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नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए Chemiluminescence-आधारित Assays और Autoxidation और Nitrosated यौगिकों से इसके डेरिवेटिव

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

यहां, हम नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उच्च संवेदनशीलता के साथ केमिलुमिनेसेंस-आधारित assays का उपयोग करके इसके जैविक रूप से प्रासंगिक डेरिवेटिव।

Abstract

विवो में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गतिविधि इसके प्रत्यक्ष प्रभावों के संयुक्त परिणाम हैं, NO autoxidation से उत्पन्न इसके डेरिवेटिव की कार्रवाई, और नाइट्रोसेटेड यौगिकों के प्रभाव। नो मेटाबोलाइट्स को मापना संवहनी स्तरों और अन्य ऊतकों दोनों में कोई गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक सेटिंग्स में जहां बहिर्जात NO प्रशासित किया जाता है। ओजोन-आधारित chemiluminescence assays दोनों तरल पदार्थ (प्लाज्मा, ऊतक homogenates, सेल संस्कृतियों सहित) और गैस मिश्रण (जैसे, साँस छोड़ने) में NO और NO मेटाबोलाइट्स के सटीक माप की अनुमति देते हैं। कोई भी एक उत्साहित राज्य में नाइट्रोजन डाइऑक्साइड उत्पन्न करने के लिए ओजोन के साथ प्रतिक्रिया करता है। परिणामस्वरूप प्रकाश उत्सर्जन फोटोडिटेक्शन और नमूने की कोई सामग्री को प्रतिबिंबित करने वाले एक इलेक्ट्रिक सिग्नल की पीढ़ी की अनुमति देता है। एक ही नमूने से एलीकोट का उपयोग विशिष्ट नो मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि नाइट्रेट, नाइट्राइट, एस-नाइट्रोसोथिओल्स, और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स। इसके अलावा, सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा उपभोग नहीं किया जाता है, यह भी chemiluminescence विश्लेषण के साथ परिमाणित किया जाता है। इन सभी तकनीकों का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।

Introduction

चूंकि साल्वाडोर मोनकाडा और नोबेल पुरस्कार विजेता रॉबर्ट फुर्चगोट, लुई इग्नारो और फेरीड मुराद ने नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) को पहले से ज्ञात एंडोथेलियल-व्युत्पन्न विश्राम कारक (ईडीआरएफ) के रूप में पहचाना था, इसलिए संवहनी जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, चयापचय और मेजबान प्रतिक्रिया 1,2,3,4,5,6,7 में फैले कई प्रमुख तंत्रों में NO की केंद्रीय भूमिका स्थापित की गई है। . कोई गैस का बहिर्जात प्रशासन नवजात शिशु में फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप के कारण श्वसन विफलता के लिए एक स्थापित उपचार बन गयाहै। नाइट्रिक ऑक्साइड गैस की भी जांच श्वसन syncytial वायरस (RSV) संक्रमण, मलेरिया और अन्य संक्रामक रोगों, ischemia-reperfusion चोट के उपचार के लिए, और कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में तीव्र गुर्दे की चोट की रोकथाम के लिए 9,10,11,12. NO, इसके मेटाबोलाइट्स, और इसके लक्षित प्रोटीन और यौगिकों के स्तर का आकलन करने के लिए सटीक माप तकनीकों की आवश्यकता यांत्रिक और इंटरवेंशनल दोनों अध्ययनों से उत्पन्न होती है।

इसकी उच्च प्रतिक्रियाशीलता के कारण, NO जैविक मैट्रिक्स के आधार पर विभिन्न प्रतिक्रियाओं से गुजर सकता है जिसमें इसका उत्पादन और / या जारी किया जाता है। हीमोग्लोबिन (एचबी) या अन्य ऑक्सी-हेमोप्रोटीन की अनुपस्थिति में, NO को लगभग पूरी तरह से नाइट्राइट (NO2-) में ऑक्सीकरण किया जाता है।

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

कोई भी पहले नाइट्रोजन डाइऑक्साइड (NO 2) उत्पन्न करने के लिए आणविक ऑक्सीजन (O2) के साथ autoxidation से गुजरता है और Dinitrogen trioxide (N2 O3) उत्पन्न करने के लिए NO2के साथ प्रतिक्रिया करता है। N2O3 का एक अणु पानी (H2O) के साथ प्रतिक्रिया करता है ताकि NO2- और एक प्रोटॉन (H+)13 के दो अणु बन सकें। पूरे रक्तके भीतर 14,15, NO और NO2- तेजी से नाइट्रेट (NO3-) में परिवर्तित हो जाते हैं क्योंकि ये अणु Hb [Hb-Fe2 +-O2 या oxyhemoglobin (oxyHb)] के ऑक्सीकृत हीम समूहों के साथ उत्साहपूर्वक प्रतिक्रिया करते हैं। यह प्रतिक्रिया फेरिक राज्य [Hb-Fe3 + या मेथेमोग्लोबिन (metHb)] के लिए हीम समूह के संक्रमण के साथ युग्मित है:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) बाधा और एंडोथेलियम से तुरंत सटे स्थान इस प्रतिक्रिया को सीमित करने वाले मुख्य कारक हैं और एंडोथेलियम द्वारा जारी एनओ के एक छोटे से हिस्से को ईडीआरएफ16,17 के रूप में कार्य करने की अनुमति देते हैं। वास्तव में, परिसंचरण में सेल-मुक्त एचबी को प्रयोगात्मक और नैदानिक सेटिंग्स17,18 में वासोडिलेशन को बाधित करने के लिए जाना जाता है। आरबीसी के भीतर, ऑक्सीकरण और NO2- एकाग्रता के आधार पर, NO का एक हिस्सा लोहे-नाइट्रोसिल Hb (Hb-Fe2+-NO या HbNO) बनाने के लिए deoxyhemoglobin (Hb-Fe2+-NO या HbNO) के साथ प्रतिक्रिया करता है:

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

आरबीसी15,17 में, NO 2- Hb-Fe2+ को कम करकेHb-Fe 3+ बना सकताहै, जिससे NO की रिहाई होती है, जो बदले में Hb-Fe2 +-O 2 (अधिमानतः) या Hb-Fe2 + को बांधती है।

NO-डेरिवेटिव की पीढ़ी को सख्ती से यूनिडायरेक्शनल नहीं माना जाना चाहिए क्योंकि NO को NO2- और NO3 से विभिन्न ऊतकों में और विभिन्न एंजाइमों (उदाहरण के लिए, आंतों के बैक्टीरिया द्वारा या माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर, विशेष रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत) 19,20 से पुनर्जीवित किया जा सकता है।

उत्पादित (या प्रशासित) की एक चर राशि एस-नाइट्रोसोथिओल्स की डाउनस्ट्रीम पीढ़ी की ओर ले जाती है, मुख्य रूप से एन2ओ3 से थिओल ट्रांसनिट्रोसेशन द्वारा एक न्यूक्लियोफाइल की उपस्थिति में एक एनओ + दाता मध्यवर्ती (एनयूसी-एनओ + -एनओ2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

एस-नाइट्रोसोथिओल्स पीढ़ी के लिए एक और संभावना ऑक्सीकरण थिओल का नाइट्रोसिलेशन है (ऑक्सीकरण थिओल के साथ प्रतिक्रिया नहीं):

RS• + NO → RS-NO

यह तंत्र और NO2 द्वारा प्रत्यक्ष थिओल ऑक्सीकरण केवल बहुत ही विशिष्ट स्थितियों में संभव हो सकता है जो कहीं और वर्णित हैं। एस-नाइट्रोसोथियोल एस-नाइट्रोसोग्लूटाथियोन जैसे प्रकाश अणुओं से लेकर बड़े थिओल युक्त प्रोटीन तक होते हैं। S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) का गठन β-श्रृंखला (π93C)22 में एक संरक्षित सिस्टीन अवशेषों के एक थिओल समूह के नाइट्रोसेशन द्वारा किया जाता है।

एस-नाइट्रोसोथिओल्स की पीढ़ी और चयापचय महत्वपूर्ण नियामक तंत्र का हिस्सा हैं। उदाहरणों में ग्लूटाथियोन का विनियमन, एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए), और रेयानोडीन रिसेप्टर्स 23,24,25,26,27,28 शामिल हैं। पहले विवो में नो बायोलॉजी के एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में माना जाता था, नाइट्रोसेटेड एल्ब्यूमिन (एस-नाइट्रोसो-एल्ब्यूमिन) किसी भी विशिष्ट अतिरिक्त जैविक गतिविधिके बिना एक नो / एनओ + ट्रांसपोर्टर प्रतीत होता है।

एक जैविक मैट्रिक्स के भीतर एक विशिष्ट जैविक नमूने से NO और इसके डेरिवेटिव की एकाग्रता को मापते समय, अम्लता, ऑक्सीकरण, तापमान और अभिकर्मकों की उपस्थिति जैसी विशेषताओं पर विचार करना महत्वपूर्ण है। उदाहरणों में प्रशासित बहिर्जात कोई दाताओं और, तीव्र सूजन की स्थापना में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) NO2 के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे पेरोक्सिनिट्रिटाइट (ONOO-) जैसे मुक्त कणों की अलौकिक एकाग्रता की पीढ़ी होती है। नियोजित विश्लेषणात्मक विधि के अलावा, नमूना तैयारी और भंडारण का पूर्व-विश्लेषणात्मक चरण मौलिक है। डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाएं जो विवो NO गतिविधि का प्रतिनिधित्व नहीं करती हैं, उनकी भविष्यवाणी की जाएगी, विचार किया जाएगा, और अवरुद्ध किया जाएगा। एक वैध उदाहरण एस-एनओ-एचबी की अस्थिरता है, जब इसे माप22 के लिए लक्षित किया जाता है तो रक्त के नमूनों के एक समर्पित उपचार की आवश्यकता होती है।

Chemiluminescence-आधारित assays NO और इसके मुख्य चयापचयों के स्तर का पता लगाने के लिए सोने का मानक हैं [NO2-, NO3-, S-NO और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स (Fe-NO)] किसी भी जैविक तरल पदार्थ में, जिसमें ऊतक होमोजेनेट्स30,31 शामिल हैं। ये विधियां chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) पर निर्भर करती हैं, एक उपकरण जो ओजोन (O3) के साथ NO की प्रतिक्रिया को रखता है, जो एक उत्साहित स्थिति (NO2•) में NO2 उत्पन्न करता है। NO2 की छूट • प्रकाश के एक फोटॉन के उत्सर्जन का कारण बनती है जो एक फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब द्वारा पता लगाया जाता है, जिससे एक इलेक्ट्रिक सिग्नल उत्पन्न होता है जो सीधे नमूना गैस मिश्रण32 की NO सामग्री के लिए आनुपातिक होता है। CLD की एक सरलीकृत योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: नाइट्रिक ऑक्साइड गैस के लिए एक chemiluminescence डिटेक्टर के सरलीकृत योजनाबद्ध. नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) का Chemiluminescence-आधारित पता लगाना प्रति NO गैस अणु प्रति एक फोटॉन की स्टोइकोमेट्रिक पीढ़ी है जिसे chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) में पेश किया जाता है। chemiluminescence प्रतिक्रिया एक आंतरिक जनरेटर से ओजोन (O3) के साथ आपूर्ति की एक नामित कक्ष में प्राप्त की जाती है, जो एक बाहरी पंप के साथ संबंध द्वारा नकारात्मक दबाव में रखा जाता है, जिससे नमूना गैस के निरंतर और निरंतर प्रवाह की अनुमति मिलती है। ओ3 की पीढ़ी को डायटोमिक ऑक्सीजन (ओ2) की आवश्यकता होती है जो सीएलडी से जुड़े एक समर्पित ओ2 टैंक द्वारा आपूर्ति की जाती है (अन्य निर्माता परिवेशी हवा के साथ संचालित सीएलडी प्रदान करते हैं)। प्रतिक्रिया कक्ष के भीतर, नमूना गैस में निहित NO गैस का प्रत्येक अणु सक्रिय अवस्था (NO2*) में नाइट्रोजन डाइऑक्साइड के एक अणु को उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करता है। अपनी जमीनी स्थिति में लौटकर, प्रत्येक NO2 * अणु एक फोटॉन का उत्सर्जन करता है जो प्रतिक्रिया कक्ष के बगल में स्थित एक फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) द्वारा पता लगाया जाता है। संबंधित एम्पलीफायर और केंद्रीय प्रसंस्करण इकाई के साथ पीएमटी फोटॉन गणना और प्रतिक्रिया कक्ष में नो अणुओं की संख्या के आनुपातिक संकेत का उत्पादन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सीएलडी के नमूना इनलेट को एक ग्लासवेयर सिस्टम से जोड़ा जा सकता है जिसमें तरल नमूनों के लिए एक प्रतिक्रिया कक्ष होता है। नाइट्रोजन, हीलियम, या आर्गन जैसी अक्रिय गैस के साथ सिस्टम को लगातार शुद्ध किया जाता है, जो प्रतिक्रिया कक्ष से सीएलडी में NO को स्थानांतरित करता है। तरल-चरण नमूनों को एक समर्पित झिल्ली के माध्यम से शुद्ध पोत में इंजेक्ट किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: नाइट्रिक ऑक्साइड गैस के chemiluminescence-आधारित पता लगाने के लिए एक शुद्ध पोत की संरचना शुद्ध पोत (दाएं) नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गैस या किसी भी अन्य यौगिक का पता लगाने के लिए अनुमति देता है जिसे तरल चरण अभिकर्मक से जारी होने पर आसानी से NO गैस में परिवर्तित किया जा सकता है। अक्रिय गैस इनलेट एक अक्रिय गैस के स्रोत (टैंक) से जुड़ा होता है जैसे कि आर्गन, क्सीऑन, या डायटोमिक नाइट्रोजन (एन2)। सुई वाल्व (बाईं ओर खुलता है) का उपयोग पर्ज पोत के भीतर दबाव नियंत्रण के लिए किया जाता है और पोत को साफ करने के लिए पूरी तरह से हटाया जा सकता है। इंजेक्शन पोर्ट को नमूना इंजेक्शन के लिए एक झिल्ली सेप्टम के साथ एक टोपी द्वारा कवर किया जाता है। झिल्ली को अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। एक गर्म जैकेट प्रतिक्रिया कक्ष को घेरता है और HCl परख में VCl3 प्रदर्शन करने के लिए एक गर्म पानी के स्नान से जुड़ा हुआ है। शुद्ध पोत आउटलेट chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) या NaOH जाल (HCl assays में VCl3 के लिए आवश्यक) से जुड़ा हुआ है। प्रतिक्रिया कक्ष सामग्री को निकालने के लिए, पहले अक्रिय गैस इनलेट और पर्ज पोत आउटलेट पर स्टॉपकॉक्स को बंद करें, सुई वाल्व को बंद करें, इंजेक्शन पोर्ट पर टोपी को हटा दें और अंत में नाली पर स्टॉपकॉक खोलें। NaOH जाल (बाएं) शुद्ध पोत और CLD के बीच इनलाइन रखा जा करने के लिए आवश्यक है यदि HCl परख में VCl3 HCl की corrosivity के कारण प्रदर्शन किया जाता है. CLD के लिए कनेक्शन हमेशा CLD और शुद्ध पोत (या NaOH जाल, यदि उपयोग किया जाता है) के आउटपुट के बीच रखा जा करने के लिए एक तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ (IFD) फिल्टर की आवश्यकता होती है। IFD फ़िल्टर हवाई कणों को हटा देता है और तरल को शुद्ध पोत से गुजरने से रोकता है। PTFE का मतलब polytetrafluoroethylene है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नतीजतन, कोई भी यौगिक जिसे एक विशिष्ट और नियंत्रित रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से NO में परिवर्तित किया जा सकता है, किसी भी जैविक तरल पदार्थ और ऊतक homogenate24 में उच्च संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है। chemiluminescence के माध्यम से गैस चरण NO का प्रत्यक्ष माप प्रयोगात्मक और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में किया जाता है। इन तकनीकों को बड़े पैमाने पर कहीं और 33,34,35 वर्णित किया गया है। NO2-, S-nitrosothiols, S-nitrosated proteins, और Fe-NOs का मापन ट्राइआयोडाइड (I3-) के साथ एक प्रतिक्रिया मिश्रण में नमूने जोड़कर किया जा सकता है, जो स्टोइकोमेट्रिक रूप से इन सभी यौगिकों से कोई गैस जारी नहीं करता है:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

जबकि मैं3- नहीं 3-15 के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है. प्रत्येक यौगिक के सटीक माप को अम्लीकृत सल्फानिलामाइड (एएस) के साथ या उसके बिना मर्क्युरिक क्लोराइड (एचजीसीएल2) के साथ नमूना एलीकोट के पूर्व-उपचार द्वारा संभव बनाया जाता है। विशेष रूप से, एएस के साथ पूर्व-उपचार सभी NO2- सामग्री को हटा देता है। नतीजतन, सीएलडी द्वारा मापी गई कोई सामग्री केवल एस-एनओ और एफई-एनओ एकाग्रता के योग को दर्शाती है। एएस इंजेक्शन से पहले एक नमूना एलीकोट में एचजीसीएल2 का इंजेक्शन एनओ2- एस-एनओ द्वारा जारी किया जाना है। एएस के साथ उपचार (NO2- हटाने के लिए अग्रणी) यह सुनिश्चित करता है कि मापा गया कोई सामग्री केवल Fe-NOs की एकाग्रता को दर्शाती है। आकलन के बीच घटाव की एक श्रृंखला तीन NO डेरिवेटिव22 की सटीक एकाग्रता की गणना करने की अनुमति देती है।

Figure 3
चित्रा 3: एसिटिक एसिड chemiluminescence परख में मैं3 के लिए नमूना तैयारी में कदम. एसिटिक एसिड chemiluminescence परख में मैं3 की तैयारी के लिए अनुक्रमिक कदम सचित्र हैं. प्रकाश-संरक्षित सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग आवश्यक है। ट्यूब 1, 2, और 3 परख के लिए तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक और नमूना ऐलीकोट (ट्यूब 4) HCl परख में VCl3 के लिए आवश्यक है अगर नाइट्रेट (NO3-) के माप की आवश्यकता है. चरणों को लाल रंग में संख्याओं द्वारा इंगित किया जाता है। प्रीफिल (चरण 1) जैसा कि नमूना मात्रा को जोड़ने से पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या एचजीसीएल2 के साथ इंगित किया गया है। नमूना मात्रा (2) के रूप में इंगित, भंवर जोड़ें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। जोड़ें (3) PBS या अम्लीकृत सल्फानिलामाइड (AS) के रूप में संकेत दिया, भंवर, और आरटी पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। परख (4) चलाएं। परख द्वारा मापा एकाग्रता प्रत्येक ट्यूब के तहत रिपोर्ट यौगिकों की एकाग्रता का योग है. ट्यूब नंबर 1 नाइट्राइट (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO), और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स (Fe-NOs) को एक ही संकेत के रूप में मापने की अनुमति देगा। नाइट्रेट (NO3-) माप के लिए, नमूनों को एसिटिक एसिड में I3- और HCl assays में VCl3 दोनों के साथ चलाया जाएगा, और ट्यूब 1 से प्राप्त मूल्य को ट्यूब 4 से प्राप्त एक से घटाया जाना चाहिए। * अवशिष्ट NO 2-, S-nitrosohemoglobin और लौह-नाइट्रोसिल-हीमोग्लोबिन के निर्धारण के लिएHb विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा का सुझाव दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

NO3- माप के लिए, हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) में वैनेडियम (III) क्लोराइड (VCl3) का उपयोग सीएलडी के साथ NO3- stoichiometrically NO को मापने के लिए पर्ज पोत में NO3- NO के रूपांतरण के लिए किया जाता है:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

पर्याप्त रूप से तेजी से रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, प्रतिक्रिया को 90-95 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। NO3 से NO2 तक की कमी HCl द्वारा NO2- से NO में कमी के साथ युग्मित है। Vanadium धातु भी S-NOs को उनके NO moiety22,36 को मुक्त करती है। एचसीएल में वीसीएल3 के साथ सीएलडी द्वारा प्राप्त अंतिम एकाग्रता NO3-, NO2, और अन्य नाइट्रोसेटेड यौगिकों की कुल एकाग्रता को दर्शाती है। मैं 3 के साथ CLD के साथ उपज एकाग्रता से बाद के मूल्य का घटाव- NO3- एकाग्रता36,37 (चित्रा3) की गणना के लिए अनुमति देता है।

कोई खपत परख में, (Z) -1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) जैसे कोई दाताओं द्वारा शुद्ध पोत में NO की निरंतर रिहाई एक स्थिर संकेत उत्पन्न करता है जो इंजेक्ट किए गए नमूनों में सेल-मुक्त ऑक्सीएचबी को परिमाणित करने की अनुमति देता है। शुद्ध पोत में खपत NO की मात्रा नमूना38 में oxyHb की मात्रा के साथ एक stoichiometric संबंध में है।

NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स, और प्लाज्मा नमूनों में सेल-मुक्त Hb द्वारा कोई खपत नहीं के माप के लिए प्रोटोकॉल सचित्र हैं। आरबीसी वातावरण में NO पर अध्ययन के लिए विशिष्ट नमूना उपचार की आवश्यकता होती है जिसके बाद बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद बेहद नाजुक S-NO-Hb और Hb-NO को मापने के लिए कुलHb एकाग्रता 15,22 के निर्धारण के साथ युग्मित होता है। नमूना तैयारी माप को सही करने में सहायक है। एच 2 ओ में NO2 के पूर्व अस्तित्व औरNO2 की रिहाई- परख के दौरान इस तरह के S-NO-Hb14,39 के रूप में कोई डेरिवेटिव के कृत्रिम रूप से उच्च सांद्रता के माप के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. नमूना तैयारी के महत्वपूर्ण पहलुओं को भी प्रस्तुत किया गया है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में इंगित की गई प्रक्रियाएं मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के समीक्षा बोर्ड के अनुसार हैं। उपयोग किए गए रक्त के नमूने पिछले अध्ययन के दौरान एकत्र किए गए थे और वर्तमान उद्देश्यके लिए डी-पहचान किए गए थे।

नोट: टयूबिंग और ग्लासवेयर के बीच इष्टतम कनेक्शन के बारे में विशिष्ट मार्गदर्शन के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें जो शुद्ध पोत, धोने और सामान्य रखरखाव का गठन करते हैं। कांच के बर्तन को नुकसान न पहुंचाने के लिए कनेक्शन को दृढ़ और सावधानीपूर्वक बनाने की आवश्यकता है। ग्लास पर्ज पोत के घटकों की पहचान करें: गैस इनलेट लाइन, हीटिंग जैकेट और कंडेनसर के साथ शुद्ध पोत, सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) गैस बबलर ट्रैप, शुद्ध पोत और बबलर के बीच कनेक्शन लाइन, एक तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ (आईएफडी) फिल्टर के साथ संपन्न पोत आउटलेट गैस लाइन (सीएलडी के लिए) को शुद्ध करें। शुद्ध पोत और CLD के नमूना इनलेट के बीच एक IFD फ़िल्टर लाइन जगह में हर बार होना चाहिए जब तरल रूप में कोई मेटाबोलाइट्स (प्लाज्मा, सेल संस्कृतियों, ऊतक homogenates) मापा जाता है (प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सभी assays). नमूना तैयारी तरल पदार्थ या ऊतक पर निर्भर करती है जिसका विश्लेषण किया जाता है और ब्याज के यौगिकों पर। प्रीएनालिटिकल चरण के महत्वपूर्ण पहलुओं को खंड 1 और 2 में शामिल किया गया है। विशिष्ट assays के लिए विशिष्ट तैयारी के चरणों को अनुभाग 3-5 में शामिल किया गया है। अनुभाग 6-8 सभी assays पर लागू होते हैं।

1. समर्पित अभिकर्मकों की तैयारी

नोट:: अधिक जानकारी के लिए, पिछलेप्रकाशनों 15,22 को देखें।

  1. 5% (290 mM) अम्लीकृत सल्फानिलामाइड (AS) समाधान तैयार करेंNO 2 के लिए- 500 मिलीग्राम सल्फानिलामाइड को 1N HCl के 10 mL में भंग करके हटाने के लिए। यह समाधान महीनों तक स्थिर रहता है।
  2. पीबीएस के 5 मिलीलीटर में HgCl2 के 67.9 मिलीग्राम HgCl2 को भंग करके S-NOs से रिलीज NO 2 के लिए 50 mM mercuric क्लोराइड (HgCl2) समाधान तैयार करें। प्रकाश से स्टॉक समाधान की रक्षा करें।
  3. thiol-समूहों को अवरुद्ध करने के लिए 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) के साथ Hb को ऑक्सीकरण करने के लिए 800 mM फेरिसाइनाइड [K3Fe(CN)6] के साथ NO2- अवरुद्ध समाधान तैयार करें और (वैकल्पिक) लाल कोशिका झिल्ली को घुलनशील बनाने के लिए 10% nonylphenyl-polyethylene ग्लाइकोल समाधान (Nonidet p-40)
    1. 800 mM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए विआयनीकृत और आसुत पानी (ddH2O, 263.5 ग्राम पाउडर प्रति लीटर) केलिए K 3Fe (CN)6 जोड़ें।
    2. DDH2O समाधान में 800 mM K3Fe(CN)6 में NEM जोड़ें (100 mM एकाग्रता रखने के लिए प्रति लीटर पाउडर का 12.5 ग्राम) और सभी क्रिस्टल को भंग करने के लिए समाधान को मिलाएं।
    3. 800 mM NEM K3Fe (CN)6 100 mM NEM समाधान (111 mL प्रति लीटर) के नौ भागों में 10% NP-40 का एक हिस्सा जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं (पूरे रक्त विश्लेषण के लिए अनिवार्य कदम)।
  4. S-NO-Hb स्थिरीकरण समाधान तैयार करें जिसमें 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA, धातु चेलेशन के लिए), और उनके स्टॉक समाधानों से 1% Nonidet p-40 डिटर्जेंट शामिल हैं।
    1. पीबीएस (25 मिलीग्राम / एमएल, उदाहरण के लिए, 10 एमएल पीबीएस में 250 मिलीग्राम) में एनईएम क्रिस्टल जोड़कर 200 एमएम एनईएम समाधान तैयार करें और समाधान को तब तक मिलाएं जब तक कि सभी क्रिस्टल भंग न हो जाएं (प्रयोग के दिन बनाया जाना है)।
    2. DdH2 O (263.5 mg/mL जैसे 5 mL में1.32g in 5 mL में DDH2O) को जोड़कर एक 800 mM K 3 Fe(CN)6 समाधान तैयार करें (प्रयोग के दिन बनाया जाना है)।
    3. डीडीएच2ओ के 200 मिलीलीटर में 786 मिलीग्राम डीटीपीए जोड़कर 10 एमएम डीटीपीए स्टॉक समाधान तैयार करें और डीटीपीए को पूरी तरह से घुलनशील बनाने के लिए 5 एन एनएओएच के साथ 7.0 पर पीएच को समायोजित करें।
    4. 200 mM NEM समाधान के 5 mL जोड़ें, 800 mM K3Fe(CN)6 समाधान के 1.5 mL और DTPA स्टॉक समाधान के 1 mL को 7.2 pH पर PBS के 81.5 mL में जोड़ें, और अंत में, अंतिम मात्रा को 100 mL तक लाने के लिए 10% NP-40 के 11 mL जोड़ें।

2. नमूना संग्रह

नोट:: नमूना संग्रह पर अधिक जानकारी के लिए, पहले प्रकाशित कार्य 15,22,40 को देखें।

  1. पूरे रक्त को इकट्ठा करें
    1. हेपरिन-लेपित ट्यूबों में रक्त एकत्र करें धमनी वाहिका (जब तक विशेष रूप से आवश्यक न हो) पर शिरापरक पसंद करते हैं और हेमोलिसिस को कम करने के लिए कम से कम 20 जी या उससे बड़े कैथेटर या सुई बोर के साथ वेनिपंक्चर (यदि संभव हो तो) पर कैथेटर प्लेसमेंट को पसंद करते हैं।
    2. तुरंत NO2- अवरुद्ध समाधान (पूरे रक्त के 4 भागों के लिए समाधान का 1 भाग), प्रक्रिया (अनुभाग 3 या 4), या फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जोड़ें।
  2. प्लाज्मा और लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) इकट्ठा
    1. हेपरिन-लेपित ट्यूबों में रक्त एकत्र करें धमनी रक्त (जब तक विशेष रूप से आवश्यक न हो) पर शिरापरक पसंद करते हैं और कम से कम 20 जी या उससे बड़े की सुइयों को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए हेमोलिसिस और सेंट्रीफ्यूज को तुरंत कम करने के लिए।
    2. Supernatant (प्लाज्मा) को NO2- ब्लॉकिंग समाधान (supernatant के 4 भागों के लिए समाधान का 1 भाग) के साथ एक नई ट्यूब और प्रक्रिया (अनुभाग 3 या 4) में मिलाएं, या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और स्टोर करें।
      नोट: कोई खपत परख के लिए, नहीं2- अवरुद्ध समाधान का उपयोग नहीं किया जा सकता है। परख प्लाज्मा पूर्व उपचार के बिना प्रदर्शन किया जा सकता है.
    3. नीचे से आरबीसी गोली को एस-नो स्थिरीकरण समाधान से पहले से भरे एक नए ट्यूब पर फिर से निलंबित करें (चरण 1.4 देखें) (समाधान के 9 एमएल के लिए गोली का 1 एमएल) और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. RBC lysate को G-25 Sephadex बहुलक के साथ एक आकार स्तंभ में पास करें जिसे पहले बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के लिए ddH2O के साथ कुल्ला किया गया है
    5. प्रक्रिया (अनुभाग 4) के लिए एचबी अंश एकत्र करें और ड्रैबकिन के अभिकर्मक का उपयोग करके एचबी एकाग्रता को मापने के लिए (एचबी माप के लिए, पहले प्रकाशित कार्य22 देखें)।
      नोट: एक विशिष्ट ऊतक / अंग को तैयार करने और नमूना करने के लिए, इसके हिलम की पहचान करें, और सर्जिकल रूप से इसे अलग करें। नस को इंकाइज़ करें, धमनी को पंचर करें, और धमनी के माध्यम से हेपरिनाइज्ड खारा (10 यू / एमएल) के साथ इंजेक्ट करें। ऊतक को एक्साइज करें जब लवण शिरापरक चीरा पर बैकफ्लो करना शुरू कर देता है। एक मैकेनिक homogenizer के साथ ऊतक homogenize, जबकि NO2 के 1 भाग को जोड़ने- homogenized ऊतक के 4 भागों के लिए समाधान अवरुद्ध.

3. VCl3 HCl परख तैयारी में

नोट:: HCl परख तैयारी में VCl3 पर अधिक जानकारी के लिए, पहले प्रकाशित37,41 काम करता है के लिए देखें.

सावधानी: CLD क्षतिग्रस्त हो जाएगा अगर NaOH जाल ठीक से जगह में नहीं है जब इस परख प्रदर्शन. यह HCl की corrosivity के कारण है।

  1. मानक वक्र के लिए NO3 के मानक समाधान तैयार करें
    1. 0.1 M NaNO3 प्राप्त करने के लिए ddH2O के 10 mL में NaNO3 के 85 मिलीग्राम को भंग करें- (यह समाधान कुछ हफ्तों के लिए स्थिर रहता है)।
    2. प्लाज्मा या मूत्र के नमूनों के लिए अंशांकन वक्र करने के लिए 5 μM, 10 μM,20μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 की सांद्रता प्राप्त करने के लिए ddH 2 O में कमजोर पड़ने से मानकों को तैयार करने के लिए स्टॉक समाधान का उपयोग करें (सेल संस्कृतियों के साथ काम करते समय कम सांद्रता का उपयोग करें)।
  2. VCl3 (वैनेडियम क्लोराइड) संतृप्त समाधान NO3 के लिए तैयार करें- पर्ज पोत में कमी
    सावधानी: पानी और VCl3 की प्रतिक्रिया exothermic है। एसिड जोड़ते समय और प्रयोग के अंत में ग्लासवेयर को धोते समय उच्च ग्लासवेयर तापमान पर ध्यान दें।
    1. पहले एक साफ फ्लास्क में VCl3 जोड़कर 1 M HCl के 200 mL में VCl3 के 1.6 ग्राम को भंग करें, फिर 1 M HCl के 200 mL को जोड़कर।
    2. वैक्यूम फ़िल्टर पेपर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें (जैसे कि 11 μm फ़िल्टर पेपर, लेकिन किसी भी फ़िल्टर पेपर का उपयोग किया जा सकता है)।
      नोट: फ़िल्टर किया गया समाधान नीले रंग को साफ़ करने के लिए बदल जाएगा, जबकि unfiltered VCl3 समाधान undissolved कणों के कारण भूरे रंग का है।
    3. संतृप्त समाधान या तो एल्यूमीनियम पन्नी या polytetrafluoroethylene (PTFE) टेप के साथ कवर रखें क्योंकि यौगिक प्रकाश संवेदनशील है।
  3. परिसंचारी पानी स्नान तैयार करें
    1. पर्ज पोत के पानी के जैकेट के लिए एक परिसंचारी पानी स्नान उपकरण कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि प्राइमिंग से पहले लाइनें सूखी हैं।
    2. 95 डिग्री सेल्सियस पर पानी का स्नान शुरू करें और लाइनों के चारों ओर (गैर-परिशिष्ट) पेपर तौलिए लागू करके पानी की लाइनों पर रिसाव की अनुपस्थिति को सत्यापित करें।
  4. गैस बबलर जाल सेट अप करें
    1. सत्यापित करें कि बबलर की PTFE आस्तीन जगह में है और यह क्षतिग्रस्त नहीं है।
    2. गैस bubbler खोलें और bubbler आधार में 1 M NaOH के 15 mL इंजेक्ट करें।
    3. गैस bubbler reposition और ऊपर की ओर नीचे दबाकर और थोड़ा दो भागों घुमा द्वारा कसकर कनेक्शन सील. बल लागू किए बिना बबलर के शीर्ष को मोड़ने की असंभवता एक सही मुहर को इंगित करती है।
    4. गैस बबलर जाल के इनलेट के लिए शुद्ध पोत के आउटलेट कनेक्ट करें।

4. मैं3- एसिटिक एसिड परख तैयारी में

नोट: एसिटिक एसिड परख तैयारी में मैं3 पर अधिक जानकारी के लिए, पहले प्रकाशित काम करता है 15,22,38,41,42 को देखें.

  1. NO2 के लिए मानक वक्र तैयार करें-
    1. 100 mM समाधान प्राप्त करने के लिए ddH2 O के 10 mL में 69 मिलीग्राम सोडियम नाइट्राइट (NaNO2) को भंग करके एक स्टॉक समाधान तैयार करें। यह समाधान स्थिर है यदि एक एयरटाइट कंटेनर में संग्रहीत किया जाता है, प्रशीतित किया जाता है, और प्रकाश से संरक्षित होता है।
    2. क्रमिक रूप से स्टॉक समाधान को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पतला करें जो पहले से 900 μL ddH2O के साथ भरा हुआ है: पहले सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्टॉक समाधान का 100 μL जोड़ें, मिश्रण, लेबल, और दूसरी ट्यूब के लिए ट्यूब के 100 μL का उपयोग करें, फिर 10 mM, 1 mM, फिर 100 μM के परिणामस्वरूप दोहराएं।
    3. अंशांकन वक्र में उपयोग किए जाने वाले 50 μM,25μM, 10 μM, 1 μM और 500 nM NaNO 2 एलीकोट प्राप्त करने के लिए ddH2 O के साथ आगे पतला करें।
  2. शुद्ध पोत के लिए एसिटिक एसिड में मैं3- तैयार करें (1 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है)22
    1. 2 ग्राम पोटेशियम आयोडाइड (केआई) और 1.3 ग्राम आयोडीन (आई2) को डीडीएच2ओ के 40 एमएल और एसिटिक एसिड के 140 एमएल में जोड़ें।
    2. मिश्रण को कम से कम 30 मिनट के लिए हिलाकर अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. NO2-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, यदि Hb एकत्र किया जाता है) और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स (Hb-NO यदि Hb एकत्र किया जाता है) के विभेदक निर्धारण के लिए नमूने तैयार करें (चित्रा 3)
    1. प्रत्येक नमूने को प्रकाश-संरक्षित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 270 μL (Hb के 900 μL यदि S-NO-Hb और Hb-NO को मापते हैं) के 3 एलीकोट में विभाजित करें, उनमें से 2 को 1x PBS के 30 μL (100 μL यदि S-NO-Hb और Hb-NO को मापते हैं) के साथ पूर्व-भरा हुआ है और HgCl2 के 30 μL के साथ तीसरी ट्यूब (100 μL यदि S-NO-Hb और Hb-NO को मापते हैं), भंवर और 2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट (चित्रा 3).
    2. Fe-NOs को मापने के लिए HgCl 2 के साथ नमूने में 5%AS के 30 μL जोड़ें, (Hb-NO के लिए 100 μL) और S-NOs और Fe-NOs (S-NO-Hb और Hb-NO के लिए 100 μL) को मापने के लिए जोड़ा गया PBS के साथ एक और तीसरे में PBS के 30 μL जोड़ें, जो पहले से ही 1x PBS से पहले से ही2-, S-NOs और Fe-NOs (100 μL) को मापने के लिए 1x PBS के साथ पहले से ही भरा हुआ है। एस-नो और एचबी-नो)। भंवर और 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट (चित्रा 3).

5. सेल मुक्त एचबी सेटअप द्वारा कोई खपत

नोट:: अधिक जानकारी के लिए, पहले प्रकाशित कार्य38 को देखें।

  1. एक ज्ञात एकाग्रता के साथ एक शुद्ध स्टॉक Hb समाधान से मानक oxyHb समाधान तैयार करें
    1. अंशांकन वक्र के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों को प्राप्त करने के लिए ddH2O के अतिरिक्त द्वारा 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टॉक समाधान को क्रमिक रूप से पतला करें: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.56 μM।
  2. DETA-NONOate समाधान तैयार करें
    1. 10 मिलीग्राम DETA-NONOate जोड़ें 610 μL के लिए 10 μM NaOH के पीएच 7.4 PBS में DETA-NONOate के 100 mM उत्पन्न करने के लिए और इसे बर्फ पर रखने के लिए।

6. chemiluminescence डिटेक्टर (CLD) शुरू करें और शुद्ध पोत तैयार

नोट:: पर्ज पोत की तैयारी के लिए, पहले प्रकाशित कार्य43 को देखें।

  1. CLD के लिए और से मुख्य कनेक्शन सत्यापित करें
    1. ऑक्सीजन लाइन को सीएलडी से कनेक्ट करें और ऑक्सीजन टैंक को एक दबाव पर खोलें जो सीएलडी के निर्माता के साथ समझौते में है।
    2. सुनिश्चित करें कि तीव्र फ़ील्ड ढांकता हुआ (IFD) फ़िल्टर लाइन CLD से कनेक्ट डे है, लेकिन पर्ज पोत या NaOH ट्रैप के लिए नहीं
  2. CLD प्रारंभ करें
    1. CLD इंटरफ़ेस पर, तरल चरण assays के लिए पता लगाने के कार्यक्रम चल रहा शुरू करें।
    2. सत्यापित करें कि ऑक्सीजन की आपूर्ति पर्याप्त है। यदि यह मामला है, तो सीएलडी सफलतापूर्वक अपने इनलेट से नमूना लेना शुरू कर देगा और मिलीवोल्ट (0-5 एमवी) में सिग्नल द्वारा पता लगाने का संकेत देगा। अन्यथा, CLD एक नकारात्मक नैदानिक संकेत संकेत देगा।
  3. शुद्ध पोत तैयार करें
    1. सभी तीन बंदरगाहों पर पर्ज पोत को बंद करें: पूरी तरह से सुई वाल्व को दाईं ओर पेंच करें, इनलेट और आउटलेट स्टॉपकॉक्स को बंद करें।
    2. पर्ज पोत से टोपी को हटा दें और प्रतिक्रिया कक्ष (तालिका 1) के लिए नियोजित परख के लिए विशिष्ट अभिकर्मक की पर्याप्त मात्रा जोड़ें ताकि नमूनों को इंजेक्ट करने के लिए उपयोग की जाने वाली सिरिंज सुई द्रव स्तंभ तक पहुंच सके।
    3. एक स्थिर वांछित आधार रेखा (तालिका 1) की उपस्थिति सत्यापित करें।
  4. पर्ज गैस प्रवाह शुरू करें
    1. सुनिश्चित करें कि अक्रिय गैस टैंक (उदाहरण के लिए, एन2) दो-चरण नियामक से सुसज्जित है और निष्क्रिय गैस टैंक को पोत के गैस इनलेट के साथ जोड़ता है।
    2. 1-5 साई के नियामक पर एक आउटलेट दबाव के साथ गैस खोलें, पर्ज पोत के इनलेट को खोलें और गैस के प्रवाह की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे पर्ज पोत के सुई वाल्व को खोलें। शुद्ध पोत के भीतर bubbling सत्यापित करें।
  5. गैस प्रवाह समायोजित करें
    1. IFD फ़िल्टर लाइन नमूना परिवेशी हवा के साथ CLD द्वारा मापा सेल दबाव रिकॉर्ड करें।
    2. शुद्ध पोत पर टोपी reposition, IFD फिल्टर लाइन शुद्ध पोत (या HCl परख में VCl3 में NaOH जाल करने के लिए) से कनेक्ट, और शुद्ध पोत के आउटलेट खोलें.
    3. CLD स्तर पर एक ही सेल दबाव तक पहुंचने के लिए सुई वाल्व का उपयोग करें जो परिवेशी हवा में दर्ज किया गया है।

7. प्रयोग

नोट:: प्रयोग के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पहले प्रकाशित कार्य43 को देखें।

  1. chemiluminescence सिग्नल अधिग्रहण कार्यक्रम प्रारंभ करें
    1. CLD के सीरियल पोर्ट को कंप्यूटर के सीरियल पोर्ट से कनेक्ट करें जिसमें अधिग्रहण प्रोग्राम स्थापित किया गया है.
    2. विश्लेषण प्रोग्राम चलाएँ।
    3. Acquire पर क्लिक करें, .data फ़ाइल को सहेजने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें, फ़ाइल नाम लिखें, और सहेजें पर क्लिक करें।
      नोट:: पूर्व निर्धारित समय स्क्रीन पर चलाने का समय ध्यान दें, क्योंकि प्रीसेट समय बीतने पर रिकॉर्डिंग स्वचालित रूप से बंद हो जाती है। यदि आवश्यक हो, तो प्रीसेट रनिंग टाइम बढ़ाया जा सकता है।
  2. बार-बार नमूना इंजेक्शन के लिए तैयार करें
    1. न्यूनतम और/या अधिकतम बटन पर क्लिक करके और फिर वांछित मान दर्ज करके लक्षित आधार रेखा पर नियंत्रण रखने के लिए स्क्रीन पर वोल्टेज स्केल समायोजित करें.
    2. नमूनों के बीच सिरिंज को कुल्ला करने के लिए डीडीएच 2 ओ से भराएक 20- या 50-एमएल ट्यूब है।
    3. नाजुक कार्य पोंछे का एक बॉक्स आसानी से उपलब्ध है.
  3. नमूना इंजेक्शन
    नोट:: अंशांकन वक्र के लिए मानक समाधान से प्रारंभ करें (सबसे अधिक केंद्रित नमूनों के लिए कम से कम केंद्रित से इंजेक्ट करें), फिर प्रयोग नमूनों के लिए आगे बढ़ें (डुप्लिकेट या प्रतिलिपि में ऐसा करने पर विचार करें)।
    1. प्रत्येक नमूने (और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद) को वापस लेने से पहले डीडीएच2ओ के साथ कम से कम दो बार या उससे अधिक सिरिंज को कुल्ला करें और एक कार्य पोंछने पर हर बार अबाधित पानी के इजेक्शन को सत्यापित करें।
    2. सिरिंज और ट्यूब दोनों को एक करीबी दूरी पर रखते हुए नमूना ट्यूब में सिरिंज डालें, प्लंजर को वांछित मात्रा में खींचें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा का बुलबुला और / या गैर-homogenized ठोस भाग फंस गए हैं।
    3. एक कार्य वाइपर के साथ सिरिंज की नोक को साफ करें, फिर इंजेक्शन पोर्ट पर सेप्टा कैप में सिरिंज डालें और यह सत्यापित करने के बाद इंजेक्ट करें कि सिरिंज की नोक प्रतिक्रिया कक्ष में तरल चरण के भीतर है।
  4. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में इंजेक्शन चिह्नित करें और प्रतीक्षा करें
    1. सत्यापित करें कि इंजेक्शन संकेत (पूरक चित्रा 1) (सेल मुक्त Hb परख द्वारा कोई खपत में नीचे की ओर) में एक ऊपर की ओर परिवर्तन का कारण बनता है और नमूना नाम के तहत ग्रे बॉक्स पर क्लिक करके नमूना नाम टाइप करें, तो मार्क इंजेक्शन पर क्लिक करें।
      नोट:: संदिग्ध सिरिंज बाधा यदि नमूना इंजेक्शन एक संकेत उत्पन्न नहीं करता है।
    2. इलेक्ट्रिक सिग्नल को फिर से बेसलाइन तक पहुंचने के लिए प्रतीक्षा करें (इसमें आमतौर पर 3-4 मिनट लगते हैं)। इस समय का उपयोग चरण 7.3.1 करने के लिए किया जा सकता है।
  5. प्रयोग के अंत तक प्रत्येक इंजेक्शन के दौरान और बाद में चरण 7.3 और 7.4 में इंगित सभी चरणों को दोहराएं। संरक्षण समाधान का एक नमूना चलाने के लिए याद रखें (यदि उपयोग किया जाता है)
  6. प्रयोग रोकें
    1. सिग्नल अधिग्रहण को बाधित करने के लिए STOP पर क्लिक करें, CLD को रोकें और पानी के स्नान को बंद कर दें (यदि NO3- मापा जाता है)।
    2. गैस प्रवाह को बाधित करें, सुई वाल्व खोलें, पर्ज पोत से टोपी को हटा दें, नाली के नीचे एक अपशिष्ट कंटेनर रखें और ड्रेनिंग स्टॉपकॉक खोलें।
      नोट:: यदि प्रयोग 60 मिनट से अधिक समय के लिए डेटा अधिग्रहण की आवश्यकता है, तो यह 60 मिनट चल रहे समय (चरण 7.1.3 को दोहराएँ) के बाद अधिग्रहण को पुनरारंभ करने और एक नई फ़ाइल बनाने के लिए आवश्यक है।

8. माप और गणना

नोट:: माप और परिकलन ऑफ़लाइन किए जाते हैं और एक अलग समय पर किया जा सकता है।

  1. ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण के लिए chemiluminescence अधिग्रहण प्रोग्राम प्रारंभ करें
    1. कार्यक्रम शुरू करें और प्रक्रिया पर क्लिक करें।
    2. प्रयोग फ़ाइल का चयन करें, फिर खोलें पर क्लिक करें।
  2. प्रत्येक व्यवस्थापन के लिए वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की गणना करें
    1. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से स्क्रीन पर बेसलाइन (पूरक चित्रा 2A, क्षैतिज पीली रेखा) और प्रत्येक नमूना प्रशासन (ऊर्ध्वाधर पीली रेखाओं) द्वारा उत्पन्न प्रत्येक तरंग के शिखर अक्ष पर रेखांकित करता है: उनकी सही स्थिति सत्यापित करें (या प्रत्येक पंक्ति पर क्लिक करके समायोजित करें और इसे माउस या तीर के साथ ले जाकर समायोजित करें) और थ्रेशोल्ड ओके (पूरक चित्रा 2 बी) पर क्लिक करें।
      नोट: सेल मुक्त एचबी माप परख द्वारा कोई खपत में, सॉफ्टवेयर आमतौर पर सही ढंग से नमूना इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न तरंग पर कब्जा करने के लिए प्रबंधन नहीं करता है। प्रत्येक तरंग पर ज़ूम करके, ऑपरेटर आसानी से क्षेत्र गणना (पूरक चित्रा 2) में सॉफ्टवेयर की सहायता कर सकते हैं।
    2. सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक नमूना प्रशासन के कारण प्रत्येक चोटी की शुरुआत (ऊर्ध्वाधर हरी रेखा) और अंत (ऊर्ध्वाधर लाल रेखा) को रेखांकित करता है: उनकी सही स्थिति को सत्यापित करें (या प्रत्येक पंक्ति पर क्लिक करके समायोजित करें और इसे माउस या तीर के साथ ले जाकर समायोजित करें) और एकीकृत करें (पूरक चित्रा 2 सी) पर क्लिक करें।
      नोट:: ट्रेस में कुछ क्षेत्रों को गलती से इस बिंदु पर इंजेक्शन के रूप में परिभाषित किया जा सकता है, और कुछ चोटियों को स्वचालित रूप से दो बार गिना जा सकता है। दोनों गलतियों को पुन: पहचाना जा सकता है और चरण 8.2.2 के दौरान निकाला जा सकता है
    3. सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रयोग और उसके असाइन किए गए नाम के दौरान चिह्नित एक इंजेक्शन के बाद प्रत्येक सिग्नल क्षेत्र से मेल खाता है: अगले शिखर और पिछले पीक पर क्लिक करके असाइन किए गए नाम के साथ प्रत्येक चोटी (एक पीले ऊर्ध्वाधर रेखा द्वारा इंगित) नेविगेट करें, फिर बटन पर क्लिक करें ऑल ओके अंतमें स्क्रीन पर सभी क्षेत्रों के लिए गणना प्राप्त करने के लिए।
    4. उपयोगकर्ता या प्रोग्राम द्वारा की गई सभी नामकरण या मिलान गलतियों को सही करने के लिए, पूरक फ़ाइल 1 में इंगित बटन ों की आवश्यकतानुसार उपयोग करें।
  3. अंशांकन वक्र मानों को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें और एक रैखिक प्रतिगमन समीकरण उत्पन्न करें (पूरक चित्र3)
    1. CLD प्रोग्राम से डेटा को कॉपी-पेस्ट के माध्यम से एक नई स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करें। डेटाशीट पर दो स्तंभों को नमूना एकाग्रता और वक्र के अंतर्गत क्षेत्र के रूप में व्यवस्थित करें, और दोनों स्तंभों पर शून्य का मिलान किया गया मान जोड़ें.
    2. दो स्तंभों का चयन करें, स्कैटर > सम्मिलित करें पर क्लिक करें, फिर चार्ट डिज़ाइन मेनू के तहत, चार्ट तत्व जोड़ें > ट्रेंडलाइन > रैखिक का चयन करें।
    3. जनरेट की गई ट्रेंडलाइन पर राइट-क्लिक करें, Format Trendline पर क्लिक करें, फिर चार्ट पर समीकरण प्रदर्शित करें और एक साधारण रैखिक अंशांकन समीकरण प्राप्त करने के लिए Format Trendline मेनू पर चार्ट पर R-squared मान प्रदर्शित करें विकल्पों पर क्लिक करें।
  4. इसकी एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रत्येक नमूने के परिकलित क्षेत्र को स्थानांतरित करें (पूरक चित्र3)
    1. स्प्रेडशीट पर प्रत्येक मान की रिपोर्ट करें. अगले कॉलम में, प्रत्येक इंजेक्ट किए गए नमूने की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए चरण 8.3.3 से प्राप्त समीकरण को लागू करें, जहां y एकाग्रता (नए कॉलम का मूल्य) है और एक्स इंजेक्शन के बाद मापा गया वक्र के तहत क्षेत्र है।
      नोट: संरक्षण समाधान (यदि उपयोग किया जाता है) में मापी गई एकाग्रता को ध्यान में रखना याद रखें और तदनुसार मानों को घटाएं।

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Representative Results

सेल-मुक्त एचबी परख द्वारा नो-खपत का उपयोग सेल-मुक्त ऑक्सीएचबी (चित्रा 4) की ज्ञात सांद्रता वाले नमूनों में किया गया था। के रूप में oxyHb stoichiometrically परख में एक अणु जारी की एक हीम के रूप में, शुद्ध सेल मुक्त oxyHb परख के लिए अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए प्रयोग किया जाता है (पूरक चित्रा 3).

सेल मुक्त एचबी (एक colorimetric परख के साथ मापा) और कार्डियक सर्जरी के दौरान कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (CPB) से बाहर आने वाले रोगियों में कोई खपत के बीच खुराक प्रतिक्रिया संबंध चित्रा 5 में दिखाया गया है। यह माना जा सकता है कि सीपीबी के बाद सीपीबी के दौरान NO प्राप्त करने वाले रोगियों की तुलना में Hb-Fe2 + -O2 स्थिति (चित्रा 5, लाल) में हीम समूहों की एक उच्च एकाग्रता होती है, जिसमें से सेल-मुक्त एचबी के हीम समूहों का केवल एक अल्पसंख्यक NO (चित्रा 5, हरा) का उपभोग करता है।

सेल-मुक्त एचबी द्वारा कोई खपत का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल पहले कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले 50 रोगियों से प्लाज्मा नमूनों का परीक्षण करने और सीपीबी की आवश्यकता के लिए लागू किया गया था। रक्त बेसलाइन पर एकत्र किया गया था और सीपीबी के बाद 15 मिनट, 4 घंटे और 12 घंटे। अध्ययन का उद्देश्य फुफ्फुसीय और प्रणालीगत संवहनी प्रतिरोध दोनों के बीच मौजूदा संबंधों और सीपीबी के बाद देखे गए हेमोलिसिस में वृद्धि की जांच करना था। सेल मुक्त एचबी एकाग्रता एक एचबी colorimetric परख के साथ मूल्यांकन किया गया था. हेमोलिसिस सीपीबी के 15 मिनट बाद चरम पर पहुंच गया। संचित मुक्त एचबी को धीरे-धीरे 12 ज18 (चित्रा 6 ए) के भीतर प्लाज्मा से समाप्त कर दिया गया था। इसके बजाय, कोई खपत 15 मिनट पर पहुंच गई और केवल 4 घंटे (चित्रा 6 बी) में बेसलाइन मानों तक पहुंच गई। सेल-मुक्त एचबी द्वारा कोई खपत के रैखिक प्रतिगमन घटता ने बेसलाइन, 4 एच, और 12 एच पोस्ट-सीपीबी (चित्रा 6 सी) के विपरीत 15 मिनट के बाद सीपीबी टाइमपॉइंट पर एक स्टोइकोमेट्रिक संबंध प्रदर्शित किया। कैनेटीक्स में देखे गए अंतर के लिए स्पष्टीकरण नए जारी किए गए मुक्त एचबी की बहुतायत में निहित है जो अभी तक रोगी के एंडोथेलियम द्वारा जारी किए जा रहे नो अणुओं का सामना नहीं किया गया है। OxyHb की एकाग्रता (scavenging NO और परख में खपत में जिसके परिणामस्वरूप) वास्तव में, किसी भी अन्य timepoint की तुलना में 15 मिनट में अधिक था। बेसलाइन पर एकत्र किए गए प्लाज्मा और अन्य टाइमपॉइंट्स पर metHb का एक अपेक्षाकृत उच्च घटक था, जिसे पहले से ही NO द्वारा ऑक्सीकरण किया गया था, NO को बांधा नहीं था, और परख में खपत का कारण नहीं था। फुफ्फुसीय और प्रणालीगत संवहनी प्रतिरोधों को आक्रामक रूप से मापा गया और 15 मिनट में चरम पर पहुंच गया। इस विशिष्ट रोगी आबादी में पहली बार, मुफ्त एचबी द्वारा कोई खपत अस्थायी रूप से वाहिकासंकीर्णन के साथ युग्मित होने के लिए देखी गई थी, जिसने पशु मॉडल में और सिकल सेल रोग18 वाले रोगियों में पिछले अवलोकनों की पुष्टि की थी।

सीपीबी के दौरान और सर्जरी के बाद कोई गैस का प्रशासन परिसंचारी metHb बनाम oxyHb की सापेक्ष मात्रा को बढ़ाता है। जब कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों को नो-गैस इंट्रा-ऑपरेटिव रूप से, और पोस्ट-ऑपरेटिव रूप से इलाज किया गया था, तो सीपीबी (चित्रा 7 ए) के बाद मुक्त एचबी की देखी गई वृद्धि को नो खपत में किसी भी वृद्धि के साथ युग्मित नहीं किया गया था, जैसा कि उपरोक्त प्रोटोकॉल (चित्रा 7 बी) के साथ मापा गया था। बहिर्जात रूप से प्रशासित नहीं गैस अधिकांश ऑक्सीएचबी को मेथएचबी में परिवर्तित करती है, जो बदले में विवो में नो को साफ नहीं करती है और न ही इन विट्रो (अप्रकाशित डेटा) का उपभोग करती है।

Figure 4
चित्रा 4: शुद्ध सेल मुक्त ऑक्सीहीमोग्लोबिन द्वारा नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत। नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत परख शुद्ध सेल मुक्त oxyhemoglobin के ज्ञात सांद्रता के नमूने इंजेक्शन द्वारा प्रदर्शन किया. प्रतिगमन रेखा लाल रंग में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत और कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के साथ कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन एकाग्रता। प्रत्येक रोगी के सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन स्तर, जैसा कि एक colorimetric किट के साथ मापा जाता है, नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) की खपत केमिल्यूमिनेसेंस के माध्यम से मापा गया था। सीपीबी के अंत के 15 मिनट बाद रक्त के नमूने लिए गए थे। प्रतिगमन लाइनों कार्डियक सर्जरी रोगियों के लिए दिखाया गया है (लाल रंग में) या प्राप्त (हरे रंग में) कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (सीपीबी) के दौरान नहीं। हीमोग्लोबिन को हीम समूहों के μM में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कार्डियक सर्जरी रोगियों में नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत और सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन। (ए) कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (सीपीबी) (एन = 50) के साथ कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों के प्लाज्मा में सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन (एचबी) एकाग्रता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगीन निर्धारण किट के उपयोग के साथ विभिन्न समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था। डेटा का विश्लेषण समय बिंदुओं के बीच एक निश्चित प्रभाव के सबूत के साथ एक मिश्रित मॉडल को फिट करके किया गया था। अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्लाज्मा एकाग्रता की तुलना टकी के कई तुलना परीक्षण के साथ बेसलाइन से की गई थी। (B) मुक्त Hb के परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले समान नमूनों से प्राप्त प्लाज्मा द्वारा नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) की खपत। समय बिंदुओं के बीच एक निश्चित प्रभाव के प्रमाण के साथ एक मिश्रित मॉडल को फिट करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्लाज्मा एकाग्रता की तुलना डनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ बेसलाइन से की गई थी। (सी) सेल मुक्त एचबी प्लाज्मा सामग्री के लिए प्रतिगमन लाइनें कोई खपत के साथ मिलान किया. * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001, एनएस महत्वपूर्ण नहीं है । डेटा को माध्यिका ± इंटरक्वार्टल रेंज के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र7: कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत पर नाइट्रिक ऑक्साइड गैस प्रशासन का प्रभाव। (A) कार्डियोपल्मोनरी बाईपास (CPB) के साथ कार्डियक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों के प्लाज्मा में सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन एकाग्रता या तो CPB की शुरुआत के बाद से 24 घंटे के लिए प्लेसबो (N = 28) या नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गैस (N = 22) प्राप्त कर रही है। एकाग्रता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध colorimetric किट के उपयोग के साथ अलग-अलग समय बिंदुओं पर निर्धारित किया गया था। डेटा का विश्लेषण फ्रीडमैन के परीक्षण द्वारा किया गया था, जो दोनों समूहों में समय बिंदुओं के बीच प्रभाव की उपस्थिति का संकेत देता है। अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्लाज्मा एकाग्रता की तुलना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ बेसलाइन से की गई थी। (बी) सेल-मुक्त एचबी के परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले समान नमूनों से प्राप्त प्लाज्मा द्वारा कोई खपत नहीं। डेटा का विश्लेषण फ्रीडमैन के परीक्षण द्वारा किया गया था, जो दोनों समूहों में समय बिंदुओं के बीच प्रभाव की उपस्थिति को दर्शाता है। अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्लाज्मा एकाग्रता की तुलना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ बेसलाइन से की गई थी। ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. डेटा को माध्यिका ± इंटरक्वार्टल रेंज के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जाँच अभिकर्मक मिश्रण लक्ष्य आधार रेखा (mV)
HCl में VCl3 HCl संतृप्त समाधान में VCl3 के 5 mL + एंटीफोम एजेंट के 100 μL 0–5 mV*
मैं3- एसिटिक एसिड में I3 के 5-7 mL- अभिकर्मक 0–5 mV*
सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा कोई खपत नहीं पीबीएस के 5-7 मिलीलीटर पीएच 7.4 + एंटीफोम एजेंट के 100 μL + विस्तारित DETA-NONOate समाधान के 20 μL पर 70–100 mV**
* आदर्श मूल्य: प्रयोग वातावरण में हवा की गुणवत्ता के कारण आधार रेखा अधिक हो सकती है
** प्रयोग शुरू करने से पहले 20 मिनट के लिए स्थिरता सुनिश्चित करें।

तालिका 1: विभिन्न chemiluminescence assays के लिए पोत अभिकर्मक संरचना और लक्ष्य आधार रेखा को शुद्ध करें। प्रत्येक वर्णित परख के लिए पोत अभिकर्मक संरचना पर्ज. NO = नाइट्रिक ऑक्साइड; पीबीएस = फॉस्फेट बफर खारा; DETA-NONOate: (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate। * आदर्श मूल्य: प्रयोग वातावरण में हवा की गुणवत्ता के कारण आधार रेखा अधिक हो सकती है। ** प्रयोग शुरू करने से पहले 20 मिनट के लिए स्थिरता सुनिश्चित करें। कोई खपत परख करने के लिए, पैमाने को 70 mV और 100 mV (जैसे, 0-100 mV) के बीच मूल्यों पर कब्जा करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर बदल दिया जाना चाहिए, जो लक्षित बेसलाइन वोल्टेज है। इस समायोजन को नमूना इंजेक्शन पर पूर्ण नियंत्रण रखने का सुझाव दिया जाता है, जो एक नमूने के इंजेक्शन के बाद बेसलाइन से आगे बढ़ने वाले सिग्नल को दस्तावेज करने और बेसलाइन पर लौटने वाले सिग्नल का निरीक्षण करने में सक्षम बनाता है। डेटा रिकॉर्डिंग विज़ुअलाइज़ किए गए पैमाने से प्रभावित नहीं होती है और न ही सीमित होती है।

पूरक चित्रा 1: चोटियों HCl परख में VCl3 में कोई पता लगाने के बाद. चोटियों जो HCl में VCl3 में नमूना प्रशासन का पालन CLD बंडल सॉफ़्टवेयर पर दिखाए जाते हैं। प्रत्येक इंजेक्शन के लिए चोटी के नीचे के क्षेत्र की गणना सुविधा के लिए दिखाया गया है और पूरक चित्र2 में समझाया गया है। इस प्रयोग में, अंशांकन वक्र के लिए विभिन्न सांद्रता के मानकों को प्रशासित किया गया है, इसके बाद प्लाज्मा नमूने। तनुकरण उन नमूनों से चयापचयों की गणना करने के लिए एक उपयोगी समाधान है जो उच्च अंत में या अंशांकन वक्र के बाहर भी नहीं उत्पन्न करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: चोटी के नीचे क्षेत्र की उपयोगकर्ता-सहायता प्राप्त स्वचालित गणना। सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा कोई खपत परख प्रदर्शन करते समय, प्रत्येक नमूना इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न चोटी के तहत क्षेत्र को मापने के लिए सबसे सटीक सीमाओं के साथ सॉफ़्टवेयर प्रदान करने के लिए मैन्युअल रूप से चोटियों को सेट करना आवश्यक हो सकता है। (ए) एक रिकॉर्ड किए गए प्रयोग का प्रतिनिधि पूर्ण दृश्य। यह मुख्य मेनू में प्रक्रिया पर क्लिक करके और ब्याज की रिकॉर्ड की गई फ़ाइल का चयन और खोलने से पहुंचा जाता है। पीली रेखा सिग्नल थ्रेशोल्ड (एमवी) का प्रतिनिधित्व करती है जो चोटी के नीचे के क्षेत्र के सीधे खंड का गठन करती है। इस पर क्लिक करके यूजर इसे सिग्नल एरिया की तरफ खींच सकता है। एक्स और वाई-अक्ष को या तो निचले बाएं बटन पर क्लिक करके या प्रत्येक के लिए वांछित न्यूनतम और अधिकतम मूल्य में टाइप करके सटीक माप के लिए ब्याज के शिखर पर ज़ूम करने के लिए बदला जा सकता है। (बी) थ्रेशोल्ड पोजिशनिंग। उपयोगकर्ता नमूना इंजेक्शन के कारण सिग्नल डाउनस्लाइड से ठीक पहले संकेत मध्यबिंदु पर पीली रेखा को खींचकर इष्टतम बेसलाइन थ्रेशोल्ड का चयन कर सकता है। क्षेत्र को सीमित करना जारी रखने के लिए, उपयोगकर्ता को सेट चोटियों को मैन्युअल रूप से बटन पर क्लिक करना होगा। (C) प्रारंभ करें और अंत कर्सर स्थिति. प्रारंभ कर्सर सेट करें बटन पर क्लिक करने से, स्क्रीन पर एक हरी रेखा दिखाई देती है। हरी रेखा को नमूना इंजेक्शन के कारण डाउनस्लाइड की शुरुआत में (खींचने और जारी करके) रखा जाना चाहिए। वही बटन अपने लेबल को सेट एंड कर्सर में परिवर्तित करता है जिस पर क्लिक करके स्क्रीन पर एक लाल रेखा दिखाई देती है। लाल रेखा को उस बिंदु पर रखा जाना चाहिए जहां इंजेक्शन वाले नमूने से कोई खपत नहीं होने के कारण विक्षेपण के बाद सिग्नल फिर से बेसलाइन तक पहुंचता है। कुल मिलाकर, थ्रेशोल्ड लाइन (पीला, बी), हरी रेखा, और लाल रेखा नमूना इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न क्षेत्र को सटीक रूप से रेखांकित करती है। (d) शिखर के अंतर्गत क्षेत्र को प्राप्त करना। एकीकृत करें बटन (सी) पर क्लिक करके, चोटी के नीचे परिकलित क्षेत्र स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर प्रदर्शित होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: अंशांकन वक्र और परिणामों के साथ प्रतिनिधि स्प्रेडशीट। सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन की ज्ञात एकाग्रता (हेम के [μM] के रूप में व्यक्त) के साथ नमूनों के इंजेक्शन द्वारा नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) खपत से उत्पन्न चोटियों के तहत गणना किए गए क्षेत्रों को शीर्ष बाईं ओर (पीले रंग की पृष्ठभूमि पर) दिखाया गया है। अंशांकन वक्र और इसके परिणामस्वरूप रैखिक समीकरण y = mx + q बनाने के लिए मानों को प्लॉट किया गया है। ढलान (m) ऑक्सीएचबी हीम समूहों (μM) की संख्या है जो फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब द्वारा 1 mV द्वारा पता लगाए गए सिग्नल को कम करने के लिए आवश्यक है। चार अलग-अलग समय बिंदुओं (विभिन्न पृष्ठभूमि रंगों द्वारा चिह्नित) पर प्राप्त एक रोगी से नमूनों के तीन प्रतियों के इंजेक्शन (रन एन 1,2,3) से परिकलित मान स्प्रेडशीट में दर्ज किए गए थे। रैखिक समीकरण को हल करके प्रत्येक नमूने के कारण कोई खपत के मूल्य को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक तीन प्रतियों का औसत उपयोग किया गया था: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Equation 1

पूरक फ़ाइल 1: बंडल सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर चोटियों की समीक्षा करना। इस फ़ाइल में बंडल किए गए सॉफ़्टवेयर से लिया गया स्क्रीनशॉट और प्रत्येक बटन के लिए अनुमत क्रियाएँ शामिल हैं. प्रत्येक चोटी के लिए (कलाकृतियों के कारण झूठी चोटियों सहित), उपयोगकर्ता फ़ाइल में इंगित बटन का उपयोग पुष्टि करने, या उपेक्षा करने, या हटाने, या आवश्यकतानुसार एक विशिष्ट चोटी का नाम देने के लिए कर सकता है। उपयोगकर्ता पहले पता नहीं लगाया गया था जो किसी चोटी को भी रिकॉर्ड कर सकते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

उच्च संवेदनशीलता के कारण, NO और संबंधित यौगिकों के निर्धारण के लिए chemiluminescence-आधारित assays में NO 2-संदूषण का उच्च जोखिम होता है। प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अभिकर्मक (विशेष रूप से NO2- अवरुद्ध समाधान) और dilutant (ddH2O सहित) को पृष्ठभूमि संकेत के लिए सही करने के लिए इसकी NO2- सामग्री के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। नाइट्राइट 10 मिनट के आसपास पूरे रक्त में आधे जीवन के साथ बेहद प्रतिक्रियाशील है और तेजी से NO 3-उत्पन्न करता है। रक्त संग्रह और सेंट्रीफ्यूजेशन, या NO2- ब्लॉकिंग के बीच बीतने वाला समय, इसलिए प्रीएनालिटिकल त्रुटियों का कारण बन सकता है और इसे कम से कम किया जाना चाहिए15। प्लाज्मा के नमूनों का उपयोग कर एक परख में, रक्त अधिमानतः हेपरिन ट्यूबों में और सेंट्रीफ्यूज में रक्त एकत्र 750 x जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए thiol समूह नाकाबंदी के बाद 200 nM NEM के 40 μL के साथ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के 10 mL में NEM के 250 मिलीग्राम भंग करके उत्पादित. स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। नाइट्रोएर्जिनिन, नाइट्रोप्रुससाइड और नाइट्रोग्लिसरीन जैसे यौगिक जो NO सिंथेज़ (NOS) को रोकते हैं, NO में धीमी गति से गैर-मात्रात्मक रूपांतरण से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक बेसलाइन ऊंचाई होती है। यदि एनओएस अवरोधकों का उपयोग जांच का हिस्सा है, तो यह सलाह दी जाती है कि ब्लॉकर्स जिनमें नाइट्रो समूह नहीं होते हैं,उनका उपयोग किया जाना चाहिए। पर्ज पोत में इनलेट दबाव नमूने के लिए सीएलडी द्वारा किए गए निरंतर नकारात्मक दबाव से मेल खाना चाहिए। यदि इनलेट दबाव कम है, तो माध्यम के वैक्यूम आसवन से गैस शुद्धिकरण लाइनों और कक्षों को दूषित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल विरूपण हो सकता है। इसके अलावा, हवा की छोटी मात्रा शुद्ध पोत में प्रवेश कर सकती है और अत्यधिक नहीं उत्पन्न करने के लिए समाधान के साथ प्रतिक्रिया कर सकती है। इसके विपरीत, एक प्रवाह दर के कारण अत्यधिक दबाव जो नमूना वापसी प्रवाह से अधिक है, वातावरण में NO जारी कर सकता है जिससे सिग्नल15 को कम करके आंका जा सकता है। इसके अलावा, एचसीएल में वीसीएल3 और एसिटिक एसिड प्रोटोकॉल में आई3- दोनों को तैयारी के दौरान कई कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है और नमूना एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए कई गणनाओं की आवश्यकता होती है। प्रत्येक चरण को सावधानीपूर्वक कमजोर पड़ने के रूप में दर्ज किया जाना चाहिए और गणना को कई समूहों द्वारा त्रुटि44 के मुख्य स्रोत के रूप में पहचाना जाता है।

NO 2- ब्लॉकिंग समाधान (चरण 2.1.2) के अलावा लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करने का कारण बनता है, जिससे सभी ऑक्सीएचबी को MetHb तक कम कर दिया जाता है। यह NO2 द्वारा लोहे से युक्त प्रोटीन (मुख्य रूप से OxyHb) की तेजी से कमी से बचता है- NO3 की बाद की पीढ़ी के साथ- संग्रह पर इस समाधान के साथ नमूनों के उपचार को सही ढंग से NO2- और / या NO 3-को मापने की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, सेल मुक्त एचबी परख द्वारा कोई खपत की योजना बनाते समय समाधान का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। NO2- अवरुद्ध समाधान के एलीकोट को नमूनों के साथ संग्रहीत किया जाना चाहिए और समाधान के कारण सिग्नल के हिस्से को हटाने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। अंत में, मापा मेटाबोलाइट की अंतिम एकाग्रता की गणना करने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। में मैं3- एसिटिक एसिड परख में, NO2- एकाग्रता केवल PBS(NO 2-, S-NO, Fe-NO) वाले एलीकोट से HgCl2 (S-NO और Fe-NO) के बिना एएस युक्त एलीकोट की एकाग्रता को घटाकर प्राप्त की जाती है। एस-एनओ (पारा-लैबाइल प्रोटीन) की एकाग्रता की गणना करने के लिए, एचजीसीएल 2 (एफई-एनओ या पारा-स्थिर नाइट्रोसो-प्रोटीन) के साथ एएस के साथइलाज किए गए एलीकोट की एकाग्रता को एचजीसीएल2 के बिना एएस के साथ इलाज किए गए एलीकोट से घटाया जाना चाहिए। घटाने से पहले, उपयोगकर्ता को नमूना तैयारी के दौरान उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने के कारक को ध्यान में रखने के लिए प्रत्येक ऐलीकोट की एकाग्रता को 0.8181 (270/330) से गुणा करना याद रखना चाहिए (चित्रा 3)। एक ही अवधारणा S-NO-Hb और Hb-NO माप के लिए लागू होती है, जहां पूर्ण सांद्रता मापा Hb22 का एक अंश है। नमूने के प्रकार के आधार पर, NO3- एकाग्रता की एक सटीक गिनती को HCl प्रोटोकॉल में VCl3 और I3- एसिटिक एसिड प्रोटोकॉल में दोनों को चलाने की आवश्यकता हो सकती है ताकि अंतमें NO2 की एकाग्रता को घटाया जा सके- NO3- और NO2- के उन लोगों से। यह हमेशा पूरे रक्त और प्लाज्मा के नमूनों में आवश्यक नहीं होता है, उदाहरण के लिए, जहां NO3- आमतौर पर NO2 से अधिक होता है।

यह याद दिलाना बहुत महत्वपूर्ण है कि CLD क्षतिग्रस्त हो जाएगा यदि NaOH जाल उचित स्थान पर नहीं है जब HCl परख में एक VCl3 प्रदर्शन HCl की corrosivity के कारण. NaOH जाल को भरने के लिए उपयोग किए जाने वाले 1 M NaOH समाधान को या तो ddH 2 O के 100 mL में NaOH नमक के 4 g को भंग करके या ddH2O के 100 mL में 50% NaOH के 5 mL को पतला करके खरीदा या तैयार किया जासकता है। जब ddH2O के साथ 10 μM को और पतला किया जाता है, तो NaOH शुद्ध पोत में इंजेक्शन द्वारा प्रोटीन मलबे को हटाने के लिए बहुत उपयोगी होता है।

CLD द्वारा पता लगाया गया आधार रेखा संकेत स्थिर और 0-5 mV के भीतर होना चाहिए। एक उच्च आधार रेखा संकेत वायु प्रदूषण (NO और डेरिवेटिव द्वारा) के कारण हो सकता है, और इसे खुली हवा में इनलेट छोड़कर सत्यापित किया जा सकता है। यदि एक उच्च वोल्टेज केवल शुद्ध पोत में मनाया जाता है, जबकि अक्रिय गैस के साथ टैंक के संदूषण पर विचार किया जाना चाहिए, तो यह अक्सर कार्बनिक अवशेषों की दृढ़ता या ट्यूब में NO 2 की उपस्थिति के कारण होता है। डीडीएच2ओ के साथ कई बार पर्ज पोत को धोने से बेसलाइन वोल्टेज को कम करने में मदद मिल सकती है। यदि असफल रहता है, तो 24-48 घंटे के लिए 100 mM NaOH के साथ शुद्ध पोत की इनक्यूबेशन के बाद ddH2O के साथ कई washes प्रदूषकों को खत्म करने में मदद करता है। सेल मुक्त एचबी परख द्वारा कोई खपत में, आवश्यक सीएलडी संकेत कम से कम 20-30 मिनट के लिए 70-100 mV है। यदि संकेत स्थिर नहीं है (यानी, वोल्टेज कम हो जाता है), तो डीईटीए नोनोएट की 10 μL की एक अतिरिक्त खुराक को शुद्ध पोत में जोड़ा जा सकता है। इसे आवश्यकतानुसार दोहराया जा सकता है। यह याद रखना आवश्यक है कि अप्रयुक्त पाउडर और पहले से ही विस्तारित DETA NONOate दोनों को -80 °C पर रखा जाना चाहिए। यह अभिकर्मक इष्टतम भंडारण के बावजूद तेजी से क्षय हो जाता है और शायद ताजा तैयार नहीं होने पर अंडरपरफॉर्म करता है, जिससे शुद्ध पोत में कई इंजेक्शन की आवश्यकता होती है और कम स्थिर आइसोइलेक्ट्रिक सिग्नल की ओर अग्रसर होता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इसे पीएच 7.4 के साथ पीबीएस में विस्तारित किया जाना चाहिए क्योंकि यह अपने आधे जीवन को अनुकूलित करता है (कमरे के तापमान पर पीएच 7.4 पर 56 ज बनाम 5.0 के पीएच पर अर्ध-त्वरित पृथक्करण बनाम 5.0) 45 के पीएच पर अर्ध-त्वरित पृथक्करण। DETA NONOate के इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सिरिंज को विशेष रूप से उस कार्रवाई के लिए समर्पित किया जाना चाहिए और नमूनों के इंजेक्शन के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।

यदि एक नमूने का इंजेक्शन एक चोटी उत्पन्न करता है जो अंशांकन वक्र के ऊपरी बिंदु से अधिक है, खासकर यदि यह 700 एमवी से अधिक वोल्टेज उत्पन्न करता है, तो त्रुटि को कम करने के लिए नमूना (2x या 4x) को पतला करने की सलाह दी जाती है। यह भी कोई खपत परख पर लागू होता है अगर नमूना इंजेक्शन के कारण डुबकी अंशांकन वक्र में उपयोग किए जाने वाले सबसे केंद्रित नमूने के इंजेक्शन के कारण एक से अधिक गहरा है। इंजेक्शन के बाद सिग्नल में एक चोटी (या एक के माध्यम से) का सबूत जो अपेक्षा से कम या अनुपस्थित है, इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सटीक सिरिंज के क्लॉगिंग का संकेत दे सकता है। उपयोग की जाने वाली छोटी मात्राओं (10-20 μL / नमूना) के कारण, विशेष रूप से यदि प्लाज्मा या मूत्र assays का प्रदर्शन किया जाता है, तो सिरिंज के क्लॉगिंग के कारण एक भरे हुए सिरिंज और नमूने की अनुपस्थिति के बीच अंतर करना मुश्किल हो सकता है। प्लंजर द्वारा किए गए प्रतिरोध पर ध्यान देने की सलाह दी जाती है। सिरिंज के निरीक्षण द्वारा पुष्टि के बाद, बाधा को हटाने का प्रयास बार-बार सिरिंज को डीडीएच2ओ के साथ धोने और एक नाजुक कार्य पोंछने पर सिरिंज को रगड़कर किया जा सकता है यदि बाधा बाहरी रूप से दिखाई देती है। जब संदेह होता है, तो यह सलाह दी जाती है कि एक कार्य पोंछने पर नमूना मात्रा को बाहर निकालें और डीडीएच2ओ के साथ सिरिंज को धोने के लिए वापस जाएं और नमूना प्रशासन को दोहराने का प्रयास करें। फोमिंग एक आम जटिलता है और तरल स्तंभ की ऊंचाई प्रतिक्रिया स्तंभ से अधिक होने के बाद प्रयोग को समाप्त करने के लिए मजबूर करती है, जिससे संकेत अस्थिरता होती है। प्रोटोकॉल में इंगित एंटीफोमिंग एजेंट खुराक से अधिक होने से बेसलाइन सिग्नल में वृद्धि हो सकती है और इससे बचा जाना चाहिए। अत्यधिक फोमिंग के गठन के कारण नमूनों की संख्या अनुमानित हो जाती है जब दोहराए जाने वाले assays का प्रदर्शन किया जाता है, एक ऐसी घटना जिसे सूचित करना चाहिए कि प्रयोग को बेहतर तरीके से कैसे नियोजित किया जा सकता है। फोमिंग को कम करने के लिए एक वैकल्पिक कदम ठंडे मेथनॉल (अनुपात 1: 1) और 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, 4 डिग्री सेल्सियस पर 13000 एक्स जी के साथ प्लाज्मा या ऊतक supernatant मिश्रण करने के लिए है। यह माना जाना चाहिए कि मेथनॉल प्रोटीन को अवक्षेपित करने का कारण बनता है। केवल हल्के एस-एनओ और एफई-एनओ जो प्रकृति में प्रोटीइक नहीं हैं, उन्हें मापा जाता है। इस प्रकार, इस विकल्प को पूरे रक्त पर अध्ययन में या किसी अन्य मामले में नहीं अपनाया जा सकता है जहां एस-एनओ और एफई-एनओ प्रोटीन में रुचि है।

एचसीएल में वीसीएल 3 और एसिटिक एसिड में आई3 के अलावा अधिक अभिकर्मकसमाधानों का वर्णन किया गया है और सफलतापूर्वक अपनाया गया है। एस्कॉर्बिक एसिड विशेष रूप से NO2 को कम करता है- NO3- और न ही S-NOs के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है, और इसका उपयोग उन स्थितियों में इंजेक्ट किए गए नमूनों और गणनाओं के थोक को कम करने के लिए किया जा सकता है जहां NO2- ब्याज का एकमात्र अणु है। मुख्य नुकसान अभिकर्मक की सीमित स्थिरता है, जिसमें अभिकर्मक समाधान के अधिक लगातार परिवर्तनों की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, दोहराए गए अंशांकन46। कार्बन मोनोऑक्साइड और क्यूप्रोस क्लोराइड (CuCl) का उपयोग करके एक परख-संतृप्त सिस्टीन (3 सी विधि) विशेष रूप से एक संवेदनशीलता के साथ एस-एनओ का पता लगा सकती है जो कि मैं3 के साथ तुलनीय है- लेकिन फिर भी गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए एचजीसीएल2 के साथ और बिना उपचार की आवश्यकता होतीहै। सिग्नल विश्लेषण में उच्च परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए, प्रयोगों को .data प्रारूप में दर्ज किया जाता है ताकि ऑफ़लाइन तरंग विश्लेषण प्रोटोकॉल में दिखाए गए बंडल प्रोग्राम के अलावा विभिन्न सॉफ़्टवेयर के साथ पूरा किया जा सके।

एक बार पहला इंजेक्शन बन जाने के बाद, प्रयोग को रोका नहीं जा सकता है। यदि एक ठहराव की आवश्यकता होती है और / या यदि किसी भी स्थिति को बदल दिया जाता है (शुद्ध पोत माध्यम की संरचना, गैस प्रवाह, बेसलाइन वोल्टेज को शुद्ध करें), तो प्रयोग केवल उस बिंदु तक इंजेक्ट किए गए नमूनों के लिए मान्य है। अधिक नमूनों को मापने से पहले एक नया मानक वक्र किया जाना चाहिए। chemiluminescence-आधारित assays द्वारा अनुमति दी परिशुद्धता एक कीमत के साथ आता है. assays कारणों की एक संख्या के लिए समय लेने वाले हैं: 1) स्वचालन संभव नहीं है के रूप में मैनुअल नमूना इंजेक्शन डुप्लिकेट में आवश्यक है; 2) अधिकांश अभिकर्मकों का उपयोग किया जाता है जो लंबे समय तक स्टॉक नहीं किया जा सकता है; 3) प्रत्येक प्रयोग को अंशांकन के लिए ज्ञात सांद्रता पर मानक नमूने चलाकर शुरू करने की आवश्यकता होती है और जब तक अंशांकन दोहराया नहीं जाता है, तब तक रोका नहीं जा सकता है; 4) प्रत्येक नमूने को विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को अवरुद्ध करने के लिए अभिकर्मकों के विभिन्न मिश्रणों वाले एलीकोट में विभाजित किया जाता है ताकि अंतमें दूसरों को घटाकर विशिष्ट चयापचयों की एकाग्रता की गणना की जा सके।

यह काम डिवाइस Zysense NOA 280i पर केंद्रित है, जिसमें गैस चरण में <1 ppb NO की पहचान सीमा है (तरल चरण में NO के 1 pM तक के अनुरूप) और 10-300 mL / मिनट का नमूना प्रवाह। अन्य सीएलडी तरल चरण में चयापचयों के माप के लिए एक बंडल टयूबिंग सिस्टम के साथ उपलब्ध हैं। Ecophysics CLDs एक उच्च संवेदनशीलता दहलीज है, उनके सबसे संवेदनशील मॉडल में 1 पीपीबी लेकिन ओजोन पीढ़ी के लिए एक ऑक्सीजन टैंक की आवश्यकता नहीं का लाभ। दूसरी ओर, उनका रिपोर्ट किया गया नमूना प्रवाह 1000 एमएल / मिनट है, जिसका तात्पर्य है कि शुद्ध पोत के लिए उपयोग किए जाने वाले अक्रिय गैस टैंक की उच्च खपत। अन्य सीएलडी मशीनें नैदानिक उपयोग के लिए कोई विश्लेषण नहीं छोड़े जाने के लिए समर्पित हैं।

Chemiluminescence सबसे संवेदनशील और मान्य विधि विशेष रूप से हेमोलिसिस के क्षेत्र में सेल मुक्त Hb द्वारा कोई खपत का आकलन करने के लिए है। अन्य तकनीकें NO, NO2-, NO3-, S-NOs और पारा-labile nitroso यौगिकों को मापने के लिए उपलब्ध हैं। NO गैस का प्रत्यक्ष माप या तो chemiluminescence द्वारा या समर्पित इलेक्ट्रोड के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है जो कि एक्सहेल्ड गैस के माप से लेकर एकल-सेल इलेक्ट्रोड तक होता है। ये केवल कोई गैस नहीं मापते हैं, कम महंगे (अभी तक अधिक खराब होने वाले) हैं, अधिक बार अंशांकन की आवश्यकता होती है, और सीएलडी31 की तुलना में कम सटीक होते हैं। नाइट्राइट्स और NO3- ऐतिहासिक रूप से Griess प्रतिक्रिया के साथ मापा गया है, एक colorimetric तकनीक है कि अपने मूल संस्करण में नमूने में उनके सापेक्ष एकाग्रता भेद की संभावना के बिना दोनों अणुओं का पता लगाता है। तकनीक के आधुनिक रूपों में रिवर्स फेज क्रोमैटोग्राफी शामिल है जो दो कॉलम में नमूने के अलगाव को नियोजित करता है, जिससे NO3- और NO 2-के साथ दो स्वतंत्र प्रतिक्रियाएं होतीहैं। उन तरीकों की संवेदनशीलता माइक्रोमोलर या थोड़ा कम है, जैसा कि सीएलडी के साथ 1 एनएम की तुलना में है। मुख्य नुकसान समय की खपत और पारे और / या फेरिसाइनाइड14 के साथ पूर्ववर्ती नमूनों के साथ असंगतता हैं। एस-एनओ को colorimetric और fluorometric तकनीकों के साथ-साथ 0.5 μM तक की संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है, जो 100 एफएम की तुलना में 100 एफएम की तुलना में वर्णित है, जैसा कि आई3 में दिखाया गया है- एसिटिक एसिड प्रोटोकॉल14,41,42 में दिखाया गया है। बायोटिन-स्विच परख, पिकोमोलर रेंज में एस-एनओ का पता लगाने में विफल रहने के बावजूद, बायोटिन-लेबल वाले प्रोटीन उत्पन्न करने का लाभ है जिसे प्रोटिओमिक विश्लेषण48 के साथ शुद्ध और पहचाना जा सकता है। जब विस्तार से देखा जाता है, तो प्रत्येक तकनीक एक आम नुकसान साझा करती है, जो एनओ की चरम प्रतिक्रियाशीलता है और इसके डेरिवेटिव इन विट्रो माप के उद्देश्य से प्रतिक्रियाओं की नाकाबंदी को अनिवार्य करते हैं। नमूनों का पूर्व-उपचार महत्वपूर्ण है, और इस सवाल का जवाब देते हुए कि क्या एक निश्चित पूर्व-उपचार पूरी तरह से एक प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करता है या किसी अन्य की तुलना में इतना बेहतर करता है, अब तक पद्धतिगत अध्ययनों में वृद्धि की दिशा में एक प्रेरक बल रहा है। जबकि NO के विवो में चरम प्रतिक्रियाशीलता निश्चित रूप से अपने चयापचयों का पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों पर शोध करने के लिए एक ड्राइव रही है, NO के प्रत्यक्ष माप ने 1990 में पहला एम्पेरोमेट्रिक डिटेक्टर विकसित होने के बाद से पिछले तीन दशकों में महत्वपूर्ण प्रगति को पूरा किया है। तब से बीस से अधिक अलग-अलग जांचों का वर्णन किया गया है, जिसमें एकल-सेल नो सामग्री49 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नैनोसेंसर शामिल हैं। इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर मुख्य उपकरण हैं जो विवो और वास्तविक समय दोनों में नहीं का पता लगा सकते हैं। फुफ्फुसीय चिकित्सा में, कई अध्ययनों ने CLDs के साथ इलेक्ट्रोड-आधारित मशीनों की तुलना की है। exhaled NO का माप मेटाबोलाइट का पता लगाने के लिए अन्य assays की तुलना में अधिक सरल है, या तो गैस लाइन के सीधे कनेक्शन (IFD फ़िल्टर के माध्यम से) को बंद-सिस्टम श्वसन सहायक या ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए एक बैग में कुछ साँसों की आवश्यकता होती है, फिर भी CLDs की लागत और खराब पोर्टेबिलिटी रुक जाती है। वर्तमान में कई इलेक्ट्रोकेमिकल डिवाइस नैदानिक उपयोग के मानदंडों को पूरा करते हैं, हालांकि सीएलडी की तुलना में उनके पास कम संवेदनशीलता और पुनरुत्पादन है। इसके अलावा, निरपेक्ष मापा मूल्यों के संदर्भ में सामंजस्य उपकरणों के बीच सबऑप्टिमल है, इसलिए यह सिफारिश की जाती है कि रोगियों को हमेशा एक ही इलेक्ट्रोकेमिकल डिवाइस50 के साथ पालन किया जाना चाहिए। इस तरह के माप नाक exhaled NO के रूप में सेटिंग्स में CLDs का उपयोग और चिकित्सीय कम और उच्च खुराक साँस NO की तरह अनुसंधान सेटिंग्स में अभी भी आवश्यक है.

NO, इसके डेरिवेटिव, और NO-बाइंडिंग प्रोटीन के सटीक माप कई स्तरों पर आवश्यक हैं ताकि सिग्नलिंग के अनदेखे और अभी भी ज्यादातर अज्ञात तंत्र को समझा जा सके। इम्युनोबायोलॉजी, न्यूरोसाइंसेज, कार्डियोवैस्कुलर साइंसेज और संक्रामक रोगों सहित विशिष्ट लक्ष्य क्षेत्रों के साथ प्रीक्लिनिकल और नैदानिक दोनों स्तरों पर आवेदन अवधि जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के क्षेत्र। प्रीक्लिनिकल अध्ययन और नैदानिक परीक्षण एक चिकित्सीय एजेंट के रूप में साँस लेने वाली नो गैस के उपयोग की जांच कर रहे हैं। कैसे बहिर्जात कोई गैस नहीं मेटाबोलाइट्स और नहीं-बाउंड प्रोटीन की एकाग्रता को प्रभावित करता है, प्लाज्मा से सेल डिब्बों तक, इस पर गहरा ज्ञान आवश्यक होगा। उच्च उपज प्रोटिओमिक्स के कार्यान्वयन से ज्ञात मध्यस्थों की संख्या में वृद्धि हो सकती है जो NO और इसके डेरिवेटिव से प्रभावित होते हैं और NO मेटाबोलाइट्स के सटीक माप की आवश्यकता वाली नई यांत्रिक जांच को अनिवार्य कर सकते हैं।

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Disclosures

एल.बी. हेमोलिसिस और नाइट्रिक ऑक्साइड पर अपने काम के लिए प्रमुख अन्वेषक के रूप में K23 HL128882 / NHLBI NIH से वेतन सहायता प्राप्त करता है। एलबी जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय के मर्काटस सेंटर में "कोविड -19 अनुसंधान के लिए फास्ट ग्रांट्स" से और आईएनओ थेरेप्यूटिक्स एलएलसी से अनुदान प्राप्त करता है। B.Y. एक NHLBI / #R21HL130956 और DOD / जिनेवा फाउंडेशन (W81XWH-19-S-CCC1, लॉग DM190244) से अनुदान द्वारा समर्थित है। बीवाई नाइट्रिक ऑक्साइड के विद्युत उत्पादन पर एमजीएच में पेटेंट प्राप्त किया।

एलबी और बीवाई ने कोविड-19 रोग पीसीटी आवेदन संख्या: पीसीटी / यूएस 2021 / 036269 में नो डिलीवरी के लिए पेटेंट आवेदन दायर किया है, जो 7 जून, 2021 को दायर किया गया था। आरडब्ल्यूसी को कम संसाधन सेटिंग्स में स्थित बच्चों में तपेदिक के विकेंद्रीकृत निदान के उद्देश्य से प्रौद्योगिकी विकास के लिए प्रमुख अन्वेषक के रूप में यूनिटएड से वेतन सहायता प्राप्त होती है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल को डॉ वॉरेन ज़पोल की प्रयोगशाला के पिछले अध्येताओं के संचित योगदान से संभव बनाया गया था, जो कि मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में एनेस्थीसिया विभाग के महत्वपूर्ण देखभाल में संज्ञाहरण अनुसंधान की प्रयोगशाला थी। हम Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, चोंग लेई, Yasuko Nagasaka, एस्टर Spagnolli और Emanuele Rezoagli के योगदान को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

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References

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चिकित्सा अंक 180
नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए Chemiluminescence-आधारित Assays और Autoxidation और Nitrosated यौगिकों से इसके डेरिवेटिव
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Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

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