Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersökning av hjärtmetabolism i det isolerade perfuserade mushjärtat med hyperpolariserat [1-13C] pyruvat och 13C/31P NMR-spektroskopi

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Vi beskriver en experimentell uppställning för administrering av hyperpolariserade 13C-märkta metaboliter i kontinuerligt perfusionsläge till ett isolerat perfuserat mushjärta. En dedikerad 13C-NMR-förvärvsmetod möjliggjorde kvantifiering av metabolisk enzymaktivitet i realtid, och en multiparametrisk 31P-NMR-analys möjliggjorde bestämning av vävnadens ATP-innehåll och pH.

Abstract

Metabolism är grunden för viktiga processer i cellulärt liv. Att karakterisera hur metaboliska nätverk fungerar i levande vävnader ger viktig information för att förstå sjukdomsmekanismen och utforma behandlingar. I detta arbete beskriver vi procedurer och metoder för att studera metabolisk aktivitet i celler i ett retrograda perfuserat mushjärta i realtid. Hjärtat isolerades in situ, i samband med hjärtstillestånd för att minimera myokardischemi och perfuserades inuti en kärnmagnetisk resonans (NMR) spektrometer. Medan i spektrometern och under kontinuerlig perfusion administrerades hyperpolariserat [1-13 C] pyruvat till hjärtat, och de efterföljande hyperpolariserade [1-13C] laktat- och [13C] bikarbonatproduktionshastigheterna tjänade till att i realtid bestämma hastigheterna för laktatdehydrogenas och pyruvatdehydrogenasproduktion. Denna metaboliska aktivitet av hyperpolariserat [1-13C] pyruvat kvantifierades med NMR-spektroskopi på ett modellfritt sätt med hjälp av produktselektiv mättnad-excitationsförvärvsmetod. 31 P-spektroskopi tillämpades mellan de hyperpolariserade förvärven för att övervaka hjärtenergin och pH. Detta system är unikt användbart för att studera metabolisk aktivitet i det friska och sjuka mushjärtat.

Introduction

Förändringar i hjärtmetabolismen är förknippade med en mängd olika kardiomyopatier och utgör ofta grunden för de underliggande patofysiologiska mekanismerna1. Det finns dock många hinder för att studera metabolism i levande vävnader, eftersom de flesta biokemiska analyser kräver homogenisering av vävnads- och celllys och / eller radioaktiv spårning. Därför finns det ett pressande behov av nya verktyg för att undersöka myokardmetabolism i levande vävnader. Magnetisk resonans (MR) av hyperpolariserade 13C-märkta substrat möjliggör realtidsmätningar av metabolism i levande vävnader 2, utan användning av joniserande strålning, genom att öka MR-signal-brusförhållandet (SNR) för de märkta platsernamed flera storleksordningar3. Här beskriver vi en experimentell uppställning, en förvärvsmetod och en analytisk metod för att studera den snabba metabolismen i det isolerade mushjärtat och parallellt presentera indikatorer på allmän vävnadsenergi och surhet. Hjärtats pH är en värdefull indikator, eftersom syra-basbalansen störs i de tidiga stadierna av hjärtsjukdomar och tillstånd som myokardischemi, maladaptiv hypertrofi och hjärtsvikt6.

Hyperpolariserad [1-13 C] laktat och [13 C] bikarbonatproduktion från hyperpolariserad [1-13C] pyruvat hjälper till att bestämma produktionshastigheterna för laktatdehydrogenas (LDH) och pyruvatdehydrogenas (PDH). De flesta av de tidigare studierna som utförts med användning av hyperpolariserade substrat i det isolerade gnagarhjärtat använde antingen komplexa kinetiska modeller för att härleda den enzymatiska aktiviteten hos LDH och PDH, eller rapporterade signalintensitetsförhållandena för den hyperpolariserade produkten till ett substrat utan att beräkna de faktiska enzymaktivitetshastigheterna 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Här använde vi produktselektiva mättnad-excitationer metod 15, vilket möjliggör övervakning av enzymaktiviteten på ett modellfritt sätt15,16. På detta sätt bestämdes de absoluta enzymatiska hastigheterna (dvs antalet mol produkt som produceras per tidsenhet). 31 P-spektroskopi användes för att observera signalerna från oorganiskt fosfat (Pi), fosfokreatin (PCr) och adenosintrifosfat (ATP). En multiparametrisk analys användes för att karakterisera hjärtats pH-fördelning, vilket demonstrerades av den heterogena kemiska förskjutningen i vävnadens Pi-signal.

Det retrograda perfuserade mushjärtat (Langendorff-hjärtat)17,18,19 är en ex vivo-modell för det intakta bultande hjärtat. I denna modell bevaras hjärtviabiliteten och pH i minst 80 min20, och det har visat potential för återhämtning efter en långvarig ischemisk skada21,22. Icke desto mindre kan oavsiktlig variabilitet under mikrokirurgi leda till variationer i vävnadens livskraft över hjärtan. Tidigare studier har rapporterat om försämringen av detta hjärta över tid19; Till exempel har en minskning av kontraktil funktion med 5% -10% per timme observerats18. Adenosintrifosfatsignalen (ATP) har tidigare visat sig rapportera om myokardiell energistatus och livskraft23. Här noterade vi att det perfuserade hjärtat ibland kan visa oavsiktlig variation i livskraftsnivåer, vilket framgår av ATP-innehållet, trots att vi hade en oavbruten perfusion och syretillförsel. Vi visar här att normalisering av LDH- och PDH-hastigheterna till ATP-innehållet i hjärtat minskar variabiliteten mellan hjärtan i dessa hastigheter.

I följande protokoll beskriver vi det kirurgiska ingrepp som används för hjärtkannulation, isolering och därmed perfusion i NMR-spektrometern. Observera att andra kirurgiska metoder som syftar till att isolera och perfusera mushjärtat har beskrivits före24,25.

De metoder som används för att samla in data relaterade till enzymatiska hastigheter i det slående hjärtat (med hjälp av 13 C-spektroskopi och hyperpolariserat [1-13C] pyruvat) och hjärtats livskraft och surhet (med 31P NMR-spektroskopi) beskrivs också. Slutligen förklaras analysmetoderna för att bestämma metaboliska enzymaktiviteter och vävnadsviabilitet och surhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den gemensamma etikkommittén (IACUC) vid Hebrew University och Hadassah Medical Center godkände studieprotokollet för djurskydd (MD-19-15827-1).

1. Krebs-Henseleit buffertberedning

  1. En dag före experimentet, förbered en modifierad version av Krebs-Henseleit-bufferten (KHB)26. Lös initialt 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvat, 1,2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3 och 1,2 mM KH2PO4 i dubbeldestilleradH2O.
  2. Bubbla blandningen med 95 %/5% O2/CO2 i 20 minuter och tillsätt sedan 1,2 mM CaCl2.
  3. Justera buffertens pH till 7,4 med HCl eller NaOH.
  4. På dagen för experimentet, tillsätt 10 mM glukos och 72 U / L insulin till KHB beredd i steg 1.2.
    OBS: Insulin tillsätts till perfusionsbufferten som beskrivs i Kolwicz et al.26 arbete och i överensstämmelse med tidigare studier som rapporterar att insulin ökar kontraktil funktion27 och intensiteten hos den hyperpolariserade [13C] bikarbonatsignalen 28.

2. Förberedelse av perfusionssystem

  1. Håll en behållare på 200 ml KHB i ett vattenbad vid 40 °C och bubbla med 95 %/5 %O2/CO2 med en flödeshastighet på 4 l/min i 1 timme före hjärtperfusion. Håll bufferten kontinuerligt bubblande med denna gasblandning under hela experimentet.
    1. Ställ först in vattenbadet på 40 °C. Sätt i KHB-behållaren. Använd en peristaltisk pump (se Materialförteckning) och förlängningsrör av medicinsk kvalitet för att återcirkulera KHB mellan buffertbehållaren och 10 mm NMR-röret med en konstant flödeshastighet på 7,5 ml/min.
    2. Anslut tre platinahärdade silikonrör (3 mm i.d.) till pumpen (ett inloppsrör och två utflödesrör för KH-bufferten). Sätt in utflödes- och inloppsledningarna i den uppvärmda KH-bufferten. Sätt sedan in syreledningen i den uppvärmda KH-bufferten.
    3. Använd tunna polyetereterketonlinjer (PEEK, se materialförteckning) för bufferten och det hyperpolariserade medlet att strömma till och från NMR-röret i spektrometerns borrning.
  2. Se till att temperaturen hålls vid 37-37,5 °C. Följ stegen nedan.
  3. Linda in inloppsledningen (från buffertbehållaren till NMR-röret) med en värmetejp inställd på 42 °C.
  4. Värm NMR-röret inuti spektrometern med ett varmt luftflöde som regleras av spektrometern.
  5. Använd en NMR-kompatibel temperatursensor (se Materialförteckning) för att mäta temperaturen inuti NMR-röret. Temperaturen justeras till 37-37,5 °C.

3. Kalibrering och förberedelse av NMR-spektrometern för förvärv

  1. På dagen för experimentet sätts in ett 13C standardprov som innehåller 1,4-dioxan (materialtabell) i spektrometern och finjustera och matcha NMR-sonden för 13 °C. Därefter erhålls ett spektrum som visar den termiska jämviktssignalen för 1,4-dioxan med en nutationsvinkel på 90°.
  2. Byt nu ut 13C-standardprovet mot ett 31 P-standardprov (Table of Materials), som innehåller 105 mM ATP iD2O. Ställ in och matcha NMR-sonden för 31P.
    OBS: Ett spektrum som visar de termiska jämviktsfosfatsignalerna erhålls med en nutationsvinkel på 50 °.
  3. Sätt in inloppsledningen, utflödesledningen och temperatursonden i ett 10 mm NMR-rör och sätt sedan in röret i magnethålet. Justera värmetejpen till 42 °C.
  4. Skaffa ett 31 P NMR-spektrum av den cirkulerande KH-bufferten som ska användas i det experimentet i 30minuter, med en nutationsvinkel på 50 ° och en TR på 1,1 s (1 640 förvärv).

4. Djurberedning, kirurgiskt ingrepp och perfusion av hjärtat i NMR-röret

  1. Bedöva en hanmus av HSD:ICR (CD-1) med 3,3 % isofluran i rumsluft (Table of Materials) vid 340 ml/min i 5 minuter med hjälp av ett gasanestesisystem (Table of Materials) i en induktionskammare.
  2. Använd näsbedövning för underhåll av narkos med 2,9% isofluran.
    OBS: Försiktighet vidtas för att minimera smärta och obehag för djuret.
  3. Säkra djurets lemmar med tejp, säkerställa en negativ pedalsmärtreflex och injicera sedan 300 IE natriumheparin intraperitonealt.
  4. Våt musens bröstvägg och buk noggrant med 70% alkohol för att säkerställa renhet och undvika hårförorening eller obstruktion under det kirurgiska ingreppet.
  5. Vid 1 min efter heparininjektionen, skära huden och muskeln i bukhålan med liten sax.
  6. Placera den lilla böjda käften hemostatlåsande myggklämman mellan xiphoidprocessen och brösthuden för att lyfta bröstet och exponera membranet. Punktera och skär membranets högra lob.
  7. Skär bröstet över mittlinjen, dra tillbaka till sidorna och ta sedan bort.
  8. Injicera hjärtats vänstra kammare med 200 IE natriumheparin för att förhindra blodkoagulation. Injicera sedan 0,1 ml iskall 0,5 mol / L KCl för att uppnå hjärtstillestånd, som tidigare beskrivits25. Hjärtstillestånd är viktigt för att kunna cannulate hjärtat.
  9. Identifiera tymus och ta bort den med sax för att exponera aortan. Ta bort kvarvarande bröstkorgvävnad.
  10. Identifiera aortabågen och använd böjda pincett för att placera en lös knut med en 3-0 silkesutur (materialtabell) runt den stigande aortan. Injicera 3 ml KHB i vänster kammare för att avlägsna blodproppar från aortan.
  11. Använd böjda pincett för att dra tillbaka hjärtat sämre för bättre visualisering av den stigande aortan.
  12. Utför kanylering in situ med en 22 G intravenös kateter (Table of Materials). Applicera cyanoakrylatlim i det kanylerade området och utför sedan dubbel suturbindning. Injicera ytterligare KH-buffert i hjärtat och kontrollera att det rinner genom kanylröret.
  13. Ta bort de böjda pincetterna. Koppla bort hjärtat från de omgivande inälvorna och perfusera det retrograd med iskallt KHB (4 °C) genom den intravenösa katetern.
  14. Anslut hjärtat till perfusionssystemets inflödeslinje via den intravenösa katetern. Vid initiering av perfusion med varm buffert (37-37,5 °C) vid 7,5 ml/min börjar hjärtat slå spontant.
  15. Fäst NMR-röret med det slående hjärtat, utflödesledningarna och temperatursonden och sätt in i spektrometerns hål och se till att hjärtat är i mitten av NMR-sonden.

5. Insamling av data för hjärtenergi och pH

  1. Skaffa 31P-spektra i ca 1 h med en vändvinkel på 50 ° och en TR på 1,1 s.

6. DNP-spinnpolarisering och upplösning

  1. Bered en 28,5 mg formulering av [1-13C] pyruvat. Denna formulering består av 11,1 mM till 14,0 mM OX063 radikal i den rena syran.
  2. Förbered 4 ml upplösningsmedium. Upplösningsmediet består av TRIS-fosfatbuffert, som innehåller 11,2 mM NaH2PO4, 38,8 mMNa2HPO4, 33mM TRIS och 2 mM HCl. Denna mediekomposition justeras så att vid tillsats av 28,5 mg [1-13C]pyruvsyraformulering till 4 ml av denna buffert (i upplösningsfasen) kommer pH för den resulterande lösningen att vara 7,4.
  3. Utför spinnpolarisering och snabb upplösning i en upplösning-DNP (dDNP) spinnpolarisationsanordning enligt tillverkarens instruktioner (Table of Materials). Applicera mikrovågsbestrålning med en frekvens av 94,110 GHz för polarisering av [1-13C] pyruvsyraformuleringen vid 1,45 K till 1,55 K i ca 1,5 timmar.
  4. Blanda snabbt 4 ml hyperpolariserat medium från dDNP-anordningen med en väl syresatt lösning som kompletterar det hyperpolariserade upplösningsmediet för att erhålla en komposition som nära matchar perfusionsmediet.
    OBS: Den slutliga volymen av mediet som perfuserar hjärtat under de hyperpolariserade injektionerna med 14 mM hyperpolariserat [1-13C] pyruvat är 26 ml. Den slutliga sammansättningen av det injicerade mediet (efter blandning) innehåller 4,7 mM KCl, 1,2 mMMgSO4, 70 mM NaCl, 25 mMNaHCO3, 1,2 mM KH 2PO4, 10 mM glukos,1,2mM CaCl2 och72 U / L insulin.
  5. Administrera det hyperpolariserade [1-13C] pyruvatinnehållande mediet till det isolerade hjärtat med hjälp av en kontinuerlig flödesinställning29.
    OBS: Detta görs för att säkerställa att hjärtperfusionen inte störs någon gång under experimentet och att det hyperpolariserade mediet administreras med en känd hastighet och under en känd varaktighet.

7. Hyperpolariserad 13C-spektroskopi

  1. Skaffa hyperpolariserade 13C-data med hjälp av produktselektiva mättnads-excitationspulser 15 genom att applicera 2,5 ms kardinal sinus (Sinc) pulser, som tidigare beskrivits 15,16. Excitera selektivt [1-13C] laktat och [13C] bikarbonat i följd med 6 s intervall för att erhålla ett 12 s intervall för varje metabolit.
  2. För [1-13 C] laktatdetektering, centrera den selektiva Sinc-pulsen vid [1-13 C] pyruvathydratfrekvensen (179,4 ppm), vilket resulterar i signalintensitetsförhållande (lac) på 0,113 för C 1-signalerna från [1-13 C] pyruvat till [1-13C] laktat.
  3. För [13 C] bikarbonatdetektering, centrera den selektiva Sinc-pulsen vid 157,7 ppm, vilket är 214 Hz nedfält av [13C] bikarbonatsignalen (161,1 ppm); Detta resulterar i ett signalintensitetsförhållande (bic) på 0,139 för C 1-signalen från [1-13C] pyruvat till [13C] bikarbonat.

8. Bestämning av vävnadens våtvikt och volym

  1. I slutet av experimentet, lossa hjärtat från perfusionssystemet och torka det försiktigt med silkespapper. Därefter väga hjärtat för att få vävnadens våtvikt.
  2. Bestäm hjärtats volym med hjälp av en densitetsfaktor på 1,05 g/cm3, som tidigare bestämts för mushjärtat30.

9. Kvantifiering av ATP-innehåll

  1. Integrera γ-ATP-signalen för ett enda förvärv av ATP-standardprovet och ett 30 minuters förvärv (TR på 1,1 s och 1 640 förvärv) av det isolerade hjärtat.
  2. Kvantifiera ATP-innehållet i hjärtat genom att jämföra integralen av hjärtats γ-ATP-signal med standardens (Table of Materials), där den senare har en känd koncentration (105 mM), och korrigera för antalet förvärv och avslappningseffekter.

10. Lösa Pi-signalen i hjärtat

OBS: För att utvärdera vävnadens pH är det först nödvändigt att dekonvolvera hjärtats Pi-signal från den totala Pi-signalen (Pit). Detta görs genom att utelämna signalen från KHB Pi (PiKH) från Pit.

  1. I ett 31P-spektrum av KHB som visar en enda Pi-signal (Pi KH, figur 1A), anpassa PiKH-signalen till en Lorentzisk funktion med Excel (Table of Materials).
  2. Volymen synlig för NMR-sonden (Vp, 1,375 ml), innehåller mer KHB när provröret inte innehåller hjärtat. För att korrigera för denna fyllningseffekt, beräkna den dämpade buffertsignalen (Pib) med hjälp av Eq. 1A.
    Equation 1Kv. 1A
    där Vh är hjärtats volym, bestämd i steg 8.
  3. Subtrahera denna signal från Pit enligt Eq. 1B för att erhålla Pi-signalen som enbart härrör från det perfuserade hjärtat (Pih, figur 1B).
    Equation 2Kv. 1B

11. Multiparametrisk pH-analys

  1. Utför omvandlingen av Pih-signalens kemiska skiftfördelning till pH med hänvisning till den kemiska förskjutningen av PCr med Eq. 231.
    Equation 3Kv. 2
    där Δδ är den kemiska skiftskillnaden, pKa är 6,72, δ fri bas är 5,69 och δ fri syra är 3,27, som tidigare beskrivits31.
  2. Korrigera den resulterande pH-fördelningskurvan för icke-linjäriteten mellan Pih kemisk skiftskala och pH-skalan enligt Lutz et al.32. En typisk pH-fördelning till följd av denna beräkning presenteras i figur 1C.
  3. Analysera vävnadens pH-fördelning med ett multiparametriskt tillvägagångssätt med hjälp av sju statistiska parametrar som följer Lutz et al. 32. Fyra av dessa parametrar presenteras här eftersom de förefaller vara de mest beskrivande för vävnadens pH: 1) globalt högsta pH; 2) vägt genomsnittligt pH, 3) viktat median pH; och 4) skevhet i pH-diagrammet (figur 1C).

12. Beräkning av LDH- och PDH-aktiviteterna

OBS: Produktionshastigheterna för de hyperpolariserade metaboliterna [1-13 C] laktat och [13C] bikarbonat används för att beräkna LDH- respektive PDH-aktiviteterna. I produktselektiv mättnad-excitationsmetod15 detekteras endast nysyntetiserade hyperpolariserade metaboliter genom varje selektiv excitation.

  1. Använd den hyperpolariserade [1-13C] pyruvatsignalen som referens för att bestämma motsvarande metabolitproduktionsnivå.
    1. Under perfusionen med det hyperpolariserade mediet ökar [1-13 C]pyruvatkoncentrationen i NMR-röret (wash-in), sedan platåer (vid en maximal koncentration av 14mM) och minskar sedan (wash-out).
    2. För att identifiera de tidpunkter vid vilka pyruvatkoncentrationen nådde en konstant nivå (platå), korrigera [1-13C]pyruvatsignalen för signalförfall till följd av T1-avkoppling och RF-pulsering med hjälp av den effektiva avkopplingskonstanten,Teff.
    3. För varje injektion definierasT-effen baserat på dess förmåga att korrigera sönderfallskurvan [1-13C]pyruvat för att visa denna flödesdynamik (Eq.3).
      Equation 43 kv.
      där Equation 5 är [1-13 C]pyruvatsignalen som förvärvades under [13C]bikarbonatförvärvet. Den genomsnittliga Teff i experimenten som beskrivs här befanns vara 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 hjärtan).
    4. Välj de datapunkter där koncentrationen ligger inom 10% av den maximala korrigerade [1-13C] pyruvatsignalen för vidare analys.
  2. Använd motsvarande data för produktionen av [1–13 C]laktat och [13C]bikarbonat för de tidpunkter som valts i steg 12.1för beräkning av produktionshastigheterna för metaboliter med användning av Eq. 4A och Eq. 4B, förutsatt att SNR för metabolitsignalen är större än 2 (tröskelvärde för analys). Ett typiskt exempel på ett sådant val av tidpunkter visas i figur 2B (markerat tidsfönster).
  3. Beräkna produktionshastigheterna för var och en av de valda datapunkterna med hjälp av Eq. 4A och Eq. 4B:
    Equation 17Kv. 4A
    Equation 6Kv. 4B
    där Equation 7 och är produktionshastigheterna för [1–13 C]laktat respektive [13 C]bikarbonat vid varje tidpunkt. och är faktorer som representerar den relativa excitationen av [1–13 C]pyruvat och Equation 8 Equation 10 produkterna [1–13 C]laktat respektive [13C]bikarbonat. Equation 9 Dessa faktorer bestämdes tidigare till 0,113 respektive 0,13929. Vp är volymen som detekteras av NMR-sonden (1,375 ml), TR betecknar tidsintervallet mellan två på varandra följande produktselektiva mättande excitationer (12 s för varje produkt) Equation 11 och är signalerna från [1-13 C] laktat respektive [13 C] bikarbonat, och och är signalerna från [1-13 C] pyruvat som förvärvades under [1-13 C] laktat och Equation 14 Equation 13 Equation 12 [13 C]bikarbonatexcitationer, respektive. [Pyr] är [1-13 C] pyruvatkoncentrationen, som var 14mM under platåfasen.
    1. Bestäm hastigheten för varje punkt och sedan genomsnittet per hyperpolariserad injektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De 31P-spektra som registrerats från ett mushjärta perfuserat med KHB och från bufferten ensam visas i figur 1A. Signalerna av α-, β- och γ-ATP, PCr och Pi observerades i hjärtat. Pi-signalen bestod av två huvudkomponenter: i det högre fältet (vänster sida av signalen) berodde Pi-signalen mestadels på KHB vid ett pH på 7,4; i det nedre fältet (höger sida av signalen) var Pi-signalen bredare och mindre homogen på grund av den surare miljön. Det senare mönstret härrör från hjärtvävnaden. Pi-signalen för hjärtvävnad extraheras genom att subtrahera Pi-signalen från KHB (figur 1B) och omvandlas sedan från ppm-skalan till pH-skalan (figur 1C). PH-värdet undersöks med hjälp av en multiparametrisk analys av vävnadens Pi-signal genom att beräkna det viktade medelvärdet, viktade medianen, det globala maximumet och skevheten (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Typiska 31 P-spektra, skillnaden mellan Pi-signalen från KHB och hjärtat, omvandling från kemisk förskjutning till pH-axlar och de statistiska parametrarna för pH-fördelningen . (A) Den övre panelen visar ett typiskt 31P NMR-spektrum erhållet från ett mushjärta perfuserat med KHB i spektrometern. medan den nedre panelen visar ett spektrum erhållet från KHB ensam. Det streckmarkerade spektralområdet visas förstorat i panel B. Förkortningar: Pi = oorganiskt fosfat; PCr = fosfokreatin; ATP = adenosintrifosfat; ADP = adenosindifosfat. (B) Det ursprungliga spektrumet visas i svart (Pit). den streckade kurvan visar endast Pi-signalen från bufferten (Pib). Den senare erhölls genom att montera en Lorentzisk linjeform med dess centrum vid motsvarande KHB-komponent i Pit-signalen och justera för mängden KHB i sonden efter hjärtinsättningen (enligt Eq. 1A). Pi-signalen som tillskrivs hjärtat (Pih) visas i orange, och detta erhålls genom att subtrahera Pib-signalen från Pit-signalen (enligt Eq. 1B). (C) Omvandling av Pih-signalens kemiska skiftfördelning som visas i (B) till en pH-fördelning och multiparametrisk pH-analys. Icke-linjäriteten mellan den kemiska förskjutningen och pH-skalorna korrigerades som tidigare beskrivits32. Resultaten av den multiparametriska pH-analysen markeras av de vertikala linjerna. För denna specifika fördelning anges värdena för de statistiska parametrarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Med den hyperpolariserade produktselektiva mättnad-excitationsförvärvsmetoden15 är det möjligt att utföra absolut kvantifiering av LDH- och PDH-enzymaktiviteterna. I figur 2 sammanfattas de insamlings- och bearbetningssteg som krävs för denna bestämning. Tabell 1 visar ATP-halten och LDH- och PDH-värdena i fem olika hjärtan. Normalisering av LDH- och PDH-aktiviteterna till ATP-innehållet i varje hjärta minskade variationen i LDH- och PDH-mätningarna över gruppen, vilket kan ses i enzymaktivitetskolumnerna i tabell 1, som uttrycks i enheter av nmol / s / μmol ATP.

Figure 2
Figur 2: Hyperpolariserad 13 C MRS-bearbetning och analys av [1-13C] pyruvatmetabolism. (A) Representativa 13C NMR-spektra förvärvade med produktselektiv mättnad-excitationsmetod under en injektion av 14 mM hyperpolariserat [1-13C] pyruvat i det perfuserade mushjärtat. Signaltilldelning: 1 = [1-13 C] laktat (183,2ppm); 2 = [1-13C]pyruvat (171 ppm); 3 = [13C]bikarbonat (161,1 ppm); * = föroreningar som härrör från [1-13C]pyruvatformuleringen33. (B) Tidsförloppet för de hyperpolariserade signalintensiteter som visas i A. De integrerade intensiteterna av [1-13C] pyruvat (grå) justerades för T1-sönderfalloch RF-pulsering med en Teff-tidskonstant på 32 s (svart), vilket gav den förväntade flödesdynamiken för substratet (inspolning, platå, utspolning). Ytterligare analys utfördes på datapunkterna inom det tidsfönster där den justerade [1-13 C] pyruvatsignalen visade en konstant och maximal [1-13C] pyruvatkoncentration i NMR-röret (markerad i ljusblått). Produktionshastigheterna för LDH och PDH (Equation 18 och ) för de valda tidpunkterna beräknades enligt Eq. 4A och Eq. 4B och Equation 19beräknades sedan i genomsnitt. Medelvärdena för denna injektion (Equation 1 och Equation 1 ) anges i enheter om nmol/s. För visningsändamål multiplicerades det justerade [1-13 C] pyruvatet, [1-13 C] laktat och [13 C] bikarbonatet med 0,143, 10 respektive 80 i förhållande till [1-13C] pyruvatsignalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Hjärta nr. ATP (μmol) LDH-hastighet (nmol/s) PDH-hastighet (nmol/s) LDH-hastighet (nmol/s/μmol ATP) PDH-hastighet (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Medelvärde (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % medelvärde 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabell 1: ATP-innehåll och LDH- och PDH-frekvenser i fem hjärtan. Förkortningar: SD = Standardavvikelse; SD % medelvärde = procentandelen av standardavvikelsen från medelvärdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerar en experimentell uppställning som är utformad för att undersöka hyperpolariserad [1-13C] pyruvatmetabolism, vävnadsenergi och pH i en isolerad mushjärtmodell.

De kritiska stegen i protokollet är följande: 1) säkerställa att buffertens pH är 7,4; 2) se till att alla buffertkomponenter ingår, 3) undvika blodkoagulering i hjärtkärlen genom heparininjektioner; 4) undvika ischemisk skada på hjärtat genom att minska den metaboliska aktiviteten (KCl-injektion och iskall buffert); 5) undvika införande av luftbubblor i hjärtat när som helst under proceduren; 6) validera framgångsrik kanylering av aortan genom vävnadens färg, som ändras från mörkröd till ljusrosa; 7) se till att perfusionen är kontinuerlig när hjärtat flyttas till varm buffert; 8) noggrant övervaka temperaturen inuti NMR-röret i spektrometern bredvid hjärtat och hålla den vid 37 °C; 9) kontroll av magnetfältets homogenitet under hela mätningen, och 10) med noggrann och uppdaterad kalibrering för RF-pulserna.

Modifieringar och felsökning av tekniken
Vi noterar ett par modifieringar som gjordes i denna studie: 1) initieringen av perfusion med iskall KHB efter operation användes för att skydda hjärtat; och 2) valideringen av buffertens pH utfördes genomgående för att säkerställa att denna parameter var under kontroll och inte var en källa till variation i resultaten. Detta gjordes i de olika stegen för förberedelse och experiment med hjälp av en pH-mätare, pH-indikatorremsor och Pi-signalen på 31P-spektrumet.

Källor till variabilitet och hur man korrigerar för dem
Mushjärtat valdes för att passa in i ett 10 mm NMR-rör. Detta lilla hjärta ger dock låga signaler, och det känsliga kirurgiska ingreppet för att isolera och perfusera hjärtat är utmanande. Sammantaget leder detta till varierande vävnadslivskraft och metabolisk aktivitet. För att ta hänsyn till denna variation normaliserade vi de metaboliska hastigheterna för LDH och PDH till ATP-innehållet (dvs mol / s / ATP). En liknande användning av ATP-innehållet som referens rapporterades tidigare i xenograft brösttumörskivor29. Denna typ av normalisering är fördelaktig eftersom den möjliggör jämförelse med resultaten från andra forskare och med andra förhållanden. Dessutom, genom att använda en omvandlingsfaktor från ATP-mängden till vävnadsmassan, kan man härleda den enzymatiska aktiviteten per vävnadsvikt (för vävnaden där metabolism sker).

Förutom variationen mellan olika isolerade hjärtpreparat (dvs från olika djur) visade vävnadens Pi (Pih) kemiska skift en icke-homogen fördelning i denna studie. Lutz et al.32 visade en liknande icke-homogen fördelning i xenografttumörer, och denna fördelning analyserades med hjälp av ett multiparametriskt tillvägagångssätt. I detta arbete implementerades denna metod i det perfuserade mushjärtat. Vi noterar att det är troligt att Pih-signalen huvudsakligen rapporterar om det intracellulära pH, som tidigare angivits16.

Osäkerhet
Ett underliggande antagande vid kvantifiering av Equation 18 och är att den hyperpolariserade [1-13C]pyruvatlösningen fyller hela volymen detekterad av NMR-sonden (Vp, Eq. 4A och Equation 19 Eq. 4B). Den hyperpolariserade [1-13C] pyruvatlösningen strömmar genom hjärtats kranskärl för att fylla de extracellulära och intracellulära facken. Därför antas hjärtvolymen fyllas med den hyperpolariserade lösningen i samma utsträckning som resten av Vp.

Med hjälp av den hyperpolariserade produktselektiva mättnad-excitationsmetoden15,29 kan den enzymatiska aktiviteten kvantifieras oberoende av eventuella variationer i metaboliternasT1 och reversibiliteten hos den enzymatiska reaktionen. Denna bestämning är robust och immun mot variationer i T1 och excitationsprofiler och är sannolikt mer reproducerbar över laboratorier jämfört med analyser av området under kurvan, som är beroende av de specifika förvärvsförhållandena och installationen i varje labb.

Att undersöka [1-13C] pyruvatmetabolism, som ligger vid korsningen av aerob och anaerob metabolism, är av stort värde för att studera hypoxi, ischemi, reperfusionsskada, svält och förändring i hjärtmetabolism, såsom vid diabetisk kardiomyopati. Hyperpolariserade 13C-märkta pyruvatanaloger har testats kliniskt 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, och därför är resultaten av sådana studier sannolikt translationella. Viktigast av allt är att vårt tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av enzymaktivitet i cellen i hela organet.

Den isolerade gnagare hjärtberedningen och de förfaranden och metoder som är involverade i denna forskning kommer att bidra till att öka förståelsen för effekten av en mängd olika stressfaktorer på hjärtfunktion, energi, och metabolism, eftersom de uppmätta parametrarna i denna modell tillskrivs enbart hjärtat. I motsats till råtthjärtat är mushjärtat lämpligt för att studera transgena modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga avslöjanden.

Acknowledgments

Detta projekt fick finansiering från Israel Science Foundation enligt bidragsavtal nr 1379/18; Jabotinsky-stipendiet från det israeliska ministeriet för vetenskap och teknik för tillämpad och ingenjörsvetenskap för direkta doktorander nr 3-15892 för DS; och Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Biologi utgåva 194 Metabolism metabolisk avbildning bildmedel magnetisk resonansspektroskopi laktatdehydrogenas pyruvatdehydrogenas [1-13C] pyruvat pH oorganiskt fosfat
Undersökning av hjärtmetabolism i det isolerade perfuserade mushjärtat med hyperpolariserat [<sup>1-13</sup>C] pyruvat och <sup>13</sup>C/<sup>31</sup>P NMR-spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter