylarca kararlıdır.
  2. 67.9 mg HgCl 2'yi 5 mL PBS'ye çözerek S-NO'lardan NO2- salınımı için 50 mM merkürik klorür (HgCl2) çözeltisi hazırlayın. Stok çözümünü ışıktan koruyun.
  3. Tiol gruplarını bloke etmek için 100 mM N-etilmaleimid (NEM) ve kırmızı hücre zarlarını çözündürmek için (İSTEĞE BAĞLI)% 10 nonilfenil-polietilen glikol çözeltisi (Nonidet p-40) ile birlikte Hb'yi oksitlemek için 800 mM ferrisiyanür [K3Fe (CN)6] ile NO2 bloke çözeltisi hazırlayın.
    1. 800mM'likbir nihai konsantrasyon elde etmek için deiyonize ve damıtılmış suya (ddH2O, litre başına 263.5 g toz) K 3 Fe (CN) 6 ekleyin.
    2. ddH 2 O çözeltisindeki 800 mM K3Fe (CN)6'yaNEM ekleyin (100 mM konsantrasyona sahip olmak için litre başına 12.5 g toz) ve tüm kristalleri çözmek için çözeltiyi karıştırın.
    3. 800 mM NEM K3Fe (CN)6 100 mM NEM çözeltisinin dokuz parçasına (litre başına 111 mL) % 10 NP-40'ın bir parçasını ekleyin ve iyice karıştırın (tam kan analizi için zorunlu adım).
  4. Stok çözeltilerinden 12 mM K3Fe (CN)6, 10 mM NEM, 100 μM dietilenetriaminepentaasetik asit (DTPA, metal şelatlama için) ve% 1 Nonidet p-40 deterjan içeren S-NO-Hb stabilizasyon çözeltisini hazırlayın.
    1. PBS'ye NEM kristalleri ekleyerek 200 mM'lik bir NEM çözeltisi hazırlayın (25 mg / mL, örneğin, 10 mL PBS'de 250 mg) ve tüm kristaller çözülene kadar (deney gününde yapılacak) çözeltiyi karıştırın.
    2. ddH 2 O'ya K 3 Fe(CN)6 ekleyerek 800 mM K3Fe(CN)6 çözeltisi hazırlayın (800 mM'lik nihai konsantrasyon elde etmek için 5 mL'lik ddH2O'da 263,5 mg/mL, örneğin 1,32 g) (deney gününde yapılacaktır).
    3. 200 mL ddH 2 O'ya 786 mg DTPA ekleyerek 10 mM DTPA stok çözeltisi hazırlayın ve DTPA'yı tamamen çözündürmek için 5N NaOH ilepH'ı7,0'a ayarlayın.
    4. 7,2 pH'ta 81,5 mL PBS'ye 5 mL 200 mM NEM çözeltisi, 1,5 mL 800 mM K3Fe(CN)6 çözeltisi ve 1 mL DTPA stok çözeltisi ekleyin ve son olarak, son hacmi 100 mL'ye getirmek için sonunda 11 mL'lik %10 NP-40 ekleyin.

2. Örnek toplama

NOT: Örnek toplama hakkında daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanmış 15,22,40 numaralı eserlere bakın.

  1. Tam kan toplayın
    1. Heparin kaplı tüplerde kan toplayın, arteriyel damar yerine venöz tercih edin (özellikle gerekli olmadıkça) ve hemolizi en aza indirmek için en az 20 G veya daha büyük kateter veya iğne deliği ile venipunktur yerine kateter yerleştirmeyi tercih edin (mümkünse).
    2. Hemen NO2- bloke edici çözeltiyi (çözeltinin 1 kısmını 4 parça tam kana ekleyin), işlemi (bölüm 3 veya 4) veya dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  2. Plazma ve kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) toplayın
    1. Hemolizi en aza indirmek için arteriyel kan yerine venöz tercih eden heparin kaplı tüplerde (özellikle gerekli olmadıkça) ve hemolizi en aza indirmek için en az 20 G veya daha büyük iğnelerde kan toplayın ve 4 ° C'de 4000 x g'de hemen 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı (plazma) NO2- bloke edici çözelti (süpernatanın 4 parçasına çözeltinin 1 kısmı) ile yeni bir tüp ve işlemde (bölüm 3 veya 4) karıştırın veya -80 ° C'de dondurun ve saklayın.
      NOT: NO tüketim testi için, NO2- blokaj çözeltisi kullanılamaz. Tahlil, plazma ön işlemi olmadan yapılabilir.
    3. RBC peletini alttan S-NO stabilizasyon çözeltisi ile önceden doldurulmuş yeni bir tüpe (bkz. adım 1.4) (1 mL pelet ila 9 mL çözelti) yeniden askıya alın ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
    4. RBC lizatını, dışlama kromatografisi için daha önce ddH 2 O ile durulanmışG-25Sephadex polimeri ile boyutlandırma sütununda geçirin
    5. İşlemek için Hb fraksiyonunu toplayın (bölüm 4) ve Drabkin'in reaktifini kullanarak Hb konsantrasyonunu ölçün (Hb ölçümü için, daha önce yayınlanmış çalışma22'ye bakın).
      NOT: Belirli bir doku/organı hazırlamak ve örneklemek için, hilumunu tanımlayın ve cerrahi olarak izole edin. Damarı kesin, arteri delin ve arter yoluyla heparinize salin (10 U / mL) enjekte edin. Tuzlu su venöz insizyonda geri akmaya başladığında dokuyu tüketin. 4 parça homojenize dokuya 1 parça NO2 bloke çözeltisi eklerken dokuyu mekanik bir homojenizatör ile homojenize edin.

3. HCl tahlil hazırlığında VCl3

NOT: HCl tahlil hazırlamada VCl3 hakkında daha fazla bilgi için, daha önce yayınlanmış37,41 numaralı çalışmalara bakın.

DİKKAT: Bu tahlil yapılırken NaOH tuzağı düzgün bir şekilde yerine getirilmezse CLD hasar görecektir. Bu, HCl'nin aşındırıcılığından kaynaklanmaktadır.

  1. Standart eğri için NO3- standart çözeltileri hazırlayın
    1. 0.1 M NaNO 3- elde etmek için 10 mL ddH2O'da 85 mg NaNO3'ü çözün (bu çözelti birkaç hafta boyunca stabil kalır).
    2. Plazma veya idrar numuneleri için bir kalibrasyon eğrisi gerçekleştirmek üzere ddH2O'da seyreltme yoluyla standartlar hazırlamak için stok çözeltisini kullanın ve 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 konsantrasyonları elde edin (hücre kültürleriyle çalışıyorsanız daha düşük konsantrasyonlar kullanın).
  2. VCl 3 (vanadyum klorür) doymuş çözeltisini NO3 için hazırlayın - boşaltma kabında azalma
    DİKKAT: Su ve VCl3'ün reaksiyonu ekzotermiktir. Asit eklerken ve deneyin sonunda cam eşyaları durularken yüksek cam eşya sıcaklığına dikkat edin.
    1. 1.6 g VCl 3'ü, önce temiz bir şişeye VCl3 ekleyerek, ardından 200 mL'lik 1 M HCl'yi ekleyerek 200mL'lik 1 M HCl'de çözün.
    2. Çözeltiyi filtre kağıdından vakumla filtreleyin (11 μm filtre kağıdı gibi, ancak herhangi bir filtre kağıdı kullanılabilir).
      NOT: Filtrelenmiş çözelti berrak maviye dönerken, filtrelenmemiş VCl3 çözeltisi çözünmemiş parçacıklar nedeniyle kahverengidir.
    3. Doymuş çözeltiyi alüminyum folyo veya politetrafloroetilen (PTFE) bant ile kaplı tutun, çünkü bileşik ışığa duyarlıdır.
  3. Dolaşımdaki su banyosunu hazırlayın
    1. Dolaşımdaki bir su banyosu cihazını temizleme kabının su ceketine bağlayın. Astarlamadan önce hatların kuru olduğundan emin olun.
    2. Su banyosunu 95 ° C'de başlatın ve hatların etrafına (yapışmayan) kağıt havlular uygulayarak su hatlarında sızıntı olmadığını doğrulayın.
  4. Gaz kabarcığı tuzağını kurun
    1. Kabarcığın PTFE manşonunun yerinde olduğunu ve hasar görmediğini doğrulayın.
    2. Gaz kabarcığını açın ve kabarcık tabanına 15 mL 1 M NaOH enjekte edin.
    3. Gaz kabarcığını yeniden konumlandırın ve alt kısmı üste doğru bastırarak ve iki parçayı hafifçe bükerek bağlantıyı sıkıca kapatın. Kabarcığın üstünü kuvvet uygulamadan döndürmenin imkansızlığı, doğru bir sızdırmazlık olduğunu gösterir.
    4. Temizleme kabının çıkışını gaz kabarcığı tuzağının girişine bağlayın.

