Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

Abstract

פעילות תחמוצת החנקן (NO) in vivo היא התוצאות המשולבות של השפעותיה הישירות, פעולת נגזרותיה הנוצרת מ- NO autoxidation, וההשפעות של תרכובות ניטרוסטיות. מדידת מטבוליטים ללא מטבוליטים חיונית לחקר פעילות NO הן ברמות כלי הדם והן ברקמות אחרות, במיוחד במסגרות הניסוי שבהן מנוהל NO אקסוגני. מבחני כימילומינסנציה מבוססי אוזון מאפשרים מדידות מדויקות של מטבוליטים NO ו-NO הן בנוזלים (כולל פלזמה, הומוגנטים של רקמות, תרביות תאים) והן בתערובות גזים (למשל, נשימה בנשיפה). NO מגיב עם אוזון כדי לייצר חנקן דו חמצני במצב נרגש. פליטת האור כתוצאה מכך מאפשרת פוטו-דטקציה ויצירת אות חשמלי המשקף את תוכן ה-NO של הדגימה. ניתן להשתמש באליקוטים מאותה דגימה כדי למדוד מטבוליטים ספציפיים של NO, כגון חנקה, ניטריט, S-nitrosothiols וקומפלקסים של ברזל-ניטרזיל. בנוסף, NO נצרך על ידי המוגלובין ללא תאים הוא גם כימות עם ניתוח chemiluminescence. המחשה של כל הטכניקות הללו מסופקת.

Introduction

מאז שסלבדור מונקדה וחתני פרס נובל רוברט פורצ'גוט, לואיס איגנארו ופריד מוראד זיהו את תחמוצת החנקן (NO) כגורם ההרפיה הנגזר מאנדותל הידוע בעבר (EDRF), התפקיד המרכזי של NO נקבע במספר מנגנונים מרכזיים המשתרעים לאורך ביולוגיה של כלי הדם, מדעי המוח, חילוף החומרים ותגובת המארח 1,2,3,4,4,5,6,7 . מתן אקסוגני של NO גז הפך לטיפול מבוסס לכשל נשימתי עקב יתר לחץ דם ריאתי בתינוק8. גז תחמוצת החנקן נחקר גם לטיפול בזיהום בנגיף סינסיטיאלי נשימתי (RSV), מלריה ומחלות זיהומיות אחרות, פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, ולמניעת פגיעה חריפה בכליות בחולים שעברו ניתוח לב 9,10,11,12. הצורך בטכניקות מדידה מדויקות כדי להעריך את רמות ה-NO, המטבוליטים שלו ואלה של חלבוני המטרה והתרכובות שלו נובע ממחקרים מכניסטיים והתערבותיים כאחד.

בשל תגובתיותו הגבוהה, NO עשוי לעבור תגובות שונות בהתאם למטריצה הביולוגית שבה הוא מיוצר ו/או משתחרר. בהיעדר המוגלובין (Hb) או אוקסי-המפרוטאינים אחרים, NO מחומצן כמעט לחלוטין לניטריט (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H 2 O→NO2- + H+

NO עובר תחילה אוטוקסידיזציה עם חמצן מולקולרי (O2) כדי לייצר חנקן דו חמצני (NO2) ומגיב עם NO2 עצמו כדי לייצר טריאוקסיד דיניטרוגן (N2O3). מולקולה אחת של N2O3 מגיבה עם מים (H2O) ויוצרת שתי מולקולות של NO2- ופרוטון (H+)13. בתוך דם שלם14,15, NO ו-NO 2 - מומרים במהירות לחנקות (NO3-) מכיוון שמולקולות אלה מגיבות בהתלהבות עם קבוצות ההם המחומצנות של Hb [Hb-Fe2+-O2 או אוקסיהמוגלובין (oxyHb)] כדי להניב NO3-. תגובה זו משולבת עם המעבר של קבוצת heme למצב ברזלי [Hb-Fe3+ או methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

מחסום תאי הדם האדומים (RBC) והחלל הסמוך לאנדותל הם הגורמים העיקריים המגבילים תגובה זו ומאפשרים לחלק קטן מה-NO המשתחרר על ידי האנדותל לפעול כ-EDRF16,17. למעשה, ידוע כי Hb ללא תאים במחזור הדם משבש את הרחבת כלי הדם במסגרות ניסיוניות וקליניות17,18. בתוך ה-RBC, בהתאם לחמצון ולריכוז NO2, חלק מה-NO מגיב עם דאוקסיהמוגלובין (Hb-Fe2+) ליצירת ברזל-ניטרוזיל Hb (Hb-Fe2+-NO או HbNO):

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

ב-RBC15,17, NO2- יכול ליצור Hb-Fe3+ על ידי הפחתת Hb-Fe2+ מה שמוביל לשחרור של NO, אשר בתורו קושר Hb-Fe2+-O 2 (באופן מועדף) או Hb-Fe2+.

אין להתייחס ליצירת נגזרות NO כאל חד-כיווניות לחלוטין, שכן NO יכול להתחדש מ-NO 2 ו-NO3 ברקמות שונות ועל ידי אנזימים שונים (למשל, על ידי חיידקי מעיים או בתוך המיטוכונדריה, במיוחד בתנאים היפוקסיים)19,20.

כמות משתנה של NO המיוצרת (או מנוהלת) מובילה לדור במורד הזרם של S-nitrosothiols, בעיקר על ידי טרנסניטרוזיה של תיול מ- N2O3 בנוכחות נוקליאופיל היוצר ביניים תורם NO+ (Nuc-NO+-NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

אפשרות נוספת ליצירת S-nitrosothiols היא ניטרוסילציה של תיולים מחומצנים (אין תגובה עם תיול מחומצן):

RS• + ללא → RS-NO

מנגנון זה וחמצון תיול ישיר על ידי NO2 עשויים להיות אפשריים רק בתנאים ספציפיים מאוד המתוארים במקום אחר21. S-nitrosothiols נעים בין מולקולות אור כמו S-nitrosoglutathione לחלבונים גדולים המכילים תיול. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) נוצר על ידי ניטרוסציה של קבוצת תיול של שאריות ציסטאין שמורות בשרשרת β (β93C)22.

הדור ומטבוליזם של S-nitrosothiols הם חלק ממנגנוני ויסות חשובים. דוגמאות לכך כוללות ויסות של גלוטתיון, קספאזות, N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) וקולטני ריאנודין 23,24,25,26,27,28. אלבומין ניטרוס (S-nitroso-albumin), שנחשב בעבר כמתווך מרכזי של NO biology in vivo, נראה כמתווך מרכזי של NO/NO+ ללא כל פעילות ביולוגית נוספת ספציפית29.

כאשר מודדים את הריכוז של NO ונגזרותיו מדגימה ביולוגית ספציפית בתוך מטריצה ביולוגית, חשוב לשקול מאפיינים כגון חומציות, חמצון, טמפרטורה ונוכחות של ריאגנטים. דוגמאות לכך כוללות תורמי NO אקסוגניים מנוהלים, ובמסגרת של דלקת חריפה, מי חמצן (H2O2) המגיבים עם NO2 המובילים ליצירת ריכוז על-טבעי של רדיקלים חופשיים כמו פרוקסיניטריט (ONOO-)21. בנוסף לשיטה האנליטית שבה נעשה שימוש, השלב הפרה-אנליטי של הכנת הדגימה ואחסון הוא בסיסי. תגובות במורד הזרם שאינן מייצגות את פעילות in vivo NO יינבאו, יובאו בחשבון וייחסמו. דוגמה תקפה היא חוסר היציבות של S-NO-Hb, הדורש טיפול ייעודי בדגימות דם כאשר הוא מיועד למדידה22.

מבחנים מבוססי Chemiluminescence הם תקן הזהב לגילוי רמות ה-NO והמטבוליטים העיקריים שלו [NO2-, NO3-, S-NO וקומפלקסים של ברזל-ניטרוזיל (Fe-NO)] בכל נוזל ביולוגי, כולל הומוגנטיםשל רקמות 30,31. שיטות אלה מסתמכות על גלאי chemiluminescence (CLD), מכשיר המאחסן את התגובה של NO עם אוזון (O3), המייצר את NO2 במצב נרגש (NO2•). הרפיה של NO2• גורמת לפליטה של פוטון של אור שמתגלה על ידי שפופרת פוטומולטיפלייר, ומייצרת אות חשמלי שנמצא ביחס ישר לתכולת NO של תערובת הגז שנדגמה32. סכימה פשוטה של ה- CLD מיוצגת.

Figure 1
איור 1: סכמות פשוטות של גלאי כימילומינסנציה עבור גז תחמוצת החנקן. זיהוי מבוסס כימילומינסנציה של תחמוצת החנקן (NO) הוא הדור הסטויכיומטרי של פוטון אחד לכל מולקולת גז NO המוחדר בגלאי הכימילומינסנציה (CLD). תגובת הכימילומינסנציה מתקבלת בתא ייעודי המסופק עם אוזון (O3) מגנרטור פנימי, אשר נשמר בלחץ שלילי על ידי חיבור עם משאבה חיצונית, ומאפשר זרימה רציפה וקבועה של גז דגימה. הדור של O3 דורש חמצן דיאטומי (O2) המסופק על ידי מיכל O2 ייעודי המחובר ל- CLD (יצרנים אחרים מספקים CLDs הפועלים עם אוויר סביבה). בתוך תא התגובה, כל מולקולה של גז NO הכלולה בגז שנדגם מגיבה בחמצן כדי להניב מולקולה אחת של חנקן דו-חמצני במצב הפעיל (NO2*). על ידי חזרה למצב הקרקע שלה, כל מולקולת NO2* פולטת פוטון אחד שמתגלה על ידי צינור פוטומולטיפלייר (PMT) הממוקם בסמוך לתא התגובה. ה-PMT עם המגבר המשויך ויחידת העיבוד המרכזית מייצר אות פרופורציונלי לספירת הפוטונים ולמספר מולקולות ה-NO בתא התגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתן לחבר את כניסת הדגימה של ה-CLD למערכת כלי זכוכית המכילה תא תגובה לדגימות נוזליות. המערכת מטוהרת באופן רציף עם גז אינרטי כגון חנקן, הליום או ארגון, ומעבירה NO מתא התגובה ל- CLD. דגימות בפאזה נוזלית מוזרקות דרך ממברנה ייעודית לתוך כלי הטיהור.

Figure 2
איור 2: מבנה של כלי טיהור לגילוי מבוסס כימילומינסנציה של גז תחמוצת החנקן כלי הטיהור (מימין) מאפשר זיהוי של גז תחמוצת החנקן (NO) או כל תרכובת אחרת שניתן להמיר בקלות לגז NO כאשר הוא משתחרר מריאגנט פאזה נוזלית. כניסת הגז האינרטית מחוברת למקור (מיכל) של גז אינרטי כגון ארגון, Xeon או חנקן דיאטומי (N2). שסתום המחט (נפתח שמאלה) משמש לבקרת לחץ בתוך כלי הטיהור וניתן להסירו לחלוטין כדי לנקות את הכלי. יציאת ההזרקה מכוסה בפקק עם מחיצת ממברנה להזרקת דגימה. יש להחליף את הממברנה לעתים קרובות. ז'קט מחומם מקיף את תא התגובה ומחובר לאמבטיית מים חמים כדי לבצע את בדיקת ה-VCl3 ב-HCl. שקע כלי הטיהור מחובר לגלאי chemiluminescence (CLD) או למלכודת NaOH (הנדרשת עבור VCl3 במבחני HCl). כדי לנקז את תכולת תא התגובה, סגרו תחילה את ה-stopcocks בפתח הגז האינרטי ובשקע כלי הטיהור, סגרו את שסתום המחט, הסירו את המכסה ביציאת ההזרקה ולבסוף פתחו את ה-stopcock בניקוז. מלכודת NaOH (משמאל) נדרשת להיות ממוקמת בשורה בין כלי הטיהור לבין ה-CLD אם בדיקת ה-VCl3 ב-HCl מבוצעת בגלל הקורוזיביות של HCl. החיבור ל-CLD דורש תמיד מסנן דיאלקטרי שדה אינטנסיבי (IFD) שיוצב בין ה-CLD לבין הפלט של כלי הטיהור (או מלכודת NaOH, אם נעשה בו שימוש). מסנן ה-IFD מסיר חלקיקים הנישאים באוויר ועוצר את מעבר הנוזלים דרך כלי הטיהור. PTFE = פוליטטרפלואורואתילן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

כתוצאה מכך, כל תרכובת שניתן להמיר ל-NO באמצעות תגובה כימית ספציפית ומבוקרת יכולה להיות מזוהה ברגישות גבוהה בכל נוזל ביולוגי ורקמותהומוגנטיות 24. מדידה ישירה של פאזה גזית NO באמצעות chemiluminescence מבוצעת הן במסגרות ניסיוניות והן במסגרות קליניות. טכניקות אלה מתוארות בהרחבה במקומות אחרים 33,34,35. מדידה של NO2-, S-nitrosothiols, חלבונים S-nitrosated ו- Fe-NOs יכולה להתבצע על ידי הוספת דגימות בתערובת תגובה עם טריודייד (I3-), אשר משחררת באופן סטואיכיומטרי גז NO מכל התרכובות הבאות:

אני3- → אני2 + אני-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

אני3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

בעוד שאני3 - לא מגיב עם NO 3-15. מדידות מדויקות של כל תרכובת מתאפשרות על ידי טיפול מקדים באליקוטים לדוגמה עם סולפנילמיד חומצי (AS) עם או בלי כלוריד כספית (HgCl2). באופן ספציפי, טיפול מקדים עם AS מסיר את כל התוכן NO 2. כתוצאה מכך, תוכן ה-NO שנמדד על ידי ה-CLD משקף רק את סכום ריכוז ה-S-NOs וה-Fe-NOs. הזרקה של HgCl2 במדגם aliquot לפני הזרקת AS גורמת ל- NO2 - להשתחרר על ידי S-NO. טיפול ב-AS (המוביל להסרת NO2) מבטיח שתוכן ה-NO הנמדד משקף רק את הריכוז של Fe-NOs. סדרה של חיסורים בין ההערכות מאפשרת לחשב את הריכוז המדויק של שלוש נגזרות NO22.

Figure 3
איור 3: שלבים בהכנת דגימה למבחן I3- בחומצה אצטית chemiluminescence. השלבים הרציפים להכנת הבדיקה I3- בחומצה אצטית chemiluminescence מודגמים. נדרש שימוש בצינורות צנטריפוגה מוגני אור. צינורות 1, 2 ו-3 הם אלה המשמשים להכנה לבדיקה. יש צורך בדגימה נוספת (צינור 4) לבדיקת VCl3 ב- HCl אם נדרשת מדידת חנקה (NO3-). השלבים מסומנים על ידי מספרים באדום. מילוי מראש (שלב 1) כפי שמצוין עם מלח מאגר פוספט (PBS) או HgCl2 לפני הוספת נפח הדגימה. הוסף את נפח הדגימה (2) כפי שצוין, מערבולת ודגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הוסף (3) PBS או סולפנילמיד חומצי (AS) כפי שצוין, מערבולת, ודגירה במשך 3 דקות ב- RT. הפעל את הבדיקה (4). הריכוז הנמדד על ידי הבדיקה הוא סכום הריכוז של התרכובות המדווחות מתחת לכל צינור. צינור מספר 1 יאפשר מדידות של ניטריט (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) וקומפלקסים של ברזל-ניטרוזיל (Fe-NOs) כאות יחיד. עבור מדידת חנקה (NO3-), דגימות יופעלו הן עם I3- בחומצה אצטית והן עם VCl3 במבחני HCl, ויש להפחית את הערך המתקבל מצינור 1 מזה המתקבל מצינור 4. *הכמויות המוצעות שישמשו לניתוח Hb לקביעת שאריות NO2-, S-nitrosohemoglobin וברזל-ניטרוזיל-המוגלובין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

למדידת NO3, ונדיום (III) כלוריד (VCl3) בחומצה הידרוכלורית (HCl) משמש להמרה של NO3- ל-NO בכלי הטיהור על מנת למדוד את NO3- באופן סטויכיומטרי עם CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + + 4H+

כדי להשיג המרה מהירה מספיק, התגובה צריכה להתבצע ב 90-95 מעלות צלזיוס. הפחתה מ- NO3 - ל- NO2 - מצטרפת להפחתה של NO2 - ל- NO על ידי HCl. מתכת ונדיום גם מפחיתה S-NOs המשחררת את ה- NO moiety22,36 שלהם. הריכוז הסופי המתקבל על ידי CLD עם VCl3 ב- HCl משקף את הריכוז המצטבר של NO3-, NO2 ותרכובות ניטרוס אחרות. חיסור הערך האחרון מהריכוז שהופק עם CLD עם I3- מאפשר חישוב של NO3- ריכוז36,37 (איור 3).

במבחן הצריכה NO, השחרור המתמשך של NO בכלי הטיהור על ידי תורמים ללא תורמים כמו (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-אמוניואתיל)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) יוצר אות יציב המאפשר כימות של oxyHb ללא תאים בדגימות המוזרקות. כמות ה- NO הנצרכת בכלי הטיהור נמצאת בקשר סטויכיומטרי עם כמות ה- oxyHb במדגם38.

פרוטוקולים למדידת NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, קומפלקסים של ברזל-ניטרוזיל, ו-NO צריכה על ידי Hb ללא תאים בדגימות פלזמה מודגמים. מחקרים על NO בסביבת RBC דורשים טיפול מדגם ספציפי ואחריו כרומטוגרפיית הרחקה כדי למדוד S-NO-Hb ו-Hb-NO שבירים במיוחד יחד עם קביעת ריכוז ההמוגלובין הכולל של15,22. הכנת הדגימה תסייע בתיקון המדידה. קיום מקדים של NO2- ב-H 2O ושחרור של NO2- במהלך הבדיקה יכולים להוביל למדידה של ריכוזים גבוהים יותר באופן מלאכותי של נגזרות NO כגון S-NO-Hb14,39. כמו כן מוצגים היבטים חשובים של הכנת מדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים המצוינים בפרוטוקול זה הם בהתאם לוועדת הבדיקה של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. דגימות הדם שבהן נעשה שימוש נאספו במהלך מחקר קודם וזוהו בביטול למטרה הנוכחית18.

הערה: עיין בהוראות היצרן לקבלת הנחיות ספציפיות לגבי חיבורים אופטימליים בין צינורות וכלי זכוכית המרכיבים את כלי הטיהור, הכביסה והתחזוקה הכללית. החיבורים צריכים להיות מוצקים ועשויים בזהירות שלא לפגוע בכלי הזכוכית. זהה את המרכיבים של כלי טיהור הזכוכית: קו כניסת גז, כלי טיהור עם מעיל חימום ומעבה, מלכודת מבעבע גז נתרן הידרוקסיד (NaOH), קו חיבור בין כלי הטיהור לבועה, קו גז מוצא כלי טיהור (ל- CLD) הניחן במסנן דיאלקטרי שדה אינטנסיבי (IFD). קו מסנן IFD בין כלי הטיהור לכניסת הדגימה של ה-CLD חייב להיות במקום בכל פעם שנמדדים מטבוליטים ללא מטבוליטים בצורה נוזלית (פלזמה, תרביות תאים, הומוגנטים של רקמות) (כל הבדיקות המוצגות בפרוטוקול). הכנת הדגימה תלויה בנוזל או ברקמה המנותחים ובתרכובות המעניינות. היבטים חשובים של השלב הפרה-אנליטי מכוסים בסעיף 1 ו-2. שלבי הכנה ספציפיים לבדיקות ספציפיות נכללים בסעיפים 3-5. סעיפים 6-8 חלים על כל המבחנים.

1. הכנת ריאגנטים ייעודיים

הערה: לפרטים נוספים, עיין בפרסומים קודמים 15,22.

  1. הכינו תמיסת סולפנילמיד חומצית (AS) של 5% (290 מ"מ) להסרה של NO2 על ידי המסת 500 מ"ג סולפנילמיד ל-10 מ"ל של 1N HCl. פתרון זה יציב במשך חודשים.
  2. הכן תמיסת 50 mM כספית כלוריד (HgCl2) לשחרור NO2 מ- S-NOs על ידי המסת 67.9 מ"ג של HgCl2 לתוך 5 מ"ל של PBS. הגן על פתרון המלאי מפני אור.
  3. הכן תמיסה חוסמת NO2 עם 800 mM ferricyanide [K3Fe(CN)6] כדי לחמצן Hb יחד עם 100 mM N-ethylmaleimide (NEM) כדי לחסום קבוצות תיול ו (אופציונלי) 10% תמיסת נונילפניל-פוליאתילן גליקול (Nonidet p-40) כדי לבודד את ממברנות התאים האדומים.
    1. הוסף K3Fe(CN)6 למים שעברו דה-יוניזציה ומזוקקים (ddH2O, 263.5 גרם אבקה לליטר) כדי לקבל ריכוז סופי של 800 mM.
    2. הוסיפו את NEM לתמיסת 800 mM K3Fe(CN)6 בתמיסת ddH2O (12.5 גרם אבקה לליטר כדי לקבל ריכוז של 100 mM) וערבבו את התמיסה כדי להמיס את כל הגבישים.
    3. הוסף חלק אחד של 10% NP-40 עד תשעה חלקים של 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM תמיסת NEM (111 מ"ל לליטר) וערבב היטב (שלב חובה לניתוח דם שלם).
  4. הכן את תמיסת הייצוב S-NO-Hb המכילה 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM חומצה דיאתילנטריאמיןפנטאצטית (DTPA, עבור כלציה של מתכת), ודטרגנט 1% Nonidet p-40 מתמיסות המלאי שלהם.
    1. הכינו תמיסת NEM של 200 mM על ידי הוספת גבישי NEM ל-PBS (25 מ"ג/מ"ל, למשל, 250 מ"ג ב-10 מ"ל PBS) וערבבו את התמיסה עד שכל הגבישים יתמוססו (שייווצרו ביום הניסוי).
    2. הכינו תמיסת 800 mM K3Fe(CN)6 על ידי הוספת K3Fe(CN)6 ל-ddH2O (263.5 מ"ג/מ"ל, למשל 1.32 גרם ב-5 מ"ל של ddH2O כדי להשיג ריכוז סופי של 800 mM) (שייעשה ביום הניסוי).
    3. הכינו תמיסת מלאי DTPA של 10 mM על ידי הוספת 786 מ"ג של DTPA ל-200 מ"ל של ddH2O והתאימו את ה-pH ל-7.0 עם 5N NaOH כדי לבודד את ה-DTPA באופן מלא.
    4. הוסף 5 מ"ל של תמיסת NEM של 200 mM, 1.5 מ"ל של 800 mM K3Fe(CN)6 פתרון ו-1 מ"ל של תמיסת מלאי DTPA ל-81.5 מ"ל של PBS ב-7.2 pH, ולבסוף, הוסף 11 מ"ל של 10% NP-40 סוף סוף כדי להביא נפח סופי ל-100 מ"ל.

2. איסוף דוגמאות

הערה: לקבלת פרטים נוספים על איסוף דוגמאות, עיין בעבודות שפורסמו בעבר 15,22,40.

  1. לאסוף דם שלם
    1. אספו דם בצינורות מצופים הפרין המעדיפים ורידי על פני כלי דם עורקי (אלא אם כן הדבר נדרש במפורש) והעדיפו מיקום צנתר על פני ורידים (במידת האפשר) עם קטטר או מחט של לפחות 20 גרם ומעלה כדי למזער את ההמוליזה.
    2. יש להוסיף מיד את תמיסת חסימת NO 2 (חלק אחד של התמיסה ל-4 חלקים של דם שלם), לעבד (סעיפים 3 או 4), או להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. לאסוף פלזמה ותאי דם אדומים (RBCs)
    1. אספו דם בצינורות מצופים הפרין המעדיפים ורידים על פני דם עורקי (אלא אם כן נדרש במפורש) ומחטים של לפחות 20 גרם ומעלה כדי למזער את ההמוליזה והצנטריפוגה באופן מיידי למשך 5 דקות ב-4000 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. ערבבו את הסופרנאטנט (פלזמה) עם תמיסת החסימה NO2 (חלק אחד של התמיסה ל-4 חלקים של הסופרנטנט) בצינור ובתהליך חדש (סעיפים 3 או 4), או הקפאו ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: עבור בדיקת NO צריכה, לא ניתן להשתמש בפתרון חסימת NO 2. ניתן לבצע את הבדיקה ללא טיפול מקדים בפלזמה.
    3. בצעו שימוש חוזר בכדור RBC מלמטה לצינור חדש מלא מראש בתמיסת ייצוב S-NO (ראו שלב 1.4) (1 מ"ל של כדור עד 9 מ"ל של תמיסה) ודגרו למשך 5 דקות.
    4. העבר את ה- RBC lysate בעמודת גודל עם פולימר G-25 Sephadex שנשטף בעבר עם ddH2O לכרומטוגרפיה של הרחקה
    5. לאסוף את שבר ה-Hb כדי לעבד (סעיף 4) ולמדוד את ריכוז ה-Hb באמצעות המגיב של Drabkin (למדידת Hb, עיין בעבודה שפורסמה בעבר22).
      הערה: כדי להכין ולדגום רקמה/איבר מסוים, לזהות את ההילום שלו ולבודד אותו בניתוח. לנטות את הווריד, לנקב את העורק ולהזריק עם מלח הפרין (10 U /mL) דרך העורק. לבלות את הרקמה כאשר מלח מתחיל לזרום בחזרה בחתך הוורידי. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר מכני תוך הוספת חלק אחד של תמיסת חסימת NO2 ל-4 חלקים של רקמה הומוגנית.

3. VCl3 בהכנת בדיקת HCl

הערה: לפרטים נוספים על VCl3 בהכנת מבחן HCl, עיין בעבודות שפורסמו בעבר37,41.

אזהרה: ה-CLD ייפגע אם מלכודת NaOH אינה במקומה כראוי בעת ביצוע בדיקה זו. זאת בשל הקורוזיביות של HCl.

  1. הכן פתרונות סטנדרטיים של NO3 - עבור עקומה סטנדרטית
    1. ממיסים 85 מ"ג של NaNO3 ב-10 מ"ל של ddH2O כדי להשיג 0.1 M NaNO3- (פתרון זה נשאר יציב במשך מספר שבועות).
    2. השתמש בתמיסת המלאי כדי להכין תקנים על ידי דילול ב- ddH2O כדי להשיג ריכוזים של 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 על מנת לבצע עקומת כיול עבור דגימות פלזמה או שתן (השתמש בריכוזים נמוכים יותר אם אתה עובד עם תרביות תאים).
  2. הכן VCl3 (ונדיום כלוריד) תמיסה רוויה עבור NO3- הפחתת כלי הטיהור
    אזהרה: התגובה של מים ו- VCl3 היא אקסותרמית. שימו לב לטמפרטורת כלי זכוכית גבוהה בעת הוספת חומצה וכאשר שוטפים את כלי הזכוכית בסוף הניסוי.
    1. ממיסים 1.6 גרם של VCl3 ב-200 מ"ל של 1 M HCl על ידי הוספת VCl3 בבקבוקון נקי ולאחר מכן הוספת 200 מ"ל של 1 M HCl.
    2. מסנן ואקום את הפתרון באמצעות נייר סינון (כגון נייר מסנן של 11 מיקרומטר, אך ניתן להשתמש בכל נייר מסנן).
      הערה: התמיסה המסוננת תהפוך לכחול שקוף, בעוד שתמיסת ה-VCl3 הלא מסוננת חומה בגלל חלקיקים לא פתורים.
    3. שמור על התמיסה הרוויה מכוסה בנייר אלומיניום או בנייר דבק מסוג polytetrafluoroethylene (PTFE) מכיוון שהתרכובת רגישה לאור.
  3. הכינו את אמבט המים במחזור הדם
    1. חברו מכשיר אמבט מים במחזור למעיל המים של כלי הטיהור. וודאו שהקווים מתייבשים לפני ההחדרה.
    2. התחילו את אמבטיית המים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס וודאו את היעדר הדליפות על קווי המים על ידי מריחת מגבות נייר (לא מעודכנות) סביב הקווים.
  4. הגדרת מלכודת בועות הגז
    1. ודא ששרוול ה- PTFE של הבועה נמצא במקומו ושהוא אינו פגום.
    2. פתחו את בועת הגז והזיקו 15 מ"ל של 1 M NaOH לבסיס הבועה.
    3. מקם מחדש את בועת הגז ואטם את החיבור בחוזקה על ידי לחיצה על החלק התחתון לכיוון החלק העליון ופיתול קל של שני החלקים. חוסר האפשרות להפוך את החלק העליון של הבועה מבלי להפעיל כוח מצביע על אטימה נכונה.
    4. חבר את היציאה של כלי הטיהור לכניסת מלכודת בועות הגז.

4. I3- בהכנת בדיקת חומצה אצטית

הערה: לפרטים נוספים על I3- בהכנת בדיקה של חומצה אצטית, עיין בעבודות שפורסמו בעבר 15,22,38,41,42.

  1. הכינו עקומה סטנדרטית ל-NO 2-
    1. הכן תמיסת מלאי על ידי המסת 69 מ"ג של נתרן ניטריט (NaNO2) ב 10 מ"ל של ddH2O כדי לקבל תמיסה של 100 mM. פתרון זה יציב אם הוא מאוחסן במיכל אטום, מקורר ומוגן מפני אור.
    2. דיללו באופן סדרתי את תמיסת המלאי לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא מראש ב-900 μL של ddH2O: הוסיפו 100 μL של תמיסת המלאי לצינור הצנטריפוגה הראשון, ערבבו, תייגו והשתמשו ב-100 μL של הצינור עבור הצינור השני, ואז חזרו על הפעולה והתוצאה תהיה 10 mM, 1 mM, ואז 100 μM.
    3. דילול נוסף עם ddH2O כדי להשיג 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM ו 500 ננומטר NaNO2 aliquots לשימוש בעקומת הכיול.
  2. הכינו את ה-I 3- בחומצה אצטית לכלי הטיהור (ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) למשך שבוע)22
    1. הוסיפו 2 גרם אשלגן יודיד (KI) ו-1.3 גרם יוד (I2) ל-40 מ"ל של ddH2O ו-140 מ"ל של חומצה אצטית.
    2. מערבבים היטב על ידי ערבוב התערובת במשך 30 דקות לפחות.
  3. הכינו את הדגימות לקביעה דיפרנציאלית של NO2-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, אם Hb נאסף) וקומפלקסים של ברזל-ניטרוזיל (Hb-NO אם Hb נאסף) (איור 3)
    1. חלקו כל דגימה ב-3 אליקוטים של 270 μL (900 μL של Hb אם מודדים S-NO-Hb ו-Hb-NO) בצינורות מיקרו-סנטריפוג' מוגני אור, 2 מהם ממולאים מראש ב-30 μL של 1x PBS (100 μL אם מודדים S-NO-Hb ו-Hb-NO) ואת הצינור השלישי עם 30 μL של HgCl2 (100 μL אם מודדים S-NO-Hb ו-Hb-NO), מערבולת ודגירה ב-RT למשך 2 דקות (איור 3).
    2. הוסף 30 μL של 5% AS למדגם עם HgCl2 כדי למדוד Fe-NOs, (100 μL עבור Hb-NO) ולאחד עם PBS נוסף למדידת S-NOs ו- Fe-NOs (100 μL עבור S-NO-Hb ו- Hb-NO) והוסף 30 μL של PBS לשלישי שכבר מלא מראש ב- 1x PBS כדי למדוד NO2-, S-NOs ו- Fe-NOs (100 μL עבור שאריות NO2 - מאוסף Hb, S-NO ו-Hb-NO). מערבולת ודגירה ב-RT למשך 3 דקות (איור 3).

5. אין צורך על ידי הגדרת Hb ללא תאים

הערה: לקבלת פרטים נוספים, עיין בעבודה שפורסמה בעבר38.

  1. הכן תמיסות oxyHb סטנדרטיות מתמיסת Hb מטוהרת עם ריכוז ידוע
    1. דילול סדרתי של תמיסת המלאי לצינורות מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל על ידי הוספת ddH2O כדי להשיג את הפתרונות שישמשו לעקומת הכיול: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.56 μM.
  2. הכן את פתרון DETA-NONOate
    1. הוסף 10 מ"ג של DETA-NONOate ל-610 μL של 10 μM NaOH ב-pH 7.4 PBS כדי לייצר 100 mM של DETA-NONOate ולשמור אותו על קרח.

6. הפעילו את גלאי הכימילומינסנציה (CLD) והכינו את כלי הטיהור

הערה: להכנת כלי הטיהור, עיין בעבודה שפורסמה בעבר43.

  1. אמת את החיבורים העיקריים אל CLD וממנו
    1. חברו את קו החמצן ל-CLD ופתחו את מיכל החמצן בלחץ שנמצא בהסכמה עם יצרן ה-CLD.
    2. ודא שקו המסנן הדיאלקטרי של שדה אינטנסיבי (IFD) מחובר ל-CLD אך לא לכלי הטיהור או למלכודת NaOH
  2. הפעל את ה- CLD
    1. בממשק CLD, התחל להפעיל את תוכנית הגילוי לבדיקות פאזה נוזליות.
    2. ודא שאספקת החמצן מספקת. אם זה המקרה, ה- CLD יתחיל בהצלחה לדגום מהכניסה שלו ויציין זיהוי על ידי אות במיליוולטים (0-5 mV). אחרת, ה- CLD יפעיל אות אבחון שלילי.
  3. הכן את כלי הטיהור
    1. סגרו את כלי הטיהור בכל שלוש היציאות: הברגו את שסתום המחט באופן מלא ימינה, סגרו את פתח הכניסה והיציאה.
    2. הסר את המכסה מכלי הטיהור והוסף כמות מספקת של המגיב הספציפי לבדיקה המתוכננת לתא התגובה (טבלה 1), כך שמחט המזרק המשמשת להזרקת הדגימות תוכל להגיע לעמודת הנוזלים.
    3. אמת את נוכחותו של קו בסיס רצוי יציב (טבלה 1).
  4. התחל את זרימת גז הטיהור
    1. ודא שמיכל הדלק האינרטי (לדוגמה, N2) מצויד בווסת דו-שלבי ומחבר את מיכל הדלק האינרטי עם כניסת הגז של כלי השיט.
    2. פתחו את הגז בלחץ יציאה בווסת של 1-5 psi, פתחו את הכניסה של כלי הטיהור ופתחו באיטיות את שסתום המחט של כלי הטיהור כדי לאפשר זרימת גז. ודא מבעבע בתוך כלי הטיהור.
  5. התאמת זרימת הגז
    1. תעד את לחץ התא שנמדד על-ידי ה-CLD באמצעות קו המסנן IFD המדגים את אוויר הסביבה.
    2. מקם מחדש את המכסה על כלי הטיהור, חבר את קו מסנן ה- IFD לכלי הטיהור (או למלכודת NaOH במבחן VCl3 ב- HCl), ופתח את השקע של כלי הטיהור.
    3. השתמש בשסתום המחט כדי להגיע לאותו לחץ תא ברמת CLD הנרשם באוויר הסביבה.

7. ניסוי

הערה: לפרטים נוספים בנוגע לניסוי, עיין בעבודהשפורסמה בעבר 43.

  1. התחל את תוכנית רכישת האותות chemiluminescence
    1. חבר את היציאה הטורית של ה-CLD ליציאה הטורית של המחשב שאליה הותקנה תוכנית הרכישה.
    2. הפעל את תוכנית הניתוח.
    3. לחץ על רכוש, בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ ה- .data, הקלד את שם הקובץ ולחץ על שמור.
      הערה: שים לב לזמן הריצה המוגדר מראש על המסך, מכיוון שההקלטה נעצרת באופן אוטומטי כאשר הזמן שנקבע מראש חולף. במידת הצורך, ניתן להגדיל את זמן הריצה המוגדר מראש.
  2. היכונו לזריקות מדגם חוזרות ונשנות
    1. התאם את סולם המתח על המסך כך שתהיה לו שליטה על קו הבסיס הממוקד על-ידי לחיצה על הלחצנים מינימום ו/או מקסימום ולאחר מכן הזנת הערך הרצוי.
    2. יש צינור 20 או 50 מ"ל מלא ב- ddH2O כדי לשטוף את המזרק בין הדגימות.
    3. הכינו קופסה של מגבוני משימה עדינים זמינים.
  3. הזרקה לדוגמה
    הערה: התחילו מהפתרונות הסטנדרטיים לעקומת הכיול (הזריקו מהדגימות הפחות מרוכזות לדגימות המרוכזות ביותר), ואז המשיכו לדגימות הניסוי (שקלו לעשות זאת בכפילויות או במשולשות).
    1. יש לשטוף את המזרק לפחות פעמיים או יותר עם ddH2O לפני משיכת כל דגימה (ואחרי כל זריקה) וודאו בכל פעם פליטת מים ללא הפרעה על גבי מגבון משימה.
    2. הכניסו את המזרק לצינור הדגימה תוך החזקת המזרק והצינור במרחק קרוב, משכו את הבוכנה לנפח הרצוי תוך הקפדה על כך שלא נלכדו בועות אוויר ו/או חלקים מוצקים שאינם הומוגניים.
    3. נקו את קצה המזרק באמצעות מגב משימה, ואז הכניסו את המזרק לתוך מכסה ה-septa ביציאת ההזרקה והזיקו לאחר שתוודאו שקצה המזרק נמצא בתוך השלב הנוזלי בתא התגובה.
  4. סמן את ההזרקה בתוכנה והמתן
    1. ודא שהזריקה גורמת לשינוי כלפי מעלה באות (איור משלים 1) (כלפי מטה בבדיקת NO על-ידי בדיקת Hb ללא תאים) והקלד את שם הדגימה על-ידי לחיצה על התיבה האפורה תחת שמות לדוגמה, ולאחר מכן לחץ על Mark Injection.
      הערה: חשד לחסימת מזרק אם הזרקת הדגימה אינה יוצרת אות.
    2. המתן עד שהאות החשמלי יגיע שוב לנקודת ההתחלה (זה בדרך כלל לוקח 3-4 דקות). הפעם ניתן להשתמש כדי לבצע את שלב 7.3.1.
  5. חזור על כל השלבים המצוינים בשלבים 7.3 ו- 7.4 במהלך כל הזרקה ולאחריה עד לסיום הניסוי. זכור להריץ מדגם של פתרון השימור (אם נעשה בו שימוש)
  6. עצרו את הניסוי
    1. לחץ על STOP כדי לקטוע את רכישת האות, עצור את ה- CLD וכבה את אמבט המים (אם NO3 - נמדד).
    2. להפסיק את זרימת הגז, לפתוח את שסתום המחט, להסיר את המכסה מכלי הטיהור, להניח מיכל פסולת מתחת לניקוז ולפתוח את מחסום הניקוז.
      הערה: אם הניסוי דורש איסוף נתונים למשך יותר מ-60 דקות, יש צורך להפעיל מחדש את הרכישה לאחר 60 דקות של זמן ריצה (חזור על שלב 7.1.3) וליצור קובץ חדש.

8. מדידות וחישובים

הערה: מדידות וחישובים נעשים במצב לא מקוון וניתן לבצע אותם בזמן אחר.

  1. התחל את תוכנית רכישת chemiluminescence לניתוח נתונים לא מקוונים
    1. הפעל את התוכנית ולחץ על תהליך.
    2. בחר/י את קובץ הניסוי ולאחר מכן לחץ/י על ״פתח״.
  2. חישוב השטח שמתחת לעקומה עבור כל ניהול
    1. התוכנה משרטטת באופן אוטומטי על המסך את קו הבסיס (איור משלים 2A, קו צהוב אופקי) ואת ציר השיא של כל גל שנוצר על-ידי כל מנהל דגימה שנוצר על-ידי כל מנהל דגימה (קווים צהובים אנכיים): ודא את מיקומם הנכון (או התאים על-ידי לחיצה על כל שורה והזזתו באמצעות העכבר או החצים) ולחץ על סף אישור (איור משלים 2B).
      הערה: בבדיקת מדידת ה-Hb ללא תאים, התוכנה בדרך כלל אינה מצליחה ללכוד נכונה את צורת הגל הנוצרת על-ידי הזרקת דגימה. על-ידי התקרבות לכל צורת גל, המפעיל יכול לסייע בקלות לתוכנה בחישוב השטח (איור משלים 2).
    2. התוכנה משרטטת באופן אוטומטי את ההתחלה (קו ירוק אנכי) ואת הסוף (קו אדום אנכי) של כל שיא שנגרם על ידי כל ניהול דגימה: לאמת את מיקומם הנכון (או להתאים על ידי לחיצה על כל שורה ולהזיז אותו עם העכבר או החצים) וללחוץ על שילוב (איור משלים 2C).
      הערה: אזורים מסוימים בעקבות עשויים להיות מוגדרים בטעות כהזרקות בשלב זה, וחלק מהשיאים עשויים להיספר באופן אוטומטי פעמיים. ניתן לזהות מחדש את שתי הטעויות ולהסירן במהלך שלב 8.2.2
    3. התוכנה מתאימה באופן אוטומטי לכל אזור אות לאחר הזרקה המסומנת במהלך הניסוי והשם שהוקצה לו: נווטו בכל פסגה (המסומנת על ידי קו אנכי צהוב) עם השם שהוקצה על ידי לחיצה על Next Peak ו-Previous Peak, ואז לחצו על הכפתור All OK כדי לקבל סוף סוף את החישוב עבור כל האזורים על המסך.
    4. על מנת לתקן את כל טעויות מתן השמות או ההתאמה שנעשו על ידי המשתמש או על ידי התוכנית, השתמש לפי הצורך בכפתורים המצוינים בקובץ משלים 1.
  3. העברת ערכי עקומת הכיול לגיליון אלקטרוני ויצירת משוואת רגרסיה ליניארית (איור משלים 3)
    1. העבר את הנתונים מתוכנית CLD לגיליון אלקטרוני חדש באמצעות העתק-הדבק. סדר את שתי העמודות בגליון הנתונים כריכוז מדגם ואזור מתחת לעקומה, והוסף ערך תואם של אפס בשתי העמודות.
    2. בחר את שתי העמודות, לחץ על הוסף > פיזור ולאחר מכן, תחת תפריט עיצוב תרשים , בחר הוסף רכיב תרשים > Trendline > ליניארי.
    3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קו המגמה שנוצר, לחץ על עיצוב קו מגמה ולאחר מכן לחץ על האפשרויות הצג משוואות בתרשים והצג ערך בריבוע R בתרשים בתפריט עיצוב Trendline כדי לקבל משוואת כיול ליניארית פשוטה.
  4. העבר את השטח המחושב של כל דגימה כדי לחשב את הריכוז שלה (איור משלים 3)
    1. דווח על כל ערך בגיליון האלקטרוני. בעמודה הבאה, החל את המשוואה המתקבלת משלב 8.3.3 כדי לקבל את הריכוז של כל דגימה מוזרקת, כאשר y הוא הריכוז (ערך העמודה החדשה) ו- x הוא השטח שמתחת לעקומה שנמדדה לאחר ההזרקה.
      הערה: זכור לקחת בחשבון את הריכוז שנמדד בתמיסת השימור (אם נעשה בו שימוש) ולחסר את הערכים בהתאם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ה-NO-consumption על ידי בדיקת Hb ללא תאים שימשה בדגימות שהכילו ריכוזים ידועים של oxyHb ללא תאים (איור 4). כאשר heme אחד של oxyHb משחרר באופן סטויכיומטרי מולקולת NO אחת בבדיקה, oxyHb מטוהר ללא תאים משמש לבניית עקומת הכיול עבור הבדיקה (איור משלים 3).

הקשר בין מינון לתגובה בין Hb ללא תאים (שנמדד באמצעות בדיקה קולורימטרית) לבין צריכת NO בחולים שירדו ממעקף לב-ריאה (CPB) במהלך ניתוח לב מוצג באיור 5. ניתן להניח כי לאחר CPB יש ריכוז גבוה יותר של קבוצות heme בסטטוס Hb-Fe2+-O2 (איור 5, אדום) בהשוואה לחולים שקיבלו NO במהלך CPB שממנו רק מיעוט מקבוצות heme של Hb ללא תאים צורכים NO (איור 5, ירוק).

הפרוטוקול להערכת צריכת NO על ידי Hb ללא תאים יושם בעבר על בדיקת דגימות פלזמה מ -50 חולים שעברו ניתוח לב ונזקקו ל- CPB. הדם נאסף בנקודת ההתחלה ו-15 דקות, 4 שעות ו-12 שעות לאחר ה-CPB. מטרת המחקר הייתה לחקור את הקשר הקיים בין עמידות כלי דם ריאתיים ומערכתיים כאחד לבין העלייה בהמוליזה שנצפתה לאחר ה- CPB. ריכוז ההמוגלובין ללא תאים הוערך באמצעות בדיקה קולורימטרית של Hb. ההמוליזה הגיעה לשיאה 15 דקות אחרי CPB. ה-Hb החופשי שהצטבר חוסל באיטיות מהפלזמה תוך 12 שעותו-18 (איור 6A). במקום זאת, צריכת NO הגיעה לשיא של 15 דקות והגיעה לערכי בסיס תוך 4 שעות בלבד (איור 6B). עקומות רגרסיה ליניאריות של אי-צריכה על-ידי Hb ללא תאים הציגו קשר סטויכיומטרי בנקודת הזמן של 15 דקות לאחר ה-CPB, לעומת נקודת הזמן הבסיסית, 4 שעות ו-12 שעות לאחר CPB (איור 6C). ההסבר להבדל שנצפה בקינטיקה טמון בשפע של Hb חופשי שזה עתה שוחרר, שעדיין לא נתקל במולקולות המשתחררות על ידי האנדותל של המטופל. הריכוז של oxyHb (נבלות NO וכתוצאה מכך הצריכה במבחן) היה, למעשה, גבוה יותר ב 15 דקות מאשר בכל נקודת זמן אחרת. פלזמה שנאספה בנקודת ההתחלה ובנקודות זמן אחרות היה מרכיב גבוה יחסית של metHb, שכבר התחמצן על ידי NO, לא קשר NO, ולא גרם לצריכה במבחן. עמידות כלי דם ריאתיים ומערכתיים נמדדה באופן פולשני והגיעה לשיאה ב-15 דקות. בפעם הראשונה באוכלוסיית חולים ספציפית זו, לא נצפתה צריכה על ידי Hb חופשי בשילוב זמני עם vasoconstriction, אשר אישר תצפיות קודמות במודלים של בעלי חיים ובחולים עם מחלת תאי חרמש18.

מתן גז NO במהלך CPB ולאחר ניתוח מגדיל את הכמות היחסית של metHb במחזור לעומת oxyHb. כאשר מטופלים שעברו ניתוח לב טופלו בגז ללא ניתוח, ולאחר הניתוח, העלייה הנצפית של Hb חופשי לאחר CPB (איור 7A) לא הייתה מלווה בעלייה כלשהי בצריכת NO, כפי שנמדד בפרוטוקול הנ"ל (איור 7B). גז ה-NO הניתן באופן אקסוגני ממיר את רוב ה-oxyHb ל-metHb, אשר בתורו אינו מנקה NO in vivo ואינו צורך NO in vitro (נתונים שלא פורסמו).

Figure 4
איור 4: צריכת תחמוצת החנקן על ידי אוקסיהמוגלובין מטוהר ללא תאים. בדיקת צריכת תחמוצת החנקן מבוצעת על ידי הזרקת דגימות של ריכוזים ידועים של אוקסיהמוגלובין ללא תאים מטוהרים. קו רגרסיה מוצג באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5. צריכת תחמוצת החנקן וריכוז המוגלובין ללא תאים מחולים שעברו ניתוח לב עם מעקף לב-ריאה. רמת ההמוגלובין נטולת התאים של כל מטופל, כפי שנמדדה בערכה קולורימטרית, הותוותה עם צריכת תחמוצת החנקן (NO) שנמדדה באמצעות כימילומינסנציה. דגימות דם נלקחו 15 דקות לאחר סיום CPB. קווי רגרסיה מוצגים עבור מטופלים עם ניתוחי לב שאינם מקבלים (באדום) או מקבלים (בירוק) NO במהלך מעקפים לב-ריאה (CPB). המוגלובין מתבטא ב- μM של קבוצות heme. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: צריכת תחמוצת החנקן והמוגלובין ללא תאים בחולי ניתוחי לב. (A) ריכוז המוגלובין ללא תאים (Hb) בפלזמה של חולים שעברו ניתוח לב עם מעקפים לבביים (CPB) (N = 50) נקבע בנקודות זמן שונות עם שימוש בערכת קביעת צבע הזמינה מסחרית. הנתונים נותחו על ידי התאמת מודל מעורב עם ראיות להשפעה קבועה בין נקודות זמן. ריכוז הפלזמה בנקודות זמן שונות הושווה לנקודת ההתחלה עם מבחן ההשוואה המרובה של טוקי. (B) צריכת תחמוצת החנקן (NO) על ידי פלזמה שהתקבלה מאותן דגימות המשמשות לכימות של Hb חופשי. הנתונים נותחו על ידי התאמת מודל מעורב עם עדות להשפעה קבועה בין נקודות זמן. ריכוז הפלזמה בנקודות זמן שונות הושווה לנקודת ההתחלה עם מבחן ההשוואה המרובה של דאנט. (C) קווי רגרסיה לתכולת פלזמת Hb ללא תאים המותאמת ללא צריכה. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns לא משמעותי. הנתונים מוצגים כחציון ± טווח בין-קווי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ההשפעות של מתן גז תחמוצת החנקן על צריכת תחמוצת החנקן בחולים שעברו ניתוח לבבי. (A) ריכוז המוגלובין ללא תאים בפלזמה של מטופלים שעברו ניתוח לב עם ניתוח לב עם מעקף לב-ריאה (CPB) שקיבלו פלצבו (N = 28) או תחמוצת חנקן (NO) גז (N = 22) במשך 24 שעות מאז תחילת CPB. הריכוז נקבע בנקודות זמן שונות תוך שימוש בערכה קולורימטרית זמינה מסחרית. הנתונים נותחו על ידי המבחן של פרידמן, מה שמעיד על נוכחות של השפעה בין נקודות זמן בשתי הקבוצות. ריכוז הפלזמה בנקודות זמן שונות הושווה לנקודת ההתחלה עם מבחן ההשוואה המרובה של דאן. (B) אין צריכה על ידי פלזמה המתקבלת מאותן דגימות המשמשות לכימות של Hb ללא תאים. הנתונים נותחו על ידי הבדיקה של פרידמן, המצביעה על נוכחות של השפעה בין נקודות זמן בשתי הקבוצות. ריכוז הפלזמה בנקודות זמן שונות הושווה לנקודת ההתחלה עם מבחן ההשוואה המרובה של דאן. ** עמ' < 0.01, *** עמ' < 0.001. הנתונים מוצגים כחציון ± טווח בין-קווי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בדיקת מעבדה תערובת ריאגנטים בסיס יעד (mV)
VCl3 ב-HCl 5 מ"ל של VCl3 בתמיסה רוויה HCl + 100 μL של חומר אנטיפום 0–5 מגה-וייט*
אני3- בחומצה אצטית 5–7 מ"ל מתוך I3 – מגיב 0–5 מגה-וייט*
ללא צריכה על ידי המוגלובין ללא תאים 5-7 מ"ל של PBS ב-pH 7.4 + 100 μL של חומר אנטי-פום + 20 μL של תמיסת DETA-NONOate מורחבת 70–100 מגה-וואט**
*ערך אידיאלי: קו הבסיס עשוי להיות גבוה יותר בשל איכות האוויר בסביבת הניסוי
**להבטיח יציבות במשך 20 דקות לפני תחילת הניסוי.

טבלה 1: טיהור הרכב ריאגנטים של כלי שיט ובסיס יעד למבחני כימילומינסנציה שונים. לטהר את הרכב ריאגנט כלי השיט עבור כל בדיקה המתוארת. NO = תחמוצת החנקן; PBS = תמיסת חיץ פוספט; DETA-NONOATE: (Z)-1-[2-(2-אמינואתיל)-N-(2-אמוניואתיל)אמינו]דיאזן-1-יום-1,2-דיולט. *ערך אידיאלי: קו הבסיס עשוי להיות גבוה יותר בשל איכות האוויר בסביבת הניסוי. **להבטיח יציבות במשך 20 דקות לפני תחילת הניסוי. כדי לבצע את בדיקת הצריכה ללא, יש לשנות את קנה המידה בתוכנה כדי ללכוד ערכים בין 70 mV ל- 100 mV (למשל, 0-100 mV), שהוא מתח הבסיס המיועד. התאמה זו מוצעת כבעלת שליטה מלאה על הזרקת הדגימה, המאפשרת לתעד את האות הנע מקו הבסיס לאחר הזרקת הדגימה ולצפות באות החוזר לנקודת ההתחלה. הקלטת הנתונים אינה מושפעת או מוגבלת לסולם ההדמיה.

איור משלים 1: שיאים בעקבות אי-זיהוי בבדיקת VCl3 ב-HCl. הפסגות העוקבות אחר מתן הדגימה ב- VCl3 ב- HCl מוצגות בתוכנת חבילת CLD. חישוב השטח שמתחת לשיא עבור כל זריקה מוצג לנוחות ומוסבר באיור משלים 2. בניסוי זה ניתנו סטנדרטים של ריכוזים שונים לעקומת הכיול, ואחריהם דגימות פלזמה. דילול הוא פתרון שימושי לחישוב מטבוליטים מדגימות המניבות NO בקצה הגבוה או אפילו מחוץ לעקומת הכיול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: חישוב אוטומטי בסיוע המשתמש של השטח שמתחת לשיא. בעת ביצוע בדיקת הצריכה NO על ידי המוגלובין ללא תאים, ייתכן שיהיה צורך להגדיר פסגות באופן ידני על מנת לספק לתוכנה את הגבולות המדויקים ביותר למדידת השטח מתחת לשיא שנוצר על ידי כל הזרקת דגימה. (א) תצוגה מלאה מייצגת של ניסוי מוקלט. הוא הגיע על ידי לחיצה על תהליך בתפריט הראשי ועל ידי בחירה ופתיחת הקובץ המוקלט של עניין. הקו הצהוב מייצג את סף האות (mV) המהווה את הקטע הישר של האזור שמתחת לשיא. על ידי לחיצה עליו, המשתמש יכול לגרור אותו לכיוון אזור האות. ניתן לשנות את ציר ה- x וה- y כדי להגדיל את שיא העניין למדידה מדויקת על ידי לחיצה על הלחצנים השמאליים התחתונים או על ידי הקלדת הערך המינימלי והמקסימלי הרצוי עבור כל אחד מהם. (ב) מיקום סף. המשתמש יכול לבחור את סף הבסיס האופטימלי על ידי גרירת הקו הצהוב לנקודת האמצע של האות ממש לפני מפולת האות הנגרמת על ידי הזרקת הדגימה. כדי להמשיך להגביל את האזור, המשתמש ילחץ על הלחצן 'קבע פסגות באופן ידני '. (C) מיקום סמני התחלה וסיום. על-ידי לחיצה על לחצן הגדר סמן התחל , מופיע קו ירוק על המסך. הקו הירוק צריך להיות ממוקם (על ידי גרירה ושחרור) ממש בתחילת המפולת הנגרמת על ידי הזרקת הדגימה. אותו לחצן משנה את התווית שלו ל-Set End Cursor על-ידי לחיצה על הקו האדום שמופיע על המסך. הקו האדום צריך להיות ממוקם בנקודה שבה האות מגיע שוב לקו הבסיס לאחר הסטייה הנגרמת על ידי אי צריכה מהדגימה המוזרקת. בסך הכל, קו הסף (צהוב, B), הקו הירוק והקו האדום מתארים במדויק את השטח שנוצר על ידי הזרקת הדגימה. (ד) מניב את השטח שמתחת לשיא. על-ידי לחיצה על לחצן שילוב (C), השטח המחושב שמתחת לשיא מוצג בפינה השמאלית העליונה של המסך. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: גיליון אלקטרוני מייצג עם עקומת כיול ותוצאות. האזורים המחושבים מתחת לשיאים הנוצרים מצריכת תחמוצת החנקן (NO) על ידי הזרקת דגימות עם ריכוז ידוע של המוגלובין ללא תאים (המבוטא כ-[μM] של heme) מוצגים בפינה השמאלית העליונה (על רקע צהוב). הערכים משורטטים לבניית עקומת הכיול והמשוואה הליניארית המתקבלת ממנה y= mx + q. השיפוע (m) הוא מספר קבוצות oxyHb heme (μM) הנדרשות כדי להקטין את האות שזוהה על ידי צינור הפוטומולטיפלייר ב-1 mV. בגיליון האלקטרוני הוזנו ערכים מחושבים מהזרקות משולשות (Run N 1,2,3) של דגימות ממטופל אחד שהתקבלו בארבע נקודות זמן שונות (המסומנות בצבעי רקע שונים). הממוצע של כל משולש שימש כדי להניב את הערך של צריכת NO הנגרמת על ידי כל מדגם על ידי פתרון המשוואה הליניארית: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Equation 1

קובץ משלים 1: סקירת הפסגות באמצעות התוכנה המצורפת. קובץ זה כולל צילום מסך שנלקח מהתוכנה המצורפת ואת הפעולות המותרות עבור כל לחצן. עבור כל שיא (כולל פסגות כוזבות הנגרמות על-ידי חפצים), המשתמש יכול להשתמש בלחצנים המצוינים בקובץ כדי לאשר, או להתעלם, או למחוק, או למחוק, או לתת שם לשיא מסוים, לפי הצורך. המשתמש יכול גם להקליט שיא שלא זוהה קודם לכן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל הרגישות הגבוהה, בדיקות מבוססות כימילומינסנציה לקביעת NO ותרכובות קשורות יש סיכון גבוה לזיהום NO2. כל מגיב (במיוחדפתרון חסימת NO 2) ומדלל (כולל ddH2O) המשמשים בניסוי צריכים להיבדק לתוכן NO 2 - שלו כדי לתקן את אות הרקע. ניטריט הוא תגובתי ביותר עם זמן מחצית חיים בדם שלם בסביבות 10 דקות ומייצר במהירות NO3-. הזמן שחולף בין איסוף הדם לצנטריפוגה, או חסימת NO2, עלול אפוא לגרום לטעויות פרה-אנליטיות ויש למזעראותו 15. בבדיקה באמצעות דגימות פלזמה, לאסוף דם רצוי בצינורות הפרין וצנטריפוגה ב 750 x g במשך 5 דקות ב 4 °C לאחר מצור קבוצת thiol עם 40 μL של 200 ננומטר NEM המיוצר על ידי המסת 250 מ"ג של NEM לתוך 10 מ"ל של מלוחים בחוצץ פוספט (PBS). ניתן לאחסן את פתרון המלאי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. תרכובות כגון ניטרוארגינין, ניטרופרוסיד וניטרוגליצרין המעכבות NO synthase (NOS) עוברות המרה איטית ולא כמותית ל-NO, וכתוצאה מכך העלייה הבסיסית. אם השימוש במעכבי NOS הוא חלק מהחקירה, מומלץ להשתמש בחוסמים שאינם מכילים קבוצות ניטרו43. לחץ הכניסה בכלי הטיהור צריך להתאים ללחץ השלילי המתמשך של ה-CLD לצורך הדגימה. אם לחץ הכניסה נמוך, זיקוק הוואקום של המדיום עלול להוביל לטיהור גזים מזוהם בקווים ובתאים, וכתוצאה מכך לעיוות האות. יתר על כן, כמויות קטנות של אוויר עשויות להיכנס לכלי הטיהור ולהגיב עם הפתרון כדי ליצור NO מוגזם. להיפך, לחץ מוגזם הנגרם על ידי קצב זרימה גבוה יותר מזרימת נסיגת הדגימה עלול לשחרר NO לאטמוספרה ולהוביל להערכת חסר של האות15. בנוסף, הן ה-VCl 3 ב-HCl והן ה-I3- בפרוטוקול החומצה האצטית דורשים דילולים מרובים במהלך ההכנה וחישובים מרובים כדי להניב ריכוז דגימה. כל שלב צריך להיות מתועד בקפידה כמו דילולים וחישובים מוכרים על ידי קבוצות רבות כמקור העיקרי של שגיאה44.

תוספת של תמיסת חסימת NO2 (שלב 2.1.2) גורמת לתאי דם אדומים לזוז, ומפחיתה את כל ה-OxyHb ל-MetHb. הוא מונע את ההפחתה המהירה של חלבונים המכילים ברזל (בעיקר OxyHb) על ידי NO2 - עם הדור הבא של NO3-. טיפול בדגימות עם פתרון זה בעת האיסוף נדרש כדי למדוד בצורה נכונה את NO2- ו / או NO3-. לעומת זאת, אין להשתמש בתמיסה בעת תכנון צריכת NO על ידי בדיקת Hb ללא תאים. יש לאחסן את ה-Aliquots של תמיסת חסימת NO 2 יחד עם הדגימות ולהשתמש בהן כדי להסיר את חלק האות שנגרם על ידי הפתרון עצמו. לבסוף, יש לקחת בחשבון את גורמי הדילול לחישוב הריכוז הסופי של המטבוליט הנמדד. במבחן I3- בחומצה אצטית, ריכוז NO2- מתקבל על ידי הפחתת הריכוז של האליקוט המכיל AS ללא HgCl2 (S-NO ו- Fe-NO) מזה של aliquot המכיל רק PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). כדי לחשב את הריכוז של S-NO (חלבוני כספית-לבילה), יש להפחית את ריכוז האליקוט שטופל ב-AS עם HgCl2 (Fe-NOs או חלבוני ניטרוסו יציבים-כספית) מזה של האליקוט שטופל ב-AS ללא HgCl2. לפני החיסור, המשתמש צריך להיזכר בהכפלת הריכוז של כל אליקוטים ב-0.8181 (270/330) כדי לקחת בחשבון את גורם הדילול ששימש במהלך תכשירי הדגימה (איור 3). אותו רעיון תקף גם לגבי מדידת S-NO-Hb ו-Hb-NO, כאשר הריכוזים המוחלטים הם שבריר מ-Hb22 שנמדדו. בהתאם לסוג הדגימה, ספירה מדויקת של ריכוז NO 3 עשויה לדרוש הרצה הן של VCl3 בפרוטוקול HCl והן של פרוטוקול I3- בחומצה אצטית כדי להפחית סוף סוף את הריכוז של NO2 - מאלו של NO3 - ו- NO2 -. זה לא תמיד הכרחי בדגימות דם ופלזמה שלמות, למשל, שם NO3 - בדרך כלל עולה בהרבה על NO2 -.

חשוב מאוד להזכיר כי CLD ייפגע אם מלכודת NaOH אינה במקום תקין בעת ביצוע VCl3 במבחן HCl בשל הקורוזיביות של HCl. ניתן לרכוש או להכין את תמיסת NaOH 1 M המשמשת למילוי מלכודת NaOH על ידי המסת 4 גרם של מלח NaOH ב-100 מ"ל של ddH2O או על ידי דילול 5 מ"ל של 50% NaOH ב-100 מ"ל של ddH2O. כאשר מדולל עוד יותר ל-10 מיקרומטר עם ddH2O, ה-NaOH שימושי מאוד להסרת פסולת חלבונים על ידי הזרקה בכלי הטיהור.

האות הבסיסי שזוהה על ידי CLD צריך להיות יציב ובתוך 0-5 mV. אות בסיסי גבוה יותר יכול להיגרם על ידי זיהום אוויר (על ידי NO ונגזרות), וניתן לאמת זאת על ידי השארת הכניסה באוויר הפתוח. אם מתח גבוה יותר נצפה רק בכלי הטיהור, בעוד שיש לשקול זיהום של המיכל בגז אינרטי, זה לרוב בגלל התמדה של שרידים אורגניים או נוכחות של NO2 - בצינור. שטיפת כלי הטיהור מספר פעמים עם ddH2O יכולה לעזור למזער את המתח הבסיסי. אם לא יצליח, הדגירה של כלי הטיהור עם 100 mM NaOH במשך 24-48 שעות ואחריו שטיפות מרובות עם ddH2O מסייע לחסל מזהמים. ב- NO צריכה על ידי בדיקת Hb ללא תאים, אות ה- CLD הנדרש הוא 70-100 mV למשך 20-30 דקות לפחות. אם האות אינו יציב (כלומר, המתח יורד), ניתן להוסיף מינון נוסף של 10 μL של DETA NONOate לכלי הטיהור. ניתן לחזור על כך לפי הצורך. חשוב לזכור כי גם אבקה שאינה בשימוש וגם DETA NONOate שכבר הורחבה צריכים להישמר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ריאגנט זה מתפורר במהירות למרות אחסון אופטימלי ואולי ביצועי חסר כאשר אינו מוכן טרי, מה שדורש הזרקות מרובות לתוך כלי הטיהור ומוביל לאות איזואלקטרי פחות יציב. חשוב מכך, יש להרחיב אותו ב-PBS עם pH 7.4 מכיוון שזה ממטב את זמן מחצית החיים שלו (56 שעות ב-pH 7.4 בטמפרטורת החדר לעומת דיסוציאציה מעין-מיידית ב-pH של 5.0)45. המזרק המשמש להזרקת DETA NONOate צריך להיות מוקדש באופן בלעדי לפעולה זו ולא לשמש להזרקת דגימות.

אם הזרקה של דגימה יוצרת שיא שהוא גבוה יותר מהנקודה העליונה של עקומת הכיול, במיוחד אם היא מייצרת מתח גבוה מ-700 mv, מומלץ לדלל את הדגימה (2x או 4x) כדי למזער את השגיאה. זה חל גם על מבחן הצריכה NO אם הטבילה הנגרמת על ידי הזרקת דגימה עמוקה יותר מזו הנגרמת על ידי הזרקה של הדגימה המרוכזת ביותר המשמשת בעקומת הכיול. העדויות על שיא (או דרך) באות לאחר ההזרקה שהוא נמוך מהצפוי או נעדר עשויות להצביע על סתימת המזרק המדויק המשמש להזרקה. בשל הכמויות הקטנות בהן נעשה שימוש (10-20 μL/sample), במיוחד אם מבוצעות בדיקות פלזמה או שתן, ייתכן שיהיה קשה להבחין בין מזרק מלא לבין היעדר הדגימה עקב סתימת המזרק. מומלץ לשים לב להתנגדות שנעשתה על ידי הבוכנה. לאחר אישור על ידי בדיקה של המזרק, ניתן לנסות להסיר את החסימה על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של המזרק עם ddH2O ועל ידי שפשוף המזרק על נגב משימה עדין אם החסימה גלויה חיצונית. כאשר יש ספק, מומלץ להוציא את נפח הדגימה על נגב משימה ולחזור לשטוף את המזרק עם ddH2O ולנסות לחזור על ניהול הדגימה. קצף הוא סיבוך נפוץ ומאלץ את הניסוי להסתיים ברגע שגובה העמודה הנוזלית עולה על זה של עמודת התגובה, מה שגורם לחוסר יציבות האות. חריגה ממינון סוכן האנטי-פומינג המצוין בפרוטוקול עלולה להוביל לעלייה באות הבסיס ויש להימנע ממנה. מספר הדגימות הגורמות להיווצרות של קצף מוגזם הופך להיות צפוי כאשר מבוצעות בדיקות חוזרות ונשנות, תופעה שאמורה ליידע כיצד ניתן לתכנן את הניסוי בצורה אופטימלית. צעד אופציונלי להפחתת הקצף הוא לערבב פלזמה או רקמות סופרנאטנט עם מתנול קר (יחס 1:1) וצנטריפוגה למשך 15 דקות, 13000 x גרם ב 4 °C (74 °F). יש לקחת בחשבון כי מתנול גורם לחלבונים לזרז. נמדדים רק S-NOs קלים ו-Fe-NOs שאינם פרוטאיים באופיים. לפיכך, אפשרות זו אינה יכולה להיות מאומצת במחקרים על דם שלם או בכל מקרה אחר שבו יש עניין בחלבוני S-NO ו- Fe-NO.

תמיסות ריאגנטיות נוספות מלבד VCl3 ב-HCl ו-I 3 בחומצה אצטית תוארו ואומצו בהצלחה. חומצה אסקורבית מפחיתה באופן ספציפי את NO2-, אינה מגיבה עם NO3- ולא עם S-NOs, וניתן להשתמש בה כדי להפחית את עיקר הדגימות והחישובים המוזרקים במצבים שבהם NO2 - היא המולקולה היחידה המעניינת. המלכודת העיקרית היא היציבות המוגבלת של המגיב, הדורשת שינויים תכופים יותר של תמיסת המגיבים, ובכך כיולים חוזריםונשנים 46. בדיקה המשתמשת בציסטאין רווי פחמן חד חמצני וקופרוס כלוריד (CuCl) (שיטת 3C) יכולה לזהות באופן ספציפי S-NOs עם רגישות הדומה ל-I 3- אך עדיין דורשת טיפול עם ובלי HgCl2 כדי למנוע תגובות לא ספציפיות47. כדי להשיג דיוק גבוה יותר בניתוח אותות, ניסויים נרשמים בתבנית .data, כך שניתן להשלים ניתוח צורות גל לא מקוונות עם תוכנות שונות מלבד תוכנית החבילה המוצגת בפרוטוקול.

לאחר ביצוע ההזרקה הראשונה, לא ניתן לעצור את הניסוי. אם יש צורך בהשהיה ו/או אם משתנה תנאי כלשהו (הרכב מדיום כלי הטיהור, זרימת גז הטיהור, המתח הבסיסי), הניסוי תקף רק לדגימות שהוזרקו עד לאותה נקודה. יש לבצע עקומה סטנדרטית חדשה לפני מדידת דגימות נוספות. הדיוק המותר על ידי מבחנים מבוססי כימילומינסנציה מגיע עם מחיר. הבדיקות גוזלות זמן רב מכמה סיבות: 1) אוטומציה אינה אפשרית מכיוון שנדרשת הזרקת דגימה ידנית בכפילויות; 2) רוב הריאגנטים המשמשים אינם ניתנים למלאי לתקופות ארוכות; 3) כל ניסוי צריך להתחיל על ידי הרצת דגימות סטנדרטיות בריכוזים ידועים לכיול ולא ניתן להשהות אותו אלא אם כן הכיול חוזר על עצמו; 4) כל דגימה מחולקת לאליפוטים המכילים תערובות שונות של ריאגנטים כדי לחסום תגובות ספציפיות על מנת לחשב סוף סוף את הריכוז של מטבוליטים ספציפיים על ידי חיסור אחרים.

עבודה זו מתמקדת במכשיר Zysense NOA 280i, בעל סף זיהוי של <1 ppb NO בשלב הגז (המתאים לעד 1 pM של NO בפאזה הנוזלית) וזרימת דגימה של 10-300 מ"ל לדקה. CLDs אחרים זמינים עם מערכת צינורות צרור למדידת מטבוליטים בפאזה הנוזלית. ל-ClDs של Ecophysics יש סף רגישות גבוה יותר, 1 ppb במודל הרגיש ביותר שלהם, אך היתרון בכך שאינם זקוקים למיכל חמצן לייצור אוזון. מצד שני, זרימת הדגימה המדווחת שלהם היא 1000 מ"ל לדקה, מה שמרמז על צריכה גבוהה יותר של מיכל הדלק האינרטי המשמש לספינת הטיהור. מכונות CLD אחרות מוקדשות לניתוח NO בנשיפה לשימוש קליני.

Chemiluminescence היא השיטה הרגישה והמאומתת ביותר להעריך באופן ספציפי את אי הצריכה על ידי Hb ללא תאים בתחום ההמוליזה. טכניקות אחרות זמינות למדידת NO, NO2-, NO3-, S-NOs ותרכובות ניטרוסו כספית-labile. מדידה ישירה של גז NO יכולה להתקבל על ידי chemiluminescence או עם שימוש באלקטרודות ייעודיות הנעות בין מדידת הגז הננשף לאלקטרודות חד-תאיות. אלה מודדים רק גז ללא גז, הם פחות יקרים (אך מתכלים יותר), דורשים כיול לעתים קרובות יותר, והם פחות מדויקים בהשוואה ל-CLD31. ניטריטים ו-NO 3- נמדדו באופן היסטורי בתגובת גריס, טכניקה קולורימטרית שבגרסתה המקורית מזהה את שתי המולקולות ללא אפשרות להבחין בריכוז היחסי שלהן בדגימה. גרסאות מודרניות של הטכניקה כוללות כרומטוגרפיית פאזה הפוכה המשתמשת בהפרדת המדגם בשתי עמודות, ומאפשרות שתי תגובות עצמאיות עם NO3 ו- NO2-. הרגישות של שיטות אלה היא מיקרומולרית או מעט פחות, בהשוואה ל-1 ננומטר עם CLD. המלכודות העיקריות הן צריכת זמן וחוסר תאימות עם דגימות שטופלו מראש בכספית ו/או פריציאניד14. ניתן לזהות S-NOs בטכניקות קולורימטריות ופלואורומטריות גם עם רגישות של עד 0.5 מיקרומטר לעומת 100 מילת נשים המתוארת על ידי שימוש בכמילומינסנציה כפי שמוצג בפרוטוקול I3- בחומצה אצטית 14,41,42. לבדיקה של מתג ביוטין, למרות שלא הצליחה לזהות S-NOs בתחום הפיקומולארים, יש את היתרון של יצירת חלבונים המסומנים בביוטין שניתן לטהר ולזהות עם ניתוח פרוטאומי48. כאשר מסתכלים על זה בפירוט, כל טכניקה חולקת מלכודת משותפת אחת, שהיא התגובה הקיצונית של NO ונגזרותיה שמטילות מצור על תגובות לצורך מדידה במבחנה. טרום טיפול בדגימות הוא קריטי, והתשובה לשאלה אם טיפול מקדים מסוים חוסם לחלוטין תגובה או עושה זאת טוב יותר מתגובה אחרת הייתה עד כה כוח מניע לקראת עלייה במחקרים מתודולוגיים. בעוד שהתגובתיות הקיצונית in vivo של NO בהחלט הייתה דחף לחקור שיטות רגישות לגילוי המטבוליטים שלו, מדידה ישירה של NO פגשה התקדמות משמעותית בשלושת העשורים האחרונים מאז פותח הגלאי האמפרומטרי הראשון בשנת 1990. יותר מעשרים בדיקות שונות תוארו מאז, כולל ננו-חיישנים המשמשים לחקר תוכן NO של תא יחיד49. חיישנים אלקטרוכימיים הם הכלים העיקריים שיכולים לזהות NO הן in vivo והן בזמן אמת. ברפואת ריאות, מחקרים רבים השוו בין מכונות מבוססות אלקטרודות לבין CLDs. מדידת NO נשף היא פשוטה יותר מבדיקות אחרות לזיהוי מטבוליטים, הדורשות חיבור ישיר של קו הגז (באמצעות מסנן IFD) לתוספת נשימתית במערכת סגורה או כמה נשימות בשקית לניתוח לא מקוון, אך העלות והניידות הירודה יותר של CLDs מתעכבות. מספר התקנים אלקטרוכימיים עומדים כיום בקריטריונים לשימוש קליני, אם כי יש להם רגישות ושכפול נמוכים יותר בהשוואה ל- CLDs. יתר על כן, הקונקורדנציה במונחים של ערכים מדודים מוחלטים היא לא אופטימלית בין מכשירים, ולכן מומלץ לחולים להיות תמיד במעקב עם אותו מכשיר אלקטרוכימי50. השימוש ב- CLDs במסגרות כגון מדידת נשיפה באף NO ובמסגרות מחקר כמו טיפול נמוך במינון גבוה בשאיפה NO עדיין נחוץ.

מדידות מדויקות של NO, נגזרותיו וחלבונים קושרי NO נחוצות ברמות רבות כדי להבין מנגנון איתות שהתעלמו ממנו ועדיין לא ידוע ברובו. תחומי היישום משתרעים על פני ביולוגיה ופתולוגיה הן ברמה הפרה-קלינית והן ברמה הקלינית עם תחומי מטרה ספציפיים, כולל אימונוביולוגיה, מדעי המוח, מדעי הלב וכלי הדם ומחלות זיהומיות. מחקרים פרה-קליניים וניסויים קליניים חוקרים את השימוש בגז NO בשאיפה כסוכן טיפולי. יידרש ידע מעמיק יותר על האופן שבו גז NO אקסוגני משפיע על ריכוז של מטבוליטים ללא מטבוליטים וחלבונים שאינם קשורים ל-NO בכל רמה, מפלזמה ועד תאי תאים. יישום של פרוטאומיקה בעלת תפוקה גבוהה עשוי להגדיל את מספר המתווכים הידועים המושפעים מ-NO ונגזרותיו ועשוי לחייב חקירות מכניסטיות חדשות הדורשות מדידות מדויקות של מטבוליטים ללא מטבוליטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ל.ב. מקבל תמיכה בשכר מ- K23 HL128882/NHLBI NIH כחוקר ראשי עבור עבודתו על המוליזה ותחמוצת החנקן. LB מקבל מענקים מ"מענקים מהירים למחקר COVID-19 " במרכז מרקטוס באוניברסיטת ג'ורג ' מייסון ומ- iNO Therapeutics LLC. B.Y. נתמך על ידי מענקים מ- NHLBI / #R21HL130956 ו- DOD / קרן ז'נבה (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). ב.י. קיבלה פטנטים ב-MGH על ייצור חשמלי של תחמוצת החנקן.

L.B. ו- B.Y. הגישו בקשת פטנט על אי מסירה במחלת COVID-19 מספר בקשה PCT: PCT / US2021 /036269 שהוגשה ב - 7 ביוני 2021. RWC מקבלת תמיכה בשכר מ- Unitaid כחוקרת הראשית לפיתוח טכנולוגיה שמטרתה אבחנה מבוזרת של שחפת בילדים הממוקמים במסגרות דלות משאבים.

Acknowledgments

הפרוטוקולים המדווחים בכתב יד זה התאפשרו הודות לתרומתם המצטברת של עמיתים קודמים במעבדתו של ד"ר וורן זפול לחקר ההרדמה בטיפול קריטי, המחלקה להרדמה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. אנו מכירים בתרומתם של ד"ר אקיטו נקגאווה, פרנצ'סקו זדק, עמנואלה ואסנה, צ'ונג ליי, יאסוקו נגאסאקה, אסתר ספאגנולי ועמנואלה רזואלי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

רפואה גיליון 180
מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter