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Biology

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell'attività enzimatica metabolica in tempo reale e un'analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Abstract

Il metabolismo è alla base di importanti processi nella vita cellulare. Caratterizzare il funzionamento delle reti metaboliche nei tessuti viventi fornisce informazioni cruciali per comprendere il meccanismo delle malattie e progettare trattamenti. In questo lavoro, descriviamo procedure e metodologie per studiare l'attività metabolica in cellula in un cuore di topo perfuso retrogradamente in tempo reale. Il cuore è stato isolato in situ, in concomitanza con l'arresto cardiaco per ridurre al minimo l'ischemia miocardica ed è stato perfuso all'interno di uno spettrometro di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mentre nello spettrometro e sotto perfusione continua, il [1-13 C]piruvato iperpolarizzato è stato somministrato al cuore, e i successivi tassi di produzione iperpolarizzati [1-13 C]lattato e [13C] bicarbonato sono serviti a determinare, in tempo reale, i tassi di produzione di lattato deidrogenasi e piruvato deidrogenasi. Questa attività metabolica del [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stata quantificata con spettroscopia NMR in un modello libero utilizzando l'approccio di acquisizione selettiva di saturazione-eccitazione del prodotto. 31 La spettroscopia P è stata applicata tra le acquisizioni iperpolarizzate per monitorare l'energetica cardiaca e il pH. Questo sistema è utile in modo univoco per studiare l'attività metabolica nel cuore di topo sano e malato.

Introduction

Le alterazioni del metabolismo cardiaco sono associate a una varietà di cardiomiopatie e spesso costituiscono la base dei meccanismi fisiopatologici sottostanti1. Tuttavia, ci sono numerosi ostacoli allo studio del metabolismo nei tessuti viventi, poiché la maggior parte dei saggi biochimici richiede l'omogeneizzazione del tessuto e la lisi cellulare e / o il tracciamento radioattivo. Pertanto, vi è una pressante necessità di nuovi strumenti per studiare il metabolismo miocardico nei tessuti viventi. La risonanza magnetica (MR) dei substrati iperpolarizzati marcati con 13C consente misurazioni in tempo reale del metabolismo nei tessuti viventi2, senza l'uso di radiazioni ionizzanti, aumentando il rapporto segnale-rumore MR (SNR) dei siti marcati di diversi ordini di grandezza3. Qui, descriviamo una configurazione sperimentale, un approccio di acquisizione e un approccio analitico per studiare il metabolismo rapido nel cuore di topo isolato e, in parallelo, presentare indicatori di energetica generale del tessuto e acidità. Il pH cardiaco è un indicatore prezioso, poiché l'equilibrio acido-base viene interrotto nelle prime fasi di malattie cardiache e condizioni come ischemia miocardica, ipertrofia disadattiva e insufficienza cardiaca6.

La produzione iperpolarizzata di [1-13 C]lattato e [13 C]bicarbonato da [1-13C]piruvato iperpolarizzato aiuta a determinare i tassi di produzione di lattato deidrogenasi (LDH) e piruvato deidrogenasi (PDH). La maggior parte degli studi precedenti condotti utilizzando substrati iperpolarizzati nel cuore isolato del roditore ha utilizzato modelli cinetici complessi per derivare l'attività enzimatica di LDH e PDH, o ha riportato i rapporti di intensità del segnale del prodotto iperpolarizzato su un substrato senza calcolare i tassi effettivi di attività enzimatica 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Qui, abbiamo utilizzato l'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto 15, che consente il monitoraggio dell'attività enzimatica in modo privo di modelli15,16. In questo modo sono stati determinati i tassi enzimatici assoluti (cioè il numero di moli di prodotto prodotte per unità di tempo). 31 La spettroscopia P è stata utilizzata per osservare i segnali di fosfato inorganico (Pi), fosfocreatina (PCr) e adenosina trifosfato (ATP). Un'analisi multiparametrica è stata utilizzata per caratterizzare la distribuzione del pH del cuore, come dimostrato dallo spostamento chimico eterogeneo nel segnale Pi del tessuto.

Il cuore di topo perfuso retrogradamente (Langendorff heart)17,18,19 è un modello ex vivo per il cuore pulsante intatto. In questo modello, la vitalità cardiaca e il pH sono conservati per almeno 80 minuti20 e ha mostrato un potenziale di recupero dopo una lesione ischemica prolungata21,22. Tuttavia, la variabilità involontaria durante la microchirurgia può portare a variabilità nella vitalità del tessuto attraverso i cuori. Studi precedenti hanno riportato il deterioramento di questo cuore nel tempo19; Ad esempio, è stata osservata una riduzione della funzione contrattile del 5% -10% all'ora18. Il segnale dell'adenosina trifosfato (ATP) ha precedentemente dimostrato di riferire sullo stato energetico miocardico e sulla vitalità23. Qui, abbiamo notato che il cuore perfuso può occasionalmente mostrare una variabilità involontaria nei livelli di vitalità, come dimostrato dal contenuto di ATP, nonostante il fatto che abbiamo avuto una perfusione ininterrotta e un apporto di ossigeno. Dimostriamo qui che normalizzare i tassi di LDH e PDH al contenuto di ATP del cuore riduce la variabilità inter-cardiaca in questi tassi.

Nel seguente protocollo, descriviamo la procedura chirurgica utilizzata per l'incannulamento cardiaco, l'isolamento e la conseguente perfusione nello spettrometro NMR. Da notare, altri approcci chirurgici volti a isolare e perfondere il cuore di topo sono stati descritti prima di24,25.

Vengono descritte anche le metodologie utilizzate per l'acquisizione dei dati relativi ai tassi enzimatici nel cuore pulsante (utilizzando la spettroscopia 13 C e iperpolarizzato [1-13C]piruvato) e la vitalità e l'acidità del cuore (utilizzando la spettroscopia NMR 31P). Infine, vengono spiegate le metodologie analitiche per determinare le attività enzimatiche metaboliche e la vitalità e l'acidità dei tessuti.

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Protocol

Il comitato etico congiunto (IACUC) dell'Università ebraica e dell'Hadassah Medical Center ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-19-15827-1).

1. Preparazione del tampone Krebs-Henseleit

  1. Un giorno prima dell'esperimento, preparare una versione modificata del buffer Krebs-Henseleit (KHB)26. Inizialmente, sciogliere 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO4 in H2O bidistillato.
  2. Bollire questa miscela con 95%/5% O 2/CO 2 per 20 minuti, quindi aggiungere 1,2 mM CaCl2.
  3. Regolare il pH del tampone a 7,4 con HCl o NaOH.
  4. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 10 mM di glucosio e 72 U / L di insulina al KHB preparato nella fase 1.2.
    NOTA: L'insulina viene aggiunta al tampone di perfusione come descritto nel lavoro di Kolwicz et al.26 e in accordo con studi precedenti che riportano che l'insulina aumenta la funzione contrattile27 e l'intensità del segnale iperpolarizzato [13C] bicarbonato 28.

2. Preparazione del sistema di perfusione

  1. Conservare un serbatoio di 200 ml di KHB a bagnomaria a 40 °C e bollire con 95%/5% O 2/CO2 ad una portata di 4 L/min per 1 ora prima della perfusione cardiaca. Mantenere il buffer continuamente gorgogliante con questa miscela di gas per tutta la durata dell'esperimento.
    1. Innanzitutto, impostare il bagno d'acqua a 40 °C. Inserire il serbatoio KHB. Utilizzare una pompa peristaltica (vedere la tabella dei materiali) e tubi di prolunga di grado medico per ricircolare il KHB tra il serbatoio tampone e il tubo NMR da 10 mm a una portata costante di 7,5 ml / min.
    2. Collegare tre tubi in silicone polimerizzato al platino (3 mm i.d.) alla pompa (un tubo di afflusso e due tubi di deflusso per il tampone KH). Inserire le linee di deflusso e afflusso nel buffer KH riscaldato. Quindi, inserire la linea dell'ossigeno nel tampone KH riscaldato.
    3. Utilizzare sottili linee di polietere etere etere chetone (PEEK, vedi Tabella dei materiali) affinché il tampone e l'agente iperpolarizzato fluiscano da e verso il tubo NMR all'interno del foro dello spettrometro.
  2. Assicurarsi che la temperatura sia mantenuta a 37-37,5 °C. Segui i passaggi seguenti.
  3. Avvolgere la linea di afflusso (dal serbatoio tampone al tubo NMR) con un nastro riscaldante impostato a 42 °C.
  4. Riscaldare il tubo NMR all'interno dello spettrometro con un flusso d'aria calda regolato dallo spettrometro.
  5. Utilizzare un sensore di temperatura compatibile NMR (vedere la tabella dei materiali) per misurare la temperatura all'interno del tubo NMR. La temperatura è regolata a 37-37,5 °C.

3. Taratura e preparazione dello spettrometro NMR per l'acquisizione

  1. Il giorno dell'esperimento, inserire un campione standard di 13 C che contiene 1,4-diossano (tabella dei materiali) nello spettrometro e sintonizzare e abbinare la sonda NMR per 13C. Quindi, ottenere uno spettro che mostri il segnale di equilibrio termico di 1,4-diossano con un angolo di nutazione di 90°.
  2. Ora scambiate il campione standard di 13C con un campione standard di 31 P (Table of Materials), che contiene 105 mM di ATP in D2O. Sintonizzare e abbinare la sonda NMR per 31P.
    NOTA: Uno spettro che mostra i segnali di equilibrio termico del fosfato è ottenuto con un angolo di nutazione di 50°.
  3. Inserire la linea di afflusso, la linea di deflusso e la sonda di temperatura in un tubo NMR da 10 mm, quindi inserire il tubo nel foro magnetico. Regolare il nastro riscaldante a 42 °C.
  4. Acquisire uno spettro NMR 31P del buffer KH circolante da utilizzare in quell'esperimento per 30 minuti, con un angolo di nutazione di 50° e un TR di 1,1 s (1.640 acquisizioni).

4. Preparazione animale, procedura chirurgica e perfusione del cuore nel tubo NMR

  1. Anestetizzare un topo maschio HSD:ICR (CD-1) con isoflurano al 3,3% nell'aria ambiente (Table of Materials) a 340 mL/min per 5 minuti utilizzando un sistema di anestesia gassosa (Table of Materials) in una camera a induzione.
  2. Utilizzare l'anestesia nasale per il mantenimento dell'anestesia generale con isoflurano al 2,9%.
    NOTA: Si presta attenzione a ridurre al minimo il dolore e il disagio per l'animale.
  3. Fissare gli arti dell'animale con del nastro adesivo, garantire un riflesso negativo del dolore al pedale e quindi iniettare 300 UI di eparina di sodio per via intraperitoneale.
  4. Bagnare accuratamente la parete toracica e l'addome del topo con alcool al 70% per garantire la pulizia ed evitare la contaminazione o l'ostruzione dei capelli durante la procedura chirurgica.
  5. A 1 minuto dopo l'iniezione di eparina, tagliare la pelle e il muscolo della cavità addominale con piccole forbici.
  6. Posizionare il piccolo morsetto per zanzare che blocca l'emostato a mascella curva tra il processo xifoideo e la pelle del torace per sollevare il torace ed esporre il diaframma. Forare e tagliare il lobo destro del diaframma.
  7. Tagliare il petto attraverso la linea mediana, ritrarre ai lati e quindi rimuovere.
  8. Iniettare il ventricolo sinistro del cuore con 200 UI di eparina di sodio per prevenire la coagulazione del sangue. Quindi, iniettare 0,1 ml di 0,5 mol/L KCl ghiacciato per ottenere un arresto cardiaco, come descritto in precedenza25. L'arresto cardiaco è essenziale per poter cannulare il cuore.
  9. Identificare il timo e rimuoverlo usando le forbici per esporre l'aorta. Rimuovere il tessuto residuo della gabbia toracica.
  10. Identificare l'arco aortico e utilizzare una pinza curva per posizionare un nodo sciolto con una sutura di seta 3-0 (Table of Materials) attorno all'aorta ascendente. Iniettare 3 ml di KHB nel ventricolo sinistro per rimuovere i coaguli di sangue dall'aorta.
  11. Utilizzare una pinza curva per ritrarre il cuore in modo inferiore per una migliore visualizzazione dell'aorta ascendente.
  12. Eseguire l'incannulamento in situ con un catetere endovenoso da 22 G (Table of Materials). Applicare l'adesivo cianoacrilato nella regione cannulata, quindi eseguire la doppia sutura di legatura. Iniettare ulteriore tampone KH nel cuore e verificare che fluisca attraverso il tubo di incannulazione.
  13. Rimuovere la pinza curva. Scollegare il cuore dai visceri circostanti e perfonderlo retrogradamente con KHB ghiacciato (4 °C) attraverso il catetere endovenoso.
  14. Collegare il cuore alla linea di afflusso del sistema di perfusione tramite il catetere endovenoso. All'inizio della perfusione con tampone caldo (37-37,5 °C) a 7,5 ml/min, il cuore inizia a battere spontaneamente.
  15. Fissare il tubo NMR con il cuore pulsante, le linee di deflusso e la sonda di temperatura e inserirlo nel foro dello spettrometro, assicurandosi che il cuore sia al centro della sonda NMR.

5. Acquisizione dei dati per l'energetica cardiaca e il pH

  1. Acquisire spettri 31P per circa 1 ora con un angolo di rotazione di 50 ° e un TR di 1,1 s.

6. Polarizzazione e dissoluzione dello spin DNP

  1. Preparare una formulazione da 28,5 mg di [1-13C]piruvato. Questa formulazione consiste di 11,1 mM a 14,0 mM OX063 radicale nell'acido puro.
  2. Preparare 4 ml di mezzo di dissoluzione. Il mezzo di dissoluzione è costituito da tampone TRIS-fosfato, che contiene 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS e2mM HCl. Questa composizione media viene regolata in modo tale che dopo l'aggiunta di 28,5 mg di [1-13C] formulazione di acido piruvico a 4 ml di questo tampone (nella fase di dissoluzione), il pH della soluzione risultante sarà 7,4.
  3. Eseguire la polarizzazione di spin e la dissoluzione rapida in un dispositivo di polarizzazione di spin DNP (dDNP) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Applicare l'irradiazione a microonde ad una frequenza di 94,110 GHz per la polarizzazione della formulazione di acido piruvico [1-13C] da 1,45 K a 1,55 K per circa 1,5 h.
  4. Miscelare rapidamente i 4 mL di mezzo iperpolarizzato dal dispositivo dDNP con una soluzione ben ossigenata che integra il mezzo di dissoluzione iperpolarizzato per ottenere una composizione che corrisponda strettamente al mezzo di perfusione.
    NOTA: Il volume finale del mezzo che perfonde il cuore durante le iniezioni iperpolarizzate con 14 mM iperpolarizzati [1-13C] piruvato è 26 ml. La composizione finale del mezzo iniettato (dopo miscelazione) contiene 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucosio, 1,2 mM CaCl2e 72 U/L di insulina.
  5. Somministrare il mezzo iperpolarizzato [1-13C]contenente piruvato al cuore isolato utilizzando una configurazione a flusso continuo29.
    NOTA: Questo viene fatto per garantire che la perfusione cardiaca non sia disturbata in nessun momento durante l'esperimento e che il mezzo iperpolarizzato venga somministrato ad una velocità nota e per una durata nota.

7. Spettroscopia iperpolarizzata 13C

  1. Acquisire dati iperpolarizzati 13C utilizzando impulsi di eccitazione saturante selettivi del prodotto 15 applicando impulsi sinusoidali cardinali (Sinc) da 2,5 ms, come descritto in precedenza15,16. Eccitare selettivamente [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato consecutivamente ad intervalli di 6 s per ottenere un intervallo di 12s per ciascun metabolita.
  2. Per il rilevamento di [1-13 C]lattato, centrare l'impulso selettivo di Sinc alla frequenza [1-13 C]piruvato idrato (179,4 ppm), che si traduce in un rapporto di intensità del segnale (lac) di 0,113 per i segnali C 1 di [1-13 C]piruvato a [1-13C]lattato.
  3. Per il rilevamento di [13 C]bicarbonato, centrare l'impulso selettivo Sinc a 157,7 ppm, che è 214 Hz down-field del segnale [13C]bicarbonato (161,1 ppm); ciò si traduce in un rapporto di intensità del segnale (bic) di 0,139 per il segnale C 1 di [1-13C]piruvato a [13C]bicarbonato.

8. Determinazione del peso e del volume umido del tessuto

  1. Alla fine dell'esperimento, staccare il cuore dal sistema di perfusione e asciugarlo delicatamente con carta velina. Successivamente, pesare il cuore per ottenere il peso umido del tessuto.
  2. Determinare il volume del cuore utilizzando un fattore di densità di 1,05 g/cm3, come determinato in precedenza per il cuore di topo30.

9. Quantificazione del contenuto di ATP

  1. Integrare il segnale γ-ATP di una singola acquisizione del campione standard ATP e un'acquisizione di 30 minuti (TR di 1,1 s e 1.640 acquisizioni) del cuore isolato.
  2. Quantificare il contenuto di ATP del cuore confrontando l'integrale del segnale γ-ATP del cuore con quello dello standard (Table of Materials), dove quest'ultimo ha una concentrazione nota (105 mM), e correggere il numero di acquisizioni ed effetti di rilassamento.

10. Risolvere il segnale Pi del cuore

NOTA: Per valutare il pH tissutale, è necessario prima deconvolgere il segnale Pi del cuore da quello del segnale Pi totale (Pit). Questo viene fatto omettendo il segnale del KHB Pi (PiKH) da quello del Pit.

  1. In uno spettro 31P di KHB che mostra un singolo segnale Pi (Pi KH, Figura 1A), adattare il segnale PiKH a una funzione lorentziana usando Excel (Table of Materials).
  2. Il volume visibile alla sonda NMR (Vp, 1,375 ml), contiene più KHB quando la provetta non contiene il cuore. Per correggere questo effetto di riempimento, calcolare il segnale tampone attenuato (Pib) utilizzando Eq. 1A.
    Equation 1Eq. 1A
    dove Vh è il volume del cuore, come determinato al punto 8.
  3. Sottrarre questo segnale dal Pit secondo Eq. 1B per ottenere il segnale Pi derivante esclusivamente dal cuore perfuso (Pih, Figura 1B).
    Equation 2Eq. 1B

11. Analisi multiparametrica del pH

  1. Eseguire la conversione della distribuzione dello spostamento chimico del segnale Pih al pH con riferimento allo spostamento chimico di PCr utilizzando Eq. 231.
    Equation 3Eq. 2
    dove Δδ è la differenza di spostamento chimico, pKa è 6,72, δ base libera è 5,69 e δ acido libero è 3,27, come descritto in precedenza31.
  2. Correggere la curva di distribuzione del pH risultante per la non linearità tra la scala di spostamento chimico di Pih e la scala di pH secondo Lutz et al.32. Una distribuzione tipica del pH risultante da questo calcolo è presentata nella Figura 1C.
  3. Analizzare la distribuzione del pH tissutale con un approccio multiparametrico utilizzando sette parametri statistici seguendo il lavoro di Lutz et al. 32. Quattro di questi parametri sono qui presentati in quanto sembrano essere i più descrittivi del pH tissutale: 1) pH massimo globale; 2) pH medio ponderato; 3) pH mediano ponderato; e 4) asimmetria del grafico del pH (Figura 1C).

12. Calcolo delle attività LDH e PDH

NOTA: I tassi di produzione dei metaboliti iperpolarizzati [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato sono utilizzati per calcolare le attività LDH e PDH, rispettivamente. Nell'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto15, solo i metaboliti iperpolarizzati appena sintetizzati vengono rilevati da ciascuna eccitazione selettiva.

  1. Utilizzare il segnale iperpolarizzato [1-13C]piruvato come riferimento per determinare il corrispondente livello di produzione di metaboliti.
    1. Durante la perfusione con il mezzo iperpolarizzato, la concentrazione di [1-13 C]piruvato nel tubo NMR aumenta (wash-in), quindi si stabilizza (ad una concentrazione massima di 14mM) e quindi diminuisce (wash-out).
    2. Per identificare i punti temporali in cui la concentrazione di piruvato ha raggiunto un livello costante (plateau), correggere il segnale [1-13C]piruvato per il decadimento del segnale risultante dal rilassamento di T1 e dalla pulsazione RF utilizzando la costante di rilassamento effettiva, Teff.
    3. Per ogni iniezione, definire il Teff in base alla sua capacità di correggere la curva di decadimento del piruvato [1-13C] per mostrare questa dinamica del flusso (Eq.3).
      Equation 4Eq. 3
      dove Equation 5 è il segnale [1-13 C]piruvato che è stato acquisito durante l'acquisizione di [13C]bicarbonato. Il Teff medio negli esperimenti qui descritti è risultato essere 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 cuori).
    4. Selezionare i punti dati in cui la concentrazione è entro il 10% del segnale massimo corretto [1-13C]piruvato per ulteriori analisi.
  2. Utilizzare i dati corrispondenti della produzione di [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato per i punti temporali selezionati nella fase 12.1per il calcolo dei tassi di produzione dei metaboliti utilizzando Eq. 4A ed Eq. 4B, a condizione che l'SNR del segnale metabolita sia maggiore di 2 (soglia per l'analisi). Un tipico esempio di tale selezione di punti temporali è mostrato nella Figura 2B (finestra temporale evidenziata).
  3. Calcola i tassi di produzione di ciascuno dei punti dati selezionati utilizzando Eq. 4A ed Eq. 4B:
    Equation 17Eq. 4A
    Equation 6Eq. 4B
    dove Equation 7 e sono i tassi di produzione di [1-13 C]lattato o [13 C]bicarbonato in ciascun punto temporale, rispettivamente. Equation 9 e sono fattori che rappresentano rispettivamente l'eccitazione relativa di [1-13 C]piruvato e Equation 10 Equation 8 dei prodotti [1-13 C]lattato o [13C]bicarbonato. Questi fattori sono stati determinati in precedenza per essere 0,113 e 0,139, rispettivamente29. Vp è il volume rilevato dalla sonda NMR (1,375 ml), TR indica l'intervallo di tempo tra due eccitazioni consecutive di saturazione selettiva del prodotto (12 s per ciascun prodotto), Equation 11 e sono i segnali di [1-13 C]lattato e [13 C]bicarbonato, rispettivamente, e e sono i segnali di [1-13C]piruvato che sono stati acquisiti durante il [1-13 C]lattato e Equation 12 Equation 13 Equation 14 [13 C]eccitazioni di bicarbonato, rispettivamente. [Pyr] è la concentrazione di [1-13 C]piruvato, che era di 14mM durante la fase di plateau.
    1. Determinare la velocità per ciascun punto e quindi la media per iniezione iperpolarizzata.

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Representative Results

Gli spettri 31P registrati da un cuore di topo perfuso con KHB e dal solo tampone sono mostrati nella Figura 1A. I segnali di α-, β- e γ-ATP, PCr e Pi sono stati osservati nel cuore. Il segnale Pi era composto da due componenti principali: nel campo superiore (lato sinistro del segnale), il segnale Pi era principalmente dovuto al KHB ad un pH di 7,4; nel campo inferiore (lato destro del segnale), il segnale Pi era più ampio e meno omogeneo a causa dell'ambiente più acido. Quest'ultimo modello deriva dal tessuto cardiaco. Il segnale Pi del tessuto cardiaco viene estratto sottraendo il segnale Pi del KHB (Figura 1B) e quindi convertito dalla scala ppm alla scala del pH (Figura 1C). Il pH viene studiato utilizzando un'analisi multiparametrica del segnale Pi tissutale calcolando la media ponderata, la mediana ponderata, il massimo globale e l'asimmetria (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Spettri tipici di 31 P, distinzione tra il segnale Pi del KHB e del cuore, conversione dallo spostamento chimico agli assi pH e parametri statistici della distribuzione del pH. (A) Il pannello superiore mostra uno spettro NMR tipico di 31P ottenuto da un cuore di topo perfuso con KHB nello spettrometro, mentre il pannello inferiore mostra uno spettro ottenuto dal solo KHB. La regione spettrale contrassegnata da trattini viene ingrandita nel pannello B. Abbreviazioni: Pi = fosfato inorganico; PCr = fosfocreatina; ATP = adenosina trifosfato; ADP = adenosina difosfato. (B) Lo spettro originale è mostrato in nero (Pit); la curva tratteggiata mostra il segnale Pi solo dal buffer (Pib). Quest'ultimo è stato ottenuto adattando una forma di linea lorentziana con il suo centro alla corrispondente componente KHB del segnale Pit e regolando la quantità di KHB nella sonda dopo l'inserimento del cuore (secondo Eq. 1A). Il segnale Pi attribuito al cuore (Pih) è mostrato in arancione, e questo si ottiene sottraendo il segnale Pib dal segnale Pit (secondo Eq. 1B). (C) Conversione della distribuzione dello spostamento chimico del segnale Pih mostrata in (B) in una distribuzione di pH e in un'analisi multiparametrica del pH. La non linearità tra lo spostamento chimico e le scale di pH è stata corretta come descritto in precedenza32. I risultati dell'analisi multiparametrica del pH sono contrassegnati dalle linee verticali. Per questa distribuzione specifica, vengono forniti i valori dei parametri statistici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Con l'approccio di acquisizione selettiva di saturazione-eccitazioni del prodotto iperpolarizzato15, è possibile eseguire la quantificazione assoluta delle attività degli enzimi LDH e PDH. Nella Figura 2 vengono riepilogate le fasi di acquisizione ed elaborazione necessarie per questa determinazione. La tabella 1 mostra il contenuto di ATP e i tassi di LDH e PDH in cinque cuori diversi. La normalizzazione delle attività LDH e PDH al contenuto di ATP di ciascun cuore ha ridotto la variabilità nelle misurazioni di LDH e PDH in tutto il gruppo, come si può vedere nelle colonne di attività enzimatica nella Tabella 1, che sono espresse in unità di ATP nmol / s / μmol.

Figure 2
Figura 2: Elaborazione iperpolarizzata di 13 C MRS e analisi del metabolismo del [1-13C]piruvato. (A) Spettri NMR rappresentativi di 13 C acquisiti con l'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto durante un'iniezione di 14 mM di [1-13C]piruvato iperpolarizzato nel cuore di topo perfuso. Assegnazione del segnale: 1 = [1-13 C]lattato (183,2ppm); 2 = [1-13C]piruvato (171 ppm); 3 = [13C]bicarbonato (161,1 ppm); * = impurezze derivanti dalla formulazione [1-13C]piruvato33. (B) Andamento temporale delle intensità del segnale iperpolarizzato visualizzate in A. Le intensità integrate di [1-13C]piruvato (grigio) sono state regolate per il decadimento T1e la pulsazione RF con una costante di tempo Teff di 32 s (nero), e questo ha prodotto la dinamica di flusso attesa per il substrato (wash-in, plateau, wash-out). Ulteriori analisi sono state eseguite sui punti dati all'interno della finestra temporale in cui il segnale [1-13 C]piruvato regolato ha mostrato una concentrazione costante e massima di [1-13C]piruvato nel tubo NMR (evidenziato in azzurro). I tassi di produzione di LDH e PDH (Equation 18 e ) per i punti temporali selezionati sono stati calcolati in base a Eq. 4A e Eq. 4B e Equation 19quindi mediati. I valori medi per questa iniezione (Equation 1 e Equation 1 ) sono forniti in unità di nmol/s. Ai fini della visualizzazione, il [1-13 C]piruvato aggiustato, il [1-13 C]lattato e il [13 C]bicarbonato sono stati moltiplicati per 0,143, 10 e 80, rispettivamente, rispetto al segnale [1-13C]piruvato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Cuore No. ATP (μmol) Tasso LDH (nmol/s) Tasso PDH (nmol/s) Tasso di LDH (nmol/s/μmol ATP) Tasso di PDH (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Media (DS) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % Media 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabella 1: Contenuto di ATP e tassi di LDH e PDH in cinque cuori. Abbreviazioni: SD = Deviazione standard; DS % Media = la percentuale della deviazione standard dalla media.

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Discussion

Dimostriamo una configurazione sperimentale progettata per studiare il metabolismo iperpolarizzato [1-13C] del piruvato, l'energetica dei tessuti e il pH in un modello di cuore di topo isolato.

I passaggi critici all'interno del protocollo sono i seguenti: 1) garantire che il pH del tampone sia 7,4; 2) garantire che tutti i componenti del buffer siano inclusi; 3) evitare la coagulazione del sangue nei vasi cardiaci mediante iniezioni di eparina; 4) evitare il danno ischemico al cuore riducendo l'attività metabolica (iniezione di KCl e tampone ghiacciato); 5) evitare l'introduzione di bolle d'aria nel cuore in qualsiasi punto della procedura; 6) convalidare con successo l'incannulamento dell'aorta dal colore del tessuto, che cambia dal rosso scuro al rosa chiaro; 7) assicurarsi che la perfusione sia continua una volta che il cuore viene spostato in tampone caldo; 8) monitorare attentamente la temperatura all'interno del tubo NMR nello spettrometro vicino al cuore e mantenerla a 37 °C; 9) verificare l'omogeneità del campo magnetico durante tutta la misura; e 10) utilizzando una calibrazione accurata e aggiornata per gli impulsi RF.

Modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica
Notiamo un paio di modifiche che sono state apportate in questo studio: 1) l'inizio della perfusione con KHB ghiacciato in seguito alla chirurgia è stato impiegato per proteggere il cuore; e 2) la convalida del pH tampone è stata eseguita per assicurarsi che questo parametro fosse sotto controllo e non fosse una fonte di variazione nei risultati. Questo è stato fatto nelle varie fasi di preparazione e sperimentazione utilizzando un pHmetro, strisce di indicatore di pH e il segnale Pi sullo spettro 31P.

Fonti di variabilità e come correggerle
Il cuore del topo è stato scelto per adattarsi a un tubo NMR da 10 mm. Tuttavia, questo piccolo cuore fornisce segnali bassi e la delicata procedura chirurgica per isolare e perfondere il cuore è impegnativa. Nel complesso, questo porta alla vitalità dei tessuti variabile e all'attività metabolica. Per tenere conto di questa variabilità, abbiamo normalizzato i tassi metabolici di LDH e PDH al contenuto di ATP (cioè mole / s / ATP). Un uso simile del contenuto di ATP come riferimento è stato precedentemente riportato nelle fette di tumore al seno xenograft29. Questo tipo di normalizzazione è vantaggioso perché consente il confronto con i risultati di altri ricercatori e con altre condizioni. Inoltre, utilizzando un fattore di conversione dalla quantità di ATP alla massa tissutale, si può ricavare l'attività enzimatica per peso tissutale (per il tessuto in cui si verifica il metabolismo).

Oltre alla variabilità tra diversi preparati cardiaci isolati (cioè da animali diversi), lo spostamento chimico del Pi (Pih) del tessuto ha mostrato una distribuzione non omogenea in questo studio. Lutz et al.32 hanno dimostrato una distribuzione non omogenea simile nei tumori xenotrapianti, e questa distribuzione è stata analizzata utilizzando un approccio multiparametrico. In questo lavoro, questa metodologia è stata implementata nel cuore di topo perfuso. Notiamo che è probabile che il segnale Pih riporti prevalentemente sul pH intracellulare, come indicato in precedenza16.

Incertezza
Un'ipotesi sottostante nella quantificazione di Equation 18 e Equation 19 è che la soluzione iperpolarizzata [1-13C]piruvato stia riempiendo l'intero volume rilevato dalla sonda NMR (Vp, Eq. 4A ed Eq. 4B). La soluzione iperpolarizzata [1-13C] piruvato scorre attraverso le arterie coronarie del cuore per riempire i compartimenti extracellulari e intracellulari. Pertanto, si presume che il volume cardiaco sia riempito con la soluzione iperpolarizzata nella stessa misura del resto del Vp.

Utilizzando l'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto iperpolarizzato15,29, l'attività enzimatica può essere quantificata indipendentemente da eventuali variazioni nel T1 dei metaboliti e dalla reversibilità della reazione enzimatica. Questa determinazione è robusta e immune alle variazioni di T1 e dei profili di eccitazione ed è probabilmente più riproducibile tra i laboratori rispetto alle analisi dell'area sotto la curva, che dipendono dalle specifiche condizioni di acquisizione e dalla configurazione in ciascun laboratorio.

Studiare il metabolismo del piruvato [1-13C], che è al crocevia del metabolismo aerobico e anaerobico, è di grande valore per studiare ipossia, ischemia, danno da riperfusione, fame e alterazione del metabolismo cardiaco, come nella cardiomiopatia diabetica. Gli analoghi iperpolarizzati del piruvato marcati con 13C sono stati testati clinicamente 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43 e, pertanto, i risultati di tali studi sono probabilmente traslazionali. Ancora più importante, il nostro approccio consente la quantificazione dell'attività enzimatica in-cell nell'intero organo.

La preparazione del cuore isolato dei roditori e le procedure e le metodologie coinvolte in questa ricerca aiuteranno a comprendere ulteriormente l'effetto di una varietà di fattori di stress sulla funzione cardiaca, sull'energetica e sul metabolismo, poiché i parametri misurati in questo modello sono attribuiti esclusivamente al cuore. A differenza del cuore di ratto, il cuore di topo è adatto per lo studio di modelli transgenici.

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Disclosures

Non ci sono divulgazioni.

Acknowledgments

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla Israel Science Foundation nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 1379/18; la borsa di studio Jabotinsky del Ministero israeliano della scienza e della tecnologia per le scienze applicate e ingegneristiche per i dottorandi diretti n. 3-15892 per DS; e il programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

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References

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Biologia Numero 194 Metabolismo imaging metabolico agente di imaging spettroscopia di risonanza magnetica lattato deidrogenasi piruvato deidrogenasi [1-13C]piruvato pH fosfato inorganico
Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e <sup>spettroscopia NMR 13</sup>C / <sup>31</sup>P<sup></sup>
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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

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