4. I3- Asetik asit tahlil hazırlamada

NOT: Asetik asit tahlil hazırlığında I3- hakkında daha fazla bilgi için, daha önce yayınlanmış15,22,38,41,42 numaralı çalışmalara bakınız.

  1. NO2- için standart eğri hazırlayın
    1. 100 mM çözelti elde etmek için 10 mL ddH 2 O içinde 69 mg sodyum nitrit (NaNO2) çözerek bir stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm, hava geçirmez bir kapta saklandığında, soğutulduğunda ve ışıktan korunduğunda kararlıdır.
    2. Stok çözeltisini 900 μL ddH2O ile önceden doldurulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne seri olarak seyreltin: İlk santrifüj tüpüne 100 μL stok çözeltisi ekleyin, karıştırın, etiketleyin ve ikinci tüp için tüpün 100 μL'sini kullanın, ardından 10 mM, 1 mM, daha sonra 100 μM ile sonuçlanan tekrarlayın.
    3. Kalibrasyon eğrisinde kullanılmak üzere 50 μM,25μM, 10 μM, 1 μM ve 500 nM NaNO 2 alikotları elde etmek için ddH2 O ile daha da seyreltin.
  2. Temizleme kabı için asetik asit içindeki I 3'ü hazırlayın (1 hafta boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir)22
    1. 40 mL ddH 2 O ve 140 mL asetik aside 2 g potasyum iyodür (KI) ve 1.3 g iyot (I2) ekleyin.
    2. Karışımı en az 30 dakika karıştırarak iyice karıştırın.
  3. NO2-, S-nitrosothiols (Hb toplanırsa S-NO-Hb) ve demir-nitrosil komplekslerinin (Hb toplanırsa Hb-NO) diferansiyel tayini için numuneleri hazırlayın (Şekil 3)
    1. Her bir numuneyi, ışık korumalı mikrosantrifüj tüplerinde 270 μL'lik (S-NO-Hb ve Hb-NO'yu ölçüyorsa 900 μL Hb) 3 alikota bölün, bunlardan 2'si 30 μL 1x PBS (S-NO-Hb ve Hb-NO'yu ölçüyorsa 100 μL) ve üçüncü tüpü 30 μL HgCl2 (S-NO-Hb ve Hb-NO'yu ölçüyorsa 100 μL) ile önceden doldurulur, vorteks ve RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 3).
    2. Fe-NO'ları ölçmek için HgCl 2 ile numuneye (Hb-NO'lar için 100 μL) ve S-NO'ları ve Fe-NO'ları ölçmek için PBS eklenmiş olana (S-NO-Hb ve Hb-NO'lar için 100 μL) %5'lik 30 μL AS ekleyin ve NO2-, S-NO'lar ve Fe-NO'ları (Hb koleksiyonundan kalan NO 2- için 100 μL) ölçmek için 1x PBS ile önceden doldurulmuş olan üçüncüye 30 μL PBS ekleyin, S-NO ve Hb-NO). RT'de 3 dakika boyunca vorteks yapın ve kuluçkaya yatın (Şekil 3).

5. Hücresiz Hb kurulumu ile tüketim YOK

NOT: Daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanmış olan38 numaralı çalışmaya bakın.

  1. Bilinen bir konsantrasyona sahip saflaştırılmış bir stok Hb çözeltisinden standart oksiHb çözeltileri hazırlayın
    1. Kalibrasyon eğrisi için kullanılacak çözeltileri elde etmek için ddH2O ilavesiyle stok çözeltisini 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine seri olarak seyreltin: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. DETA-NONOate çözümünü hazırlama
    1. 100 mM DETA-NONOate üretmek ve buz üzerinde tutmak için pH 7.4 PBS'de 610 μL 10 μM NaOH'ye 10 mg DETA-NONOate ekleyin.

6. Kemilüminesans dedektörünü (CLD) çalıştırın ve temizleme kabını hazırlayın

NOT: Temizleme kabının hazırlanması için, daha önce yayınlanmış olan43 numaralı çalışmaya bakınız.

  1. CLD'ye ve CLD'den ana bağlantıları doğrulayın
    1. Oksijen hattını CLD'ye bağlayın ve oksijen tankını CLD'nin üreticisi ile anlaşmaya varılan bir basınçta açın.
    2. Yoğun Alan Dielektrik (IFD) filtre hattının CLD'ye bağlı olduğundan ancak boşaltma kabına veya NaOH tuzağına bağlı olmadığından emin olun
  2. CLD'yi başlatın
    1. CLD arabiriminde, sıvı faz tahlilleri için algılama programını çalıştırmaya başlayın.
    2. Oksijen kaynağının yeterli olduğunu doğrulayın. Bu durumda, CLD girişinden numune almaya başarıyla başlayacak ve milivolt (0-5 mV) cinsinden bir sinyalle algılamayı gösterecektir. Aksi takdirde, CLD negatif bir tanılama sinyali ister.
  3. Temizleme kabını hazırlayın
    1. Her üç porttaki temizleme kabını kapatın: iğne valfini sağa tamamen vidalayın, giriş ve çıkış durdurma musluklarını kapatın.
    2. Kapağı temizleme kabından çıkarın ve numuneleri enjekte etmek için kullanılan şırınga iğnesinin sıvı kolonuna ulaşabilmesi için reaksiyon odasına (Tablo 1) planlanan tahile özgü yeterli miktarda reaktif ekleyin.
    3. İstenen kararlı bir taban çizgisinin varlığını doğrulayın (Tablo 1).
  4. Tahliye gazı akışını başlatın
    1. İnert gaz tankının (örneğin,N2) iki aşamalı bir regülatör ile donatıldığından emin olun ve inert gaz tankını geminin gaz girişine bağlayın.
    2. Gazı 1-5 psi regülatörde bir çıkış basıncı ile açın, boşaltma kabının girişini açın ve gaz girişine izin vermek için boşaltma kabının iğne valfini yavaşça açın. Temizleme kabı içindeki köpürmeyi doğrulayın.
  5. Gaz akışını ayarlama
    1. CLD tarafından ölçülen hücre basıncını, ortam havasını örnekleyen IFD filtre hattı ile kaydedin.
    2. Kapağı temizleme kabı üzerinde yeniden konumlandırın, IFD filtre hattını boşaltma kabına (veya HCl tahlilindeki VCl3'teki NaOH tuzağına) bağlayın ve temizleme kabının çıkışını açın.
    3. Ortam havasında kaydedilen CLD seviyesinde aynı hücre basıncına ulaşmak için iğne valfini kullanın.

7. Deney

NOT: Deneyle ilgili daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanmış olan43 numaralı çalışmaya bakın.

  1. Kemilüminesans sinyal toplama programını başlatın
    1. CLD'nin seri bağlantı noktasını, bilgisayarın edinme programının yüklü olduğu seri bağlantı noktasına bağlayın.
    2. Analiz programını çalıştırın.
    3. Al'a tıklayın, .data dosyasını kaydetmek için klasörü seçin, dosya adını yazın ve Kaydet'e tıklayın.
      NOT: Önceden ayarlanmış süre geçtiğinde kayıt otomatik olarak durduğundan, ekranda önceden ayarlanmış çalışma süresine dikkat edin. Gerekirse, önceden ayarlanmış çalışma süresi artırılabilir.
  2. Tekrarlanan numune enjeksiyonlarına hazırlanın
    1. Minimum ve/veya Maksimum düğmelerine tıklayarak ve ardından istenen değeri girerek hedeflenen taban çizgisi üzerinde kontrol sahibi olmak için ekrandaki voltaj ölçeğini ayarlayın.
    2. Şırıngayı numuneler arasında durulamak için ddH 2 O ile doldurulmuş20veya 50 mL'lik bir tüp bulundurun.
    3. Hazır bir kutu hassas görev mendili bulundurun.
  3. Numune enjeksiyonu
    NOT: Kalibrasyon eğrisi için standart çözeltilerden başlayın (en az konsantre numunelerden en konsantre numunelere enjekte edin), ardından deney numunelerine geçin (bunu kopyalar veya üçlü olarak yapmayı düşünün).
    1. Şırıngayı ddH2O ile en az iki kez veya daha fazla kez durulayın ve her numuneyi geri çekmeden önce (ve her enjeksiyondan sonra) ve bir görev silme işleminde engelsiz su tahliyesini her seferinde doğrulayın.
    2. Hem şırıngayı hem de tüpü yakın bir mesafede tutarken şırıngayı numune tüpüne yerleştirin, hava kabarcığı ve / veya homojenize edilmemiş katı parçaların sıkışmadığından emin olurken pistonu istenen hacme kadar çekin.
    3. Şırınganın ucunu bir görev sileceği ile temizleyin, ardından şırıngayı enjeksiyon portundaki septa kapağına yerleştirin ve şırınganın ucunun reaksiyon odasındaki sıvı fazda olduğunu doğruladıktan sonra enjekte edin.
  4. Yazılım programındaki enjeksiyonu işaretleyin ve bekleyin
    1. Enjeksiyonun sinyalde yukarı doğru bir değişikliğe neden olduğunu doğrulayın (Ek Şekil 1) (hücresiz Hb testi ile NO tüketiminde aşağı doğru) ve Örnek Adları'nın altındaki gri kutuyu tıklayarak örnek adını yazın, ardından İşaret Enjeksiyonu'na tıklayın.
      NOT: Numune enjeksiyonu bir sinyal üretmezse şırınga tıkanıklığından şüphelenin.
    2. Elektrik sinyalinin tekrar taban çizgisine ulaşmasını bekleyin (bu genellikle 3-4 dakika sürer). Bu süre, adım 7.3.1'i gerçekleştirmek için kullanılabilir.
  5. Deneyin sonuna kadar her enjeksiyon sırasında ve sonrasında adım 7.3 ve 7.4'te belirtilen tüm adımları tekrarlayın. Koruma çözümünün bir örneğini çalıştırmayı unutmayın (kullanılıyorsa)
  6. Denemeyi durdurma
    1. Sinyal alımını kesmek için DURDUR'a tıklayın, CLD'yi durdurun ve su banyosunu kapatın (NO3- ölçülürse).
    2. Gaz akışını kesin, iğne valfini açın, kapağı boşaltma kabından çıkarın, drenajın altına bir atık kabı yerleştirin ve boşaltma musluğunu açın.
      NOT: Deneme 60 dakikadan daha uzun süre veri toplamayı gerektiriyorsa, 60 dakikalık çalışma süresinden sonra edinimi yeniden başlatmak (7.1.3 adımını tekrarlayın) ve yeni bir dosya oluşturmak gerekir.

8. Ölçümler ve hesaplamalar

NOT: Ölçümler ve hesaplamalar çevrimdışı yapılır ve farklı bir zamanda gerçekleştirilebilir.

  1. Çevrimdışı veri analizi için kemilüminesans toplama programını başlatın
    1. Programı başlatın ve İşlem'e tıklayın.
    2. Deneme dosyasını seçin ve ardından Aç'ı tıklayın.
  2. Her yönetim için eğrinin altındaki alanı hesaplayın
    1. Yazılım, her örnek uygulaması tarafından oluşturulan her dalganın taban çizgisini (Ek Şekil 2A, yatay sarı çizgi) ve tepe eksenini (dikey sarı çizgiler) ekranda otomatik olarak grafiklendirir: doğru konumlarını doğrulayın (veya her bir çizgiye tıklayıp fare veya oklarla hareket ettirerek ayarlayın) ve Eşik Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 2B).
      NOT: Hücresiz Hb ölçüm testi ile NO tüketiminde, yazılım tipik olarak numune enjeksiyonu tarafından oluşturulan dalga formunu doğru bir şekilde yakalamayı başaramaz. Her dalga formunu yakınlaştırarak, operatör alan hesaplamasında yazılıma kolayca yardımcı olabilir (Ek Şekil 2).
    2. Yazılım, her örnek uygulamasının neden olduğu her zirvenin başlangıcını (dikey yeşil çizgi) ve sonunu (dikey kırmızı çizgi) otomatik olarak grafiklendirir: doğru konumlarını doğrulayın (veya her bir çizgiye tıklayıp fare veya oklarla hareket ettirerek ayarlayın) ve Entegre Et'e tıklayın (Ek Şekil 2C).
      NOT: İzdeki bazı alanlar bu noktada yanlışlıkla enjeksiyon olarak tanımlanabilir ve bazı zirveler otomatik olarak iki kez sayılabilir. Her iki hata da adım 8.2.2 sırasında yeniden tanımlanabilir ve kaldırılabilir.
    3. Yazılım, deney sırasında işaretlenen bir enjeksiyonu ve atanan adını takiben her sinyal alanını otomatik olarak eşleştirir: Sonraki Tepe ve Önceki Zirve'ye tıklayarak atanan adla her zirvede (sarı dikey bir çizgiyle gösterilir) gezinin, ardından ekrandaki tüm alanlar için hesaplamayı nihayet elde etmek için Tamam düğmesine tıklayın.
    4. Kullanıcı veya program tarafından yapılan tüm adlandırma veya eşleştirme hatalarını düzeltmek için, Ek Dosya 1'de belirtilen düğmeleri gerektiği gibi kullanın.
  3. Kalibrasyon eğrisi değerlerini bir elektronik tabloya aktarın ve doğrusal bir regresyon denklemi oluşturun (Ek Şekil 3)
    1. Verileri CLD programından kopyala-yapıştır yoluyla yeni bir elektronik tabloya aktarın. Veri sayfasındaki iki sütunu Örnek Konsantrasyonu ve Eğrinin Altındaki Alan olarak düzenleyin ve her iki sütuna da sıfırdan eşleşen bir değer ekleyin.
    2. İki sütunu seçin, > Dağılım Ekle'yi tıklayın, ardından Grafik Tasarımı menüsünün altında Grafik Öğesi Ekle > Eğilim Çizgisi > Doğrusal'ı seçin.
    3. Basit bir doğrusal kalibrasyon denklemi elde etmek için oluşturulan eğilim çizgisine sağ tıklayın, Eğilim Çizgisini Biçimlendir'e tıklayın, ardından Denklemleri Grafikte Görüntüle ve Eğilim Çizgisini Biçimlendir menüsünde R-kare değerini Grafikte Görüntüle seçeneklerine tıklayın.
  4. Konsantrasyonunu hesaplamak için her numunenin hesaplanan alanını aktarın (Ek Şekil 3)
    1. E-tablodaki her değeri raporlayın. Bir sonraki sütunda, enjekte edilen her numunenin konsantrasyonunu elde etmek için adım 8.3.3'ten elde edilen denklemi uygulayın; burada y, konsantrasyondur (yeni sütunun değeri) ve x, enjeksiyondan sonra ölçülen eğrinin altındaki alandır.
      NOT: Koruma çözeltisinde ölçülen konsantrasyonu (kullanılıyorsa) dikkate almayı ve değerleri buna göre çıkarmayı unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücresiz Hb testi ile NO-tüketimi, bilinen hücresiz oksiHb konsantrasyonlarını içeren örneklerde kullanılmıştır (Şekil 4). Bir oksiHb hemi stokiyometrik olarak tahlilde bir NO molekülünü serbest bıraktığından, tahlil için kalibrasyon eğrisini oluşturmak için saflaştırılmış hücresiz oksiHb kullanılır (Ek Şekil 3).

Kalp cerrahisi sırasında kardiyopulmoner bypass'tan (KPB) çıkan hastalarda hücresiz Hb (kolorimetrik tahlil ile ölçülen) ile NO tüketimi arasındaki doz-yanıt ilişkisi Şekil 5'te gösterilmiştir. CPB'den sonra, Hb-Fe2+-O 2 durumunda (Şekil 5, kırmızı), hücresiz Hb'nin heme gruplarının sadece bir azınlığının NO tükettiği CPB sırasında NO alan hastalara kıyasla daha yüksek bir heme grubu konsantrasyonu olduğu varsayılabilir (Şekil 5, yeşil).

Hücresiz Hb ile NO tüketimini değerlendirme protokolü daha önce kalp cerrahisi geçiren ve CPB gerektiren 50 hastadan plazma örneklerini test etmek için uygulanmıştı. Kan başlangıçta ve CPB'den 15 dakika, 4 saat ve 12 saat sonra toplandı. Çalışmanın amacı, hem pulmoner hem de sistemik vasküler direnç ile KPB sonrası gözlenen hemoliz artışı arasındaki mevcut ilişkiyi araştırmaktır. Hücresiz Hb konsantrasyonu Hb kolorimetrik testi ile değerlendirildi. Hemoliz CPB'den 15 dakika sonra zirveye ulaştı. Biriken serbest Hb 12 saat18 içinde plazmadan yavaşça elimine edildi (Şekil 6A). NO tüketimi, bunun yerine, 15 dakikada zirveye ulaştı ve sadece 4 saat içinde temel değerlere ulaştı (Şekil 6B). Hücresiz Hb tarafından NO tüketiminin doğrusal regresyon eğrileri, CPB sonrası 15 dakikalık zaman noktasında, CPB sonrası taban çizgisi, 4 saat ve 12 saat sonrasının aksine, stokiyometrik bir ilişki sergilemiştir (Şekil 6C). Kinetikte gözlenen farkın açıklaması, hastanın endoteli tarafından salınan NO molekülleriyle henüz karşılaşmamış olan yeni salınan serbest Hb'nin bolluğunda yatmaktadır. OxyHb konsantrasyonu (NO'yu süpürmek ve tahlilde tüketimle sonuçlanmak) aslında 15 dakikada diğer zaman noktalarından daha yüksekti. Başlangıçta ve diğer zaman noktalarında toplanan plazma, zaten NO tarafından oksitlenmiş, NO'yu bağlamayan ve tahlilde tüketime neden olmayan nispeten daha yüksek bir metHb bileşenine sahipti. Pulmoner ve sistemik vasküler dirençler invaziv olarak ölçüldü ve 15 dakikada zirveye ulaştı. Bu spesifik hasta popülasyonunda ilk kez, serbest Hb ile NO tüketiminin, hayvan modellerinde ve orak hücre hastalığı olan hastalarda önceki gözlemleri doğrulayan vazokonstriksiyon ile geçici olarak birleştiği gözlenmiştir18.

CPB sırasında ve cerrahi sonrası NO gazının uygulanması, dolaşımdaki metHb'ye karşı oksiHb'nin göreceli miktarını arttırır. Kalp cerrahisi geçiren hastalar intraoperatif ve postoperatif olarak NO-gazı ile tedavi edildiğinde, CPB sonrası gözlenen serbest Hb artışı (Şekil 7A), yukarıda belirtilen protokolle ölçüldüğü gibi NO tüketimindeki herhangi bir artışla birleştirilmemiştir (Şekil 7B). Eksojen olarak uygulanan NO gazı, çoğu oksiHb'yi metHb'ye dönüştürür, bu da HAYIR'ı in vivo olarak temizlemez veya NO in vitro tüketmez (yayınlanmamış veriler).

