Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Abstract

O metabolismo é a base de processos importantes na vida celular. Caracterizar como as redes metabólicas funcionam nos tecidos vivos fornece informações cruciais para a compreensão do mecanismo das doenças e a concepção de tratamentos. Neste trabalho, descrevemos procedimentos e metodologias para estudar a atividade metabólica intracelular em um coração de camundongo retrógrado perfundido em tempo real. O coração foi isolado in situ, em conjunto com parada cardíaca para minimizar a isquemia miocárdica e foi perfundido dentro de um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto no espectrômetro e sob perfusão contínua, o [1-13 C]piruvato hiperpolarizado foi administrado ao coração, e as subsequentes taxas de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato hiperpolarizadas serviram para determinar, em tempo real, as taxas de produção de lactato desidrogenase e piruvato desidrogenase. Esta atividade metabólica do [1-13C]piruvato hiperpolarizado foi quantificada com espectroscopia de RMN de forma livre usando a abordagem de aquisição de saturação seletiva de excitações do produto. 31 anos A espectroscopia de P foi aplicada entre as aquisições hiperpolarizadas para monitorar a energia cardíaca e o pH. Este sistema é excepcionalmente útil para estudar a atividade metabólica no coração de rato saudável e doente.

Introduction

Alterações no metabolismo cardíaco estão associadas a uma variedade de cardiomiopatias e muitas vezes formam a base dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes1. No entanto, existem inúmeros obstáculos para estudar o metabolismo em tecidos vivos, já que a maioria dos ensaios bioquímicos requer a homogeneização do tecido e lise celular e / ou rastreamento radioativo. Portanto, há uma necessidade premente de novas ferramentas para investigar o metabolismo miocárdico em tecidos vivos. A ressonância magnética (RM) de substratos hiperpolarizados marcados com 13C permite medições em tempo real do metabolismo em tecidos vivos2, sem o uso de radiação ionizante, aumentando a relação sinal-ruído (SNR) por RM do(s) sítio(s) marcado(s) em várias ordens de magnitude3. Aqui, descrevemos uma configuração experimental, uma abordagem de aquisição e uma abordagem analítica para estudar o metabolismo rápido no coração isolado de camundongos e, em paralelo, apresentar indicadores de energia e acidez tecidual geral. O pH cardíaco é um indicador valioso, pois o equilíbrio ácido-base é interrompido nos estágios iniciais de doenças cardíacas e condições como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiência cardíaca6.

A produção de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato hiperpolarizados a partir do [1-13C]piruvato hiperpolarizado ajuda a determinar as taxas de produção de lactato desidrogenase (LDH) e piruvato desidrogenase (PDH). A maioria dos estudos prévios realizados utilizando substratos hiperpolarizados no coração de roedores isolados utilizou modelos cinéticos complexos para derivar a atividade enzimática da LDH e PDH, ou relatou as razões de intensidade de sinal do produto hiperpolarizado para um substrato sem calcular as taxas reais de atividade enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aqui, utilizou-se a abordagem de saturação-excitação seletiva do produto 15, que permite o monitoramento da atividade enzimática de forma livre de modelos15,16. Desta forma, as taxas enzimáticas absolutas (ou seja, o número de moles de produto produzido por unidade de tempo) foram determinadas. 31 anos A espectroscopia P foi utilizada para observar os sinais de fosfato inorgânico (Pi), fosfocreatina (PCr) e trifosfato de adenosina (ATP). Uma análise multiparamétrica foi utilizada para caracterizar a distribuição do pH do coração, como demonstrado pelo deslocamento químico heterogêneo no sinal Pi do tecido.

O coração de rato retrógrado perfundido (coração de Langendorff)17,18,19 é um modelo ex vivo para o coração que bate intacto. Nesse modelo, a viabilidade cardíaca e o pH são preservados por pelo menos 80 min20, e tem demonstrado potencial de recuperação após lesão isquêmica prolongada21,22. No entanto, a variabilidade inadvertida durante a microcirurgia pode levar à variabilidade na viabilidade tecidual entre os corações. Estudos anteriores relataram a deterioração desse coração ao longo do tempo19; por exemplo, observou-se uma redução na função contrátil de 5%-10% por hora18. O sinal do trifosfato de adenosina (ATP) já demonstrou relatar o estado energético miocárdico e a viabilidade23. Aqui, observamos que o coração perfundido pode, ocasionalmente, apresentar variabilidade não intencional nos níveis de viabilidade, como demonstrado pelo teor de ATP, apesar de termos tido uma perfusão ininterrupta e suprimento de oxigênio. Demonstramos aqui que normalizar as taxas de LDH e PDH para o conteúdo de ATP do coração reduz a variabilidade intercardíaca nessas taxas.

No protocolo a seguir, descrevemos o procedimento cirúrgico utilizado para canulação cardíaca, isolamento e consequente perfusão no espectrômetro de RMN. Vale ressaltar que outras abordagens cirúrgicas com o objetivo de isolar e perfundir o coração de camundongos foram descritas antesde 24,25.

As metodologias utilizadas para a aquisição de dados relacionados às taxas enzimáticas no coração batendo (usando espectroscopia de 13 C e [1-13C]piruvato hiperpolarizado) e a viabilidade e acidez do coração (usando espectroscopia de RMN de 31P) também são descritas. Finalmente, as metodologias analíticas para determinar as atividades enzimáticas metabólicas e a viabilidade e acidez tecidual são explicadas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

O comitê conjunto de ética (IACUC) da Universidade Hebraica e do Hadassah Medical Center aprovou o protocolo de estudo para o bem-estar animal (MD-19-15827-1).

1. Preparação do tampão de Krebs-Henseleit

  1. Um dia antes do experimento, prepare uma versão modificada do buffer de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, dissolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO4 em H2O de destilação dupla.
  2. Borbulhe esta mistura com 95%/5% O 2/CO 2 por 20 min e, em seguida, adicione 1,2 mM CaCl2.
  3. Ajuste o pH do tampão para 7,4 com HCl ou NaOH.
  4. No dia do experimento, adicionar 10 mM de glicose e 72 U/L de insulina ao KHB preparado na etapa 1.2.
    NOTA: A insulina é adicionada ao tampão de perfusão conforme descrito no trabalho de Kolwicz et al.26 e em concordância com estudos anteriores relatando que a insulina aumenta a função contrátil27 e a intensidade do sinal de bicarbonato hiperpolarizado [13C]28.

2. Preparação do sistema de perfusão

  1. Manter um reservatório de 200 mL de KHB em banho-maria a 40 °C e borbulhar com 95%/5% O 2/CO2 a uma taxa de fluxo de 4 L/min por 1 h antes da perfusão cardíaca. Mantenha o tampão continuamente borbulhando com esta mistura de gases durante todo o experimento.
    1. Primeiro, ajuste o banho-maria para 40 °C. Insira o reservatório KHB. Use uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) e tubos de extensão de grau médico para recircular o KHB entre o reservatório tampão e o tubo de RMN de 10 mm a uma taxa de fluxo constante de 7,5 mL/min.
    2. Conecte três tubos de silicone curados com platina (3 mm i.d.) à bomba (um tubo de entrada e dois tubos de saída para o buffer KH). Insira as linhas de saída e de entrada no buffer KH aquecido. Em seguida, insira a linha de oxigênio no tampão KH aquecido.
    3. Use linhas finas de éter de poliéter cetona (PEEK, consulte Tabela de Materiais) para que o buffer e o agente hiperpolarizado fluam de e para o tubo de RMN dentro do furo do espectrômetro.
  2. Certifique-se de que a temperatura é mantida em 37-37,5 °C. Siga os passos abaixo.
  3. Envolva a linha de entrada (do reservatório tampão para o tubo de RMN) com uma fita de aquecimento ajustada para 42 °C.
  4. Aqueça o tubo de RMN dentro do espectrômetro com um fluxo de ar quente que é regulado pelo espectrômetro.
  5. Use um sensor de temperatura compatível com RMN (consulte Tabela de Materiais) para medir a temperatura dentro do tubo de RMN. A temperatura é ajustada para 37-37,5 °C.

3. Calibração e preparação do espectrômetro de RMN para aquisição

  1. No dia do experimento, insira uma amostra padrão de 13 C que contenha 1,4-dioxano (Tabela de Materiais) no espectrômetro e ajuste e combine a sonda de RMN para 13C. Em seguida, obtenha um espectro mostrando o sinal de equilíbrio térmico de 1,4-dioxano com um ângulo de nutação de 90°.
  2. Agora troque a amostra padrão de 13C por uma amostra padrão de 31 P (Tabela de Materiais), que contém 105 mM de ATP em D2O. Tune e corresponda à sonda NMR para 31P.
    NOTA: Um espectro que mostra os sinais de fosfato de equilíbrio térmico é obtido com um ângulo de nutação de 50°.
  3. Insira a linha de entrada, a linha de saída e a sonda de temperatura em um tubo de RMN de 10 mm e, em seguida, insira o tubo no furo magnético. Ajustar a fita de aquecimento a 42 °C.
  4. Adquira um espectro de RMN de 31 P do tampão KH circulante a ser usado nesse experimento por 30min, com um ângulo de nutação de 50° e um TR de 1,1 s (1.640 aquisições).

4. Preparação animal, procedimento cirúrgico e perfusão do coração no tubo de RMN

  1. Anestesiar um camundongo macho HSD:ICR (CD-1) com isoflurano a 3,3% em ar ambiente (Tabela de Materiais) a 340 mL/min por 5 min utilizando um sistema de anestesia gasosa (Tabela de Materiais) em câmara de indução.
  2. Utilizar anestesia nasal para a manutenção da anestesia geral com isoflurano a 2,9%.
    NOTA: Cuidados são tomados para minimizar a dor e o desconforto para o animal.
  3. Prenda os membros do animal com fita adesiva, assegure um reflexo negativo de dor no pedal e, em seguida, injete 300 UI de heparina sódica por via intraperitoneal.
  4. Molhe a parede torácica e o abdômen do rato completamente com álcool a 70% para garantir a limpeza e evitar a contaminação ou obstrução do cabelo durante o procedimento cirúrgico.
  5. Em 1 min após a injeção de heparina, corte a pele e o músculo da cavidade abdominal com uma pequena tesoura.
  6. Coloque o pequeno grampo de mosquito com bloqueio de hemostático de mandíbula curva entre o processo xifoide e a pele do peito para levantar o peito e expor o diafragma. Punção e corte o lobo direito do diafragma.
  7. Corte o peito através da linha média, retraia para os lados e, em seguida, remova.
  8. Injete o ventrículo esquerdo do coração com 200 UI de heparina sódica para evitar a coagulação do sangue. Em seguida, injete 0,1 mL de KCl gelado a 0,5 mol/L para atingir a parada cardíaca, conforme descrito anteriormente25. A parada cardíaca é essencial para poder canular o coração.
  9. Identifique o timo e remova-o usando uma tesoura para expor a aorta. Remova o tecido residual da caixa torácica.
  10. Identifique o arco aórtico e use pinças curvas para colocar um nó solto com uma sutura de seda 3-0 (Tabela de Materiais) ao redor da aorta ascendente. Injete 3 mL de KHB no ventrículo esquerdo para remover coágulos sanguíneos da aorta.
  11. Use pinça curva para retrair o coração inferiormente para melhor visualização da aorta ascendente.
  12. Realizar a canulação in situ com cateter intravenoso 22 G (Tabela de Materiais). Aplique adesivo de cianoacrilato na região canulada e, em seguida, realize a amarração de sutura dupla. Injete tampão KH adicional no coração e verifique se ele flui através do tubo de canulação.
  13. Remova a pinça curva. Desconecte o coração das vísceras circundantes e perfunda-o retrógradamente com KHB gelado (4 °C) através do cateter intravenoso.
  14. Conecte o coração à linha de entrada do sistema de perfusão através do cateter intravenoso. Após o início da perfusão com tampão quente (37-37,5 °C) a 7,5 mL/min, o coração começa a bater espontaneamente.
  15. Fixe o tubo de RMN com o coração batendo, as linhas de saída e a sonda de temperatura e insira no furo do espectrômetro, certificando-se de que o coração esteja no centro da sonda de RMN.

5. Aquisição de dados para energia cardíaca e pH

  1. Adquira espectros de 31P por cerca de 1 h com um ângulo de inversão de 50 ° e um TR de 1,1 s.

6. Polarização e dissolução do spin DNP

  1. Prepare uma formulação de 28,5 mg de [1-13C]piruvato. Esta formulação consiste em 11,1 mM a 14,0 mM OX063 radical no ácido puro.
  2. Preparar 4 ml de meio de dissolução. O meio de dissolução consiste em tampão TRIS-fosfato, que contém 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS e2mM HCl. Esta composição do meio é ajustada de tal forma que, após a adição de 28,5 mg de formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 4 mL deste tampão (na fase de dissolução), o pH da solução resultante será de 7,4.
  3. Execute a polarização por rotação e a dissolução rápida em um dispositivo de polarização por rotação DNP (dDNP) de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Aplicar irradiação de micro-ondas a uma frequência de 94,110 GHz para a polarização da formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 1,45 K a 1,55 K por cerca de 1,5 h.
  4. Misture rapidamente os 4 mL de meio hiperpolarizado do dispositivo dDNP com uma solução bem oxigenada que complemente o meio de dissolução hiperpolarizado para obter uma composição próxima ao meio de perfusão.
    NOTA: O volume final do meio que perfunde o coração durante as injeções hiperpolarizadas com 14 mM hiperpolarizados [1-13C]piruvato é de 26 mL. A composição final do meio injetado (após mistura) contém 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM de glicose, 1,2 mM CaCl2e 72 U/L de insulina.
  5. Administrar o meio hiperpolarizado contendo [1-13C]piruvato ao coração isolado usando uma configuração de fluxo contínuo29.
    NOTA: Isso é feito para garantir que a perfusão cardíaca não seja perturbada em nenhum momento durante o experimento e que o meio hiperpolarizado seja administrado a uma taxa conhecida e por uma duração conhecida.

7. Espectroscopia hiperpolarizada de 13C

  1. Adquirir dados hiperpolarizados de 13 C usando pulsos de saturação-excitação seletivos do produto 15 aplicando pulsos de seno cardinal (Sinc) de 2,5 ms, conforme descrito anteriormente15,16. Excitar seletivamente [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato consecutivamente em intervalos de 6 s para obter um intervalo de 12s para cada metabólito.
  2. Para a detecção de [1-13 C]lactato, centralize o pulso seletivo de Sinc na frequência de hidrato de [1-13 C]piruvato (179,4 ppm), o que resulta em razão de intensidade de sinal (lac) de 0,113 para os sinais C 1 de [1-13 C]piruvato para [1-13C]lactato.
  3. Para a detecção de [13 C]bicarbonato, centralize o pulso seletivo de Sinc em 157,7 ppm, que é 214 Hz de campo descendente do sinal de [13C]bicarbonato (161,1 ppm); isso resulta em uma razão de intensidade de sinal (bic) de 0,139 para o sinal C 1 de [1-13C]piruvato para [13C]bicarbonato.

8. Determinação do peso e volume húmidos do tecido

  1. No final do experimento, desprenda o coração do sistema de perfusão e seque-o suavemente com papel de seda. Posteriormente, pese o coração para obter o peso úmido do tecido.
  2. Determinar o volume do coração usando um fator de densidade de 1,05 g/cm3, conforme determinado anteriormente para o coração do rato30.

9. Quantificação do teor de ATP

  1. Integrar o sinal γ-ATP de uma única aquisição da amostra padrão ATP e uma aquisição de 30 min (TR de 1,1 s e 1.640 aquisições) do coração isolado.
  2. Quantifique o conteúdo de ATP do coração comparando a integral do sinal γ-ATP do coração com o do padrão (Tabela de Materiais), onde este último tem uma concentração conhecida (105 mM), e corrigir o número de aquisições e efeitos de relaxamento.

10. Resolvendo o sinal Pi do coração

NOTA: Para avaliar o pH tecidual, primeiro é necessário dissociar o sinal Pi do coração do sinal Pi total (Pit). Isso é feito omitindo o sinal do KHB Pi (PiKH) do sinal do Pit.

  1. Em um espectro de 31P de KHB que mostra um único sinal Pi (Pi KH, Figura 1A), ajuste o sinal PiKH a uma função lorentziana usando o Excel (Tabela de Materiais).
  2. O volume visível para a sonda de RMN (Vp, 1,375 mL), contém mais KHB quando o tubo de amostra não contém o coração. Para corrigir esse efeito de enchimento, calcule o sinal de buffer atenuado (Pib) usando a Eq. 1A.
    Equation 1Equina 1A
    onde Vh é o volume do coração, conforme determinado na etapa 8.
  3. Subtraia este sinal do Pit de acordo com a Eq. 1B para obter o sinal Pi proveniente exclusivamente do coração perfundido (Pih, Figura 1B).
    Equation 2Eq. 1B

11. Análise multiparamétrica do pH

  1. Realizar a conversão da distribuição do deslocamento químico do sinal de Pih para o pH com referência ao deslocamento químico do PCr usando a Eq. 231.
    Equation 3Equina 2
    onde Δδ é a diferença de deslocamento químico, pKa é 6,72, δ base livre é 5,69 e δ ácido livre é 3,27, conforme descrito anteriormente31.
  2. Corrigir a curva de distribuição de pH resultante para a não linearidade entre a escala de deslocamento químico de Pih e a escala de pH de acordo com Lutz et al.32. Uma distribuição típica do pH resultante desse cálculo é apresentada na Figura 1C.
  3. Analisar a distribuição do pH tecidual com uma abordagem multiparamétrica utilizando sete parâmetros estatísticos seguindo o trabalho de Lutz et al. 32. Quatro desses parâmetros são apresentados aqui, pois parecem ser os mais descritivos do pH tecidual: 1) pH máximo global; 2) pH médio ponderado; 3) pH mediano ponderado; e 4) distorção do gráfico de pH (Figura 1C).

12. Cálculo das atividades LDH e PDH

NOTA: As taxas de produção dos metabólitos hiperpolarizados [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato são utilizadas para calcular as actividades LDH e PDH, respectivamente. Na abordagem de saturação-excitação seletiva do produto15, apenas metabólitos hiperpolarizados recém-sintetizados são detectados por cada excitação seletiva.

  1. Use o sinal hiperpolarizado [1-13C]piruvato como referência para determinar o nível de produção de metabólitos correspondente.
    1. Durante a perfusão com o meio hiperpolarizado, a concentração de [1-13C]piruvato no tubo de RMN aumenta (wash-in), depois se estabiliza (a uma concentração máxima de 14 mM) e depois diminui (wash-out).
    2. Para identificar os pontos de tempo em que a concentração de piruvato atingiu um nível constante (platô), corrija o sinal de [1-13C]piruvato para o decaimento do sinal resultante do relaxamento de T1 e da pulsação de RF usando a constante de relaxamento efetiva, Teff.
    3. Para cada injeção, defina o Teff com base em sua capacidade de corrigir a curva de decaimento do [1-13C]piruvato para mostrar essa dinâmica de fluxo (Eq.3).
      Equation 4Equina 3
      onde Equation 5 é o sinal de [1-13 C]piruvato que foi adquirido durante a aquisição de [13C]bicarbonato. A média de Teff nos experimentos aqui descritos foi de 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 corações).
    4. Selecione os pontos de dados em que a concentração está dentro de 10% do sinal máximo corrigido [1-13C]piruvato para análise posterior.
  2. Utilizar os dados correspondentes de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato para os pontos de tempo selecionados no passo 12.1 para o cálculo das taxas de produção de metabolitos utilizando a Eq. 4A e a Eq. 4B, desde que o SNR do sinal do metabolito seja superior a 2 (limiar para análise). Um exemplo típico de tal seleção de pontos de tempo é mostrado na Figura 2B (janela temporal realçada).
  3. Calcule as taxas de produção de cada um dos pontos de dados selecionados usando a Eq. 4A e a Eq. 4B:
    Equation 17Equina 4A
    Equation 6Equina 4B
    onde Equation 7 e são as taxas de produção de [1-13 C]lactato ou [13 C]bicarbonato em cada ponto de tempo, respectivamente. e são fatores que representam a excitação relativa de [1-13 C]piruvato e Equation 8 Equation 10 os produtos [1-13 C]lactato ou [13C]bicarbonato, respectivamente.Equation 9 Esses fatores foram determinados previamente como sendo 0,113 e 0,139, respectivamente29. Vp é o volume que é detectado pela sonda de RMN (1,375 mL), TR denota o intervalo de tempo entre duas excitações seletivas consecutivas de saturação do produto (12 s para cada produto), Equation 11 e são os sinais de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato, respectivamente, e Equation 14 Equation 13 são os sinais de [1-13 C]piruvato que foram adquiridos durante o [1-13 C]lactato e Equation 12 [13 Excitações de C]bicarbonato, respectivamente. [Pyr] é a concentração de [1-13C]piruvato, que foi de 14 mM durante a fase de platô.
    1. Determine a taxa para cada ponto e, em seguida, a média por injeção hiperpolarizada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os espectros de 31P registrados a partir de um coração de rato perfundido com KHB e do tampão isolado são mostrados na Figura 1A. Os sinais de α, β e γ-ATP, PCr e Pi foram observados no coração. O sinal Pi foi composto por dois componentes principais: no campo superior (lado esquerdo do sinal), o sinal Pi foi principalmente devido ao KHB a um pH de 7,4; no campo inferior (lado direito do sinal), o sinal Pi foi mais amplo e menos homogêneo devido ao ambiente mais ácido. Este último padrão surge do tecido cardíaco. O sinal Pi do tecido cardíaco é extraído subtraindo o sinal Pi do KHB (Figura 1B) e, em seguida, convertido da escala ppm para a escala de pH (Figura 1C). O pH é investigado por meio de uma análise multiparamétrica do sinal Pi tecidual, calculando-se a média ponderada, a mediana ponderada, o máximo global e a assimetria (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Espectros típicos de 31 P, a distinção entre o sinal Pi do KHB e do coração, a conversão do deslocamento químico para os eixos de pH e os parâmetros estatísticos da distribuição de pH. (A) O painel superior exibe um espectro típico de RMN de 31P obtido de um coração de rato perfundido com KHB no espectrômetro, enquanto o painel inferior mostra um espectro obtido apenas a partir de KHB. A região espectral marcada com traços é mostrada ampliada no painel B. Abreviaturas: Pi = fosfato inorgânico; PCr = fosfocreatina; ATP = trifosfato de adenosina; ADP = difosfato de adenosina. (B) O espectro original é mostrado em preto (Pit); a curva tracejada mostra o sinal Pi somente do buffer (Pib). Este último foi obtido ajustando-se uma forma de linha lorentziana com seu centro no componente KHB correspondente do sinal de Pit e ajustando-se para a quantidade de KHB na sonda após a inserção do coração (de acordo com a Eq. 1A). O sinal Pi atribuído ao coração (Pih) é mostrado em laranja, e isso é obtido subtraindo o sinal Pib do sinal Pit (de acordo com a Eq. 1B). (C) Conversão da distribuição de deslocamento químico do sinal de Pih mostrada em (B) para uma distribuição de pH e análise de pH multiparamétrica. A não linearidade entre o deslocamento químico e as escalas de pH foi corrigida conforme descrito anteriormente32. Os resultados da análise multiparamétrica de pH são marcados pelas linhas verticais. Para esta distribuição específica, os valores dos parâmetros estatísticos são fornecidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Com a abordagem de aquisição seletiva de saturação-excitações do produto hiperpolarizado15, é possível realizar a quantificação absoluta das atividades enzimáticas de LDH e PDH. A Figura 2 resume as etapas de aquisição e processamento necessárias para essa determinação. A Tabela 1 mostra o teor de ATP e as taxas de LDH e PDH em cinco corações diferentes. A normalização das atividades de LDH e PDH para o conteúdo de ATP de cada coração reduziu a variabilidade nas medidas de LDH e PDH em todo o grupo, como pode ser visto nas colunas de atividade enzimática da Tabela 1, que são expressas em unidades de nmol/s/μmol ATP.

Figure 2
Figura 2: Processamento hiperpolarizado de MRS de 13 C e análise do metabolismo do [1-13C]piruvato. (A) Espectros de RMN representativos de 13 C adquiridos com a abordagem de excitações de saturação seletiva do produto durante uma injeção de 14 mM de [1-13C]piruvato hiperpolarizado no coração decamundongo perfundido. Atribuição do sinal: 1 = [1-13 C]lactato (183,2ppm); 2 = [1-13 C]piruvato (171ppm); 3 = [13C]bicarbonato (161,1 ppm); * = impurezas decorrentes da formulação de [1-13C]piruvato33. (B) Curso temporal das intensidades de sinal hiperpolarizadas exibidas em A. As intensidades integradas de [1-13C]piruvato (cinza) foram ajustadas para decaimento T1e pulsação de RF com uma constante de tempo de Teff de 32 s (preto), e isso produziu a dinâmica de fluxo esperada para o substrato (wash-in, plateau, wash-out). Uma análise mais aprofundada foi realizada nos pontos de dados dentro da janela de tempo em que o sinal ajustado de [1-13 C]piruvato mostrou uma concentração constante e máxima de [1-13C]piruvato no tubo de RMN (destacado em azul claro). As taxas de produção de LDH e PDH (Equation 18 e ) para os pontos de tempo selecionados foram calculadas de acordo com a Eq. 4A e Equation 19Eq. 4B e, em seguida, calculadas em média. Os valores médios para esta injeção (Equation 1 e Equation 1 ) são fornecidos em unidades de nmol/s. Para fins de exibição, o [1-13 C]piruvato ajustado, o [1-13 C]lactato e o [13 C]bicarbonato foram multiplicados por 0,143, 10 e 80, respectivamente, em relação ao sinal de [1-13C]piruvato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coração No. ATP (μmol) Taxa de LDH (nmol/s) Taxa de PDH (nmol/s) Taxa de LDH (nmol/s/μmol ATP) Taxa de PDH (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Média (DP) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
DP % Média 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabela 1: Teor de ATP e taxas de LDH e PDH em cinco corações. Abreviaturas: DP = Desvio padrão; DP % Média = a porcentagem do desvio padrão da média.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Demonstramos uma configuração experimental projetada para investigar o metabolismo hiperpolarizado do [1-13C]piruvato, a energia tecidual e o pH em um modelo isolado de coração de camundongo.

As etapas críticas dentro do protocolo são as seguintes: 1) garantir que o pH do tampão seja de 7,4; 2) assegurar que todos os componentes da reserva sejam incluídos; 3) evitar a coagulação do sangue nos vasos cardíacos por injeções de heparina; 4) evitar danos isquêmicos ao coração, reduzindo a atividade metabólica (injeção de KCl e tampão gelado); 5) evitar a introdução de bolhas de ar no coração em qualquer ponto do procedimento; 6) validação bem-sucedida da canulação da aorta pela cor do tecido, que muda de vermelho escuro para rosa claro; 7) certificar-se de que a perfusão é contínua uma vez que o coração é movido para aquecer o tampão; 8) monitorar de perto a temperatura dentro do tubo de RMN no espectrômetro ao lado do coração e mantê-lo a 37 °C; 9) verificar a homogeneidade do campo magnético ao longo da medição; e 10) utilizando calibração precisa e atualizada para os pulsos de RF.

Modificações e solução de problemas da técnica
Notamos algumas modificações que foram feitas neste estudo: 1) o início da perfusão com KHB gelado após a cirurgia foi empregado para proteger o coração; e 2) a validação do pH tampão foi realizada durante todo o tempo para garantir que esse parâmetro estivesse sob controle e não fosse uma fonte de variação nos resultados. Isso foi feito nas várias etapas de preparação e experimentação usando um medidor de pH, tiras indicadoras de pH e o sinal Pi no espectro 31P.

Fontes de variabilidade e como corrigi-las
O coração do rato foi escolhido para caber em um tubo de RMN de 10 mm. No entanto, este pequeno coração fornece sinais baixos, e o delicado procedimento cirúrgico para isolar e perfundir o coração é um desafio. No geral, isso leva à viabilidade variável do tecido e à atividade metabólica. Para explicar essa variabilidade, normalizamos as taxas metabólicas de LDH e PDH para o conteúdo de ATP (ou seja, mole/s/ATP). Um uso semelhante do conteúdo de ATP como referência foi previamente relatado em cortes de tumor de mama de xenoenxerto29. Esse tipo de normalização é benéfico porque permite a comparação com os resultados de outros pesquisadores e com outras condições. Além disso, usando um fator de conversão da quantidade de ATP para a massa do tecido, pode-se derivar a atividade enzimática por peso tecidual (para o tecido em que o metabolismo ocorre).

Além da variabilidade entre diferentes preparações cardíacas isoladas (ou seja, de diferentes animais), o deslocamento químico do tecido Pi (Pih) mostrou uma distribuição não homogênea neste estudo. Lutz et al.32 demonstraram uma distribuição não homogênea semelhante em tumores de xenoenxerto, e essa distribuição foi analisada por meio de uma abordagem multiparamétrica. Neste trabalho, essa metodologia foi implementada no coração de rato perfundido. Nota-se que é provável que o sinal de Pih reporte predominantemente no pH intracelular, como indicado anteriormente16.

Incerteza
Uma suposição subjacente na quantificação de e é que a solução hiperpolarizada de [1-13C]piruvato está preenchendo todo o volume detectado pela sonda de Equation 18 RMN (Vp, Eq. 4A e Equation 19 Eq. 4B). A solução hiperpolarizada de [1-13C]piruvato flui através das artérias coronárias do coração para preencher os compartimentos extracelular e intracelular. Portanto, assume-se que o volume cardíaco está preenchido com a solução hiperpolarizada na mesma medida que o resto do Vp.

Utilizando a abordagem de saturação-excitação seletiva do produto hiperpolarizado15,29, a atividade enzimática pode ser quantificada independentemente de quaisquer variações no T1 dos metabólitos e da reversibilidade da reação enzimática. Essa determinação é robusta e imune a variações nos perfis de T1 e excitação e provavelmente é mais reprodutível em todos os laboratórios em comparação com as análises de área sob a curva, que dependem das condições específicas de aquisição e configuração em cada laboratório.

Investigar o metabolismo do [1-13C]piruvato, que está na encruzilhada do metabolismo aeróbio e anaeróbio, é de grande valor para o estudo da hipóxia, isquemia, lesão por reperfusão, fome e alteração no metabolismo cardíaco, como na cardiomiopatia diabética. Análogos de piruvato hiperpolarizados marcados com 13C foram testados clinicamente 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 e, portanto, os resultados de tais estudos são provavelmente translacionais. Mais importante ainda, nossa abordagem permite a quantificação da atividade enzimática intracelular em todo o órgão.

A preparação isolada do coração de roedores e os procedimentos e metodologias envolvidos nesta pesquisa ajudarão a aprofundar a compreensão do efeito de uma variedade de estressores na função cardíaca, energética e metabolismo, uma vez que os parâmetros medidos neste modelo são atribuídos exclusivamente ao coração. Ao contrário do coração de rato, o coração de rato é adequado para estudar modelos transgênicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há divulgações.

Acknowledgments

Este projeto recebeu financiamento da Israel Science Foundation sob o contrato de subvenção nº 1379/18; a Bolsa Jabotinsky do Ministério da Ciência e Tecnologia de Israel para Ciências Aplicadas e de Engenharia para Estudantes de Doutorado Direto No. 3-15892 para D.S.; e o programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo da convenção de subvenção n.º 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Biologia Edição 194 Metabolismo imagem metabólica agente de imagem espectroscopia de ressonância magnética lactato desidrogenase piruvato desidrogenase [1-13C]piruvato pH fosfato inorgânico
Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [<sup>1-13</sup>C]Piruvato e Espectroscopia de RMN <sup>13</sup>C/<sup>31</sup>P
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter