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Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Abstract

A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.

Introduction

Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tratamento estabelecido para insuficiência respiratória devido à hipertensão pulmonar no recém-nascido8. O gás óxido nítrico também tem sido investigado para o tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), malária e outras doenças infecciosas, lesão de isquemia-reperfusão e para prevenção de lesão renal aguda em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca 9,10,11,12. A necessidade de técnicas precisas de medição para avaliar os níveis de NO, seus metabólitos e os de suas proteínas e compostos-alvo surge tanto de estudos mecanicistas quanto intervencionistas.

Devido à sua alta reatividade, a NO pode sofrer reações diferentes dependendo da matriz biológica em que é produzida e/ou liberada. Na ausência de hemoglobina (Hb) ou outras hemoproteínas de oxi, a NO é oxidada quase completamente ao nitrito (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

O NO primeiro sofre autoxidação com oxigênio molecular (O2) para produzir dióxido de nitrogênio (NO2) e reage com o próprio NO2 para gerar trióxido de dinitrogen (N2O3). Uma molécula de N2O3 reage com água (H2O) para formar duas moléculas de NO2- e um próton (H+)13. Dentro de sangue inteiro14,15, NO e NO2- são rapidamente convertidos em nitrato (NO3-) como essas moléculas reagem avidamente com os grupos de heme oxidado de Hb [Hb-Fe2+-O2 ou oximosoglobina (oxicodona)] para produzir NO3-. Esta reação é associada à transição do grupo heme para o estado férrico [Hb-Fe3+ ou methemoglobina (metHb)]:

HB-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

A barreira das células vermelhas do sangue (RBC) e o espaço imediatamente adjacente ao endotélio são os principais fatores que limitam essa reação e permitem que uma pequena porção do NO liberada pelo endotélio atue como EDRF16,17. Na verdade, o Hb livre de células na circulação é conhecido por interromper a vasodilatação em ambientes experimentais e clínicos17,18. Dentro da RBC, dependendo da oxigenação e da concentração NO2, uma porção de NO reage com desoxihemoglobina (Hb-Fe2+) para formar ferro-nitrosol Hb (Hb-Fe2+-NO ou HbNO):

HB-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

Na RBC15,17, o NO2- pode formar o Hb-Fe3+ reduzindo o Hb-Fe2+ levando ao lançamento do NO, que por sua vez liga o Hb-Fe2+-O2 (preferencialmente) ou o Hb-Fe2+.

A geração de no-derivados não deve ser considerada estritamente unidirecional, pois o NO pode ser regenerado a partir de NO2- e NO3- em vários tecidos e por diferentes enzimas (por exemplo, por bactérias intestinais ou dentro das mitocôndrias, particularmente sob condições hipoxicas)19,20.

Uma quantidade variável de NO produzido (ou administrado) leva à geração a jusante de S-nitrosothiols, principalmente por transinrose de thiol a partir de N2O3 na presença de um nucleófilo criando um intermediário doador NO+ (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Outra possibilidade para a geração de S-nitrosothiols é a nitrosiagem de tiais oxidados (NÃO reage com um tiol oxidado):

RS• + NO → RS-NO

Este mecanismo e oxidação direta de thiol pelo NO2 só podem ser possíveis em condições muito específicas que são descritas em outros lugares21. Os s-nitrosothiols variam de moléculas leves como S-nitrosoglutathione a grandes proteínas que contêm tiol. A s-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) é formada por nitrosão de um grupo de tiol de um resíduo de cisteína conservado na cadeia de β (β93C)22.

A geração e o metabolismo dos S-nitrosothiols fazem parte de importantes mecanismos regulatórios. Exemplos incluem regulação de glutathione, caspases, N-metil-D-Aspartato (NMDA) e receptores de ryanodo 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerado como um grande mediador da NO biology in vivo, a albumina nitrosa (S-nitroso-albumina) parece ser um transportador NO/NO+ sem qualquer atividade biológica adicional específica29.

Ao medir a concentração de NO e seus derivados de uma amostra biológica específica dentro de uma matriz biológica, é importante considerar características como acidez, oxigenação, temperatura e presença de reagentes. Exemplos incluem doadores exógenos administrados NO e, no cenário de inflamação aguda, peróxido de hidrogênio (H2O2) reagindo com o NO2 levando à geração de concentração supernormal de radicais livres como a peroxitorita (ONOO-)21. Além do método analítico que é empregado, a fase pré-analítica da preparação e armazenamento da amostra é fundamental. Reações a jusante que não representam a atividade in vivo NO devem ser previstas, consideradas e bloqueadas. Um exemplo válido é a instabilidade do S-NO-Hb, que exige um tratamento dedicado de amostras de sangue quando é direcionado para a medição22.

Ensaios baseados em chemiluminescência são o padrão-ouro para detectar os níveis de NO e seus principais metabólitos [NO2-, NO3-, S-NO e complexos ferro-nitrosol (Fe-NO)] em qualquer fluido biológico, incluindo homogeneiza tecidos30,31. Esses métodos dependem do detector de chemiluminescência (CLD), um dispositivo que abriga a reação de NO com ozônio (O3), gerando o Nº2 em estado animado (NO2•). Relaxamento do NO2• causa emissão de um fóton de luz detectado por um tubo fotomultiplier, gerando um sinal elétrico diretamente proporcional ao teor NO da mistura de gás amostrado32. Um esquema simplificado do CLD está representado.

Figure 1
Figura 1: Esquema simplificado de um detector de quimiluminescência para gás óxido nítrico. A detecção baseada em óxido nítrico (NO) é a geração estequiométrica de uma molécula de gás NO que é introduzida no detector de quimiominascência (CID). A reação de chemiluminescência é obtida em uma câmara designada fornecida com ozônio (O3) de um gerador interno, que é mantida em pressão negativa por conexão com uma bomba externa, permitindo entrada contínua e constante de gás amostral. A geração de O3 requer oxigênio diatômico (O2) que é fornecido por um tanque O2 dedicado conectado com o CLD (outros fabricantes fornecem CLDs operando com ar ambiente). Dentro da câmara de reação, cada molécula de gás NO contido no gás amostrado reage com oxigênio para produzir uma molécula de dióxido de nitrogênio no estado ativado (NO2*). Ao retornar ao seu estado terrestre, cada molécula NO2* emite um fóton que é detectado por um tubo fotomultiplier (PMT) localizado ao lado da câmara de reação. O TPM com o amplificador associado e unidade de processamento central produz um sinal proporcional à contagem de fótons e ao número de nenhuma molécula na câmara de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A entrada amostral do CLD pode ser conectada a um sistema de vidro contendo uma câmara de reação para amostras líquidas. O sistema é continuamente purgado com um gás inerte como nitrogênio, hélio ou argônio, transferindo NÃO da câmara de reação para o CLD. Amostras de fase líquida são injetadas através de uma membrana dedicada no vaso de purga.

Figure 2
Figura 2: Estrutura de um vaso de purga para detecção baseada em óxido nítrico à base de quimiotrica O vaso de purga (à direita) permite a detecção de gás óxido nítrico (NO) ou qualquer outro composto que possa ser facilmente convertido em nenhum gás quando liberado de um reagente de fase líquida. A entrada de gás inerte está conectada a uma fonte (tanque) de um gás inerte como Argon, Xeon ou nitrogênio diatômico (N2). A válvula da agulha (abre à esquerda) é usada para controle de pressão dentro do vaso de purga e pode ser completamente removida para limpar o vaso. A porta de injeção é coberta por uma tampa com um septo de membrana para injeção de amostra. A membrana deve ser substituída com frequência. Uma jaqueta aquecida envolve a câmara de reação e é conectada a um banho de água quente para realizar o teste VCl3 em HCl. A saída do vaso de purgação está conectada ao detector de quimiominascência (CLD) ou à armadilha NaOH (necessária para vcl3 em ensaios HCl). Para drenar o conteúdo da câmara de reação, primeiro feche as torneiras na entrada de gás inerte e a saída do vaso de purga, feche a válvula da agulha, remova a tampa no porta de injeção e, finalmente, abra a torneira no ralo. A armadilha NaOH (esquerda) é necessária para ser colocada em linha entre o vaso de purga e o CLD se o ensaio VCl3 em HCl for realizado devido à corrosão do HCL. A conexão com o CLD sempre requer um filtro de campo intenso (IFD) a ser colocado entre o CLD e a saída do vaso de purga (ou a armadilha NaOH, se usado). O filtro IFD remove partículas aéreas e impede que o líquido passe pelo vaso de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como consequência, qualquer composto que possa ser convertido em NÃO através de uma reação química específica e controlada pode ser detectado com alta sensibilidade em qualquer fluido biológico e homogeneizar tecido24. A medição direta da fase de gás NO através da chemiluminescência é realizada tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Essas técnicas são amplamente descritas em outros lugares 33,34,35. A medição de NO2-, S-nitrosothiols, proteínas S-nitrosated e Fe-NOs pode ser realizada adicionando amostras em uma mistura de reação com triiodeto (I3-), que não libera gás estelioetricamente de todos esses compostos:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

enquanto eu3- não reage com o NO 3-15. Medições precisas de cada composto são possíveis pelo pré-tratamento de alíquotas amostrais com sulfanilamida acidificada (AS) com ou sem cloreto mercúrico (HgCl2). Especificamente, o pré-tratamento com AS remove todo o conteúdo NO 2. Como consequência, o conteúdo NO medido pelo CLD reflete apenas a soma da concentração de S-NOs e Fe-NOs. A injeção de HgCl2 em uma alíquota de amostra antes da injeção de AS faz com que o NO2- seja liberado pelo S-NO. O tratamento com AS (levando à remoção nº2) garante que o teor de NÃO medido só reflete a concentração de Fe-NOs. Uma série de subtrações entre as avaliações permitem calcular a concentração precisa dos três derivados NO22.

Figure 3
Figura 3: Etapas na preparação da amostra para o ensaio i3- em ácido acético quemiluminescence. Os passos sequenciais para a preparação do ensaio i3- em ácido acético chemiluminescence são ilustrados. É necessário o uso de tubos de centrífuga protegidos pela luz. Os tubos 1, 2 e 3 são os usados para se preparar para o ensaio. Outra alíquota de amostra (tubo 4) é necessária para o ensaio VCl3 em HCl se for necessária a medição do nitrato (NO3-). As etapas são indicadas por números em vermelho. Pré-preenchimento (Passo 1) conforme indicado com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou HgCl2 antes de adicionar o volume amostral. Adicione o volume amostral (2) conforme indicado, vórtice e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente (RT). Adicionar (3) PBS ou sulfanilamida acidificada (AS) conforme indicado,vórtice e incubar por 3 min no RT. Execute o ensaio (4). A concentração medida pelo ensaio é a soma da concentração dos compostos relatados sob cada tubo. O tubo número 1 permitirá medições de nitrito (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) e complexos ferro-nitrosilo (Fe-NOs) como um único sinal. Para a medição do nitrato (NO3-), as amostras devem ser executadas com i3- em ácido acético e VCl3 em ensaios de HCl, e o valor obtido a partir do tubo 1 deve ser subtraído do obtido do tubo 4. *Quantidades sugeridas a serem utilizadas para análise de Hb para determinação de resíduos NO2-, S-nitrosohemoglobina e ferro-nitrosibina-hemoglobina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para a medição Nº3, o cloreto de vanádio (III) (VCl3) em ácido clorídrico (HCl) é usado para conversão de NO3- a NO no vaso de purga, a fim de medir o nº3- estequiometricalmente com o CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

Para conseguir uma conversão suficientemente rápida, a reação precisa ser realizada a 90-95 °C. A redução de NO3- para NO2- é associada à redução de NO2- para NO por HCl. O metal vanadium também reduz os S-NOs liberando seu NO moiety22,36. A concentração final obtida pelo CLD com VCl3 em HCl reflete a concentração agregada de NO3-, NO2 e outros compostos nitrosados. A subtração do último valor da concentração rendeda com CLD com I3- permite o cálculo de Nº3- concentração36,37 (Figura 3).

No ensaio de consumo NO, a liberação contínua de NÃO no recipiente de purga por NENHUM doador como (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) gera um sinal estável permitindo quantificar oxiHb sem células nas amostras injetadas. A quantidade de NÃO consumida no vaso de purga está em uma relação estequiométrica com a quantidade de oxicodona na amostra38.

Protocolos para medição de NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, complexos ferro-nitrosilo e NO consumo por Hb livre de células em amostras de plasma são ilustrados. Estudos sobre NÃO no ambiente RBC requerem tratamento amostral específico seguido de cromatografia de exclusão para medir s-no-hb e hb-no extremamente frágeis, juntamente com a determinação da concentração total de Hb15,22. A preparação da amostra é fundamental na correção da medição. A pré-existência do NO2- em H2O e liberação do Nº2- durante o ensaio pode levar à medição de concentrações artificialmente maiores de nenhum derivado, como o S-NO-Hb14,39. Aspectos importantes da preparação da amostra também são apresentados.

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Protocol

Os procedimentos indicados neste protocolo estão de acordo com o conselho de revisão do Hospital Geral de Massachusetts. As amostras de sangue utilizadas foram coletadas durante um estudo anterior e foram desidentifidas para a finalidade atual18.

NOTA: Consulte as instruções do fabricante para obter orientações específicas sobre as conexões ideais entre tubos e vidros que constituem o vaso de purga, a lavagem e a manutenção geral. As conexões precisam ser firmes e cuidadosamente feitas para não danificar os vidros. Identifique os componentes do vaso de purga de vidro: linha de entrada de gás, vaso de purga com jaqueta de aquecimento e condensador, armadilha de bolha de gás de hidróxido de sódio (NaOH), linha de conexão entre o vaso de purga e o borbulhador, linha de gás de saída de purga (para CLD) dotada de um filtro dieletrico de campo intenso (IFD). Uma linha de filtro IFD entre o vaso de purga e a entrada amostral do CLD deve estar no lugar toda vez que não metabólitos em forma líquida (plasma, culturas celulares, homogeneizadores teciduais) (todos os ensaios apresentados no protocolo). A preparação da amostra depende do fluido ou tecido analisado e dos compostos de interesse. Aspectos importantes da fase pré-analítica são abordados nas seções 1 e 2. As etapas específicas de preparação para ensaios específicos estão incluídas nas seções 3-5. As seções 6-8 aplicam-se a todos os ensaios.

1. Preparação de reagentes dedicados

NOTA: Para mais detalhes, consulte as publicações anteriores15,22.

  1. Prepare 5% (290 mM) solução de sulfanilamida acidificada (AS) para remoção nº2, dissolvendo 500 mg de sulfanilamida em 10 mL de 1N HCl. Esta solução está estável há meses.
  2. Prepare a solução de cloreto mercurico de 50 mM (HgCl2) para o NO2- liberação de S-NOs dissolvendo 67,9 mgs de HgCl2 em 5 mL de PBS. Proteja a solução de estoque da luz.
  3. Prepare a solução de bloqueio NO 2 com ferricyanida de 800 mM [K3Fe(CN)6] para oxidar hb juntamente com 100 mM N-ethylmaleimida (NEM) para bloquear grupos de tiol e (OPCIONAL) solução glicol não-fenil-polietileno (Nonidet p-40) para solubilizar membranas celulares vermelhas.
    1. Adicione K3Fe(CN)6 à água desionizada e destilada (ddH2O, 263,5 g de pó por litro) para obter uma concentração final de 800 mM.
    2. Adicione NEM aos 800 mM K3Fe(CN)6 na solução ddH2O (12,5 g de pó por litro para ter concentração de 100 mM) e misture a solução para dissolver todos os cristais.
    3. Adicione uma parte de 10% NP-40 a nove partes da solução NEM K3Fe(CN) 6 100 mM NEM (111 mL por litro) e misture bem (passo obrigatório para análise de sangue integral).
  4. Prepare a solução de estabilização S-NO-Hb contendo 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM de ácido dietilenetriaminepentaactic (DTPA, para quelação metálica) e 1% de detergente nãoidet p-40 de suas soluções de estoque.
    1. Prepare uma solução NEM de 200 mM adicionando cristais NEM ao PBS (25 mg/mL, por exemplo, 250 mgs em PBS de 10 mL) e misture a solução até que todos os cristais sejam dissolvidos (a ser feito no dia do experimento).
    2. Prepare uma solução de 800 mM K3Fe(CN)6 adicionando K3Fe(CN)6 a ddH2O (263,5 mg/mL, por exemplo, 1,32 g em 5 mL de ddH2O para obter concentração final de 800 mM) (a ser feita no dia do experimento).
    3. Prepare uma solução de estoque DTPA de 10 mM adicionando 786 mg de DTPA a 200 mL de ddH2O e ajuste pH para 7.0 com 5N NaOH para solubilizar totalmente o DTPA.
    4. Adicione 5 mL de solução NEM de 200 mM, 1,5 mL de solução 800 mM K3Fe(CN)6 e 1 mL de solução de estoque DTPA para 81,5 mL de PBS a 7,2 pH e, finalmente, adicione 11 mL de 10% NP-40 finalmente para trazer volume final a 7,2 mL.

2. Coleta de amostras

NOTA: Para obter mais detalhes sobre a coleta de amostras, consulte as obras publicadas anteriormente 15,22,40.

  1. Coletar sangue inteiro
    1. Coletar sangue em tubos revestidos de heparina preferindo venoso sobre vaso arterial (a menos que especificamente necessário) e preferindo a colocação do cateter em vez de venipuntura (se possível) com cateter ou furo de agulha de pelo menos 20 G ou maior para minimizar a hemólise.
    2. Adicione imediatamente a solução de bloqueio NO 2 (1 parte da solução para 4 partes de sangue inteiro), processe (seções 3 ou 4) ou congele e armazene a -80 °C.
  2. Coletar plasma e glóbulos vermelhos (RBCs)
    1. Coletar sangue em tubos revestidos de heparina que preferem sangue venoso em vez de sangue arterial (a menos que especificamente necessário) e agulhas de pelo menos 20 G ou maiores para minimizar a hemolise e centrífuga imediatamente por 5 min a 4000 x g a 4 °C.
    2. Misture o supernatante (plasma) com a solução de bloqueio NO 2 (1 parte da solução para 4 partes do supernatante) em um novo tubo e processo (seções 3 ou 4), ou congele e armazene a -80 °C.
      NOTA: Para o ensaio de não consumo, a solução de bloqueio NO 2 não pode ser utilizada. O ensaio pode ser realizado sem pré-tratamento de plasma.
    3. Resuspende a pelota RBC de baixo para um novo tubo pré-preenchido com solução de estabilização S-NO (ver passo 1.4) (1 mL de pelota a 9 mL de solução) e incubar por 5 min.
    4. Passe o lise RBC em uma coluna de dimensionamento com polímero sephadex G-25 que foi previamente enxaguado com ddH2O para cromatografia de exclusão
    5. Colete a fração hb para processar (seção 4) e para medir a concentração de Hb usando o reagente de Drabkin (para medição de Hb, consulte o trabalho publicado anteriormente22).
      NOTA: Para preparar e provar um tecido/órgão específico, identifique seu hilum e isole-o cirurgicamente. Incisar a veia, perfurar a artéria e injetar soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) através da artéria. Extirpara o tecido quando a solução salina começar a retrofluir na incisão venosa. Homogeneize o tecido com um homogeneizador mecânico ao adicionar 1 parte da solução de bloqueio NO 2 a 4 partes do tecido homogeneizado.

3. VCl3 na preparação do ensaio HCl

NOTA: Para obter mais detalhes sobre a preparação do ensaio de VCl3 no HCl, consulte os trabalhos publicados anteriormente37,41.

ATENÇÃO: O CLD será danificado se a armadilha NaOH não estiver corretamente no lugar ao realizar este ensaio. Isso é devido à corrosão do HCL.

  1. Prepare soluções padrão de NO3- para curva padrão
    1. Dissolver 85 mg de NaNO3 em 10 mL de ddH2O para obter 0,1 M NaNO3- (esta solução permanece estável por algumas semanas).
    2. Use a solução de estoque para preparar padrões por diluição em ddH2O para obter concentrações de 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 para realizar uma curva de calibração para amostras de plasma ou urina (use concentrações mais baixas se trabalhar com culturas celulares).
  2. Prepare a solução saturada VCl3 (cloreto de vanádio) para a redução no3º no vaso de purga
    ATENÇÃO: A reação da água e do VCl3 é exotérmica. Preste atenção à alta temperatura do vidro ao adicionar ácido e ao enxaguar os vidros no final do experimento.
    1. Dissolva 1,6 g de VCl3 em 200 mL de 1 M HCl adicionando primeiro VCl3 em um frasco limpo e adicionando 200 mL de 1 M HCl.
    2. Filtro de vácuo a solução através de papel filtro (como papel filtro de 11 μm, mas qualquer papel filtro pode ser usado).
      NOTA: A solução filtrada deve tornar-se azul claro, enquanto a solução VCl3 não filtrada é marrom devido a partículas não resolvidas.
    3. Mantenha a solução saturada coberta com papel alumínio ou fita de politetrafluoroetileno (PTFE), pois o composto é sensível à luz.
  3. Prepare o banho de água circulante
    1. Conecte um dispositivo de banho de água circulante à capa de água do vaso de purga. Certifique-se de que as linhas estão secas antes de escorar.
    2. Inicie o banho de água a 95 °C e verifique a ausência de vazamentos nas linhas de água aplicando toalhas de papel (não adesivas) ao redor das linhas.
  4. Configure a armadilha do bubbler de gás
    1. Verifique se a manga PTFE do bolha está no lugar e se ela não está danificada.
    2. Abra o bolha de gás e injete 15 mL de 1 M NaOH na base do borbulhante.
    3. Reposicione o bolha de gás e sele firmemente a conexão pressionando a parte inferior em direção ao topo e torcendo ligeiramente as duas partes. A impossibilidade de girar a parte superior do borbulhante sem aplicar força indica um selo correto.
    4. Conecte a saída do recipiente de purga à entrada da armadilha do borbulhante de gás.

4. I3- na preparação do ensaio de ácido acético

NOTA: Para mais detalhes sobre i3- na preparação do ensaio de ácido acético, consulte os trabalhos publicados anteriormente 15,22,38,41,42.

  1. Prepare a curva padrão para o NO2-
    1. Prepare uma solução de estoque dissolvendo 69 mg de nitrito de sódio (NaNO2) em 10 mL de ddH2O para obter solução de 100 mM. Esta solução é estável se armazenada em um recipiente hermético, refrigerado e protegido contra a luz.
    2. Diluir a solução de estoque em tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL pré-preenchido com 900 μL de ddH2O: Adicionar 100 μL da solução de estoque ao primeiro tubo de centrífugas, misturar, rotular e usar 100 μL do tubo para o segundo tubo, em seguida, repetir resultando em 10 mM, 1 mM, em seguida, 100 μM.
    3. Diluir ainda mais com alíquotas ddH2O para obter 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM e 500 nM NaNO2 alíquotas a serem utilizadas na curva de calibração.
  2. Prepare o i3- em ácido acético para o vaso de purga (pode ser armazenado à temperatura ambiente (RT) por 1 semana)22
    1. Adicione 2 g de iodeto de potássio (KI) e 1,3 g de iodo (I2) a 40 mL de ddH2O e 140 mL de ácido acético.
    2. Misture bem mexendo a mistura por pelo menos 30 min.
  3. Prepare as amostras para a determinação diferencial de no2-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, se Hb for coletado) e complexos ferro-nitrosol (Hb-NO se Hb for coletado) (Figura 3)
    1. Divida cada amostra em 3 alíquotas de 270 μL (900 μL de Hb se medir S-NO-Hb e Hb-NO) em tubos de microcentrifuuge protegidos pela luz, 2 deles pré-preenchidos com 30 μL de 1x PBS (100 μL se medir S-NO-Hb e Hb-NO) e o terceiro tubo com 30 μL de HgCl2 (100 μL se medir S-NO-Hb e Hb-NO), vórtice e incubação em RT por 2 min (Figura 3).
    2. Adicione 30 μL de 5% de AS à amostra com HgCl2 para medir Fe-NOs, (100 μL para Hb-NO) e para um com PBS adicionado para medir S-NOs e Fe-NOs (100 μL para S-NO-Hb e Hb-NO) e adicionar 30 μL de PBS ao terceiro já pré-preenchido com PBS 1x para medir o NO2-, S-NOs e Fe-NOs (100 μL para resíduos NO2- da coleção Hb, S-NO e Hb-NO). Vórtice e incubação em RT por 3 min (Figura 3).

5. NO consumo por configuração hb sem células

NOTA: Para mais detalhes, consulte o trabalho publicado anteriormente38.

  1. Prepare soluções padrão de oxiHb a partir de uma solução Hb de estoque purificado com uma concentração conhecida
    1. Diluir a solução de estoque em tubos de microcentrífugo de 1,5 mL por adição de ddH2O para obter as soluções que serão utilizadas para a curva de calibração: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Prepare a solução DETA-NONOate
    1. Adicione 10 mg de DETA-NONOate a 610 μL de 10 μM NaOH em pH 7.4 PBS para gerar 100 mM de DETA-NONOate e mantê-lo no gelo.

6. Inicie o detector de quimiluminescência (CLD) e prepare o vaso de purga

NOTA: Para a preparação do vaso de purga, consulte o trabalho publicado anteriormente43.

  1. Verifique as principais conexões de e para o CLD
    1. Conecte a linha de oxigênio ao CLD e abra o tanque de oxigênio a uma pressão que esteja de acordo com o fabricante do CLD.
    2. Certifique-se de que a linha de filtro Dielectric intense field (IFD) esteja conectada ao CLD, mas não ao vaso de purga ou à armadilha NaOH
  2. Inicie o CLD
    1. Na interface CLD, comece a executar o programa de detecção para ensaios de fase líquida.
    2. Verifique se o suprimento de oxigênio é adequado. Se este for o caso, o CLD começará com sucesso a amostragem a partir de sua entrada e indicará a detecção por um sinal em milivolts (0-5 mV). Caso contrário, o CLD solicitará um sinal de diagnóstico negativo.
  3. Prepare o vaso de purga
    1. Feche o recipiente de purga nas três portas: enrosque totalmente a válvula da agulha à direita, feche as torneiras de entrada e saída.
    2. Remova a tampa do vaso de purga e adicione uma quantidade suficiente do reagente específico ao ensaio planejado à câmara de reação (Tabela 1) para que a agulha de seringa usada para injetar as amostras possa atingir a coluna de fluido.
    3. Verifique a presença de uma linha de base estável desejada (Tabela 1).
  4. Inicie o fluxo de gás de purga
    1. Certifique-se de que o tanque de gás inerte (por exemplo, N2) esteja equipado com um regulador de dois estágios e conecte o tanque de gás inerte com a entrada de gás do navio.
    2. Abra o gás com uma pressão de saída no regulador de 1-5 psi, abra a entrada do vaso de purga e abra lentamente a válvula de agulha do vaso de purga para permitir a entrada de gás. Verifique borbulhar dentro do vaso de purga.
  5. Ajuste o fluxo de gás
    1. Registre a pressão celular medida pelo CLD com a linha de filtro IFD amostrando ar ambiente.
    2. Reposicione a tampa no vaso de purga, conecte a linha do filtro IFD ao vaso de purga (ou à armadilha NaOH no ensaio VCl3 em HCl) e abra a saída do vaso de purga.
    3. Use a válvula da agulha para atingir a mesma pressão celular no nível cld que é registrado no ar ambiente.

7. Experimento

NOTA: Para obter mais detalhes sobre o experimento, consulte o trabalho publicado anteriormente43.

  1. Inicie o programa de aquisição de sinal de chemiluminescence
    1. Conecte a porta serial do CLD à porta serial do computador na qual o programa de aquisição foi instalado.
    2. Execute o programa de análise.
    3. Clique em Adquirir, selecione a pasta para salvar o arquivo .data, digite o nome do arquivo e clique em Salvar.
      NOTA: Observe o tempo de execução predefinido na tela, pois a gravação pára automaticamente quando o tempo predefinido decorre. Se necessário, o tempo de execução predefinido pode ser aumentado.
  2. Prepare-se para repetidas injeções de amostra
    1. Ajuste a escala de tensão na tela para ter controle sobre a linha de base direcionada clicando nos botões Mínimo e/ou Máximo e, em seguida, digitando o valor desejado.
    2. Tenha um tubo de 20 ou 50 mL preenchido com ddH2O para enxaguar a seringa entre as amostras.
    3. Tenha uma caixa de limpezas de tarefas delicadas prontamente disponíveis.
  3. Injeção de amostra
    NOTA: Comece a partir das soluções padrão para a curva de calibração (injetar das amostras menos concentradas para as mais concentradas), em seguida, proceda às amostras de experimento (considere fazê-lo em duplicatas ou triplicados).
    1. Enxágüe a seringa pelo menos duas ou mais vezes com ddH2O antes de retirar cada amostra (e após cada injeção) e verifique cada vez que a ejeção de água desobstruída em uma limpeza de tarefa.
    2. Insira a seringa no tubo de amostra enquanto segura a seringa e o tubo a uma distância próxima, puxe o êmbolo para o volume desejado, garantindo que nenhuma bolha de ar e/ou partes sólidas não homogeneizadas fiquem presas.
    3. Limpe a ponta da seringa com um limpador de tarefas, depois insira a seringa na tampa de septa na porta de injeção e injete depois de verificar se a ponta da seringa está dentro da fase líquida na câmara de reação.
  4. Marque a injeção no programa de software e espere
    1. Verifique se a injeção causa uma mudança para cima no sinal (Figura Suplementar 1) (para baixo no consumo NO por ensaio hb livre de células) e digite o nome da amostra clicando na caixa cinza em Nomes de Amostra, em seguida, clique em Mark Injection.
      NOTA: Obstrução da seringa suspeita se a injeção de amostra não gerar um sinal.
    2. Aguarde o sinal elétrico para chegar novamente à linha de base (isso geralmente leva de 3 a 4 minutos). Este tempo pode ser usado para realizar a etapa 7.3.1.
  5. Repita todas as etapas indicadas nas etapas 7.3 e 7.4 durante e após cada injeção até o final do experimento. Lembre-se de executar uma amostra da solução de preservação (se usado)
  6. Pare o experimento
    1. Clique em STOP para interromper a aquisição do sinal, pare o CLD e desligue o banho de água (se o NO3- for medido).
    2. Interrompa o fluxo de gás, abra a válvula da agulha, remova a tampa do recipiente de purga, coloque um recipiente de lixo sob o ralo e abra a torneira de drenagem.
      NOTA: Se o experimento exigir aquisição de dados por mais de 60 minutos, é necessário reiniciar a aquisição após 60 minutos de tempo de execução (repetir a etapa 7.1.3) e fazer um novo arquivo.

8. Medições e cálculos

NOTA: As medições e os cálculos são feitos offline e podem ser realizados em um momento diferente.

  1. Inicie o programa de aquisição de chemiluminescence para análise de dados offline
    1. Inicie o programa e clique em Process.
    2. Selecione o arquivo de experimento e clique em Abrir.
  2. Calcule a área sob a curva para cada administração
    1. O softwaregrafa automaticamente na tela a linha de base (Figura Suplementar 2A, linha amarela horizontal) e o eixo máximo de cada onda gerada por cada administração de amostra (linhas amarelas verticais): verificar sua posição correta (ou ajustar clicando em cada linha e movendo-a com o mouse ou as setas) e clique em Threshold OK (Figura Suplementar 2B).
      NOTA: No ensaio de medição de HB sem células, o software normalmente não consegue capturar corretamente a forma de onda gerada pela injeção de amostra. Ao ampliar cada forma de onda, o operador pode facilmente auxiliar o software no cálculo da área (Figura Suplementar 2).
    2. O softwaregrafa automaticamente o início (linha verde vertical) e a extremidade (linha vermelha vertical) de cada pico causado por cada administração de amostra: verifique sua posição correta (ou ajuste clicando em cada linha e movendo-a com o mouse ou as setas) e clique em Integrar (Figura Suplementar 2C).
      NOTA: Algumas áreas do rastreamento podem ser equivocadamente definidas como injeções neste momento, e alguns picos podem ser contados automaticamente duas vezes. Ambos os erros podem ser reidentifiquem e removidos durante a etapa 8.2.2
    3. O software corresponde automaticamente a cada área de sinal após uma injeção marcada durante o experimento e seu nome atribuído: navegue por cada pico (indicado por uma linha vertical amarela) com o nome atribuído clicando no Next Peak e no Anterior Peak, em seguida, clique no botão Tudo OK para finalmente obter o cálculo para todas as áreas na tela.
    4. Para corrigir todos os erros de nomeação ou correspondência cometidos pelo usuário ou pelo programa, use conforme necessário os botões indicados no Arquivo Suplementar 1.
  3. Transfira os valores da curva de calibração para uma planilha e gere uma equação de regressão linear (Figura Suplementar 3)
    1. Transfira os dados do programa CLD para uma nova planilha através de pasta de cópia. Organize as duas colunas na folha de dados como Concentração de Amostra e Área Sob a Curva, e adicione um valor combinado de zero em ambas as colunas.
    2. Selecione as duas colunas, clique em Inserir > Dispersão e, em seguida, no menu Chart Design , selecione Adicionar elemento gráfico > linha de tendência > Linear.
    3. Clique com o botão direito do mouse na linha de tendência gerada, clique em Format Trendline e clique nas opções Exibir Equações no Gráfico e Exibir valor R-quadrado no gráfico no menu Format Trendline para obter uma simples equação de calibração linear.
  4. Transfira a área calculada de cada amostra para calcular sua concentração (Figura Suplementar 3)
    1. Informe todos os valores da planilha. Na coluna seguinte, aplique a equação obtida a partir da etapa 8.3.3 para obter a concentração de cada amostra injetada, onde y é a concentração (valor da nova coluna) e x é a área sob a curva medida após a injeção.
      NOTA: Lembre-se de levar em conta a concentração medida na solução de preservação (se utilizada) e subtrair os valores em conformidade.

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Representative Results

O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3).

A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO consumo em pacientes que saem do bypass cardiopulmonar (CPB) durante a cirurgia cardíaca é mostrada na Figura 5. Pode-se supor que após o CPB há uma maior concentração de grupos de heme no estado Hb-Fe2+-O2 (Figura 5, vermelho) em comparação com os pacientes que recebem NO durante o CPB do qual apenas uma minoria de grupos heme de Hb livre de células consome NO (Figura 5, verde).

O protocolo para avaliar o consumo de NO por Hb livre de células foi previamente aplicado para testar amostras de plasma de 50 pacientes submetidos a cirurgia cardíaca e necessitando de CPB. O sangue foi coletado na linha de base e 15 min, 4h e 12h após o CPB. O objetivo do estudo foi investigar a relação existente entre a resistência vascular pulmonar e sistêmica e o aumento da hemólise observada após o CPB. A concentração de Hb livre de células foi avaliada com um ensaio colorimétrico hb. A hemólise atingiu o pico 15 min após o CPB. O Hb livre acumulado foi lentamente eliminado do plasma dentro de 12 h18 (Figura 6A). O consumo NÃO, em vez disso, atingiu 15 min e atingiu valores básicos em apenas 4h (Figura 6B). As curvas de regressão linear de NO consumo por Hb livre de células apresentaram uma relação estequiométrica no ponto de tempo pós-CPB de 15 min em oposição à linha de base, 4 h e 12 h pós-CPB (Figura 6C). A explicação para a diferença observada na cinética está na abundância de Hb livre recém-lançado que ainda não encontrou nenhuma molécula sendo liberada pelo endotélio do paciente. A concentração de oxicodona (scavenging NO e resultando em consumo no ensaio) foi, de fato, maior em 15 min do que em qualquer outro ponto de tempo. O plasma coletado na linha de base e em outros pontos de tempo tinha um componente relativamente maior do metHb, que já havia sido oxidado pelo NO, não vinculou NÃO, e não causou consumo no ensaio. As resistências vasculares pulmonares e sistêmicas foram medidas invasivamente e atingiram 15 minutos. Pela primeira vez nesta população específica de pacientes, observou-se que o consumo de NÃO por Hb gratuito foi observado como temporalmente associado à vasoconstrição, que confirmou observações prévias em modelos animais e em pacientes com doença falciforme18.

A administração de NO gás durante o CPB e após a cirurgia aumenta a quantidade relativa de metHb circulante vs. oxicodona. Quando os pacientes submetidos à cirurgia cardíaca foram tratados com não-gás intraoperatório e pós-operatório, o aumento observado de Hb livre após o CPB (Figura 7A) não foi associado a qualquer aumento no consumo de NO, como medido com o protocolo acima mencionado (Figura 7B). O gás EXogenously administrado NO converte a maioria do oxyHb em metHb, que por sua vez não caça NO in vivo nem consome NO in vitro (dados inéditos).

Figure 4
Figura 4: Consumo de óxido nítrico por oxihemoglobina purificada sem células. Ensaio de consumo de óxido nítrico realizado pela injeção de amostras de concentrações conhecidas de oxihemoglobina purificada sem células. Linha de regressão é mostrada em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Consumo de óxido nítrico e concentração de hemoglobina livre de células de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca com bypass cardiopulmonar. O nível de hemoglobina livre de células de cada paciente, medido com um kit colorimétrico, foi plotado com o consumo de óxido nítrico (NO) medido através da quimiluminescência. Amostras de sangue foram colhidas 15 minutos após o fim do CPB. As linhas de regressão são mostradas para pacientes de cirurgia cardíaca que não recebem (em vermelho) ou recebem (em verde) NÃO durante o bypass cardiopulmonar (CPB). A hemoglobina é expressa em μM de grupos de heme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: O consumo de óxido nítrico e a hemoglobina livre de células em pacientes de cirurgia cardíaca. (A) Concentração de hemoglobina livre de células (Hb) no plasma de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca com bypass cardiopulmonar (CPB) (N = 50) foi determinada em diferentes pontos de tempo com o uso de um kit de determinação colorimétrica disponível comercialmente. Os dados foram analisados por meio da adequação de um modelo misto com evidência de efeito fixo entre os pontos de tempo. A concentração de plasma em diferentes pontos de tempo foi comparada com a linha de base com o teste de comparação múltipla de Tukey. (B) O consumo de óxido nítrico (NO) por plasma obtido a partir das mesmas amostras utilizadas para quantificação de Hb. Os dados foram analisados por meio da adequação de um modelo misto com evidência de efeito fixo entre os pontos de tempo. A concentração de plasma em diferentes pontos de tempo foi comparada com a linha de base com o teste de comparação múltipla de Dunnett. (C) Linhas de regressão para conteúdo de plasma hb sem células combinadas com nenhum consumo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns não significativo. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Efeitos da administração de gás óxido nítrico no consumo de óxido nítrico em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca. (A) Concentração de hemoglobina sem células no plasma de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca com bypass cardiopulmonar (CPB) recebendo um placebo (N = 28) ou óxido nítrico (N) gás (N = 22) por 24 h desde o início do CPB. A concentração foi determinada em diferentes pontos de tempo com o uso de um kit colorimétrico comercialmente disponível. Os dados foram analisados pelo teste de Friedman, indicando a presença de um efeito entre os pontos de tempo em ambos os grupos. A concentração de plasma em diferentes pontos de tempo foi comparada com a linha de base com o teste de comparação múltipla de Dunn. (B) NENHUM consumo por plasma obtido a partir das mesmas amostras utilizadas para quantificação de Hb. Os dados livres de células foram analisados pelo teste de Friedman, indicando a presença de um efeito entre os pontos de tempo em ambos os grupos. A concentração de plasma em diferentes pontos de tempo foi comparada com a linha de base com o teste de comparação múltipla de Dunn. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise Mistura de reagente Linha de base do alvo (mV)
VCl3 em HCL 5 mL de VCl3 em solução saturada HCl + 100 μL de agente antifoam 0-5 mV*
I3- em ácido acético 5-7 mL de I3- reagente 0-5 mV*
NO consumo por Hemoglobina livre de células 5-7 mL de PBS em pH 7.4 + 100 μL de agente antifoam + 20 μL de solução DETA-NONOate expandida 70-100 mV**
*valor ideal: a linha de base pode ser maior devido à qualidade do ar no ambiente de experimento
**certifique-se de estabilidade por 20 minutos antes de iniciar o experimento.

Tabela 1: Expurgar a composição do reagente do vaso e a linha de base alvo para vários ensaios de quemiluminescence. Purigue a composição do reagente do vaso para cada ensaio descrito. NÃO = Óxido Nítrico; PBS = Salina tampão fosfato; DETA-NONOate: (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato. *valor ideal: a linha de base pode ser maior devido à qualidade do ar no ambiente de experimentos. **certifique-se de estabilidade por 20 minutos antes de iniciar o experimento. Para realizar o ensaio de não consumo, a escala deve ser alterada no software para capturar valores entre 70 mV e 100 mV (por exemplo, 0-100 mV), que é a tensão de linha de base direcionada. Este ajuste é sugerido para ter controle total sobre a injeção de amostra, o que permite documentar o sinal movendo-se da linha de base após a injeção de uma amostra e observar o sinal retornando à linha de base. O registro de dados não é influenciado nem limitado à escala visualizada.

Figura suplementar 1: Picos após NO detection no ensaio VCl3 no HCl. Os picos que seguem a administração da amostra no VCl3 em HCl são mostrados no software de feixe CLD. O cálculo da área sob o pico para cada injeção é mostrado para conveniência e explicado na Figura Suplementar 2. Neste experimento, foram administrados padrões de diferentes concentrações para a curva de calibração, seguidos por amostras de plasma. A diluição é uma solução útil para calcular metabólitos a partir de amostras que produzem NÃO na extremidade alta ou mesmo fora da curva de calibração. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Cálculo automatizado assistido pelo usuário da área sob o pico. Ao realizar o ensaio de não consumo por hemoglobina livre de células, pode ser necessário definir picos manualmente para fornecer ao software os limites mais precisos para medir a área sob o pico gerado por cada injeção de amostra. (A) Visão completa representativa de um experimento gravado. Ele é alcançado clicando em Processo no menu principal e selecionando e abrindo o arquivo de interesse gravado. A linha amarela representa o limiar de sinal (mV) que constitui o segmento reto da área sob o pico. Clicando nele, o usuário pode arrastá-lo para a área de sinal. O eixo x e y pode ser alterado para ampliar o pico de interesse para medição precisa clicando nos botões inferiores esquerdos ou digitando no valor mínimo e máximo desejado para cada um. (B) Posicionamento limiar. O usuário pode selecionar o limiar de linha de base ideal arrastando a linha amarela para o ponto médio do sinal antes do deslizamento de sinal causado pela injeção de amostra. Para continuar limitando a área, o usuário deve clicar no botão Definir Picos Manualmente . (C) Posicionamento dos cursores de início e fim. Ao clicar no botão Definir Cursor de partida , uma linha verde aparece na tela. A linha verde deve ser colocada (arrastando e liberando) no início do deslizamento causado pela injeção amostral. O mesmo botão muda sua etiqueta para Set End Cursor clicando em qual uma linha vermelha aparece na tela. A linha vermelha deve ser colocada no ponto onde o sinal chega novamente à linha de base após a deflexão causada pelo não consumo da amostra injetada. Ao todo, a linha limiar (amarelo, B), a linha verde e a linha vermelha descrevem precisamente a área gerada pela injeção amostral. (D) Ceder a área sob o pico. Ao clicar no botão Integrar (C), a área calculada sob o pico é exibida no canto superior direito da tela. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar 3: Planilha representativa com curva de calibração e resultados. As áreas calculadas sob os picos gerados a partir do consumo de óxido nítrico (NO) por injeção de amostras com uma concentração conhecida de hemoglobina livre de células (expressa como [μM] de heme) são mostradas no canto superior esquerdo (no fundo amarelo). Os valores são plotados para construir a curva de calibração e sua equação linear resultante y= mx + q. A inclinação (m) é o número de grupos de heme oxyHb (μM) necessários para diminuir o sinal detectado pelo tubo fotomultiplier em 1 mV. Foram inseridos na planilha os valores calculados das injeções triplicadas (Execu N 1,2,3) de amostras de um paciente obtidas em quatro pontos de tempo diferentes (marcados por diferentes cores de fundo). A média de cada triplicado foi usada para produzir o valor de NO consumo causado por cada amostra, resolvendo a equação linear: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Equation 1

Arquivo Suplementar 1: Revisão dos picos usando o software empacotado. Este arquivo inclui uma captura de tela tirada do software empacotado e as ações permitidas para cada botão. Para cada pico (incluindo picos falsos causados por artefatos), o usuário pode usar os botões indicados no arquivo para confirmar, ou desconsiderar ou excluir ou nomear um pico específico, conforme necessário. O usuário também pode registrar um pico que não foi detectado anteriormente. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco de contaminação nº2. Cada reagente (especialmente a solução de bloqueio NO 2) e dilutante (incluindo ddH2O) usado no experimento devem ser testados para seu conteúdo NO 2 para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidamente gera NO3-. O tempo que se passa entre a coleta de sangue e a centrifugação, ou no2- bloqueio, pode, portanto, causar erros pré-analíticos e deve ser minimizado15. Em um ensaio usando amostras de plasma, colete sangue preferencialmente em tubos de heparina e centrífuga a 750 x g por 5 min a 4 °C após o bloqueio do grupo thiol com 40 μL de 200 nM NEM produzido pela dissolução de 250 mg de NEM em 10 mL de soro fisco tamponado com fosfato (PBS). A solução de estoque pode ser armazenada a 4 °C. Compostos como nitroarginina, nitroprusside e nitroglicerina que inibem a NO synthase (NOS) sofrem lenta conversão não quantitativa para NO, resultando em uma elevação da linha de base. Se o uso de inibidores de NOS faz parte da investigação, é aconselhável que bloqueadores que não contenham grupos nitro sejam usados43. A pressão de entrada no vaso de purga deve corresponder à pressão negativa contínua feita pelo CLD para amostragem. Se a pressão da entrada estiver baixa, a destilação a vácuo do meio pode levar a contaminar linhas e câmaras de purificação de gás, resultando em distorção do sinal. Além disso, pequenos volumes de ar podem entrar no vaso de purga e reagir com a solução para gerar no excessivo. Pelo contrário, a pressão excessiva causada por uma taxa de fluxo superior ao fluxo de retirada de amostras pode liberar NÃO na atmosfera levando a uma subestimação do sinal15. Além disso, tanto o VCl3 em HCl quanto o I3- em protocolo de ácido acético requerem múltiplas diluições durante a preparação e múltiplos cálculos para produzir concentração amostral. Cada passo deve ser cuidadosamente registrado, pois as diluições e os cálculos são reconhecidos por muitos grupos como a principal fonte de erro44.

A adição da solução de bloqueio NO 2 (etapa 2.1.2) faz com que os glóbulos vermelhos lise, reduzindo todo o OxyHb para MetHb. Evita a rápida redução de proteínas que contêm ferro (principalmente OxyHb) por NO2- com geração subsequente de NO3-. O tratamento das amostras com esta solução no momento da coleta é necessário para medir corretamente o Nº2 e/ou NO3-. Em contrapartida, a solução não deve ser utilizada ao planejar o consumo NO por ensaio hb livre de células. As alíquotas da solução de bloqueio NO 2 devem ser armazenadas juntamente com as amostras e utilizadas para remover a porção de sinal causada pela própria solução. Por fim, os fatores de diluição devem ser levados em conta para o cálculo da concentração final do metabólito medido. No ensaio I3- em ácido acético, a concentração NO 2 é obtida subtraindo a concentração da alíquota contendo AS sem HgCl2 (S-NO e Fe-NO) da alíquota contendo apenas PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). Para calcular a concentração de S-NO (proteínas mercúrio-labile), a concentração da alíquota tratada com AS com HgCl2 (Fe-NOs ou nitroso-proteínas estáveis em mercúrio) deve ser subtraída da alíquota tratada com AS sem HgCl2. Antes de subtrair, o usuário deve recordar a multiplicação da concentração de cada alíquota por 0,8181 (270/330) para levar em conta o fator de diluição utilizado durante as preparações amostrais (Figura 3). O mesmo conceito se aplica à medição S-NO-Hb e Hb-NO, onde as concentrações absolutas são uma fração do Hb22 medido. Dependendo do tipo de amostra, uma contagem precisa da concentração NO 3 pode exigir a execução tanto do protocolo VCl3 no HCl quanto do protocolo i3- em ácido acético para finalmente subtrair a concentração de NO2- daqueles de NO3- e NO2-. Isso nem sempre é necessário em amostras inteiras de sangue e plasma, por exemplo, onde o NO3- tipicamente excede em muito o NO2-.

É muito importante lembrar que o CLD será danificado se a armadilha NaOH não estiver no lugar adequado ao realizar um teste VCl3 em HCl devido à corrosão do HCl. A solução NaOH de 1 M usada para encher a armadilha NaOH pode ser comprada ou preparada, dissolvendo 4 g de sal NaOH em 100 mL de ddH2O ou diluindo 5 mL de 50% NaOH em 100 mL de ddH2O. Quando diluído ainda mais para 10 μM com ddH2O, o NaOH é muito útil para remover detritos proteicos por injeção no vaso de purga.

O sinal de linha de base detectado pelo CLD deve ser estável e dentro de 0-5 mV. Um sinal de linha de base mais alto pode ser causado pela poluição do ar (por NO e derivados), e isso pode ser verificado deixando a entrada ao ar livre. Se uma tensão mais alta é observada apenas no vaso de purga, enquanto a contaminação do tanque com gás inerte deve ser considerada, é mais frequentemente devido à persistência de remanescentes orgânicos ou à presença de NO2- no tubo. Lavar o vaso de purga várias vezes com ddH2O pode ajudar a minimizar a tensão da linha de base. Se não for bem sucedida, a incubação do vaso de purga com 100 mM NaOH por 24-48 h seguido de múltiplas lavagens com ddH2O ajuda a eliminar poluentes. No ensaio NÃO por hb sem células, o sinal CLD necessário é de 70-100 mV por pelo menos 20-30 min. Se o sinal não estiver estável (ou seja, a tensão diminui), uma dose extra de 10 μL de DETA NONOate pode ser adicionada ao vaso de purga. Isso pode ser repetido conforme necessário. É essencial lembrar que tanto o pó nãoutilado quanto o DETA NONOate já expandido devem ser mantidos a -80 °C. Este reagente decai rapidamente apesar do armazenamento ideal e talvez com baixo desempenho quando não está recém-preparado, exigindo múltiplas injeções no vaso de purga e levando a um sinal isoelétrico menos estável. Mais importante, deve ser expandido em PBS com pH 7.4, pois isso otimiza sua meia-vida (56 h a pH 7,4 à temperatura ambiente versus dissociação quase instantânea em pH de 5,0)45. A seringa utilizada para injeção de DETA NONOate deve ser exclusivamente dedicada a essa ação e não utilizada para injeção de amostras.

Se a injeção de uma amostra gera um pico superior ao ponto superior da curva de calibração, especialmente se gerar uma tensão superior a 700 mv, é aconselhável diluir a amostra (2x ou 4x) para minimizar o erro. Isso também se aplica ao ensaio de não consumo se a queda causada pela injeção de amostra for mais profunda do que a causada pela injeção da amostra mais concentrada usada na curva de calibração. A evidência de um pico (ou um through) no sinal após a injeção que é menor do que o esperado ou ausente pode indicar entupimento da seringa de precisão usada para injeção. Devido aos pequenos volumes utilizados (10-20 μL/amostra), particularmente se forem realizados ensaios de plasma ou urina, pode ser difícil distinguir entre uma seringa preenchida e a ausência da amostra devido ao entupimento da seringa. É aconselhável prestar atenção à resistência feita pelo êmbolo. Após a confirmação pela inspeção da seringa, a remoção da obstrução pode ser tentada lavando repetidamente a seringa com ddH2O e esfregando a seringa em uma delicada limpeza de tarefa se a obstrução estiver externamente visível. Na dúvida, é aconselhável ejetar o volume da amostra em uma limpeza de tarefa e voltar para lavar a seringa com ddH2O e tentar repetir a administração da amostra. A espuma é uma complicação comum e força o experimento a ser encerrado uma vez que a altura da coluna líquida excede a da coluna de reação, causando instabilidade de sinal. Exceder a dose de agente antifoamante indicada no protocolo pode levar a um aumento no sinal da linha de base e deve ser evitado. O número de amostras que causam a formação de espuma excessiva torna-se previsível quando são realizados ensaios repetidos, um fenômeno que deve informar como o experimento pode ser planejado de forma ideal. Um passo opcional para diminuir a espuma é misturar plasma ou supernanato tecidual com metanol frio (razão 1:1) e centrífuga por 15 min, 13000 x g a 4 °C. Deve-se considerar que o metanol faz com que as proteínas precipitam. Apenas S-NOs leves e Fe-NOs que não são proteicos na natureza são medidos. Assim, essa opção não pode ser adotada em estudos sobre sangue inteiro ou em qualquer outro caso em que haja interesse em proteínas S-NO e Fe-NO.

Mais soluções de reagente além do VCl3 em HCl e do I3- em ácido acético foram descritas e adotadas com sucesso. O ácido ascórbico reduz especificamente o NO2-, não reage com NO3- nem S-NOs, e pode ser usado para reduzir a maior parte das amostras injetadas e cálculos em situações onde o NO2- é a única molécula de interesse. A principal armadilha é a estabilidade limitada do reagente, exigindo mudanças mais frequentes da solução de reagente e, assim, calibrações repetidas46. Um ensaio usando monóxido de carbono e cloreto de cuprous (método 3C) pode detectar especificamente S-NOs com uma sensibilidade que é comparável com I3, mas ainda requer tratamento com e sem HgCl2 para evitar reações não específicas47. Para obter maior precisão na análise de sinais, os experimentos são registrados no formato .data para que a análise de forma de onda offline possa ser concluída com software diferente do programa de pacotes mostrado no protocolo.

Uma vez que a primeira injeção é feita, o experimento não pode ser interrompido. Se for necessária uma pausa e/ou se alguma condição for alterada (composição do meio do vaso de purga, fluxo de gás de purga, tensão de linha de base), o experimento é válido apenas para as amostras injetadas até esse ponto. Uma nova curva padrão deve ser realizada antes de medir mais amostras. A precisão permitida pelos ensaios baseados em chemiluminescência vem com um preço. Os ensaios são demorados por uma série de razões: 1) a automação não é possível, pois a injeção manual de amostra é necessária em duplicatas; 2) a maioria dos reagentes utilizados não pode ser estocada por longos períodos; 3) cada experimento precisa ser iniciado executando amostras padrão em concentrações conhecidas para calibração e não pode ser pausado a menos que a calibração seja repetida; 4) cada amostra é dividida em alíquotas contendo diferentes misturas de reagentes para bloquear reações específicas, a fim de finalmente calcular a concentração de metabólitos específicos subtraindo outros.

Este trabalho é focado no dispositivo Zysense NOA 280i, que possui um limiar de detecção de <1 ppb NO na fase de gás (correspondente a até 1 pM de NO na fase líquida) e um fluxo amostral de 10-300 mL/min. Outros CLDs estão disponíveis com um sistema de tubos de feixe para a medição de metabólitos na fase líquida. Os CLDs ecológicos têm um limiar de sensibilidade mais elevado, 1 ppb em seu modelo mais sensível, mas a vantagem de não precisar de um tanque de oxigênio para a geração de ozônio. Por outro lado, seu fluxo amostral relatado é de 1000 mL/min, o que implica um maior consumo do tanque de gás inerte usado para o navio de purga. Outras máquinas cld são dedicadas à análise no exalada para uso clínico.

A chemiluminescência é o método mais sensível e validado para avaliar especificamente o consumo de NO por Hb livre de células no campo da hemólise. Outras técnicas estão disponíveis para medir compostos nos, NO2, NO 3-, S-NOs e nitroso de mercúrio-labile. A medição direta do gás NO pode ser obtida por chemiluminescência ou com o uso de eletrodos dedicados que vão desde a medição do gás exalado até eletrodos unicelulares. Estes medem apenas nenhum gás, são menos caros (ainda mais perecíveis), requerem calibração com mais frequência, e são menos precisos em comparação com um CLD31. Nitritos e NO3- foram historicamente medidos com a reação de Griess, uma técnica colorimétrica que em sua versão original detecta ambas as moléculas sem a possibilidade de distinguir sua concentração relativa na amostra. As variantes modernas da técnica envolvem cromatografia de fase inversa empregando separação da amostra em duas colunas, permitindo duas reações independentes com o NO3 e o NO2-. A sensibilidade desses métodos é micromolar ou ligeiramente menor, em comparação com 1 nM com CID. As principais armadilhas são o consumo de tempo e a incompatibilidade com amostras pré-tratadas com mercúrio e/ou ferricyanida14. Os S-NOs podem ser detectados com técnicas colorimétricas e fluorométricas, bem como com uma sensibilidade de até 0,5 μM em comparação com 100 fM descritos pelo uso de chemiluminescência como mostrado no protocolo I3- em ácido acético 14,41,42. O ensaio biotina-switch, apesar de não ter detectado S-NOs na gama picomolar, tem a vantagem de gerar proteínas rotuladas por biotina que podem ser purificadas e identificadas com a análise proteômica48. Quando analisadas em detalhes, cada técnica compartilha uma armadilha comum, que é a reatividade extrema do NO e seus derivados que obrigam o bloqueio de reações para fins de medição in vitro. O pré-tratamento das amostras é crítico, e responder à pergunta se um determinado pré-tratamento bloqueia completamente uma reação ou o faz melhor do que outro tem sido até agora uma força motriz para um aumento nos estudos metodológicos. Embora a reatividade extrema no NO tenha sido certamente um impulso para a pesquisa de métodos sensíveis para detecção de seus metabólitos, a medição direta do NO tem alcançado progressos significativos nas últimas três décadas desde que o primeiro detector amperométrico foi desenvolvido em 1990. Mais de vinte sondas diferentes foram descritas desde então, incluindo nanosensores usados para estudar o conteúdo NO de célula única49. Sensores eletroquímicos são as principais ferramentas que podem detectar NO tanto in vivo quanto em tempo real. Na medicina pulmonar, vários estudos compararam máquinas à base de eletrodos com CLDs. A medição do NO expirado é mais simples do que outros ensaios para detecção metabólica, exigindo conexão direta da linha de gás (via filtro IFD) a um adjunto respiratório do sistema fechado ou algumas respirações em um saco para análise off-line, mas o custo e a menor portabilidade dos CLDs param. Uma série de dispositivos eletroquímicos atualmente atendem aos critérios de uso clínico, embora tenham menor sensibilidade e reprodutibilidade quando comparados aos CLDs. Além disso, a concordância em termos de valores absolutos medidos é subótima entre os dispositivos, por isso recomenda-se que os pacientes sejam sempre acompanhados com o mesmo dispositivo eletroquímico50. O uso de CLDs em configurações como medição nasal exalou NO e em ambientes de pesquisa como terapêutica baixa e alta dose inalada NO ainda é necessário.

Medições precisas de NO, seus derivados e proteínas sem ligação são necessárias em muitos níveis para entender um mecanismo negligenciado e ainda mais desconhecido de sinalização. Os campos de aplicação abrangem biologia e patologia em níveis pré-clínicos e clínicos com áreas alvo específicas, incluindo imunobiologia, neurociências, ciências cardiovasculares e doenças infecciosas. Estudos pré-clínicos e ensaios clínicos estão investigando o uso de gás não inalado como agente terapêutico. Conhecimento mais profundo sobre como o gás NO exógeno influencia a concentração de METAbólitos NO e proteínas sem limites em todos os níveis, do plasma aos compartimentos celulares, será necessário. A implementação de proteômicas de alto rendimento pode provavelmente aumentar o número de mediadores conhecidos que são influenciados pelo NO e seus derivados e podem exigir novas investigações mecanicistas que requerem medições precisas de METAbólitos NO.

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Disclosures

L.B. recebe apoio salarial da K23 HL128882/NHLBI NIH como principal investigador por seu trabalho em hemólise e óxido nítrico. A LB recebe bolsas de "Bolsas Rápidas para pesquisa COVID-19" no Mercatus Center da Universidade George Mason e na iNO Therapeutics LLC. A B.Y. é apoiada por subsídios de uma NHLBI/#R21HL130956 e do DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recebeu patentes na MGH sobre a geração elétrica de óxido nítrico.

L.B. e B.Y. registraram pedido de patente para não entrega no número de solicitação pct da doença COVID-19: PCT/US2021/036269 arquivado em 7 de junho de 2021. A RWC recebe apoio salarial da Unitaid como principal pesquisadora para o desenvolvimento tecnológico voltada para o diagnóstico descentralizado da tuberculose em crianças localizadas em ambientes de baixo recurso.

Acknowledgments

Os protocolos relatados neste manuscrito foram possíveis pelas contribuições acumuladas de bolsistas anteriores do laboratório de Pesquisa de Anestesia em Cuidados Críticos do Dr. Warren Zapol. Reconhecemos a contribuição dos Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli e Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

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References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

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Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated
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Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

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