Figure 4
Şekil 4: Saflaştırılmış hücresiz oksihemoglobin ile nitrik oksit tüketimi. Nitrik oksit tüketim testi, saflaştırılmış hücresiz oksihemoglobinin bilinen konsantrasyonlarının numunelerinin enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Regresyon çizgisi kırmızı renkle gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. Kardiyopulmoner bypass ile kalp cerrahisi geçiren hastalardan nitrik oksit tüketimi ve hücresiz hemoglobin konsantrasyonu. Her hastanın kolorimetrik bir kit ile ölçülen hücresiz hemoglobin seviyesi, kemilüminesans yoluyla ölçülen nitrik oksit (NO) tüketimi ile çizildi. Kan örnekleri CPB'nin bitiminden 15 dakika sonra alındı. Regresyon çizgileri, kardiyopulmoner bypass (CPB) sırasında NO almayan (kırmızı renkte) veya (yeşil renkte) NO almayan kalp cerrahisi hastaları için gösterilmiştir. Hemoglobin, heme gruplarının μM cinsinden eksprese edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kalp cerrahisi hastalarında nitrik oksit tüketimi ve hücresiz hemoglobin. (A) Kardiyopulmoner bypass (KPB) ile kalp cerrahisi geçiren hastaların plazmasındaki hücresiz hemoglobin (Hb) konsantrasyonu (N=50) ticari olarak temin edilebilen kolorimetrik belirleme kiti kullanılarak farklı zaman noktalarında belirlendi. Veriler, zaman noktaları arasında sabit bir etkinin kanıtı olan karışık bir model takılarak analiz edilmiştir. Farklı zaman noktalarındaki plazma konsantrasyonu, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile taban çizgisi ile karşılaştırıldı. (B) Serbest Hb'nin nicelleştirilmesi için kullanılan aynı örneklerden elde edilen plazma ile nitrik oksit (NO) tüketimi. Veriler, zaman noktaları arasında sabit bir etkinin kanıtı olan karışık bir model takılarak analiz edilmiştir. Farklı zaman noktalarındaki plazma konsantrasyonu, Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile taban çizgisi ile karşılaştırıldı. (C) Hücresiz Hb plazma içeriği için REGRESYON çizgileri NO tüketimi ile eşleşir. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns anlamlı değil. Veriler medyan ± çeyrekler arası aralık olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Kalp cerrahisi geçiren hastalarda nitrik oksit gazı uygulamasının nitrik oksit tüketimi üzerine etkileri. (A) KPB'nin başlangıcından bu yana 24 saat boyunca plasebo (N=28) veya nitrik oksit (NO) gazı (N=22) alan kardiyopulmoner bypass (KPB) ile kalp cerrahisi geçiren hastaların plazmasındaki hücresiz hemoglobin konsantrasyonu. Konsantrasyon, ticari olarak temin edilebilen bir kolorimetrik kit kullanılarak farklı zaman noktalarında belirlendi. Veriler, her iki gruptaki zaman noktaları arasında bir etkinin varlığını gösteren Friedman'ın testi ile analiz edildi. Farklı zaman noktalarındaki plazma konsantrasyonu, Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile taban çizgisi ile karşılaştırıldı. (B) Hücresiz Hb'nin nicelleştirilmesi için kullanılan aynı örneklerden elde edilen plazma ile tüketim YOK Veriler, her iki gruptaki zaman noktaları arasında bir etkinin varlığını gösteren Friedman'ın testi ile analiz edilmiştir. Farklı zaman noktalarındaki plazma konsantrasyonu, Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile taban çizgisi ile karşılaştırıldı. ** p 0,01 <, *** p 0,001 <. Veriler medyan ± çeyrekler arası aralık olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tahlil Reaktif Karışımı Hedef Taban Çizgisi (mV)
HCl'de VCl 3 HCl doymuş çözeltide 5 mL VCl3 + 100 μL köpük önleyici madde 0–5 mV*
I3- asetik asit içinde 5–7 mL I3– reaktif 0–5 mV*
Hücresiz Hemoglobin tarafından tüketim YOK pH 7.4'te 5–7 mL PBS + köpük önleyici ajan + 20 μL genleşmiş DETA-NONOat çözeltisi 70–100 mV**
* ideal değer: Deney ortamındaki havanın kalitesi nedeniyle taban çizgisi daha yüksek olabilir
** Deneye başlamadan önce 20 dakika boyunca stabiliteyi sağlayın.

Tablo 1: Çeşitli kemilüminesans testleri için temizleme kabı reaktif bileşimi ve hedef taban çizgisi. Tarif edilen her tahlil için kap reaktif bileşimini temizleyin. NO = Nitrik Oksit; PBS = Fosfat Tampon Salin; DETA-NONOat: (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-amonyoetil)amino]diazen-1-ium-1,2-diyat. *ideal değer: Deney ortamındaki havanın kalitesi nedeniyle taban çizgisi daha yüksek olabilir. ** Deneye başlamadan önce 20 dakika boyunca stabiliteyi sağlayın. NO tüketim testini gerçekleştirmek için, kantar, hedeflenen temel voltaj olan 70 mV ile 100 mV (örneğin, 0-100 mV) arasındaki değerleri yakalamak üzere yazılımda değiştirilmelidir. Bu ayarlamanın, numune enjeksiyonu üzerinde tam kontrole sahip olması önerilmektedir, bu da bir numunenin enjeksiyonunu takiben taban çizgisinden hareket eden sinyalin belgelenmesini ve sinyalin taban çizgisine geri dönmesini gözlemlemeyi sağlar. Veri kaydı, görselleştirilmiş ölçekten etkilenmez veya bunlarla sınırlı değildir.

Ek Şekil 1: HCl testinde VCl3'te NO tespitini takiben pikler. HCl'deki VCl3'teki örnek uygulamasını takip eden tepe noktaları CLD paket yazılımında gösterilir. Her enjeksiyon için tepe noktasının altındaki alanın hesaplanması kolaylık sağlamak için gösterilmiştir ve Ek Şekil 2'de açıklanmıştır. Bu deneyde, kalibrasyon eğrisi için farklı konsantrasyonlarda standartlar uygulanmış ve bunu plazma örnekleri izlemiştir. Seyreltme, üst uçta veya hatta kalibrasyon eğrisinin dışında NO veren numunelerden metabolitleri hesaplamak için kullanışlı bir çözümdür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Zirvenin altındaki alanın kullanıcı destekli otomatik olarak hesaplanması. Hücresiz hemoglobin ile NO tüketim testi yapılırken, yazılıma her numune enjeksiyonu tarafından oluşturulan pikin altındaki alanı ölçmek için en kesin sınırları sağlamak amacıyla pikleri manuel olarak ayarlamak gerekebilir. (A) Kayıtlı bir deneyin temsili tam görünümü. Ana menüde İşlem'e tıklayarak ve ilgilendiğiniz kayıtlı dosyayı seçip açarak ulaşılır. Sarı çizgi, tepe noktasının altındaki alanın düz segmentini oluşturan sinyal eşiğini (mV) temsil eder. Üzerine tıklayarak, kullanıcı sinyal alanına doğru sürükleyebilir. X ve y ekseni, sol alt düğmelere tıklayarak veya her biri için istenen minimum ve maksimum değeri yazarak hassas ölçüm için ilgi duyulan zirveyi yakınlaştırmak üzere değiştirilebilir. (B) Eşik konumlandırma. Kullanıcı, numune enjeksiyonunun neden olduğu sinyal düşüşünden hemen önce sarı çizgiyi sinyal orta noktasına sürükleyerek en uygun taban çizgisi eşiğini seçebilir. Alanı sınırlamaya devam etmek için, kullanıcı Tepe Noktalarını Manuel Olarak Ayarla düğmesine tıklamalıdır. (C) Başlangıç ve Bitiş İmleçleri konumlandırma. Başlangıç İmlecini Ayarla düğmesine tıklandığında, ekranda yeşil bir çizgi belirir. Yeşil çizgi, numune enjeksiyonunun neden olduğu aşağı kaymanın en başına (sürüklenerek ve serbest bırakılarak) yerleştirilmelidir. Aynı düğme, ekranda kırmızı bir çizginin göründüğü simgeyi tıklatarak etiketini Bitiş İmlecini Ayarla olarak değiştirir. Kırmızı çizgi, enjekte edilen numuneden NO tüketiminin neden olduğu sapmadan sonra sinyalin tekrar taban çizgisine ulaştığı noktaya yerleştirilmelidir. Toplamda, eşik çizgisi (sarı, B), yeşil çizgi ve kırmızı çizgi, numune enjeksiyonu tarafından oluşturulan alanı tam olarak özetler. (D) Zirvenin altındaki alanın verilmesi. Entegre Et düğmesine (C) tıklandığında, zirvenin altındaki hesaplanan alan ekranın sağ üst köşesinde görüntülenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Kalibrasyon eğrisi ve sonuçları içeren temsili elektronik tablo. Bilinen bir hücresiz hemoglobin konsantrasyonuna (heme [μM] olarak ifade edilen) sahip numunelerin enjeksiyonu ile nitrik oksit (NO) tüketiminden üretilen piklerin altındaki hesaplanan alanlar sol üstte (sarı arka plan üzerinde) gösterilmiştir. Değerler, kalibrasyon eğrisini ve bunun sonucunda ortaya çıkan doğrusal denklemi y = mx + q oluşturmak için çizilir. Eğim (m), fotoçarpan tüpü tarafından algılanan sinyali 1 mV azaltmak için gereken oksiHb heme gruplarının (μM) sayısıdır. Bir hastadan dört farklı zaman noktasında (farklı arka plan renkleriyle işaretlenmiş) alınan örneklerin üçlü enjeksiyonlarından (Run N 1,2,3) hesaplanan değerler elektronik tabloya girildi. Her üçlünün ortalaması, doğrusal denklemi çözerek her bir numunenin neden olduğu NO tüketiminin değerini vermek için kullanılmıştır: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Equation 1

Ek Dosya 1: Birlikte verilen yazılımı kullanarak tepe noktalarını gözden geçirme. Bu dosya, birlikte verilen yazılımdan alınan bir ekran görüntüsünü ve her düğme için izin verilen eylemleri içerir. Her tepe noktası için (yapıtların neden olduğu yanlış tepe noktaları dahil), kullanıcı dosyada belirtilen düğmeleri kullanarak gerektiğinde belirli bir tepe noktasını onaylayabilir, göz ardı edebilir veya silebilir ya da adlandırabilir. Kullanıcı ayrıca daha önce algılanmamış bir tepe noktasını da kaydedebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yüksek hassasiyet nedeniyle, NO ve ilgili bileşiklerin belirlenmesi için kemilüminesans bazlı testler yüksekNO2 kontaminasyon riskine sahiptir. Deneyde kullanılan her reaktif (özellikle NO 2- bloke edici çözelti) ve seyreltici (ddH 2 O dahil), arka plan sinyalini düzeltmek için NO2- içeriği açısından test edilmelidir. Nitrit, tam kanda yaklaşık 10 dakika yarı ömürlü bir yarı ömür ile son derece reaktiftir ve hızlaNO3- üretir. Bu nedenle, kan toplanması ve santrifüjleme veya NO2- bloklama arasında geçen süre, preanalitik hatalara neden olabilir ve en aza indirilmelidir15. Plazma örneklerini kullanan bir tahlilde, tercihen heparin tüplerinde kan toplayın ve 250 mg NEM'in 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içine çözülmesiyle üretilen 40 μL 200 nM NEM ile tiol grubu blokajından sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj yapın. Stok çözeltisi 4 °C'de saklanabilir. NO sentazı (NOS) inhibe eden nitroarginin, nitroprusside ve nitrogliserin gibi bileşikler, NO'ya yavaş kantitatif olmayan dönüşüme uğrar ve bu da bir taban çizgisi yükselmesi ile sonuçlanır. NOS inhibitörlerinin kullanımı araştırmanın bir parçasıysa, nitro grupları içermeyen blokerlerin kullanılması önerilmektedir43. Temizleme kabındaki giriş basıncı, CLD tarafından numune alma için yapılan sürekli negatif basınçla eşleşmelidir. Giriş basıncı düşükse, ortamın vakumla damıtılması, gaz temizleme hatlarının ve odalarının kirlenmesine neden olabilir ve bu da sinyal bozulmasına neden olabilir. Ayrıca, küçük hacimli havalar temizleme kabına girebilir ve aşırı NO üretmek için çözelti ile reaksiyona girebilir. Aksine, numune geri çekilme akışından daha yüksek bir akış hızının neden olduğu aşırı basınç, NO'yu atmosfere salabilir vesinyal 15'in hafife alınmasına neden olabilir. Ek olarak, HCl'deki VCl 3 ve asetik asit protokolündeki I3- preparat sırasında çoklu seyreltmeler ve numune konsantrasyonu elde etmek için çoklu hesaplamalar gerektirir. Seyreltmeler ve hesaplamalar birçok grup tarafındanhata 44'ün ana kaynağı olarak kabul edildiğinden her adım dikkatlice kaydedilmelidir.

NO2 bloke edici çözeltinin eklenmesi (adım 2.1.2), kırmızı kan hücrelerinin lize olmasına neden olur ve tüm OxyHb'yi MetHb'ye düşürür. Demir içeren proteinlerin (öncelikle OxyHb) NO2 ile hızlı bir şekilde azaltılmasını önler - sonraki nesil NO3- ile. Numunelerin toplandıktan sonra bu çözelti ile işlenmesi, NO2- ve / veya NO3- 'yi doğru bir şekilde ölçmek için gereklidir. Buna karşılık, hücresiz Hb testi ile NO tüketimini planlarken çözelti kullanılmamalıdır. NO2- bloke edici çözeltinin alikotları numunelerle birlikte saklanmalı ve çözeltinin kendisinden kaynaklanan sinyal kısmını çıkarmak için kullanılmalıdır. Son olarak, ölçülen metabolitin nihai konsantrasyonunu hesaplamak için seyreltme faktörleri dikkate alınmalıdır. Asetik asit testinde I3- konsantrasyonu, HgCl 2 (S-NO ve Fe-NO) içermeyen AS içeren alikotun konsantrasyonunun, sadece PBS(NO 2-, S-NO, Fe-NO) içeren aliquot'unkinden çıkarılmasıyla elde edilir. S-NO'nun (cıva-kararsız proteinler) konsantrasyonunu hesaplamak için, HgCl 2 (Fe-NO'lar veya cıva stabil nitroso-proteinler) ile AS ile muamele edilen aliquot'un konsantrasyonu, HgCl2 olmadan AS ile muamele edilen alikotunkinden çıkarılmalıdır. Çıkarmadan önce, kullanıcı numune preparatları sırasında kullanılan seyreltme faktörünü dikkate almak için her bir aliquot'un konsantrasyonunu 0.8181 (270/330) ile çarptığını hatırlamalıdır (Şekil 3). Aynı kavram, mutlak konsantrasyonların ölçülen Hb22'nin bir fraksiyonu olduğu S-NO-Hb ve Hb-NO ölçümü için de geçerlidir. Numunenin türüne bağlı olarak, NO 3- konsantrasyonunun kesin bir sayımı, NO 2- konsantrasyonunu NO 3-ve NO 2- konsantrasyonundan çıkarmak için hem HCl protokolünde VCl3'ün hem de asetik asit protokolündeki I3- 'ün çalıştırılmasını gerektirebilir. Bu, tam kan ve plazma örneklerinde her zaman gerekli değildir, örneğin, NO3- tipik olarak NO 2'yi çok aşar.

HCl'nin aşındırıcılığı nedeniyle HCl testinde VCl 3 yapılırken NaOH tuzağı uygun yerde değilse, CLD'nin zarar göreceğini hatırlatmak çok önemlidir. NaOH tuzağını doldurmak için kullanılan 1 M NaOH çözeltisi, 100 mL ddH 2 O'da 4 g NaOH tuzu çözülerek veya 100 mL ddH2O'da5 mL% 50 NaOH seyreltilerek satın alınabilir veya hazırlanabilir. ddH2O ile 10 μM'ye kadar seyreltildiğinde, NaOH, temizleme kabına enjeksiyon yoluyla protein kalıntılarını gidermek için çok yararlıdır.

CLD tarafından algılanan taban çizgisi sinyali kararlı ve 0-5 mV içinde olmalıdır. Daha yüksek bir temel sinyale hava kirliliği neden olabilir (NO ve türevleri tarafından) ve bu, girişi açık havada bırakarak doğrulanabilir. Sadece tahliye kabında daha yüksek bir voltaj gözlenirse, tankın inert gazla kirlenmesi göz önünde bulundurulurken, bunun nedeni çoğunlukla organik kalıntıların kalıcılığı veya tüpte NO2- bulunmasıdır. Temizleme kabının ddH2O ile birden çok kez yıkanması, taban çizgisi voltajının en aza indirilmesine yardımcı olabilir. Başarısız olursa, temizleme kabının 24-48 saat boyunca 100 mM NaOH ile inkübasyonu ve ardından ddH2O ile çoklu yıkamalar kirleticilerin giderilmesine yardımcı olur. Hücresiz Hb testi ile NO tüketiminde, gerekli CLD sinyali en az 20-30 dakika boyunca 70-100 mV'dur. Sinyal kararlı değilse (yani, voltaj azalırsa), boşaltma kabına fazladan 10 μL DETA NONOate dozu eklenebilir. Bu gerektiğinde tekrarlanabilir. Hem kullanılmayan tozun hem de zaten genişlemiş DETA NONOate'in -80 ° C'de tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu reaktif, optimum depolamaya rağmen hızla bozulur ve belki de yeni hazırlanmadığında düşük performans gösterir, temizleme kabına çoklu enjeksiyonlar gerektirir ve daha az kararlı bir izoelektrik sinyale yol açar. Daha da önemlisi, PBS'de pH 7.4 ile genişletilmelidir, çünkü bu yarı ömrünü optimize eder (oda sıcaklığında pH 7.4'te 56 saat ve pH 5.0'da yarı-anında ayrışma)45. DETA NONOate enjeksiyonu için kullanılan şırınga, yalnızca bu eyleme adanmış olmalı ve numunelerin enjeksiyonu için kullanılmamalıdır.

Bir numunenin enjeksiyonu, kalibrasyon eğrisinin üst noktasından daha yüksek bir tepe noktası oluşturuyorsa, özellikle 700 mv'den daha yüksek bir voltaj üretiyorsa, hatayı en aza indirmek için numunenin (2x veya 4x) seyreltilmesi önerilir. Bu, numune enjeksiyonunun neden olduğu düşüşün, kalibrasyon eğrisinde kullanılan en konsantre numunenin enjeksiyonundan kaynaklanandan daha derin olması durumunda tüketim yok testi için de geçerlidir. Enjeksiyondan sonra sinyalde beklenenden daha az veya eksik olan bir tepe noktasının (veya bir geçişin) kanıtı, enjeksiyon için kullanılan hassas şırınganın tıkandığını gösterebilir. Kullanılan küçük hacimler nedeniyle (10-20 μL / numune), özellikle plazma veya idrar tahlilleri yapılırsa, doldurulmuş bir şırınga ile şırınganın tıkanması nedeniyle numunenin yokluğu arasında ayrım yapmak zor olabilir. Piston tarafından yapılan dirence dikkat etmeniz önerilir. Şırınganın incelenmesiyle onaylandıktan sonra, şırınganın ddH2O ile tekrar tekrar yıkanması ve tıkanıklık dışarıdan görülebiliyorsa şırınganın hassas bir görev silme işlemine sürtünmesi ile tıkanıklığın giderilmesi denenebilir. Şüphe duyulduğunda, numune hacmini bir görev silme işleminde çıkarmanız ve şırıngayı ddH2O ile yıkamak için geri dönmeniz ve numune uygulamasını tekrarlamaya çalışmanız önerilir. Köpüklenme yaygın bir komplikasyondur ve sıvı sütunun yüksekliği reaksiyon kolonununkini aştığında deneyin sonlandırılmasını zorlar ve sinyal kararsızlığına neden olur. Protokolde belirtilen köpük önleyici ajan dozunun aşılması, temel sinyalde bir artışa neden olabilir ve bundan kaçınılmalıdır. Aşırı köpüklenme oluşumuna neden olan numune sayısı, tekrarlanan testler yapıldığında öngörülebilir hale gelir; bu, deneyin en uygun şekilde nasıl planlanabileceğini bildirmesi gereken bir olgudur. Köpüklenmeyi azaltmak için isteğe bağlı bir adım, plazma veya doku süpernatanı ile soğuk metanol (oran 1: 1) ve santrifüj ile 15 dakika, 13000 x g 4 ° C'de karıştırmaktır. Metanolün proteinlerin çökelmesine neden olduğu düşünülmelidir. Sadece doğada proteik olmayan hafif S-NO'lar ve Fe-NO'lar ölçülür. Bu nedenle, bu seçenek tam kan üzerine yapılan çalışmalarda veya S-NO ve Fe-NO proteinlerine ilgi duyulan başka herhangi bir durumda benimsenemez.

HCl'deki VCl 3 ve asetik asitteki I3- dışındaki daha fazla reaktif çözeltisi tanımlanmış ve başarıyla benimsenmiştir. Askorbik asit özellikle NO 2'yi azaltır, NO3- veya S-NO'larla reaksiyona girmez ve NO-2'nin ilgilenilen tek molekül olduğu durumlarda enjekte edilen numunelerin ve hesaplamaların kütlesini azaltmak için kullanılabilir. Ana tuzak, reaktif çözeltisinin daha sık değiştirilmesini ve böylece tekrarlanan kalibrasyonları gerektiren reaktifin sınırlı stabilitesidir46. Karbon monoksit ve küproz klorür (CuCl) ile doymuş sistein (3C yöntemi) kullanan bir tahlil, S-NO'ları I3 ile karşılaştırılabilir bir hassasiyetle spesifik olarak tespit edebilir, ancak yine de spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için HgCl 2 ile ve HgCl2 olmadan tedavi gerektirir47. Sinyal analizinde daha yüksek hassasiyet elde etmek için, deneyler .data formatında kaydedilir, böylece çevrimdışı dalga formu analizi, protokolde gösterilen paket programı dışında farklı yazılımlarla tamamlanabilir.

İlk enjeksiyon yapıldıktan sonra, deney durdurulamaz. Bir duraklama gerekiyorsa ve/veya herhangi bir koşul değiştirilirse (tahliye kabı ortamının bileşimi, tahliye gazı akışı, taban çizgisi voltajı), deney sadece o noktaya kadar enjekte edilen numuneler için geçerlidir. Daha fazla numuneyi ölçmeden önce yeni bir standart eğri gerçekleştirilmelidir. Kemilüminesans bazlı testlerin izin verdiği hassasiyetin bir bedeli vardır. Tahliller çeşitli nedenlerden dolayı zaman alıcıdır: 1) kopyalarda manuel numune enjeksiyonu gerektiğinden otomasyon mümkün değildir; 2) kullanılan çoğu reaktif uzun süre stoklanamaz; 3) Her deneyin kalibrasyon için bilinen konsantrasyonlarda standart numuneler çalıştırılarak başlatılması gerekir ve kalibrasyon tekrarlanmadıkça duraklatılamaz; 4) Her numune, spesifik metabolitlerin konsantrasyonunu diğerlerini çıkararak nihai olarak hesaplamak için spesifik reaksiyonları bloke etmek için farklı reaktif karışımları içeren alikotlara bölünür.

Bu çalışma, gaz fazında <1 ppb NO'luk bir algılama eşiğine (sıvı fazda 1 pM'ye kadar NO'ya karşılık gelen) ve 10-300 mL / dak'lık bir örnekleme akışına sahip olan Zysense NOA 280i cihazına odaklanmıştır. Diğer CLD'ler, sıvı fazdaki metabolitlerin ölçümü için bir demet boru sistemi ile mevcuttur. Ekofizik CLD'ler daha yüksek bir hassasiyet eşiğine, en hassas modellerinde 1 ppb'ye sahiptir, ancak ozon üretimi için bir oksijen tankı gerektirmeme avantajı. Öte yandan, rapor edilen örnekleme akışları 1000 mL / dak'dır, bu da tahliye kabı için kullanılan inert gaz tankının daha yüksek bir tüketimi anlamına gelir. Diğer CLD makineleri, klinik kullanım için ekshale edilmiş NO analizine adanmıştır.

Kemilüminesans, hemoliz alanında hücresiz Hb tarafından NO tüketimini spesifik olarak değerlendirmek için en hassas ve doğrulanmış yöntemdir. NO, NO2-, NO3-, S-NO'ları ve cıva-kararsız nitroso bileşiklerini ölçmek için başka teknikler de mevcuttur. NO gazının doğrudan ölçümü, kemilüminesans yoluyla veya ekshale edilen gazın ölçümünden tek hücreli elektrotlara kadar değişen özel elektrotların kullanılmasıyla elde edilebilir. Bunlar sadece gaz YOK ölçümü, daha az pahalıdır (ancak daha fazla bozulabilir), daha sık kalibrasyon gerektirir ve CLD31'e kıyasla daha az hassastır. Nitritler ve NO3- tarihsel olarak, orijinal versiyonunda her iki molekülü de numunedeki göreceli konsantrasyonlarını ayırt etme imkanı olmadan tespit eden kolorimetrik bir teknik olan Griess reaksiyonu ile ölçülmüştür. Tekniğin modern varyantları, numunenin iki sütunda ayrılmasını sağlayan ters faz kromatografisini içerir ve NO3- ve NO2- ile iki bağımsız reaksiyona izin verir. Bu yöntemlerin duyarlılığı, CLD ile 1 nM ile karşılaştırıldığında mikromolar veya biraz daha azdır. Başlıca tuzaklar zaman tüketimi ve cıva ve / veya ferrisiyanür 14 ile önceden işlenmiş numunelerleuyumsuzluktur. S-NO'lar, kolorimetrik ve florometrik tekniklerle ve ayrıca asetik asit protokolü14,41,42'deki I3- 'de gösterildiği gibi kemilüminesans kullanılarak tanımlanan 100 fM'ye kıyasla 0,5 μM'ye kadar bir hassasiyetle tespit edilebilir. Biotin-switch testi, pikomolar aralıktaki S-NO'ları tespit edememesine rağmen, proteomik analiz48 ile saflaştırılabilen ve tanımlanabilen biyotin etiketli proteinler üretme avantajına sahiptir. Ayrıntılı olarak bakıldığında, her teknik, NO'nun aşırı reaktivitesi ve türevlerinin in vitro ölçüm amacıyla reaksiyonların blokajını zorunlu kılan ortak bir tuzağı paylaşır. Numunelerin ön muamelesi kritiktir ve belirli bir ön işlemin bir reaksiyonu tamamen engelleyip engellemediği veya diğerinden daha iyi olup olmadığı sorusuna cevap vermek, şimdiye kadar metodolojik çalışmalarda bir artışa doğru itici bir güç olmuştur. NO'nun in vivo aşırı reaktivitesi, metabolitlerinin tespiti için hassas yöntemleri araştırmak için kesinlikle bir itici güç olsa da, NO'nun doğrudan ölçümü, ilk amperometrik dedektörün 1990 yılında geliştirilmesinden bu yana son otuz yılda önemli ilerlemeler kaydetmiştir. O zamandan beri, tek hücreli NO içeriğini incelemek için kullanılan nanosensörler de dahil olmak üzere yirmiden fazla farklı prob tanımlanmıştır49. Elektrokimyasal sensörler, NO'yu hem in vivo hem de gerçek zamanlı olarak tespit edebilen ana araçlardır. Ekshale edilen NO'nun ölçümü, gaz hattının (IFD filtresi aracılığıyla) kapalı sistem solunum yardımcısına doğrudan bağlanmasını veya çevrimdışı analiz için bir torbada birkaç nefes alınmasını gerektiren, metabolit tespiti için diğer tahlillerden daha basittir, ancak CLD'lerin maliyeti ve daha zayıf taşınabilirliği durur. Bir dizi elektrokimyasal cihaz şu anda klinik kullanım kriterlerini karşılamaktadır, ancak CLD'lere kıyasla daha düşük hassasiyete ve tekrarlanabilirliğe sahiptirler. Ayrıca, mutlak ölçülen değerler açısından uyum cihazlar arasında optimal değildir, bu nedenle hastaların her zaman aynı elektrokimyasal cihazla takip edilmesi önerilir50. CLD'lerin ölçüm nazal ekshale NO gibi ortamlarda ve terapötik düşük ve yüksek dozda inhale NO gibi araştırma ortamlarında kullanımı hala gereklidir.

NO, türevleri ve NO-bağlayıcı proteinlerin hassas ölçümleri, gözden kaçan ve hala çoğunlukla bilinmeyen bir sinyal mekanizmasını anlamak için birçok seviyede gereklidir. Uygulama alanları, immünobiyoloji, nörobilimler, kardiyovasküler bilimler ve enfektif hastalıklar dahil olmak üzere spesifik hedef alanlarla hem klinik öncesi hem de klinik düzeyde biyoloji ve patolojiyi kapsamaktadır. Preklinik çalışmalar ve klinik çalışmalar, inhale NO gazının terapötik bir ajan olarak kullanımını araştırmaktadır. Eksojen NO gazının, plazmadan hücre bölmelerine kadar her seviyede NO metabolitlerinin ve NO-bağlı proteinlerin konsantrasyonunu nasıl etkilediği hakkında daha derin bilgi gerekli olacaktır. Yüksek verimli proteomiklerin uygulanması, NO ve türevlerinden etkilenen bilinen mediatörlerin sayısını artırabilir ve NO metabolitlerinin kesin ölçümlerini gerektiren yeni mekanik araştırmaları zorunlu kılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B., hemoliz ve nitrik oksit üzerindeki çalışmaları için baş araştırmacı olarak K23 HL128882 / NHLBI NIH'den maaş desteği almaktadır. LB, George Mason Üniversitesi Mercatus Merkezi'ndeki "COVID-19 araştırması için Hızlı Hibeler" ve iNO Therapeutics LLC'den hibe aldı. B.Y., NHLBI/#R21HL130956 ve DOD/Cenevre Vakfı'ndan (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244) gelen hibelerle desteklenmektedir. B.Y., MGH'de nitrik oksitin elektrik üretimi konusunda patent aldı.

L.B. ve B.Y., COVID-19 hastalığında NO teslimatı için patent başvurusunda bulundu PCT başvuru numarası: PCT / US2021 / 036269 7 Haziran 2021'de dosyalandı. RWC, düşük kaynak ortamlarında bulunan çocuklarda tüberkülozun merkezi olmayan teşhisini amaçlayan teknoloji geliştirme baş araştırmacısı olarak Unitaid'den maaş desteği almaktadır.

Acknowledgments

Bu makalede bildirilen protokoller, Dr. Warren Zapol'un Massachusetts Genel Hastanesi Anestezi Bölümü Kritik Bakımda Anestezi Araştırma Laboratuvarı'nın önceki bursiyerlerinin birikmiş katkılarıyla mümkün olmuştur. Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ve Emanuele Rezoagli'nin katkılarını takdir ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Tıp Sayı 180
Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter