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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Abstract

La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional que regula no solo la estabilidad sino también la localización y función de una proteína sustrato. El proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula casi todos los procesos biológicos celulares básicos. La purificación de proteínas ubiquitinadas ayuda a la investigación del papel de la ubiquitinación en el control de la función de las proteínas de sustrato. Aquí, se describe un procedimiento paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos con la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes. La proteína p53 marcada con Flag celular total se purificó con agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag en condiciones no desnaturalizantes. Alternativamente, la proteína ubiquitinada marcada con His celular total se purificó utilizando resina cargada de níquel en condiciones de desnaturalización. Las proteínas p53 ubiquitinadas en los eluidos se detectaron con éxito con anticuerpos específicos. Usando este procedimiento, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas.

Introduction

La ubiquitina es una proteína evolutivamente conservada de 76 aminoácidos 1,2,3. La ubiquitina se une covalentemente a los residuos de lisina en las proteínas diana a través de cascadas que involucran enzimas activadoras (E1), conjugadas (E2) y ligasas (E3). La ubiquitina es activada primero por la enzima E1 y luego se transfiere a las enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, las ligasas de ubiquitina E3 interactúan tanto con las enzimas E2 cargadas de ubiquitina como con las proteínas de sustrato y median la formación de un enlace isopeptídico entre el C-terminal de ubiquitina y un residuo de lisina en el sustrato 1,2,3,4,5. La ubiquitinación implica la unión de restos de ubiquitina a residuos de lisina en proteínas de sustrato o a sí misma, lo que lleva a la monoubiquitinación de proteínas o poliubiquitinación. Este proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula una gran variedad de procesos biológicos. La ubiquitinación resulta en la degradación de proteínas sustrato a través del sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Además, la ubiquitinación modula la localización subcelular de proteínas, la formación de complejos proteicos y el tráfico de proteínas en las células 3,5. Las fracciones de ubiquitina ligadas a proteínas sustrato pueden ser eliminadas por enzimas desubiquitinantes (DUB)6,7. En particular, las diferentes formas en que se ensamblan las cadenas de ubiquitina proporcionan una miríada de medios para regular diversos procesos biológicos 1,5. Los roles exactos de la ubiquitinación en la regulación de la función de la proteína sustrato siguen sin entenderse completamente hasta ahora. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a la elucidación de los efectos de la ubiquitinación de proteínas en una variedad de procesos celulares.

La proteína p53 es una de las proteínas supresoras de tumores más importantes y exhibe mutaciones genéticas o inactivación en casi todos los cánceres humanos 8,9,10,11. La estabilidad y la actividad de p53 están delicadamente reguladas in vivo mediante modificaciones postraduccionales, incluyendo ubiquitinación, fosforilación, acetilación y metilación12,13. La proteína p53 tiene una vida media corta que varía de 6 min a 40 min en varias células, lo que resulta principalmente de su poliubiquitinación y posterior degradación proteasómica10,12. El ratón doble minuto 2 (Mdm2) es una ubiquitina ligasa E3 de p53 que se une al N-terminal de p53 para inhibir su actividad transcripcional12,14,15. Mdm2 promueve la poliubiquitinación y degradación proteasómica de p53 para controlar su estabilidad e induce la monoubiquitinación de p53 para facilitar su exportación nuclear12,14,15,16. Aquí, la ubiquitinación de p53 mediada por Mdm2 se utiliza como ejemplo para introducir un método para la purificación de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos en detalle. Los reguladores que influyen en el estado de ubiquitinación de las proteínas diana se pueden identificar utilizando este ensayo de ubiquitinación in vivo cuando se sobreexpresan o se derriban / eliminan en células de mamíferos. Además, las proteínas ubiquitinadas se pueden utilizar como sustratos para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Se puede realizar un cribado de alto rendimiento para identificar DUB específicos para proteínas diana mediante la incubación de sustratos ubiquitinados con DUB individuales. Las proteínas ubiquitinadas pueden actuar como un andamio para reclutar proteínas de señalización aguas abajo en las células. Un complejo de proteína diana ubiquitinado puede purificarse mediante inmunoprecipitación secuencial en condiciones de purificación nativas e identificarse mediante espectrometría de masas. El protocolo actual se puede utilizar ampliamente para investigar las proteínas celulares reguladas por ubiquitinación.

Se han establecido varios métodos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluyen el uso de ubiquitina marcada por afinidad, anticuerpos de ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y dominios aislados de unión a ubiquitina (UBD)17. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza ubiquitina marcada con afinidad como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos. El uso de ubiquitina poli-marcada con His ofrece ventajas sobre los otros métodos. Las proteínas ubiquitinadas se purifican en presencia de desnaturalizantes fuertes, lo que reduce la unión no específica a la resina cargada de níquel mediante la linealización de proteínas celulares y la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Por el contrario, el uso de anticuerpos contra la ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y UBD aisladas como mediadores no puede excluir eficazmente a los socios de unión de la proteína diana porque la purificación debe realizarse en condiciones menos estrictas. Además, la purificación también puede conducir a una mayor unión de proteínas no relacionadas utilizando estos mediadores. Además, existe una propensión a la unión a varios tipos de enlaces de ubiquitina, así como a la mono y poliubiquitinación por proteínas de unión a ubiquitina o UBD aisladas17. El uso de ubiquitina poli-marcada con His contribuye a derribar todas las proteínas ubiquitinizadas celulares. Alternativamente, el uso de agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag o anti-HA disponibles comercialmente facilita la inmunoprecipitación de proteínas diana marcadas con Flag o HA a gran escala en condiciones no desnaturalizantes. Un segundo paso de purificación, por ejemplo, mediante resina cargada de níquel dirigida a ubiquitina poli-marcada con His, se puede utilizar para adquirir proteínas diana ubiquitinadas con una alta pureza para experimentos posteriores. En particular, una estrategia de purificación de marcado de epítopos se puede adaptar cuando no se puede adquirir un anticuerpo específico para inmunoprecipitar proteínas diana de manera efectiva. Finalmente, la purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos, en comparación con la purificación in vitro, conserva el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más fisiológicas.

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Protocol

NOTA: Las células H1299 fueron amablemente proporcionadas por el Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias y se demostró que eran negativas para la contaminación por micoplasma.

1. Cultivo celular

  1. Para el cultivo inicial, colocar 1 x 106 células de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, H1299 en una placa de Petri de 10 cm con 10-12 ml de RPMI 1640 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aditivo de glutamina, 1% de piruvato de sodio y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Mantener las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% deCO2. Divida las células cada 2-3 días dependiendo de cuándo alcancen el 80% -90% de confluencia.
  2. Un día antes de la transfección, preparar 6-9 x 10 6 células para tres placas de Petri y placa 2-3 x 106 células en una sola placa de Petri de 10 cm que contenga 10-12 ml de medio para lograr una confluencia de 70% -90% durante la transfección.
    NOTA: Las células HEK293T también se pueden utilizar para purificar proteínas ubiquitinadas debido a su alta eficiencia de transfección y nivel de expresión de proteínas.

2. Transfección de plásmidos

  1. Agregue 1.5 ml de medio sérico reducido en tres tubos centrífugos de 15 ml.
  2. Agregue ADN plásmido listo para la transfección a cada tubo para hacer diluciones de la siguiente manera. Tubo 1: 1 μg de plásmido Flag-p53, 12 μg de vector vacío; Tubo 2: 1 μg de plásmido Flag-p53, 3 μg de plásmido His-HA-Ub (HH-Ub) y 9 μg de vector vacío; Tubo 3: 1 μg de plásmido Flag-p53, 3 μg de plásmido HH-Ub y 9 μg de plásmido Mdm2. Agregue un total de 0,2 μg de plásmido de proteína fluorescente verde (GFP) a cada tubo para controlar la eficiencia de la transfección.
    NOTA: Se debe realizar un experimento piloto para determinar las cantidades óptimas de plásmidos necesarios para lograr una expresión eficiente de proteínas diana en las células.
  3. Agregue 78 μL de reactivo de transfección de liposomas a 4.5 ml de medio sérico reducido en otro tubo de centrífuga para diluir los liposomas. Mezclar bien moviendo el tubo y dejar reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
  4. Añadir 1,5 ml de la solución liposomal diluida en cada tubo del paso 2.2 que contiene 1,5 ml de la solución de ADN diluida. Mezclar bien y entrelazar los plásmidos con los liposomas durante al menos 20 minutos en RT. Utilice una relación ADN plásmido: liposomas de 1:2 (μg:μL) para cada transfección.
  5. Deseche el medio original de las placas de Petri y agregue 9 ml de medio sérico reducido en cada plato. Agregue 3 ml de la mezcla de liposomas y ADN a cada plato y mezcle la solución agitando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás 3x, y luego izquierda y derecha 3x para una distribución uniforme de la mezcla en la placa.
  6. Cultivar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2. Reemplace el medio después de 4-6 h y continúe cultivando las células durante 24-36 h.

3. Recolección de células

  1. Después de 24-36 h, tratar las células con MG132 a una concentración final de 10 μM durante 4-6 h.
    NOTA: MG132 es un aldehído peptídico que bloquea eficientemente la actividad proteolítica del complejo proteasómico 26S. Las cantidades de proteínas ubiquitinadas con cadenas de poliubiquitina ligadas a lisina-48 (K48) pueden aumentarse después de que las células se tratan con MG132 u otros inhibidores del proteasoma.
  2. Deseche el medio, lave las células 2 veces (teniendo cuidado de no eliminar las células) con solución salina tamponada con fosfato helado (PBS) y aspire las células con pipetas serológicas.
  3. Agregue 1 ml de PBS al plato, retire las células raspando con un raspador limpio y transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 x g durante 5 min para recoger los gránulos celulares.

4. Purificación de proteínas ubiquitinadas en condiciones no desnaturalizantes

  1. Prepare el tampón de lisis Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 1% Triton X-100, 0.2% sarkosyl y 10% glycerol) recién suplementado con cóctel inhibidor de proteasa antes de su uso.
  2. Añadir 800 μL de tampón de lisis Flag helado a las celdas de cada tubo, mezclar las células con un oscilador de vórtice o una pipeta y, a continuación, incubar la mezcla en un rotador a 4 °C durante 30 min.
  3. Someta la mezcla a 5-10 pulsos breves de ultrasonido. Realice la ultrasonicación en el hielo a una frecuencia de sonicación de 20 kHZ y 80% de amplitud con cada pulso que dura 1 s. Incubar la mezcla en un rotador a 40 revoluciones por minuto (rpm) a 4 °C durante 30 min.
  4. Centrifugar las muestras ultrasónicas a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  5. Alícuota 80 μL (1/10) del extracto celular y mezclar con 20 μL de 5x tampón de carga de dodecil sulfato de sodio (SDS). Hervir las muestras a 98 °C durante 5 minutos, enfriar en hielo durante 2 minutos y almacenar a -20 °C hasta su uso. Utilice estas muestras como grupo de entrada para controlar la expresión de proteínas.
  6. Añadir 30 μL de perlas conjugadas con anticuerpos anti-Flag M2 (Flag/M2) a los extractos celulares restantes e incubar en un rotador a 4 °C durante al menos 4 h o durante la noche.
  7. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recoger las perlas. Agregue 1 ml de tampón de lisis Flag helado a las perlas y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
  8. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recoger las perlas. Repita el paso 4.7 de 4 a 6 veces.
  9. Añadir 40 μL de péptidos Flag a una concentración final de 200 ng/μL a las perlas e incubar en un rotador a 4 °C durante 2 h para eluyir las proteínas unidas.
  10. Centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  11. Añadir 10 μL de tampón de carga 5x SDS, hervir la mezcla a 98 °C durante 5 min, enfriar en hielo durante 2 min, y almacenar a -20 °C para la Western blotting. Alternativamente, almacenar el eluido del paso 4.10 directamente a -80 °C para otros experimentos posteriores.
    NOTA: La cantidad de proteínas ubiquitinadas purificadas se puede ampliar aumentando el número de células y las cantidades de plásmidos transfectados. Se puede adaptar una estrategia de marcado de epítopos para purificar complejos celulares que se unen específicamente a p53 ubiquitinado en condiciones de purificación nativas. Al coexpresar Flag-p53, mdm2 y HA-ubiquitina, el complejo proteico p53 ubiquitinado puede ser inmunoprecipitado por agarosa secuencial conjugada con anticuerpos Flag y HA de células de mamíferos. Para mantener a los socios de unión de las proteínas p53 ubiquitinadas, se debe usar el tampón de lisis BC100 menos estricto (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% de glicerol, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 y 1x inhibidor de proteasa) durante el proceso de purificación. El eluido del péptido HA se somete a espectrometría de masas para identificar todos los socios que se unen específicamente a p53 ubiquitinado.

5. Purificación de proteínas ubiquitinadas en condiciones de desnaturalización

  1. Añadir 1 ml de PBS helado a los gránulos celulares obtenidos en el paso 3.3 y mezclar uniformemente. Alícuota 100 μL (1/10 volumen) de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga como muestra de entrada.
  2. Centrifugar a 700 x g durante 5 min a 4 °C para recoger los gránulos celulares. Añadir 80 μL de tampón de lisis Flag a la muestra de entrada, mezclar las células con un oscilador de vórtice o una pipeta, y lisar las células en hielo durante 1 h.
  3. Centrifugar a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Alícuota 80 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
  4. Añadir 20 μL de tampón de carga 5x SDS al sobrenadante, hervir a 98 °C durante 5-10 min, enfriar en hielo durante 2 min y almacenar a -20 °C hasta su uso.
  5. Centrifugar los 900 μL restantes de la suspensión celular a 700 x g durante 5 min a 4 °C para recoger el pellet celular. Agregue 1 ml de tampón de ubiquitina 1 (tampón UB 1; 6 M guanidina-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) y0.2% Triton X-100, recién suplementado con 10 mM β-mercaptoetanol y 5 mM de imidazol) a los gránulos celulares y mezcle varias veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las células.
    NOTA: La concentración de imidazol puede variar de 5 mM a 20 mM para disminuir la unión de proteínas no específicas en la resina cargada de níquel. El tampón de ubiquitina contiene clorhidrato de guanidina, que inactiva tanto las ligasas como los DUB. β-mercaptoetanol es un líquido transparente e incoloro con un olor fuerte y desagradable similar a los huevos podridos. Una solución de alta concentración causará daños graves a la membrana mucosa, el tracto respiratorio superior, la piel y los ojos. Use guantes y gafas y opere en la campana extractora.
  6. Someter los lisados celulares a 10-20 rondas de ultrasonidos hasta que la solución ya no sea viscosa. Realice la ultrasonicación en el hielo a una frecuencia de sonicación de 20 kHZ y 80% de amplitud con cada pulso que dura 1 s. Centrifugar a 8.000 x g durante 20-30 min a RT y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  7. Añadir 30 μL de resina cargada de níquel al sobrenadante e incubar en un rotador ajustado a 15 rpm durante 4 h o durante la noche a RT. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min en RT para recoger las perlas.
  8. Añadir 1 ml de tampón UB 1, incubar con rotación en un agitador durante 10 min a RT, y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a RT para recoger las perlas.
  9. Añadir 1 ml de tampón de ubiquitina 2 (tampón UB 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) y 0,2% Triton X-100) a las perlas, incubar con rotación en un agitador durante 10 min a RT, y centrifugar a 1.500 x g durante2min para recoger las perlas. Repita esto una vez más.
  10. A las perlas, agregue 1 ml de PBS, incubar con rotación en un agitador durante 10 minutos en RT y centrifugar a 1,500 x g durante 2 minutos en RT para recolectar las perlas. Repita esto una vez más.
  11. Eluyente unido a proteínas incubando las perlas con 40 μL de imidazol a una concentración final de 0,5 M durante 1 h a RT. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a RT.
  12. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio, agregue 10 μL de tampón de carga SDS 5x, hierva a 98 °C durante 5 minutos, enfríe en hielo durante 2 minutos y guárdelo a -20 °C para la Western blotting. Alternativamente, almacenar el eluido sin procesar a -80 °C para otros experimentos posteriores.

6. Detección de proteínas ubiquitinadas purificadas por Western blot

  1. Resolver las muestras de los pasos 4.11 y 5.12 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), y luego transferirlas a una membrana de nitrocelulosa mediante Western blotting para detectar proteínas diana utilizando los anticuerpos correspondientes como se describe18.
  2. En resumen, incubar la membrana sumergiendo en 20 ml de solución de bloqueo que contenga 5% de leche en polvo en tampón TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, recién suplementado con 0.1% Tween-20 antes de su uso) en RT durante 1 h. A continuación, incubar la membrana con anticuerpos primarios a RT durante 2 h o durante la noche a 4 °C. Use los siguientes anticuerpos para cada conjunto. Todos los anticuerpos primarios se utilizaron en una dilución de 1:1000.
    1. Detectar la proteína p53 total, incluida la p53 ubiquitinada, con un anticuerpo monoclonal anti-p53 después de la inmunoprecipitación con perlas de agarosa Flag/M2.
    2. Detectar proteínas p53 ubiquitinadas con un anticuerpo anti-HA o anticuerpo antiubiquitina después de la inmunoprecipitación con perlas de agarosa Flag/M2.
    3. Detecte proteínas p53 ubiquitinadas con un anticuerpo monoclonal anti-p53 después de la extracción de resina cargada de níquel.
    4. Detectar proteína ubiquitinada total con un anticuerpo anti-HA o anticuerpo antiubiquitina después de la extracción de resina cargada de níquel.
  3. Incubar la membrana con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a RT durante 1 h después de lavar 3x con tampón TBST durante 5 min cada uno. Todos los anticuerpos secundarios se utilizaron en una dilución de 1:3000. Luego, lave la membrana con tampón TBST 3x durante 5 minutos cada uno con una agitación suave.
  4. Inicie el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para detectar señales de Western blotting. Preparar la solución de sustrato para HRP mezclando las soluciones A y B en una proporción de 1:1.
  5. Coloque la membrana de nitrocelulosa en la cámara oscura boca arriba y cubra la solución de sustrato uniformemente sobre la membrana con una pistola de pipeteo. Seleccione el procedimiento de exposición automática para capturar señales quimioluminiscentes y ajuste manualmente el tiempo de exposición hasta que se adquiera una señal ideal.

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Representative Results

El diagrama esquemático muestra las proteínas p53 (Flag-p53) y ubiquitina doble marcada con His/HA (HH-Ub) (Figura 1A). Los procedimientos utilizados para purificar las proteínas ubiquitinadas se resumen en la Figura 1B. La ubiquitina marcada con Poly-His se puede ligar a proteínas diana en células de mamíferos. Las proteínas ubiquitinadas pueden purificarse con perlas Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes o mediante cromatografía de afinidad iónica metálica inmovilizada (IMAC) en condiciones de desnaturalización (Figura 1B). La proteína p53 total, incluida la p53 ubiquitinada, se inmunoprecipitó con perlas Flag/M2 de células H1299 en condiciones no desnaturalizantes. La señal de la proteína p53 ubiquitinada, que aparece como una banda manchada de bajo a alto peso molecular, aumentó notablemente cuando Mdm2 se expresó ectópicamente en estas células, lo que sugiere que la proteína p53 ubiquitinada se ha purificado eficazmente de las células (Figura 2). A continuación, las células se lisaron en condiciones de desnaturalización, y la proteína ubiquitinada celular total se redujo con resina cargada de níquel. La proteína celular total se detectó mediante Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-HA y la proteína p53 ubiquitinada se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-p53. Los resultados mostraron que el nivel total de proteína ubiquitinada se mantuvo sin cambios, pero el nivel de proteína p53 ubiquitinada aumentó dramáticamente después de que Mdm2 se sobreexpresó en estas células. Estos resultados indicaron que las proteínas ubiquitinas totales que contienen p53 ubiquitinado se retiraron efectivamente de los lisados celulares en condiciones de desnaturalización (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Un resumen de los procedimientos utilizados para purificar las proteínas ubiquitinadas. (A) Diagrama esquemático de las proteínas p53 marcadas con bandera (Flag-p53) y ubiquitina doble marcada con His/HA (HH-Ub). (B) Las proteínas ubiquitinadas pueden purificarse con perlas Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes y por IMAC en condiciones desnaturalizantes. Abreviaturas: His/HA = polihistidina/hemaglutinina; Ub = ubiquitina; Perlas Flag/M2 = perlas conjugadas con anticuerpos anti-Flag M2; IMAC = cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron en condiciones no desnaturalizantes. El plásmido de expresión de Flag-p53 se transfectó solo, con HH-Ub, o con Mdm2 y HH-Ub en células H1299. El total de proteínas p53 y las formas ubiquitinadas fueron inmunoprecipitadas por perlas Flag/M2 de extractos celulares. El eluido se sometió a Western blot con anticuerpos monoclonales anti-p53 (A) y anti-HA (B). (C) Los extractos de células crudas (Input) fueron sometidos a Western blot con anticuerpos monoclonales anti-p53 y anti-Mdm2. GFP se utilizó como control de carga. Abreviaturas: HH-Ub = ubiquitina de doble marcado; HA = hemaglutinina; Perlas Flag/M2 = perlas conjugadas con anticuerpos anti-Flag M2; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las proteínas p53 ubiquitinadas fueron purificadas en condiciones de desnaturalización. El plásmido de expresión de Flag-p53 se transfectó solo, con HH-Ub, o con Mdm2 y HH-Ub en células H1299. Las proteínas ubiquitinadas celulares totales se retiraron con resina cargada de níquel y luego se sometieron a Western blot con anticuerpos monoclonales anti-p53 y anti-HA. (A) La proteína p53 ubiquitinada se detectó utilizando un anticuerpo anti-p53. (B) La proteína ubiquitinada total se detectó utilizando un anticuerpo anti-HA. (C) Los extractos de células crudas (Input) fueron sometidos a Western blot con anticuerpos monoclonales anti-p53 y anti-Mdm2. GFP se utilizó como control de carga. Abreviaturas: HH-Ub = ubiquitina de doble marcado; HA = hemaglutinina; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La ubiquitinación juega un papel crítico en casi todos los procesos celulares fisiológicos y patológicos2. En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión del papel molecular de la ubiquitina en las vías de señalización y cómo los cambios en el sistema de ubiquitina conducen a diferentes enfermedades humanas2. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a proporcionar información sobre los roles exactos de ubiquitinación en estos procesos. Las mezclas de proteínas conjugadas con ubiquitina pueden purificarse a partir de células en condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes. IMAC utilizando resinas de níquel se puede utilizar para purificar proteínas poli-His-marcadas en condiciones de desnaturalización. El objetivo de purificar las proteínas ubiquitinadas en condiciones desnaturalizantes es descartar a los socios de interacción de las proteínas diana. Todos los componentes celulares que se unen a las proteínas diana se eliminarán de la elución en condiciones de desnaturalización. En contraste, algunas proteínas celulares que se unen a las proteínas diana pueden mantenerse en la elución en condiciones nativas, lo que puede interferir con los experimentos posteriores. Las proteínas ubiquitinadas se pueden purificar incluso en presencia de desnaturalizantes fuertes, lo que disminuye en gran medida la unión de proteínas no específicas a las resinas de níquel. En contraste, las proteínas diana totales, incluidas sus formas ubiquitinadas, pueden purificarse mediante estrategias de marcado de epítopos utilizando perlas de agarosa conjugadas con anticuerpos en condiciones no desnaturalizantes. Las proteínas se purificaron en condiciones menos estrictas porque se utilizó la purificación de afinidad mediada por anticuerpos durante este proceso. Las proteínas diana y sus formas ubiquitinadas se detectaron con anticuerpos específicos de proteínas o ubiquitina. Las proteínas marcadas con HA y Myc se pueden purificar convenientemente utilizando el mismo procedimiento con perlas de agarosa conjugadas con anticuerpos. En particular, es más fácil detectar proteínas con cadenas de monoubiquitina únicas o múltiples que aquellas con cadenas de poliubiquitina con anticuerpos específicos de proteínas. En contraste, las proteínas con cadenas de poliubiquitina pueden ser más fácilmente reconocidas por anticuerpos específicos de ubiquitina.

Para purificar eficazmente las proteínas ubiquitinadas, el nivel de expresión de las proteínas diana debe ser alto en las células de mamíferos. Los vectores de expresión con fuertes promotores de CMV se pueden utilizar para lograr altos niveles de expresión de proteínas en las células. Además, la ubiquitina ligasa E3 y la ubiquitina pueden expresarse conjuntamente con las proteínas diana. Agregará restos de ubiquitina de manera más efectiva a las proteínas. La actividad del proteasoma 26S puede ser bloqueada por un inhibidor de moléculas pequeñas para acumular proteínas ubiquitinadas en las células. Para hacer que las proteínas ubiquitinadas se unan eficazmente a la resina, los extractos celulares deben sonicarse brevemente para interrumpir el complejo de ADN y hacer que la solución no sea viscosa. Para disminuir la unión no específica, se debe agregar una baja concentración de imidazol al tampón de lisis en condiciones de desnaturalización. Las proteínas ubiquitinadas con un peso molecular muy alto son más fáciles de atar con la resina después del procedimiento de desnaturalización y replegado. Para aumentar la eficiencia de la elución, trate de usar una mayor concentración de imidazol. Si las eficiencias de la elución aún eran extremadamente bajas, intente eluyir las proteínas ubiquitinadas hirviendo directamente en el tampón de carga SDS Laemmli. La mayoría de las proteínas ubiquitinadas unidas a la resina pueden ser eluyidas en este fuerte tampón desnaturalizador. Para lograr una mayor pureza de las proteínas ubiquitinadas, se puede adaptar una purificación de afinidad en dos pasos. Después de la inmunoprecipitación de Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes, se puede utilizar un segundo paso de purificación por resina cargada de níquel para extraer la proteína ubiquitinada marcada con His y deshacerse de los sustratos no ubiquitinados. Por el contrario, después de la extracción de resina cargada de níquel en condiciones de desnaturalización, se puede adaptar un segundo paso de purificación de afinidad para inmunoprecipitar las proteínas diana utilizando la estrategia de marcado de epítopos mediante perlas de agarosa conjugadas anti-Flag o anti-HA.

Hemos utilizado inmunotransferencia más sensible en lugar de tinción de plata o tinción de Coomassie para detectar proteínas ubiquitinadas porque realizamos una pequeña escala de purificación en este estudio. De hecho, aunque algunas proteínas celulares se ubiquitinan fácilmente en las células, solo una pequeña parte de las proteínas puede ligarse con restos de ubiquitina. Para detectar con éxito estas proteínas mediante tinción de plata o tinción de Coomassie, se debe realizar una purificación a gran escala. Para aumentar la pureza de las proteínas ubiquitinadas, también se debe realizar un segundo paso de purificación de afinidad. No realizamos estos experimentos porque las proteínas ubiquitinadas purificadas a través de este protocolo cumplen completamente con el requisito de los análisis posteriores. Por ejemplo, para identificar DUB específicos para una proteína diana regulada por ubiquitinación, necesitamos purificar una gran cantidad de proteínas diana ubiquitinadas. Estas proteínas se pueden incubar con DUBs individuales purificados a partir de células de mamíferos en un tampón de desubiquitinación. Mediante este cribado in vitro de alto rendimiento, podemos identificar DUBs específicos para una proteína diana en células de mamíferos.

Hay varias limitaciones de la técnica. Las proteínas ubiquitinadas representan una parte muy pequeña de las proteínas diana, es difícil purificar una gran cantidad de proteínas diana ubiquitinadas. Trate de ampliar la expresión de proteínas en las células para lograr una alta eficiencia de purificación. Una alternativa es realizar una reacción de ubiquitinación in vitro para adquirir más proteínas ubiquitinadas. Algunas proteínas son difíciles de expresar altamente en las células de mamíferos, lo que pone otra limitación en la purificación de mayores cantidades de proteínas ubiquitinadas. Finalmente, el protocolo actual se limita a la purificación de proteínas marcadas que se sobreexpresan utilizando ADN plásmido. Los niveles de expresión de las proteínas diana son superiores a los de las proteínas diana endógenas. Para evaluar el estado de ubiquitinación endógena de una proteína diana, las proteínas con sus formas ubiquitinadas pueden ser inmunoprecipitadas directamente por anticuerpos específicos de proteínas diana de las células. Los anticuerpos antiubiquitina se pueden usar para determinar el estado de ubiquitinación de la proteína diana. Sin embargo, en algunas circunstancias, el nivel de expresión más bajo, el nivel de ubiquitinación más bajo de la proteína diana o la menor eficiencia de inmunoprecipitación de anticuerpos específicos pueden limitar la detección del estado de ubiquitinación de las proteínas diana endógenas de las células de mamíferos. El protocolo actual puede proporcionar un sistema experimental en su lugar.

La proteína supresora tumoral p53 juega un papel crítico en la prevención de la transformación maligna de las células normales 8,9,10,11. La estabilidad de p53 está estrechamente regulada por la degradación mediada por ubiquitinación en las células. Mdm2 actúa como una ubiquitina ligasa E3 para promover la mono y poliubiquitinación de p53 de una manera dependiente de la dosis16. Aquí, las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes en células de mamíferos en presencia de sobreexpresión de Mdm2. Las proteínas p53 monoubiquitinadas se detectaron preferentemente con anticuerpos monoclonales anti-p53, mientras que las formas poliubiquitinadas se detectaron fácilmente con anticuerpos específicos de ubiquitina. Los niveles de formas poliubiquitinadas pueden aumentarse eficazmente elevando la expresión de Mdm2 en las células. Este artículo proporciona un sistema experimental ideal para la preparación de proteínas ubiquitinadas con el fin de dilucidar el papel de la ubiquitinación en la modulación de la función de las proteínas. Las proteínas ubiquitinadas se pueden usar para identificar DUB específicos para una proteína diana y para revelar los roles de diferentes tipos de cadenas de ubiquitina, por ejemplo, las cadenas unidas a K48 y K63, en la señalización. Este protocolo se puede utilizar para investigar los roles de la ubiquitinación en la interacción proteína-proteína y la formación de complejos proteicos.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81972624) a D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

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References

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Bioquímica Número 181
Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos
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Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

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