Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Chemiluminescence-baserte analyser for påvisning av nitrogenoksid og dets derivater fra autoxidasjon og nitroserte forbindelser

Published: February 16, 2022 doi: 10.3791/63107
Automatic Translation
1,3, 1,3, 2,3, 1,3
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

Summary

Her presenterer vi protokoller for å oppdage nitrogenoksid og dets biologisk relevante derivater ved hjelp av chemiluminescensbaserte analyser med høy følsomhet.

Abstract

Nitrogenoksid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerte resultatene av sine direkte effekter, virkningen av dets derivater generert fra INGEN autoxidasjon, og effekten av nitroserte forbindelser. Måling av NO metabolitter er avgjørende for å studere INGEN aktivitet både på vaskulære nivåer og i andre vev, spesielt i eksperimentelle omgivelser der eksogen NO administreres. Ozonbaserte chemiluminescensanalyser tillater presise målinger av NO- og NO-metabolitter i begge væsker (inkludert plasma, vevshomogenater, cellekulturer) og gassblandinger (f.eks. utåndet pust). NO reagerer med ozon for å generere nitrogendioksid i en opphisset tilstand. Det påfølgende lysutslippet tillater fotodeteksjon og generering av et elektrisk signal som reflekterer NO-innholdet i prøven. Aliquots fra samme prøve kan brukes til å måle spesifikke NO metabolitter, for eksempel nitrat, nitritt, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. I tillegg er NO konsumert av cellefritt hemoglobin også kvantifisert med chemiluminescensanalyse. En illustrasjon av alle disse teknikkene er gitt.

Introduction

Siden Salvador Moncada og nobelprisvinnerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identifiserte nitrogenoksid (NO) som den tidligere kjente endotel-avledede avslapningsfaktoren (EDRF), har den sentrale rollen til NO blitt etablert i flere viktige mekanismer som spenner over vaskulær biologi, nevrovitenskap, metabolisme og vertsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administrering av NO-gass har blitt en etablert behandling for respirasjonssvikt på grunn av pulmonal hypertensjon hos nyfødte8. Nitrogenoksidgass har også blitt undersøkt for behandling av respiratorisk synytialvirusinfeksjon (RSV), malaria og andre infeksjonssykdommer, iskemi-reperfusjonsskade, og for forebygging av akutt nyreskade hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for presise måleteknikker for å vurdere nivåene av NO, dets metabolitter, og de av målproteiner og forbindelser oppstår fra både mekanistiske og intervensjonelle studier.

På grunn av sin høye reaktivitet kan NO gjennomgå forskjellige reaksjoner avhengig av den biologiske matrisen den produseres og/eller frigjøres i. I fravær av hemoglobin (Hb) eller andre oksy-hemoproteiner oksideres NO nesten helt til nitritt (NO2-).

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NR2- + H+

NO gjennomgår først autoxidasjon med molekylært oksygen (O2) for å gi nitrogendioksid (NO2) og reagerer med NO2 selv for å generere dinitrogentrioksid (N2O3). Ett molekyl av N2O3 reagerer med vann (H2O) for å danne to molekyler av NO2- og en proton (H+)13. Innen fullblods14,15, NEI og NO2- konverteres raskt til nitrat (NO3-) da disse molekylene reagerer ivrig med de oksiderte hemegruppene hb [Hb-Fe2 +-O2 eller oksyhemoglobin (oksyHb)] for å gi NO3-. Denne reaksjonen er kombinert med overgangen av heme-gruppen til ferric-tilstanden [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

Den røde blodlegemer (RBC) barrieren og rommet rett ved siden av endotelet er de viktigste faktorene som begrenser denne reaksjonen og tillater en liten del av NO frigjort av endotelet å fungere som EDRF16,17. Faktisk er cellefri Hb i sirkulasjonen kjent for å forstyrre vasodilatasjon i eksperimentelle og kliniske omgivelser17,18. Innenfor RBC, avhengig av oksygenering og NO 2-konsentrasjon, reagerer en del av NO med deoksyhemoglobin (Hb-Fe2+) for å danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

I RBC15,17 kan NO2- danne Hb-Fe3+ ved å redusere Hb-Fe2+ som fører til utgivelsen av NO, som igjen binder Hb-Fe2 +-O2 (fortrinnsvis) eller Hb-Fe2+.

Genereringen av NO-derivater bør ikke betraktes som strengt enveis, da NO kan regenereres fra NO2- og NO3- i ulike vev og av forskjellige enzymer (f.eks. ved tarmbakterier eller innen mitokondrier, spesielt under hypoksiske forhold)19,20.

En variabel mengde NO produsert (eller administrert) fører til nedstrøms generering av S-nitrosothioler, hovedsakelig ved tioltransnitrosasjon fra N2O3 i nærvær av en nukleofil som skaper en NO + donor mellomliggende (Nuc-NO + -NO2-):

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

En annen mulighet for S-nitrosothiols generasjon er nitrosylering av oksiderte tioler (INGEN reagerer med en oksidert tiol):

RS• + NO → RS-NO

Denne mekanismen og direkte tioloksidasjon ved NO2 kan bare være mulig under svært spesifikke forhold som er beskrevet andre steder21. S-nitrosothioler spenner fra lette molekyler som S-nitrosoglutathione til store tiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosasjon av en tiolgruppe av en konservert cysteinrester i β-kjeden (β93C)22.

Generering og metabolisme av S-nitrosothioler er en del av viktige regulatoriske mekanismer. Eksempler er regulering av glutathione, caspaser, N-metyl-D-Aspartat (NMDA) og ryanodinreseptorer 23,24,25,26,27,28. Tidligere ansett som en stor formidler av NO biologi in vivo, nitrosated albumin (S-nitroso-albumin) synes å være en NO / NO + transportør uten noen spesifikk ekstra biologisk aktivitet29.

Ved måling av konsentrasjonen av NO og dets derivater fra en bestemt biologisk prøve i en biologisk matrise, er det viktig å vurdere egenskaper som surhet, oksygenering, temperatur og tilstedeværelse av reagenser. Eksempler er administrerte eksogene NO-donorer, og i innstillingen av akutt betennelse reagerer hydrogenperoksid (H2O2) med NO2 som fører til generering av supernormal konsentrasjon av frie radikaler som peroksynitritt (ONOO-)21. I tillegg til den analytiske metoden som brukes, er den preanalytiske fasen av prøvepreparering og lagring grunnleggende. Nedstrømsreaksjoner som ikke representerer in vivo NO-aktiviteten skal forutsies, vurderes og blokkeres. Et gyldig eksempel er ustabiliteten til S-NO-Hb, som krever en dedikert behandling av blodprøver når den er rettet mot måling22.

Chemiluminescence-baserte analyser er gullstandarden for å oppdage nivåene av NO og dens viktigste metabolitter [NO2-, NO3-, S-NO og iron-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, inkludert vev homogenater30,31. Disse metodene er avhengige av chemiluminescence detector (CLD), en enhet som huser reaksjonen av NO med ozon (O3), og genererer NO2 i en spent tilstand (NO2•). Avslapping av NO2• forårsaker utslipp av en foton av lys som oppdages av et fotomultiplierrør, og genererer et elektrisk signal som er direkte proporsjonalt med NO-innholdet i den prøvede gassblandingen32. Et forenklet skjema av CLD er representert.

Figure 1
Figur 1: Forenklet skjematisk for en chemiluminescensdetektor for nitrogenoksidgass. Chemiluminescence-basert deteksjon av nitrogenoksid (NO) er den stoichiometriske generasjonen av ett foton per NO gassmolekyl som introduseres i chemiluminescence detector (CLD). Chemiluminescensreaksjonen oppnås i et utpekt kammer som leveres med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved negativt trykk ved forbindelse med en ekstern pumpe, noe som tillater kontinuerlig og konstant tilstrømning av prøvegass. Genereringen av O3 krever diatomisk oksygen (O2) som leveres av en dedikert O2-tank koblet til CLD (andre produsenter gir CLDer som opererer med omgivelsesluft). Innenfor reaksjonskammeret reagerer hvert molekyl av INGEN gass i prøvegassen med oksygen for å gi ett molekyl nitrogendioksid i aktivert tilstand (NO2*). Ved å gå tilbake til sin bakketilstand avgir hvert NO2* molekyl en foton som oppdages av et fotomultiplierrør (PMT) som ligger ved siden av reaksjonskammeret. PMT med tilhørende forsterker og sentral prosesseringsenhet produserer et signal proporsjonalt med fotontallet og antall NO-molekyler i reaksjonskammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøveinntaket til CLD kan kobles til et glassrørsystem som inneholder et reaksjonskammer for væskeprøver. Systemet renses kontinuerlig med en inert gass som nitrogen, helium eller argon, og overfører NEI fra reaksjonskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiseres gjennom en dedikert membran inn i rensebeholderen.

Figure 2
Figur 2: Struktur av et rensekar for chemiluminescensbasert påvisning av nitrogenoksidgass Rensebeholderen (høyre) gjør det mulig å påvise nitrogenoksid (NO) gass eller annen forbindelse som lett kan omdannes til INGEN gass når den slippes ut fra et flytende fasereagens. Det inert gassinntaket er koblet til en kilde (tank) av en inert gass som Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (N2). Nåleventilen (åpnes til venstre) brukes til trykkregulering i rensebeholderen og kan fjernes helt for å rengjøre fartøyet. Injeksjonsporten er dekket av en hette med en membran septum for prøveinjeksjon. Membranen bør byttes ofte ut. En oppvarmet jakke omgir reaksjonskammeret og er koblet til et varmtvannsbad for å utføre VCl3 i HCl-analysen. Utløpet av rensebeholderen er koblet til chemiluminescensdetektoren (CLD) eller naoh-fellen (kreves for VCl3 i HCl-analyser). For å tømme innholdet i reaksjonskammeret må du først lukke stoppekranene ved det inerte gassinntaket og rensekarutløpet, lukke nåleventilen, fjerne hetten ved injeksjonsporten og til slutt åpne stoppekranen ved avløpet. NaOH-fellen (til venstre) må plasseres linjebundet mellom rensebeholderen og CLD hvis VCl3 i HCl-analysen utføres på grunn av korrosjonen til HCl. Forbindelsen til CLD krever alltid at et intenst felt dielektrisk (IFD) filter skal plasseres mellom CLD og utgangen av rensebeholderen (eller NaOH-fellen, hvis det brukes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og stopper væske fra å passere gjennom rensebeholderen. PTFE = polytetrafluoretylen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som en konsekvens kan enhver forbindelse som kan konverteres til NEI gjennom en bestemt og kontrollert kjemisk reaksjon oppdages med høy følsomhet i enhver biologisk væske og vev homogenat24. Direkte måling av gassfase NO gjennom chemiluminescens utføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikkene er omfattende beskrevet andre steder 33,34,35. Måling av NO2-, S-nitrosothiols, S-nitroserte proteiner og Fe-NOs kan utføres ved å legge til prøver i en reaksjonsblanding med triiodid (I3-), som stoichiometisk frigjør INGEN gass fra alle disse forbindelsene:

Jeg3- → jeg2 + jeg-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

mens jeg3- reagerer ikke med NO 3-15. Nøyaktige målinger av hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling av prøve aliquots med surgjort sulfanilamid (AS) med eller uten mercuric klorid (HgCl2). Spesielt fjerner forbehandling med AS alt NO 2-innhold. Som en konsekvens av dette gjenspeiler NO-innholdet målt ved CLD bare summen av S-NOer og Fe-NOs konsentrasjon. Injeksjon av HgCl2 i en prøve aliquot før AS injeksjon fører til at NO2- frigjøres av S-NO. Behandling med AS (som fører til NO2- fjerning) sikrer at det målte NO-innholdet bare gjenspeiler konsentrasjonen av Fe-NOer. En rekke subtraksjoner mellom vurderingene gjør det mulig å beregne den nøyaktige konsentrasjonen av de tre NO-derivatene22.

Figure 3
Figur 3: Trinn i prøvepreparering for I 3-i-eddiksyre chemiluminescence-analysen. De sekvensielle trinnene for fremstilling av I 3-i eddiksyre chemiluminescence-analysen er illustrert. Bruk av lysbeskyttede sentrifugerør er nødvendig. Rør 1, 2 og 3 er de som brukes til å forberede seg på analysen. En annen prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl3 i HCl-analysen hvis måling av nitrat (NO3-) er nødvendig. Trinnene angis med tall i rødt. Forhåndsutfylling (trinn 1) som indikert med fosfatbuffersark (PBS) eller HgCl2 før prøvevolumet tilsettes. Tilsett prøvevolumet (2) som angitt, virvel og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur (RT). Tilsett (3) PBS eller surgjort sulfanilamid (AS) som indikert, virvel og inkuber i 3 min ved RT. Kjør analysen (4). Konsentrasjonen målt ved analysen er summen av konsentrasjonen av forbindelsene som rapporteres under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillate målinger av nitritt (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NOs) som et enkelt signal. For nitratmåling (NO3-) skal prøver kjøres med både I3- i eddiksyre og VCl3 i HCl-analyser, og verdien oppnådd fra rør 1 skal trekkes fra den som er oppnådd fra rør 4. *foreslåtte mengder som skal brukes til Hb-analyse for bestemmelse av rest no2-, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hemoglobin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For NO 3-måling brukes Vanadium (III) klorid (VCl3) i saltsyre (HCl) til konvertering av NO3- til NO i rensebeholderen for å måle NO 3-stoichiometrisk med CLD:

2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

For å oppnå en tilstrekkelig rask konvertering må reaksjonen utføres ved 90-95 °C. Reduksjon fra NO3- til NO2- kombineres med reduksjon av NO2- til NO av HCl. Vanadium metall reduserer også S-NOs frigjøre sin NO moiety22,36. Den endelige konsentrasjonen oppnådd av CLD med VCl3 i HCl gjenspeiler den samlede konsentrasjonen av NO3-, NO2 og andre nitroserte forbindelser. Subtraksjon av sistnevnte verdi fra konsentrasjonen gitt med CLD med I3- tillater beregning av NO 3-konsentrasjon 36,37 (figur 3).

I NO-forbruksanalysen genererer den kontinuerlige frigjøringen av NO i rensefartøyet av NO-givere som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal som tillater kvantifisering av cellefri oksyHb i de injiserte prøvene. Mengden NO som forbrukes i rensebeholderen er i et stoichiometrisk forhold til mengden oksyHb iprøven 38.

Protokoller for måling av NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, jern-nitrosylkomplekser og INGEN forbruk ved cellefri Hb i plasmaprøver er illustrert. Studier på NO i RBC-miljøet krever spesifikk prøvebehandling etterfulgt av eksklusjonskromatografi for å måle ekstremt skjøre S-NO-Hb og Hb-NO kombinert med bestemmelse av total Hb-konsentrasjon15,22. Prøvepreparering er medvirkende til å korrigere måling. Pre-eksistens av NO2- i H2O og frigjøring av NO2- under analysen kan føre til måling av kunstig høyere konsentrasjoner av NO derivater som S-NO-Hb14,39. Viktige aspekter ved prøveforberedelse presenteres også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene som er angitt i denne protokollen er i samsvar med kontrollstyret ved Massachusetts General Hospital. Blodprøvene som ble brukt hadde blitt samlet inn i en tidligere studie og ble av-identifisert for gjeldende formål18.

MERK: Se produsentens anvisninger for spesifikk veiledning om optimale forbindelser mellom slanger og glassvarer som utgjør rensebeholderen, vasken og generelt vedlikehold. Tilkoblinger må være faste og nøye laget for ikke å skade glasset. Identifiser komponentene i glassrensebeholderen: gassinntaksledning, rensebeholder med varmejakke og kondensator, natriumhydroksid (NaOH) gassboblefelle, forbindelseslinje mellom rensebeholderen og bobleren, rensebeholderens utløpsgassledning (til CLD) utstyrt med et intenst felt dielektrisk (IFD) filter. En IFD-filterlinje mellom rensebeholderen og prøveinntaket til CLD må være på plass hver gang INGEN metabolitter i flytende form (plasma, cellekulturer, vevshomogenater) måles (alle analysene som presenteres i protokollen). Prøvepreparatet avhenger av væsken eller vevet som analyseres og på forbindelsene av interesse. Viktige aspekter ved den preanalytiske fasen dekkes i § 1 og 2. Spesifikke forberedelsestrinn for spesifikke analyser er inkludert i avsnitt 3-5. § 6-8 gjelder for alle analyser.

1. Utarbeidelse av dedikerte reagenser

MERK: Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se tidligere publikasjoner15,22.

  1. Forbered 5% (290 mM) surgjort sulfanilamid (AS) løsning for NO2- fjerning ved å oppløse 500 mg sulfanilamid i 10 ml 1N HCl. Denne løsningen er stabil i flere måneder.
  2. Forbered 50 mM mercuric klorid (HgCl2) oppløsning for NO 2-release fra S-NOs ved å oppløse 67,9 mg HgCl2 til 5 ml PBS. Beskytt lagerløsningen mot lys.
  3. Forbered NO 2-blokkerende løsning med 800 mM ferricyanid [K 3Fe(CN)6] for å oksidere Hb sammen med 100 mM N-etylmalimid (NEM) for å blokkere tiolgrupper og (VALGFRITT) 10% nonylfenyl-polyetylenglykoloppløsning (Nonidet p-40) for å løse røde cellemembraner.
    1. Tilsett K3Fe(CN)6 til deionisert og destillert vann (ddH2O, 263,5 g pulver per liter) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 800 mM.
    2. Tilsett NEM i 800 mM K3Fe(CN)6 i ddH2O-oppløsning (12,5 g pulver per liter for å ha 100 mM konsentrasjon) og bland løsningen for å oppløse alle krystaller.
    3. Tilsett en del av 10% NP-40 til ni deler av 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM-løsning (111 ml per liter) og bland godt (obligatorisk trinn for fullblodsanalyse).
  4. Forbered S-NO-Hb stabiliseringsløsningen som inneholder 12 mM K3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM dietylentriaminpentaacetic acid (DTPA, for metallchelation) og 1% Nonidet p-40 vaskemiddel fra sine lagerløsninger.
    1. Forbered en 200 mM NEM-løsning ved å tilsette NEM-krystaller til PBS (25 mg/ml, for eksempel 250 mg i 10 ml PBS) og bland oppløsningen til alle krystaller er oppløst (som skal gjøres på eksperimentdagen).
    2. Forbered en 800 mM K3Fe(CN)6-løsning ved å tilsette K3Fe(CN)6 til ddH2O (263,5 mg/ml f.eks. 1,32 g i 5 ml ddH2O for å oppnå en endelig konsentrasjon på 800 mM) (som skal gjøres på eksperimentdagen).
    3. Forbered en 10 mM DTPA-lagerløsning ved å tilsette 786 mg DTPA til 200 ml ddH2O og juster pH til 7,0 med 5N NaOH for å fullstendig løse DTPA.
    4. Tilsett 5 ml 200 mM NEM-løsning, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-løsning og 1 ml DTPA-lagerløsning til 81,5 ml PBS ved 7,2 pH, og til slutt tilsett 11 ml 10 % NP-40 til slutt for å bringe det endelige volumet til 100 ml.

2. Eksempel samling

MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om eksempelsamling, kan du se tidligere publiserte verk 15,22,40.

  1. Samle hele blodet
    1. Samle blod i heparinbelagte rør som foretrekker venøst over arterielt kar (med mindre det er spesifikt nødvendig) og foretrekker kateterplassering fremfor venepunksjon (om mulig) med kateter eller nålboring på minst 20 G eller større for å minimere hemolyse.
    2. Tilsett straks NO 2-blokkeringsløsningen (1 del av oppløsningen til 4 deler fullblod), prosess (avsnitt 3 eller 4), eller frys og oppbevar ved -80 °C.
  2. Samle plasma og røde blodlegemer (RBCer)
    1. Samle blod i heparinbelagte rør som foretrekker venøst over arterielt blod (med mindre det er spesifikt nødvendig) og nåler på minst 20 G eller større for å minimere hemolyse og sentrifugering umiddelbart i 5 minutter ved 4000 x g ved 4 °C.
    2. Bland supernatanten (plasma) med NO 2-blokkerende oppløsning (1 del av oppløsningen til 4 deler av supernatanten) i et nytt rør og en ny prosess (avsnitt 3 eller 4), eller frys og oppbevar den ved -80 °C.
      MERK: For NO-forbruksanalysen kan ikke NO 2-blokkeringsløsningen brukes. Analysen kan utføres uten plasmaforbehandling.
    3. Resuspend RBC pellet fra bunnen til et nytt rør ferdigfylt med S-NO stabiliseringsløsning (se trinn 1.4) (1 ml pellet til 9 ml løsning) og inkubere i 5 min.
    4. Send RBC-lysatet i en størrelseskolonne med G-25 Sephadex-polymer som tidligere har blitt skyllet med ddH2O for eksklusjonskromatografi
    5. Samle Hb-fraksjonen for å behandle (avsnitt 4) og for å måle Hb-konsentrasjonen ved hjelp av Drabkins reagens (for Hb-måling, se tidligere publisert arbeid22).
      MERK: For å forberede og prøve et bestemt vev/organ, identifiser hilumen og isoler den kirurgisk. Øk venen, punkter arterien, og injiser med heparinisert saltvann (10 U / ml) via arterien. Sluk vevet når saltvann begynner å tilbakeløpe ved venøs snitt. Homogeniser vevet med en mekanisk homogenisator mens du tilsetter 1 del av NO 2-blokkerende løsning til 4 deler homogenisert vev.

3. VCl3 i HCl analyse forberedelse

MERK: For mer informasjon om VCl3 i HCl analyse forberedelse, se tidligere publiserte verk37,41.

FORSIKTIG: CLD-en vil bli skadet hvis NaOH-fellen ikke er riktig på plass når du utfører denne analysen. Dette skyldes korrosjonen til HCl.

  1. Klargjøre standardløsninger for NO3- for standardkurve
    1. Løs opp 85 mg NaNO3 i 10 ml ddH2O for å oppnå 0,1 M NaNO3- (denne løsningen forblir stabil i noen uker).
    2. Bruk lagerløsningen til å forberede standarder ved fortynning i ddH2O for å oppnå konsentrasjoner på 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3 for å utføre en kalibreringskurve for plasma- eller urinprøver (bruk lavere konsentrasjoner hvis du arbeider med cellekulturer).
  2. Klargjør VCl3 (vanadiumklorid) mettet oppløsning for NO 3-reduksjon i rensebeholderen
    FORSIKTIG: Reaksjonen av vann og VCl3 er eksotermisk. Vær oppmerksom på høy glassvaretemperatur når du tilsetter syre og når du skyller glasset på slutten av eksperimentet.
    1. Løs opp 1,6 g VCl3 i 200 ml 1 M HCl ved først å legge til VCl3 i en ren kolbe og deretter legge til 200 ml 1 M HCl.
    2. Støvsug oppløsningen gjennom filterpapir (for eksempel 11 μm filterpapir, men eventuelt filterpapir kan brukes).
      MERK: Den filtrerte oppløsningen skal dreies for å fjerne blått, mens den ufiltrerte VCl3-oppløsningen er brun på grunn av uløste partikler.
    3. Hold den mettede løsningen dekket med enten aluminiumsfolie eller polytetrafluoretylen (PTFE) tape da forbindelsen er lysfølsom.
  3. Forbered det sirkulerende vannbadet
    1. Koble en sirkulerende vannbadeenhet til vannkappen på rensebeholderen. Pass på at linjene er tørre før påfylling.
    2. Start vannbadet ved 95 °C og kontroller fraværet av lekkasjer på vannledningene ved å påføre (ikke-sammenhengende) papirhåndklær rundt linjene.
  4. Sett opp gassboblefellen
    1. Kontroller at PTFE-hylsen på bobleren er på plass og at den ikke er skadet.
    2. Åpne gassboblen og injiser 15 ml 1 M NaOH i boblebasen.
    3. Omplasser gassboblen og forsegle tilkoblingen tett ved å trykke bunnen mot toppen og vri de to delene litt. Umuligheten av å dreie toppen av bobleren uten å bruke kraft indikerer en riktig forsegling.
    4. Koble utløpet av rensebeholderen til innløpet til gassboblefellen.

4. I3- i acetisk syre analysepreparat

MERK: For mer informasjon om jeg 3-i eddiksyre analyse forberedelse, se tidligere publiserte verk 15,22,38,41,42.

  1. Forbered standardkurve for NO2-
    1. Forbered en lagerløsning ved å oppløse 69 mg natriumnitritt (NaNO2) i 10 ml ddH2O for å oppnå 100 mM oppløsning. Denne løsningen er stabil hvis den lagres i en lufttett beholder, nedkjølt og beskyttet mot lys.
    2. Fortynn lagerløsningen i 1,5 ml mikrosentrifugerør ferdigfylt med 900 μL ddH2O: Tilsett 100 μL av lagerløsningen til det første sentrifugerøret, bland, merk og bruk 100 μL av røret for det andre røret, og gjenta deretter resulterer i 10 mM, 1 mM, deretter 100 μL av røret.
    3. Fortynn ytterligere med ddH2O for å oppnå 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM og 500 nM NaNO2 aliquots som skal brukes i kalibreringskurven.
  2. Forbered I 3-i eddiksyre til rensebeholderen (kan lagres ved romtemperatur (RT) i 1 uke)22
    1. Tilsett 2 g kaliumjodid (KI) og 1,3 g jod (I2) til 40 ml ddH2O og 140 ml eddiksyre.
    2. Bland grundig ved å røre blandingen i minst 30 min.
  3. Klargjør prøvene for differensialbestemmelse av NO2-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, hvis Hb samles inn) og jern-nitrosylkomplekser (Hb-NO hvis Hb samles inn) (figur 3)
    1. Del hver prøve i 3 aliquots på 270 μL (900 μL Hb hvis du måler S-NO-Hb og Hb-NO) i lysbeskyttede mikrosenter, 2 av dem ferdigfylt med 30 μL 1x PBS (100 μL hvis du måler S-NO-Hb og Hb-NO) og det tredje røret med 30 μL HgCl2 (100 μL hvis du måler S-NO-Hb og Hb-NO), virvel og inkubere ved RT i 2 min (figur 3).
    2. Tilsett 30 μL 5% AS i prøven med HgCl2 for å måle Fe-NOs, (100 μL for Hb-NO) og til en med ekstra PBS for å måle S-NOer og Fe-NOer (100 μL for S-NO-Hb og Hb-NO) og tilsett 30 μL PBS til den tredje som allerede er ferdigfylt med 1x PBS for å måle NO2-, S-NOs og Fe-NOs (100 μL for rest NO2- fra Hb-kolleksjon , S-NO og Hb-NO). Virvel og inkuber ved RT i 3 min (figur 3).

5. INGEN forbruk etter cellefritt Hb-oppsett

MERK: Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se det tidligere publiserte arbeidet38.

  1. Forbered standard oxyHb-løsninger fra en renset Hb-løsning med en kjent konsentrasjon
    1. Fortynn lagerløsningen seriell i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved tilsetning av ddH2O for å oppnå løsningene som skal brukes til kalibreringskurven: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Klargjøre DETA-NONOate-løsningen
    1. Tilsett 10 mg DETA-NONOate til 610 μL 10 μM NaOH i pH 7,4 PBS for å generere 100 mM DETA-NONOate og hold det på is.

6. Start chemiluminescence detector (CLD) og klargjør rensebeholderen

MERK: For utarbeidelse av rensefartøyet, se det tidligere publiserte arbeidet43.

  1. Kontroller hovedtilkoblingene til og fra CLD
    1. Koble oksygenledningen til CLD og åpne oksygentanken ved et trykk som er i samsvar med CLD-produsenten.
    2. Kontroller at filterlinjen intense felt dielektriske (IFD) er koblet til CLD, men ikke til rensebeholderen eller NaOH-fellen
  2. Starte CLD
    1. I CLD-grensesnittet begynner du å kjøre deteksjonsprogrammet for væskefaseanalyser.
    2. Kontroller at oksygentilførselen er tilstrekkelig. Hvis dette er tilfelle, vil CLD starte prøvetaking fra innløpet og indikere deteksjon med et signal i millivolt (0-5 mV). Ellers vil CLD be om et negativt diagnosesignal.
  3. Forbered rensefartøyet
    1. Lukk rensebeholderen på alle tre portene: Skru nåleventilen helt til høyre, lukk innløps- og utløpsstoppene.
    2. Fjern hetten fra rensebeholderen og tilsett tilstrekkelig mengde reagens som er spesifikk for den planlagte analysen, til reaksjonskammeret (tabell 1) slik at sprøytenålen som brukes til å injisere prøvene, kan nå væskekolonnen.
    3. Kontroller at det finnes en stabil ønsket grunnlinje (tabell 1).
  4. Start rensegassstrømmen
    1. Påse at den inert gastanken (f.eks. N2) er utstyrt med en totrinns regulator og koble den inert gastanken til gassinntaket på fartøyet.
    2. Åpne gassen med et utløpstrykk ved regulatoren på 1-5 psi, åpne innløpet til rensebeholderen og åpne sakte nåleventilen til rensebeholderen for å tillate tilstrømning av gass. Kontroller bobler i rensebeholderen.
  5. Juster gassstrømmen
    1. Registrer celletrykket målt ved CLD med IFD-filterlinjens prøvetaking av omgivelsesluft.
    2. Flytt hetten på rensebeholderen, koble IFD-filterlinjen til rensebeholderen (eller til NaOH-fellen i VCl3 i HCl-analysen), og åpne utløpet av rensebeholderen.
    3. Bruk nåleventilen til å nå samme celletrykk på CLD-nivå som registreres i omgivelsesluft.

7. Eksperimentere

MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om eksperimentet, kan du se det tidligere publiserte arbeidet43.

  1. Start chemiluminescence signalanskaffelsesprogrammet
    1. Koble den serielle porten til CLD-en til datamaskinens serielle port som anskaffelsesprogrammet er installert på.
    2. Kjør analyseprogrammet.
    3. Klikk på Hent, velg mappen for å lagre .data-filen, skriv inn filnavnet, og klikk på Lagre.
      MERK: Legg merke til den forhåndsinnstilte kjøretiden på skjermen, da opptaket stopper automatisk når den forhåndsinnstilte tiden går. Om nødvendig kan den forhåndsinnstilte kjøretiden økes.
  2. Forbered deg på gjentatte prøveinjeksjoner
    1. Juster spenningsskalaen på skjermen for å ha kontroll over den målrettede grunnlinjen ved å klikke på Minimums- og/eller Maksimum-knappene og deretter angi ønsket verdi.
    2. Ha et rør på 20 eller 50 ml fylt med ddH2O for å skylle sprøyten mellom prøvene.
    3. Ha en eske med delikate oppgaveservietter lett tilgjengelig.
  3. Prøveinjeksjon
    MERK: Start fra standardløsningene for kalibreringskurven (injiser fra de minst konsentrerte til de mest konsentrerte prøvene), og fortsett deretter til eksperimentprøvene (vurder å gjøre det i duplikater eller triplikater).
    1. Skyll sprøyten minst to ganger eller mer med ddH2O før du trekker ut hver prøve (og etter hver injeksjon) og kontroller hver gang uhindret vannutkast på en oppgaveserviett.
    2. Sett sprøyten inn i prøverøret mens du holder både sprøyten og røret på kort avstand, trekk stempelet opp til ønsket volum samtidig som du sikrer at ingen luftbobler og/eller ikke-homogeniserte faste deler er fanget.
    3. Rengjør spissen av sprøyten med en oppgavevisker, sett deretter sprøyten inn i septahetten ved injeksjonsporten og injiser etter å ha kontrollert at spissen av sprøyten er innenfor væskefasen i reaksjonskammeret.
  4. Merk injeksjonen i programmet og vent
    1. Kontroller at injeksjonen fører til en oppadgående endring i signalet (Tilleggs figur 1) (nedover i NO-forbruket etter cellefri Hb-analyse) og skriv inn prøvenavnet ved å klikke på den grå boksen under Prøvenavn, og klikk deretter på Mark Injection.
      MERK: Mistenker sprøyteobstruksjon hvis prøveinjeksjonen ikke genererer et signal.
    2. Vent til det elektriske signalet når baseline igjen (dette tar vanligvis 3-4 min). Denne gangen kan brukes til å utføre trinn 7.3.1.
  5. Gjenta alle trinnene som er angitt i trinn 7.3 og 7.4 under og etter hver injeksjon til slutten av eksperimentet. Husk å kjøre en prøve av bevaringsløsningen (hvis den brukes)
  6. Stopp eksperimentet
    1. Klikk på STOP for å avbryte signalanskaffelsen, stopp CLD og slå av vannbadet (hvis NO3- måles).
    2. Avbryt gassstrømmen, åpne nåleventilen, fjern hetten fra rensebeholderen, legg en avfallsbeholder under avløpet og åpne dreneringsstoppcocken.
      MERK: Hvis eksperimentet krever datainnsamling i mer enn 60 minutter, er det nødvendig å starte oppkjøpet på nytt etter 60 min kjøretid (gjenta trinn 7.1.3) og lage en ny fil.

8. Målinger og beregninger

MERK: Målinger og beregninger gjøres offline og kan utføres på et annet tidspunkt.

  1. Start chemiluminescence-anskaffelsesprogrammet for offline dataanalyse
    1. Start programmet og klikk på Prosess.
    2. Velg eksperimentfilen, og klikk deretter på Åpne.
  2. Beregn området under kurven for hver administrasjon
    1. Programvaren grafer automatisk på skjermen grunnlinjen (Supplerende figur 2A, horisontal gul linje) og toppaksen for hver bølge generert av hver prøveadministrasjon (vertikale gule linjer): bekreft riktig posisjon (eller juster ved å klikke på hver linje og flytte den med musen eller pilene) og klikk på Threshold OK (Supplemental Figure 2B).
      MERK: I NO-forbruket ved cellefri Hb-måleanalyse klarer ikke programvaren vanligvis å fange opp bølgeformen som genereres ved prøveinjeksjon på riktig måte. Ved å zoome på hver bølgeform kan operatøren enkelt hjelpe programvaren i områdeberegningen (Tilleggs figur 2).
    2. Programvaren grafer automatisk begynnelsen (vertikal grønn linje) og slutten (vertikal rød linje) av hver topp forårsaket av hver prøveadministrasjon: bekreft riktig posisjon (eller juster ved å klikke på hver linje og flytte den med musen eller pilene) og klikk på Integrer (Supplerende figur 2C).
      MERK: Noen områder i sporet kan feilaktig defineres som injeksjoner på dette tidspunktet, og noen topper kan telles automatisk to ganger. Begge feilene kan identifiseres på nytt og fjernes i trinn 8.2.2
    3. Programvaren samsvarer automatisk med hvert signalområde etter en injeksjon merket under eksperimentet og det tildelte navnet: naviger hver topp (angitt av en gul vertikal linje) med det tildelte navnet ved å klikke på Next Peak og Previous Peak, og klikk deretter på knappen All OK for endelig å få beregningen for alle områder på skjermen.
    4. For å korrigere alle navngivnings- eller samsvarsfeil som er gjort av brukeren eller av programmet, bruk etter behov knappene som er angitt i Tilleggsfil 1.
  3. Overføre kalibreringskurveverdiene til et regneark og generere en lineær regresjonsligning (supplerende figur 3)
    1. Overfør dataene fra CLD-programmet til et nytt regneark ved hjelp av kopier og lim inn. Ordne de to kolonnene i dataarket som Eksempelkonsentrasjon og Areal Under kurven, og legg til en samsvarende verdi på null i begge kolonnene.
    2. Merk de to kolonnene, klikk Sett inn > punkt, og velg deretter Legg til diagramelement på Diagramutforming-menyen > Trendlinje > Lineær.
    3. Høyreklikk på den genererte trendlinjen, klikk på Formater trendlinje, klikk deretter alternativene Vis formler på diagram og Vis R-kvadrert verdi på diagram på Format Trendline-menyen for å få en enkel lineær kalibreringsligning.
  4. Overfør det beregnede området i hver prøve for å beregne konsentrasjonen (supplerende figur 3)
    1. Rapporter alle verdier i regnearket. I neste kolonne, bruk ligningen oppnådd fra trinn 8.3.3 for å oppnå konsentrasjonen av hver injisert prøve, hvor y er konsentrasjonen (verdien av den nye kolonnen) og x er området under kurven målt etter injeksjon.
      MERK: Husk å ta hensyn til konsentrasjonen målt i bevaringsløsningen (hvis den brukes) og trekk fra verdiene tilsvarende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NO-forbruket ved cellefri Hb-analyse ble brukt i prøver som inneholder kjente konsentrasjoner av cellefri oksyHb (figur 4). Som en heme av oksyHb stoichiometrisk frigjør ett NO-molekyl i analysen, brukes renset cellefri oksyHb til å bygge kalibreringskurven for analysen (Supplerende figur 3).

Doseresponsforholdet mellom cellefri Hb (målt med en kolorimetrisk analyse) og INGEN forbruk hos pasienter som kommer ut av hjerte- og lunge bypass (CPB) under hjertekirurgi er vist i figur 5. Det kan antas at etter CPB er det en høyere konsentrasjon av heme-grupper i Hb-Fe2 +-O2-status (figur 5, rød) sammenlignet med pasienter som får NEI under CPB, hvorav bare et mindretall av heme-gruppene av cellefri Hb bruker NEI (figur 5, grønn).

Protokollen for å vurdere NO-forbruk ved cellefri Hb ble tidligere brukt til å teste plasmaprøver fra 50 pasienter som gjennomgår hjertekirurgi og krever CPB. Blod ble samlet inn ved baseline og 15 min, 4 timer og 12 timer etter CPB. Hensikten med studien var å undersøke det eksisterende forholdet mellom både lunge- og systemisk vaskulær resistens og økningen i hemolyse observert etter CPB. Cellefri Hb-konsentrasjon ble vurdert med en hb kolorimetrisk analyse. Hemolyse nådde 15 minutter etter CPB. Den akkumulerte frie Hb ble sakte eliminert fra plasma innen 12 timer18 (figur 6A). Ingen forbruk nådde i stedet 15 min og nådde opprinnelige verdier på bare 4 t (figur 6B). Lineære regresjonskurver av NO-forbruk ved cellefri Hb viste et stoichiometrisk forhold ved tidspunktet 15 min etter CPB i motsetning til baseline, 4 t og 12 t etter CPB (figur 6C). Forklaringen på den observerte forskjellen i kinetikk ligger i overflod av nylig utgitt fri Hb som ennå ikke har møtt INGEN molekyler som frigjøres av pasientens endotel. Konsentrasjonen av oksyHb (scavenging NO og resulterer i forbruk i analysen) var faktisk høyere på 15 min enn på noe annet tidspunkt. Plasma samlet ved baseline og på andre tidspunkter hadde en relativt høyere komponent av metHb, som allerede hadde blitt oksidert av NO, binder ikke NEI, og forårsaket ikke forbruk i analysen. Lunge- og systemiske vaskulære resistenser ble målt invasivt og nådde en topp på 15 min. For første gang i denne spesifikke pasientpopulasjonen ble DET IKKE observert noe forbruk av fri Hb for å være timelig kombinert med vasokonstriksjon, som bekreftet tidligere observasjoner i dyremodeller og hos pasienter med sigdcellesykdom18.

Administrering av INGEN gass under CPB og etter operasjonen øker den relative mengden sirkulerende metHb vs. oxyHb. Når pasienter som gjennomgår hjertekirurgi ble behandlet med NO-gass intraoperativt og postoperativt, ble den observerte økningen av fri Hb etter CPB (figur 7A) ikke kombinert med noen økning i NO-forbruket, målt med den nevnte protokollen (figur 7B). Den eksogent administrerte NO-gassen omdanner de fleste oksyHb til metHb, som igjen ikke scavenge NO in vivo eller bruker INGEN in vitro (upubliserte data).

Figure 4
Figur 4: Nitrogenoksidforbruk ved renset cellefritt oksyhemoglobin. Nitrogenoksidforbruksanalyse utført ved å injisere prøver av kjente konsentrasjoner av renset cellefritt oksyhemoglobin. Regresjonslinjen vises i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Nitrogenoksidforbruk og cellefri hemoglobinkonsentrasjon fra pasienter som gjennomgår hjertekirurgi med kardiopulmonal bypass. Hver pasients cellefrie hemoglobinnivå, målt med et kolorimetrisk sett, ble plottet inn med nitrogenoksidforbruket (NO) målt gjennom chemiluminescens. Blodprøver ble trukket 15 min etter slutten av CPB. Regresjonslinjer vises for hjertekirurgiske pasienter som ikke får (i rødt) eller får (i grønt) NEI under kardiopulmonal bypass (CPB). Hemoglobin uttrykkes i μM av hemegrupper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Nitrogenoksidforbruk og cellefritt hemoglobin hos hjertekirurgiske pasienter. (A) Cellefri hemoglobin (Hb) konsentrasjon i plasma av pasienter som gjennomgår hjertekirurgi med hjerte-lunge bypass (CPB) (N = 50) ble bestemt på forskjellige tidspunkter ved bruk av et kommersielt tilgjengelig kolorimetrisk bestemmelsessett. Data ble analysert ved å tilpasse en blandet modell med bevis på en fast effekt mellom tidspunkter. Plasmakonsentrasjon på forskjellige tidspunkter ble sammenlignet med baseline med Tukeys multippel sammenligningstest. (B) Nitrogenoksid (NO) forbruk ved plasma hentet fra de samme prøvene som brukes til kvantifisering av gratis Hb. Data ble analysert ved å tilpasse en blandet modell med bevis på en fast effekt mellom tidspunkter. Plasmakonsentrasjon på ulike tidspunkter ble sammenlignet med baseline med Dunnetts multippel sammenligningstest. (C) Regresjonslinjer for cellefritt Hb plasmainnhold matchet med NO-forbruk. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns ikke signifikant. Data presenteres som median ± interkvartilt område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Effekter av administrasjon av nitrogenoksidgass på nitrogenoksidforbruk hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi. (A) Cellefri hemoglobinkonsentrasjon i plasma av pasienter som gjennomgår hjertekirurgi med hjerte-lunge-bypass (CPB) som enten har fått placebo (N = 28) eller nitrogenoksid (NO) gass (N = 22) i 24 timer siden begynnelsen av CPB. Konsentrasjonen ble bestemt på forskjellige tidspunkter ved bruk av et kommersielt tilgjengelig kolorimetrisk sett. Data ble analysert av Friedmans test, noe som indikerer tilstedeværelsen av en effekt mellom tidspunkter i begge gruppene. Plasmakonsentrasjon på ulike tidspunkter ble sammenlignet med baseline med Dunns multippel sammenligningstest. (B) INGEN forbruk ved plasma hentet fra de samme prøvene som brukes til kvantifisering av cellefri Hb. Data ble analysert av Friedmans test, noe som indikerer tilstedeværelsen av en effekt mellom tidspunkter i begge gruppene. Plasmakonsentrasjon på ulike tidspunkter ble sammenlignet med baseline med Dunns multippel sammenligningstest. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Data presenteres som median ± interkvartilt område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analyse Reagensblanding Opprinnelig plan for mål (mV)
VCl3 i HCl 5 ml VCl3 i HCl mettet oppløsning + 100 μL antifoammiddel 0–5 mV*
I3– i eddiksyre 5–7 ml I3– reagens 0–5 mV*
IKKE forbruk etter cellefritt Hemoglobin 5–7 ml PBS ved pH 7,4 + 100 μL antifoammiddel + 20 μL utvidet DETA-NONOate-oppløsning 70–100 mV**
* Ideell verdi: baseline kan være høyere på grunn av kvaliteten på luften i eksperimentmiljøet
**sørg for stabilitet i 20 minutter før du starter eksperimentet.

Tabell 1: Rens fartøyets reagenssammensetning og mål baseline for ulike chemiluminescence-analyser. Rensefartøyets reagenssammensetning for hver beskrevne analyse. NEI = Nitrogenoksid; PBS = Fosfatbuffer saltvann; DETA-NONOate: (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat. * Ideell verdi: baseline kan være høyere på grunn av kvaliteten på luften i eksperimentmiljøet. **sørg for stabilitet i 20 minutter før du starter eksperimentet. For å utføre NO-forbruksanalysen, bør vekten endres på programvaren for å fange opp verdier mellom 70 mV og 100 mV (f.eks. 0-100 mV), som er den målrettede grunnlinjespenningen. Denne justeringen foreslås å ha full kontroll over prøveinjeksjonen, noe som gjør det mulig å dokumentere signalet som beveger seg fra baseline etter injeksjonen av en prøve og for å observere signalet som går tilbake til baseline. Dataregistrering påvirkes ikke av eller begrenses ikke til den visualiserte skalaen.

Supplerende figur 1: Topper etter INGEN deteksjon i VCl3 i HCl-analysen. Toppene som følger prøveadministrasjon i VCl3 i HCl, vises på CLD-pakkeprogramvaren. Beregning av området under toppen for hver injeksjon er vist for enkelhets skyld og forklart i supplerende figur 2. I dette eksperimentet har standarder for ulike konsentrasjoner blitt administrert for kalibreringskurven, etterfulgt av plasmaprøver. Fortynning er en nyttig løsning for å beregne metabolitter fra prøver som gir NEI i den høye enden eller til og med utenfor kalibreringskurven. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Brukerassistert automatisert beregning av området under toppen. Når du utfører NO-forbruksanalysen ved cellefritt hemoglobin, kan det være nødvendig å sette topper manuelt for å gi programvaren de mest presise grensene for å måle området under toppen som genereres av hver prøveinjeksjon. (A) Representativ full oversikt over et innspilt eksperiment. Det nås ved å klikke på Prosess i hovedmenyen og ved å velge og åpne den innspilte filen av interesse. Den gule linjen representerer signalterskelen (mV) som utgjør det rette segmentet av området under toppen. Ved å klikke på den, kan brukeren dra den mot signalområdet. X- og y-aksen kan endres for å zoome på toppen av interesse for nøyaktig måling ved å klikke på knappene nederst til venstre eller ved å skrive inn ønsket minimums- og maksimumsverdi for hver av dem. (B) Terskelposisjonering. Brukeren kan velge den optimale grunnlinjeterskelen ved å dra den gule linjen til signalmidtpunktet rett før signalet downslide forårsaket av prøveinjeksjonen. For å fortsette å begrense området, skal brukeren klikke på Angi topper manuelt-knappen . (C) Plassering av start- og sluttmarkører. Ved å klikke på Angi startmarkør-knappen vises en grønn linje på skjermen. Den grønne linjen skal plasseres (ved å dra og slippe) helt i begynnelsen av downslide forårsaket av prøveinjeksjonen. Den samme knappen endrer etiketten til Angi sluttmarkør ved å klikke på hvilken rød linje som vises på skjermen. Den røde linjen skal plasseres på det punktet hvor signalet når grunnlinjen igjen etter avbøyningen forårsaket av NO-forbruk fra den injiserte prøven. Til sammen skisserer terskellinjen (gul, B), den grønne linjen og den røde linjen nøyaktig området som genereres av prøveinjeksjonen. (D) Gi området under toppen. Ved å klikke på Integrer-knappen (C) vises det beregnede området under toppen øverst til høyre på skjermen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Representativt regneark med kalibreringskurve og resultater. De beregnede områdene under toppene generert fra nitrogenoksid (NO) forbruk ved injeksjon av prøver med en kjent konsentrasjon av cellefri hemoglobin (uttrykt som [μM] av heme) vises øverst til venstre (på gul bakgrunn). Verdiene er plottet inn for å bygge kalibreringskurven og den resulterende lineære ligningen y = mx + q. Hellingen (m) er antall oxyHb heme grupper (μM) som kreves for å redusere signalet som oppdages av fotomultiplierrøret med 1 mV. Beregnede verdier fra triplikatinjeksjoner (Kjør N 1,2,3) av prøver fra en pasient oppnådd ved fire forskjellige tidspunkter (merket med forskjellige bakgrunnsfarger) ble lagt inn i regnearket. Gjennomsnittet av hvert triplikat ble brukt til å gi verdien av NO-forbruk forårsaket av hvert utvalg ved å løse den lineære ligningen: Klikk her for å laste ned denne filen.

Equation 1

Tilleggsfil 1: Gjennomgang av toppene ved hjelp av den medfølgende programvaren. Denne filen inneholder et skjermbilde tatt fra den medfølgende programvaren og handlingene som er tillatt for hver knapp. For hver topp (inkludert falske topper forårsaket av artefakter) kan brukeren bruke knappene som er angitt i filen, til å bekrefte, ignorere eller slette, eller gi navn til en bestemt topp etter behov. Brukeren kan også registrere en topp som ikke ble oppdaget tidligere. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av den høye følsomheten har chemiluminescensbaserte analyser for bestemmelse av NO og relaterte forbindelser en høy risiko for NO 2-forurensning. Hvert reagens (spesielt NO 2-blokkerende løsning) og fortynningsmiddel (inkludert ddH2O) som brukes i eksperimentet, bør testes for no 2-innhold for å korrigere for bakgrunnssignal. Nitritt er ekstremt reaktiv med en halveringstid i fullblod rundt 10 min og genererer raskt NO3-. Tiden som går mellom blodinnsamling og sentrifugering, eller NO 2-blokkering, kan derfor forårsake preanalytiske feil og bør minimeres15. I en analyse ved hjelp av plasmaprøver, samle blod fortrinnsvis i heparinrør og sentrifuge ved 750 x g i 5 min ved 4 °C etter tiolgruppeblokade med 40 μL 200 nM NEM produsert ved å oppløse 250 mg NEM i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Lagerløsningen kan lagres ved 4 °C. Forbindelser som nitroarginin, nitroprusside og nitroglyserin som hemmer NO-syntase (NOS) gjennomgår langsom ikke-kvantitativ konvertering til NEI, noe som resulterer i en grunnlinjehøyde. Hvis bruk av NOS-hemmere er en del av undersøkelsen, anbefales det at blokkere som ikke inneholder nitrogrupper, brukes43. Innløpstrykket i rensebeholderen skal samsvare med det kontinuerlige negative trykket fra CLD for prøvetaking. Hvis innløpstrykket er lavt, kan vakuumdestillasjonen av mediet føre til forurensende gassrenselinjer og kamre, noe som resulterer i signalforvrengning. Videre kan små mengder luft komme inn i rensefartøyet og reagere med løsningen for å generere overdreven NEI. Tvert imot kan for høyt trykk forårsaket av en strømningshastighet som er høyere enn prøveuttaksstrømmen frigjøre NEI inn i atmosfæren som fører til en underestimering av signalet15. I tillegg krever både VCl3 i HCl og I3- i eddiksyreprotokoll flere fortynninger under tilberedning og flere beregninger for å gi prøvekonsentrasjon. Hvert trinn bør registreres nøye, da fortynninger og beregninger gjenkjennes av mange grupper som hovedkilden til feil44.

Tilsetning av NO 2-blokkerende løsning (trinn 2.1.2) fører til at røde blodlegemer lyser, og reduserer all OxyHb til MetHb. Det unngår rask reduksjon av jernholdige proteiner (primært OxyHb) ved NO2- med påfølgende generasjon NO3-. Behandling av prøver med denne oppløsningen ved innsamling er nødvendig for å måle NO2- og/eller NO 3-riktig. Løsningen bør derimot ikke brukes ved planlegging av NO-forbruket ved cellefri Hb-analyse. Aliquots av NO 2-blokkeringsløsningen skal lagres sammen med prøvene og brukes til å fjerne den delen av signalet forårsaket av selve løsningen. Til slutt bør fortynningsfaktorene tas i betraktning for beregning av den endelige konsentrasjonen av den målte metabolitten. I I3- i eddiksyreanalyse oppnås NO 2-konsentrasjonen ved å trekke konsentrasjonen av aliquoten som inneholder AS uten HgCl2 (S-NO og Fe-NO) fra aliquot som bare inneholder PBS (NO2-, S-NO, Fe-NO). For å beregne konsentrasjonen av S-NO (kvikksølv-labile proteiner), bør konsentrasjonen av aliquot behandlet med AS med HgCl2 (Fe-NOs eller kvikksølv-stabile nitroso-proteiner) trekkes fra aliquot behandlet med AS uten HgCl2. Før fratrukket, bør brukeren huske å multiplisere hver aliquot konsentrasjon med 0,8181 (270/330) for å ta hensyn til fortynningsfaktoren som brukes under prøvepreparater (figur 3). Det samme konseptet gjelder for S-NO-Hb og Hb-NO måling, der absolutte konsentrasjoner er en brøkdel av målt Hb22. Avhengig av type prøve, kan en presis telling av NO 3-konsentrasjonen kreve å kjøre både VCl3 i HCl-protokollen og I 3-i eddiksyreprotokollen for endelig å trekke konsentrasjonen av NO2- fra NO3- og NO2-. Dette er ikke alltid nødvendig i fullblods- og plasmaprøver, for eksempel der NO3- vanligvis langt overstiger NO2-.

Det er svært viktig å minne om at CLD vil bli skadet hvis NaOH-fellen ikke er på riktig sted når du utfører en VCl3 i HCl-analyse på grunn av korrosjonen til HCl. 1 M NaOH-løsningen som brukes til å fylle NaOH-fellen, kan kjøpes eller tilberedes enten ved å oppløse 4 g NaOH-salt i 100 ml ddH2O eller ved å fortynne 5 ml 50 % NaOH i 100 ml ddH2O. Når det fortynnes ytterligere til 10 μM med ddH2O, er NaOH veldig nyttig for å fjerne proteinrester ved injeksjon i rensebeholderen.

Basislinjesignalet som CLD oppdaget, skal være stabilt og innenfor 0-5 mV. Et høyere basissignal kan være forårsaket av luftforurensning (av NO og derivater), og dette kan verifiseres ved å la innløpet stå i friluft. Hvis en høyere spenning bare observeres i rensebeholderen, mens forurensning av tanken med inert gass bør vurderes, er det oftest på grunn av utholdenheten til organiske rester eller tilstedeværelsen av NO2- i røret. Vasking av rensebeholderen flere ganger med ddH2O kan bidra til å minimere grunnspenningen. Hvis det ikke lykkes, bidrar inkubasjonen av rensebeholderen med 100 mM NaOH i 24-48 timer etterfulgt av flere vasker med ddH2O til å eliminere miljøgifter. I NO-forbruket ved cellefri Hb-analyse er det nødvendige CLD-signalet 70-100 mV i minst 20-30 minutter. Hvis signalet ikke er stabilt (dvs. spenningsreduksjoner), kan en ekstra dose på 10 μL DETA NONOate legges til rensebeholderen. Dette kan gjentas etter behov. Det er viktig å huske at både ubrukt pulver og allerede utvidet DETA NONOate skal holdes ved -80 °C. Dette reagenset forfaller raskt til tross for optimal lagring og kanskje underpresterer når det ikke er ferskt forberedt, krever flere injeksjoner i rensebeholderen og fører til et mindre stabilt isoelektrisk signal. Enda viktigere er at den bør utvides i PBS med pH 7.4, da dette optimaliserer halveringstiden (56 timer ved pH 7,4 ved romtemperatur vs. kvasi-øyeblikkelig dissosiasjon ved pH på 5,0)45. Sprøyten som brukes til injeksjon av DETA NONOate bør utelukkende være dedikert til den handlingen og ikke brukes til injeksjon av prøver.

Hvis injeksjonen av en prøve genererer en topp som er høyere enn det øvre punktet i kalibreringskurven, spesielt hvis den genererer en spenning som er høyere enn 700 mv, anbefales det å fortynne prøven (2x eller 4x) for å minimere feil. Dette gjelder også NO-forbruksanalysen hvis fallet forårsaket av prøveinjeksjon er dypere enn den som skyldes injeksjonen av den mest konsentrerte prøven som brukes i kalibreringskurven. Beviset på en topp (eller en gjennom) i signal etter injeksjon som er mindre enn forventet eller fraværende, kan indikere tilstopping av presisjonssprøyten som brukes til injeksjon. På grunn av de små volumene som brukes (10-20 μL/ prøve), spesielt hvis plasma- eller urinanalyser utføres, kan det være vanskelig å skille mellom en fylt sprøyte og fraværet av prøven på grunn av tilstopping av sprøyten. Det anbefales å være oppmerksom på stempelets motstand. Etter bekreftelse ved inspeksjon av sprøyten, kan fjerning av hindringen forsøkes ved gjentatte ganger å vaske sprøyten med ddH2O og ved å gni sprøyten på en delikat oppgaveserviett hvis hindringen er eksternt synlig. Når du er i tvil, anbefales det å løse ut prøvevolumet på en oppgaveserviett og gå tilbake for å vaske sprøyten med ddH2O og prøve å gjenta prøveadministrasjonen. Skumming er en vanlig komplikasjon og tvinger eksperimentet til å avsluttes når høyden på væskekolonnen overstiger reaksjonskolonnen, noe som forårsaker signal ustabilitet. Overskridelse av antifoamingmiddeldosen som er angitt i protokollen, kan føre til en økning i basislinjesignalet og bør unngås. Antall prøver som forårsaker dannelsen av overdreven skumming blir forutsigbart når gjentatte analyser utføres, et fenomen som bør informere hvordan eksperimentet kan planlegges optimalt. Et valgfritt trinn for å redusere skumming er å blande plasma eller vev supernatant med kald metanol (forhold 1:1) og sentrifuge i 15 min, 13000 x g ved 4 °C. Det bør vurderes at metanol får proteiner til å utfelle. Bare lette S-NOer og Fe-NOer som ikke er proteiske i naturen måles. Dermed kan dette alternativet ikke vedtas i studier på fullblod eller i noe annet tilfelle der det er interesse for S-NO og Fe-NO proteiner.

Flere reagensløsninger annet enn VCl3 i HCl og I 3-i eddiksyre har blitt beskrevet og vellykket vedtatt. Askorbinsyre reduserer spesifikt NO2-, reagerer ikke med NO3- eller S-NOs, og kan brukes til å redusere hoveddelen av injiserte prøver og beregninger i situasjoner der NO2- er det eneste molekylet av interesse. Den viktigste fallgruven er reagensets begrensede stabilitet, som krever hyppigere endringer i reagensløsningen og dermed gjentatte kalibreringer46. En analyse ved hjelp av karbonmonoksid og cuprous klorid (CuCl)-mettet cystein (3C-metode) kan spesifikt oppdage S-NOer med en følsomhet som kan sammenlignes med I 3-men likevel krever behandling med og uten HgCl2 for å unngå ikke-spesifikke reaksjoner47. For å oppnå høyere presisjon i signalanalyse registreres eksperimenter i .data-formatet slik at offline bølgeformanalyse kan fullføres med annen programvare enn buntprogrammet som vises i protokollen.

Når den første injeksjonen er gjort, kan eksperimentet ikke stoppes. Hvis det er behov for en pause og/eller hvis en tilstand endres (sammensetningen av rensekarmediet, rensegassstrømmen, grunnlinjespenningen), er eksperimentet kun gyldig for prøvene som injiseres frem til dette punktet. En ny standardkurve bør utføres før du måler flere prøver. Presisjonen tillatt av chemiluminescence-baserte analyser kommer med en pris. Analysene er tidkrevende av flere grunner: 1) automatisering er ikke mulig, da manuell prøveinjeksjon kreves i duplikater; 2) de fleste reagenser som brukes kan ikke lagres i lange perioder; 3) hvert eksperiment må startes ved å kjøre standardprøver ved kjente konsentrasjoner for kalibrering og kan ikke settes på pause med mindre kalibrering gjentas; 4) Hver prøve er delt inn i aliquots som inneholder forskjellige blandinger av reagenser for å blokkere spesifikke reaksjoner for endelig å beregne konsentrasjonen av spesifikke metabolitter ved å trekke fra andre.

Dette arbeidet er fokusert på enheten Zysense NOA 280i, som har en deteksjonsterskel på <1 ppb NO i gassfasen (tilsvarende opptil 1 pM NEI i væskefasen) og en prøvetakingsstrøm på 10-300 ml / min. Andre CLDer er tilgjengelige med et buntrørsystem for måling av metabolitter i væskefasen. Ecophysics CLDs har en høyere følsomhetsterskel, 1 ppb i sin mest følsomme modell, men fordelen med å ikke kreve en oksygentank for ozongenerering. På den annen side er deres rapporterte prøvetakingsstrøm 1000 ml / min, noe som innebærer et høyere forbruk av den inertgasstanken som brukes til rensebeholderen. Andre CLD-maskiner er dedikert til utåndet INGEN analyse for klinisk bruk.

Chemiluminescence er den mest følsomme og validerte metoden for å spesifikt vurdere NO-forbruk ved cellefri Hb innen hemolyse. Andre teknikker er tilgjengelige for å måle NO, NO2-, NO3-, S-NOs og kvikksølv-labile nitrosoforbindelser. Den direkte målingen av NO-gass kan oppnås enten ved chemiluminescens eller ved bruk av dedikerte elektroder som spenner fra måling av utåndet gass til encellede elektroder. Disse måler bare INGEN gass, er billigere (men mer forgjengelig), krever kalibrering oftere, og er mindre presise sammenlignet med en CLD31. Nitritter og NO3- har blitt historisk målt med Griess-reaksjonen, en kolorimetrisk teknikk som i sin opprinnelige versjon oppdager begge molekylene uten mulighet for å skille sin relative konsentrasjon i prøven. Moderne varianter av teknikken innebærer omvendt fasekromatografi som benytter separasjon av prøven i to kolonner, slik at to uavhengige reaksjoner med NO3- og NO2-. Følsomheten til disse metodene er mikromolar eller litt mindre, sammenlignet med 1 nM med CLD. De viktigste fallgruvene er tidsforbruk og inkompatibilitet med prøver forbehandlet med kvikksølv og/eller ferricyanid14. S-NOer kan påvises med kolorimetriske og fluorometriske teknikker samt med en følsomhet på opptil 0,5 μM sammenlignet med 100 fM beskrevet ved hjelp av chemiluminescens som vist i I 3-i eddiksyreprotokollen 14,41,42. Biotin-switch-analysen, til tross for at de ikke klarer å oppdage S-NOer i picomolar-serien, har fordelen av å generere biotinmerkede proteiner som kan renses og identifiseres med proteomisk analyse48. Når man ser nærmere på, deler hver teknikk en vanlig fallgruve, som er den ekstreme reaktiviteten til NO og dens derivater som mandikerer blokade av reaksjoner med det formål å in vitro-måling. Forbehandling av prøver er kritisk, og å svare på spørsmålet om en viss forbehandling helt blokkerer en reaksjon eller gjør det bedre enn en annen, har så langt vært en drivkraft mot en økning i metodologiske studier. Mens den ekstreme reaktivitet in vivo av NO har sikkert vært et pådriv for å undersøke sensitive metoder for påvisning av sine metabolitter, direkte måling av NO har møtt betydelig fremgang de siste tre tiårene siden den første amperometriske detektoren ble utviklet i 1990. Mer enn tjue forskjellige sonder har blitt beskrevet siden da, inkludert nanosensorer som brukes til å studere encellet NO-innhold49. Elektrokjemiske sensorer er de viktigste verktøyene som kan oppdage INGEN både in vivo og i sanntid. I lungemedisin har flere studier sammenlignet elektrodebaserte maskiner med CLDs. Måling av utånding NO er enklere enn andre analyser for metabolittdeteksjon, som krever enten direkte tilkobling av gassledningen (via IFD-filter) til et lukket respiratorisk tillegg eller noen få pust i en pose for offline analyse, men kostnaden og dårligere bærbarhet av CLD-er stillstand. En rekke elektrokjemiske enheter oppfyller for tiden kriteriene for klinisk bruk, selv om de har lavere følsomhet og reproduserbarhet sammenlignet med CLDer. Videre er konkordansen når det gjelder absolutt målte verdier suboptimal mellom enheter, så det anbefales at pasienter alltid følges opp med samme elektrokjemiske enhet50. Bruk av CLD i innstillinger som måling av neseutåndet NEI og i forskningsmiljøer som terapeutisk lav og høydose inhalert NEI er fortsatt nødvendig.

Presise målinger av NO, dets derivater og NO-bindende proteiner er nødvendige på mange nivåer for å forstå en oversett og fortsatt for det meste ukjent signalmekanisme. Anvendelsesområdene spenner over biologi og patologi på både prekliniske og kliniske nivåer med spesifikke målområder, inkludert immunobiologi, nevrovitenskap, kardiovaskulære vitenskaper og infeksjonssykdommer. Prekliniske studier og kliniske studier undersøker bruken av inhalert NO-gass som terapeutisk middel. Dypere kunnskap om hvordan eksogen INGEN gass påvirker konsentrasjonen av NO metabolitter og NO-bundet proteiner på alle nivåer, fra plasma til cellerom, vil være nødvendig. Implementering av proteomikk med høy avkastning kan trolig øke antall kjente meglere som påvirkes av NO og dets derivater, og kan kreve nye mekanistiske undersøkelser som krever presise målinger av NO-metabolitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.B. mottar lønnsstøtte fra K23 HL128882/NHLBI NIH som prosjektleder for sitt arbeid med hemolyse og nitrogenoksid. LB mottar tilskudd fra "Fast Grants for COVID-19 research" ved Mercatus Center of George Mason University og fra iNO Therapeutics LLC. B.Y. støttes av tilskudd fra en NHLBI/#R21HL130956 og DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. mottok patenter ved MGH på elektrisk generering av nitrogenoksid.

L.B. og B.Y. har innlevert patentsøknad for INGEN levering i COVID-19 sykdom PCT søknadsnummer: PCT / US2021 / 036269 innlevert 7. RWC mottar lønnsstøtte fra Unitaid som prosjektleder for teknologiutvikling rettet mot desentralisert diagnose av tuberkulose hos barn som befinner seg i lavressursmiljøer.

Acknowledgments

Protokollene som ble rapportert i dette manuskriptet ble muliggjort av de akkumulerte bidragene fra tidligere stipendiater ved Dr. Warren Zapols laboratorium for anestesiforskning i kritisk omsorg, Anestesidepartementet ved Massachusetts General Hospital. Vi anerkjenner bidraget fra Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli og Emanuele Rezoagli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma 45754 500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion Sigma A5757 250 mL - liquid
DETA NONOate Cayman 82120 10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190144 500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M) Sigma 258148 500 mL - liquid
Iodine SAFC 207772 100 g - solid
Kimwipes Kimtech 34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5% Sigma 215465 100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe Hamilton 80530 Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe Hamilton 84854 Microliter syringe
N-ethylmaleimide Sigma 4260 25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel Zysense NOA 280i Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40) ThermoFisher 85125 10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99% Sigma 244023 100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99% Sigma 221945 100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS Supelco 105067 250 g - crystalline
PowerGen 125 Fisher Scientific 14-359-251 Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump Edwards A65201906 Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo BD Biosciences BD367871 75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97% Sigma 795429 1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99% Sigma 221341 500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99% Sigma S2252 500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98% Sigma S9251 100 g - solid
Vanadium (III) Chloride Sigma 112393 25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper Sigma WHA10010155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186 (1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550 (2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550 (2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238 (2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879 (2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Tags

Medisin utgave 180
Chemiluminescence-baserte analyser for påvisning av nitrogenoksid og dets derivater fra autoxidasjon og nitroserte forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R.… More

Di Fenza, R., Yu, B., Carroll, R. W., Berra, L. Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds. J. Vis. Exp. (180), e63107, doi:10.3791/63107 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter